Enseignement supérieur et formation professionnelle
Modèle de DMLA chez le lapin
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
Des tirs de laser sur la rétine, ou une injection sous la rétine, servent à provoquer une dégénérescence maculaire chez 1 200 lapins âgés de deux à trois mois. Suivent des examens ophtalmologiques répétés, des gouttes administrées jusqu'à six à huit fois par jour et des injections dans l'œil sous anesthésie, l'ensemble étant déclaré en niveau de souffrance léger. Le porteur affirme que le développement de la maladie n'est pas douloureux, tout en indiquant que la pathologie "devrait entrainer une altération permanente de la vision sur l'œil ayant reçu l'induction". 1 104 lapins sont tués pour les analyses ex vivo, les 96 autres, écartés avant l'induction pour un défaut anatomique de l'œil, étant réutilisés dans d'autres procédures.
Objectifs
La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est la première cause de mal voyance chez les personnes de plus de 50 ans dans les pays industrialisés. Cette pathologie touche l'œil dans une zone particulière de la rétine : la macula, impliquée dans la vision fine et la vision centrale. La maladie est silencieuse pendant plusieurs années, puis la vision et la perception des détails baissent, des tâches sombres apparaissent au centre du champ de la vision. Dans la forme dite humide de la DMLA, plus grave qui évolue rapidement vers une perte importante de la vision centrale, de nouveaux vaisseaux sanguins poussent de façon anormale depuis la choroïde et endommagent la rétine. La stratégie des traitements est de stopper la progression anarchique de ces vaisseaux délétères. Dans une autre forme dite "sèche" la maladie ne développe pas cette néovascularisation, mais des zones de rétine s'atrophient et perdent leur fonction. L’objectif de ce projet est de mettre en place dans l’établissement utilisateur, un modèle expérimental de forme humide en induisant la néovascularisation choroïdienne et aussi un modèle expérimental de forme sèche avec atrophie de la rétine sans néovascularisation, chez le lapin pour participer au développement de substances thérapeutiques limitant l'évolution de cette maladie de la rétine.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera au développement de médicaments luttant contre la DMLA et améliorant la vue des patients. La DMLA est la première cause de mal voyance chez les personnes de plus de 50 ans dans les pays industrialisés et la troisième cause dans le monde (1,5 millions de personnes en France, 196 millions dans le monde). Sa fréquence augmente avec l’âge et le nombre de patient augmentera compte tenu de l’allongement de l’espérance de vie.
Procédures
L’induction de la DMLA chez le lapin se fera par des tirs de laser ophtalmiques sur la rétine sous anesthésie, ou par une injection sous la rétine. Cette manipulation a lieu une fois au début de l'étude. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ils sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens en lampe à fente) mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ils sont rapides, ne dureront pas plus de quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par injection au niveau de l'œil (injection intravitréenne, sous conjonctivale), soit par administration orale, par injection sous cutanée, intraveineuse, ou intramusculaire (pour les anesthésiants). Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical, et durent en général 5 minutes par animal. Si le traitement est administré par voie orale il peut être au maximum quotidien, par voie intraveineuse il sera au maximum 3 fois par semaine, si la voie d’administration est l’injections sous-cutanée, la fréquence sera au maximum de 2 fois par jours, sur la durée de l’étude soit maximum 2 mois. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Le développement de la DMLA chez l’homme, et par transposition chez l’animal, n’est pas douloureux. Les nuisances pour l’animal sont celles dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. En dehors de ces périodes d’examen ou d’administration de traitement, l’animal est libre de ces mouvements, avec un accès à l’eau et à la nourriture. La pathologie devrait entrainer une altération permanente de la vision sur l'œil ayant reçu l'induction.
Devenir
Les animaux qui auront suivi la totalité de chaque procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Pour les études d’efficacité de traitement, les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure (estimé à environ 10%, hormis ceux exclus pour cause de points limites) pourront être réutilisés dans d’autres procédures expérimentales compatibles avec l’avis du vétérinaire. Ces animaux sont des animaux qui sont exclus de l'étude en raison d'un défaut anatomique ou physiologique détecté aux examens de baseline au niveau de l'œil avant le début de l’étude. Ces animaux n'auront pas reçu d'induction de la pathologie, ni d'administration de traitement, seulement des examens qui ne sont pas invalidants mais qui potentiellement nécessitent une anesthésie.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. Les lignées cellulaires ou les systèmes alternatifs comme les organoïdes ne permettent d’étudier qu’une partie des mécanismes. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse ...) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Les études in vivo permettent d’observer les réponses physiologiques d’un traitement dans un organisme vivant en tenant compte des pharmaco cinétiques, des métabolites générés. Compte tenu de la complexité de l’organe nous aurons donc recourt à des animaux.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques suivant la distribution des données, avec possibilité d'effectuer des comparaisons multiples. Chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en binôme avec différents enrichissements adaptés à l'espèce. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Lors des anesthésies des substituts de larmes sont régulièrement instillés sur les cornées pour éviter le dessèchement, un dispositif est prévu pour éviter l’hypothermie (tapis chauffant, ou lampe). Les procédures impliquées ne devraient pas entrainer de douleur. La sévérité de la demande est classée légère. L’application d’anesthésiant locaux est prévue avant les injections. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum, cependant si une complication apparait au cours du temps, l’emploi d’un analgésique de type buprénorphine sera envisagé.
Choix des espèces
Le lapin possède une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. Le modèle chez le lapin grâce à la taille de l’œil offre la possibilité de pose d’implant pour répondre au mieux à la problématique et identifier des principes actifs pouvant être bénéfiques aux patients. Les animaux seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans les études auront 2 à 3 mois.
Étude de l’impact de la modulation des gènes dans des cellules non neuronales dans un contexte d’ataxie cérébelleuse. EU3/4
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Transportées à pied d'un bâtiment à l'autre dans une cage placée en double emballage opaque, 360 souris circulent entre les quatre établissements utilisateurs de ce projet sur l'ataxie cérébelleuse. Elles subissent un prélèvement d'oreille, une chirurgie d'une heure sous anesthésie, des tests comportementaux répétés jusqu'à cinq fois, puis pour une partie d'entre elles une dernière chirurgie d'injection de fixateur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 52 femelles passent par un projet d'élevage pour la reproduction avant d'être tuées, les 308 autres sont tuées pour prélèvement de tissus. Sur le remplacement, le porteur écrit qu'un axe d'études comportementales rend impossible de se passer du modèle animal, et que les réseaux neuronaux visés ne se reproduisent pas en culture cellulaire.
Objectifs
Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par des troubles de la marche, une perte d'équilibre et de coordination motrice. Ces troubles sont causés par la dégénérescence des neurones du cervelet. Du fait de la faible prévalence de ces maladies, la mise en place d'études cliniques s'est avérée difficile et, à ce jour, aucun traitement curatif n'est disponible et très peu de médicaments sont proposés aux patients. Au fil des années, des modèles murins reproduisant les symptômes de plusieurs formes d'ataxie cérébelleuse ont été développés. Chaque modèle reproduit les principales caractéristiques génétiques, la dégénérescence cellulaire et les symptômes observés chez les patients. Au sein de ce projet multi-établissement (effectués dans 4 établissements utilisateurs, nommés ici EU1/EU2/EU3/EU4) nous avons sélectionné deux modèles murins d'ataxie cérébelleuse pouvant servir de paradigme pour ce groupe de maladies : l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et l'ataxie de Friedreich (AF). En fait, ces maladies couvrent l'hétérogénéité de ce groupe en termes de mode de transmission, de type de mutation génétique et de fonction de la protéine mutée. Nous avons récemment réalisé une analyse du cervelet afin d'identifier les principaux dysfonctionnements impliqués dans ces maladies. Nous avons constaté que la perte neuronale peut être influencée par des anomalies de certains types cellulaires non neuronaux qui contribuent au bon fonctionnement des neurones. Parmi ces anomalies, nous avons identifié un gène dont l'expression est plus faible chez les souris malades que chez les souris saines, dans les deux modèles de maladie. Ce projet vise donc à rétablir l'expression de ce gène au même niveau que chez les souris saines afin de démontrer son rôle dans la maladie. Dans cette optique, nous injecterons dans le cervelet de souris anesthésiées un vecteur portant un fragment génétique destiné à augmenter l'expression du gène spécifiquement dans un type particulier de cellules non neuronales, avant l'apparition des symptômes. En surveillant le comportement des souris et en réalisant des analyses moléculaires et histologiques ultérieures, nous espérons améliorer ou retarder l'apparition des symptômes chez les souris injectées. En complément, la seconde partie de notre projet tend à démontrer que la diminution d’expression de ce gène à elle seule suffit à faire apparaître les symptômes moteurs de la maladie chez des souris saines.
Bénéfices attendus
Par la modulation d'un gène spécifique et la combinaison de tests comportementaux, d'analyses histologiques, moléculaires et biochimiques, ce projet vise à élucider le rôle des cellules non neuronales dans l'ataxie cérébelleuse. Plus précisément, grâce à deux modèles murins paradigmatiques d'ataxie cérébelleuse, nous cherchons à démontrer la fonction cruciale d'une protéine produite par les cellules non neuronales pour protéger la fonction neuronale et ainsi prévenir les symptômes neurologiques. Ce projet pourrait prouver l'intérêt de ce gène pour le développement de futurs médicaments applicables à plusieurs types d'ataxies cérébelleuses.
Procédures
Les animaux de ce projet seront soumis à un prélèvement de tissus à l’oreille unique, procédure prenant environ 5 secondes au sein de l’EU1 et de l’EU2. Par la suite, un traitement sera administré par une intervention chirurgicale unique durant 1 heure et qui sera réalisée sous anesthésie et analgésie au sein de l’EU3. Des tests comportementaux, dont la durée totale est de 15 minutes, seront réalisés sur les animaux (au maximum 3 répétitions par test, EU3). En fonction du traitement reçu, ces tests seront réalisés soit 1 fois sur les animaux soit 5 fois (au maximum). Pour finir, une partie des animaux recevra une dernière chirurgie avec injection d’un fixateur sous anesthésie et analgésie pour prélèvements d’organes (intervention prenant 10 minutes au sein de l’EU4).
Impact sur les animaux
Un des deux modèles murins de ce projet commence à perdre du poids à partir de 20 semaines d’âge accompagné de symptômes ataxiques. Le second modèle de ce projet ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois mais à partir de 4 à 5 mois des symptômes légers de défaut de coordination motrice sont visibles lors de tests comportementaux. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs, sont indolores et n’impliquent qu’un court et léger stress ne causant donc aucun dommage durable aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection est accompagnée des mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires en amont et lors de l’opération. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. En prévision de cela, nous optons pour un traitement analgésique post-opératoire pour tous les animaux ayant reçu une injection.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Une partie des animaux produits (femelles) sera réutilisée pour reproduction au sein d’un projet d’élevage déjà en place dans l’EU2 avant mise à mort. Le reste sera étudié puis mis à mort pour prélèvement de tissus et analyses histologiques, moléculaires et biochimiques.
Remplacement
Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture cellulaire des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier.
Réduction
Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats des expériences. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l’ataxie de Friedreich affectent de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux pour former nos groupes expérimentaux.
Raffinement
Le transport court des animaux entre les différents établissements utilisateurs sera réalisé à pied et de préférence en début de journée, pour limiter l’impact sur la phase de repos des animaux, dans une cage fermée placée dans un double emballage opaque et fermé. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. Les animaux seront aussi habitués aux dispositifs pour tests comportementaux en amont de la réalisation des tests. De plus, nous effectuons un marquage temporaire de couleur à la base de la queue avec un feutre non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Les animaux seront surveillés tout au long de l’étude à l’aide d’une liste de points limites adaptés et précoces. Pour la prise en charge de la douleur péri-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet accompagné d’une grille de score adaptée pour surveiller le bon rétablissement des animaux. En complément, une grille de score est mise en place afin de surveiller l’état de santé des animaux et de pouvoir mettre en place un traitement précoce et adapté à l’apparition de symptômes.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous avons choisi d'utiliser des modèles murins parce que ces derniers présentent des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Les deux modèles utilisés au sein de ce projet sont déjà bien caractérisés ce qui nous permet de prévoir et gérer l’apparition des symptômes ataxiques ainsi que de tester un traitement par modulation génique avant apparition des symptômes. Les tests comportementaux seront effectués à l’âge où les symptômes ataxiques sont significativement visibles afin de mesurer l’efficacité de notre traitement.
Étude de l’impact de la modulation des gènes dans des cellules non neuronales dans un contexte d’ataxie cérébelleuse. EU1/4
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Biopsie de l'oreille, chirurgie d'une heure sous anesthésie, puis pour une partie des animaux une seconde chirurgie avec injection d'un fixateur pour prélever les organes : 360 souris passent par ces étapes réparties sur quatre établissements utilisateurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 308 sont tuées à l'issue, 52 femelles étant d'abord réutilisées pour la reproduction dans un projet d'élevage avant d'être tuées elles aussi. Le projet porte sur deux modèles d'ataxie cérébelleuse, dont l'un perd du poids dès vingt semaines d'âge. Les tests comportementaux, répétés jusqu'à cinq fois, sont qualifiés de non invasifs et indolores sans qu'aucun ne soit nommé.
Objectifs
Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par des troubles de la marche, une perte d'équilibre et de coordination motrice. Ces troubles sont causés par la dégénérescence des neurones du cervelet. Du fait de la faible prévalence de ces maladies, la mise en place d'études cliniques s'est avérée difficile et, à ce jour, aucun traitement curatif n'est disponible et très peu de médicaments sont proposés aux patients. Au fil des années, des modèles murins reproduisant les symptômes de plusieurs formes d'ataxie cérébelleuse ont été développés. Chaque modèle reproduit les principales caractéristiques génétiques, la dégénérescence cellulaire et les symptômes observés chez les patients. Au sein de ce projet multi-établissement (effectués dans 4 établissements utilisateurs, nommés ici EU1/EU2/EU3/EU4) nous avons sélectionné deux modèles murins d'ataxie cérébelleuse pouvant servir de paradigme pour ce groupe de maladies : l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et l'ataxie de Friedreich (AF). En fait, ces maladies couvrent l'hétérogénéité de ce groupe en termes de mode de transmission, de type de mutation génétique et de fonction de la protéine mutée. Nous avons récemment réalisé une analyse du cervelet afin d'identifier les principaux dysfonctionnements impliqués dans ces maladies. Nous avons constaté que la perte neuronale peut être influencée par des anomalies de certains types cellulaires non neuronaux qui contribuent au bon fonctionnement des neurones. Parmi ces anomalies, nous avons identifié un gène dont l'expression est plus faible chez les souris malades que chez les souris saines, dans les deux modèles de maladie. Ce projet vise donc à rétablir l'expression de ce gène au même niveau que chez les souris saines afin de démontrer son rôle dans la maladie. Dans cette optique, nous injecterons dans le cervelet de souris anesthésiées un vecteur portant un fragment génétique destiné à augmenter l'expression du gène spécifiquement dans un type particulier de cellules non neuronales, avant l'apparition des symptômes. En surveillant le comportement des souris et en réalisant des analyses moléculaires et histologiques ultérieures, nous espérons améliorer ou retarder l'apparition des symptômes chez les souris injectées. En complément, la seconde partie de notre projet tend à démontrer que la diminution d’expression de ce gène à elle seule suffit à faire apparaître les symptômes moteurs de la maladie chez des souris saines.
Bénéfices attendus
Par la modulation d'un gène spécifique et la combinaison de tests comportementaux, d'analyses histologiques, moléculaires et biochimiques, ce projet vise à élucider le rôle des cellules non neuronales dans l'ataxie cérébelleuse. Plus précisément, grâce à deux modèles murins paradigmatiques d'ataxie cérébelleuse, nous cherchons à démontrer la fonction cruciale d'une protéine produite par les cellules non neuronales pour protéger la fonction neuronale et ainsi prévenir les symptômes neurologiques. Ce projet pourrait prouver l'intérêt de ce gène pour le développement de futurs médicaments applicables à plusieurs types d'ataxies cérébelleuses.
Procédures
Les animaux de ce projet seront soumis à un prélèvement de tissus à l’oreille unique, procédure prenant environ 5 secondes au sein de l’EU1 et de l’EU2. Par la suite, un traitement sera administré par une intervention chirurgicale unique durant 1 heure et qui sera réalisée sous anesthésie et analgésie au sein de l’EU3. Des tests comportementaux, dont la durée totale est de 15 minutes, seront réalisés sur les animaux (au maximum 3 répétitions par test, EU3). En fonction du traitement reçu, ces tests seront réalisés soit 1 fois sur les animaux soit 5 fois (au maximum). Pour finir, une partie des animaux recevra une dernière chirurgie avec injection d’un fixateur sous anesthésie et analgésie pour prélèvements d’organes (intervention prenant 10 minutes au sein de l’EU4).
Impact sur les animaux
Un des deux modèles murins de ce projet commence à perdre du poids à partir de 20 semaines d’âge accompagné de symptômes ataxiques. Le second modèle de ce projet ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois mais à partir de 4 à 5 mois des symptômes légers de défaut de coordination motrice sont visibles lors de tests comportementaux. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs, sont indolores et n’impliquent qu’un court et léger stress ne causant donc aucun dommage durable aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection est accompagnée des mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires en amont et lors de l’opération. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. En prévision de cela, nous optons pour un traitement analgésique post-opératoire pour tous les animaux ayant reçu une injection.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Une partie des animaux produits (femelles) sera réutilisée pour reproduction au sein d’un projet d’élevage déjà en place dans l’EU2 avant mise à mort. Le reste sera étudié puis mis à mort pour prélèvement de tissus et analyses histologiques, moléculaires et biochimiques.
Remplacement
Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture cellulaire des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier.
Réduction
Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats des expériences. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l’ataxie de Friedreich affectent de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux pour former nos groupes expérimentaux.
Raffinement
Le transport court des animaux entre les différents établissements utilisateurs sera réalisé à pied et de préférence en début de journée, pour limiter l’impact sur la phase de repos des animaux, dans une cage fermée placée dans un double emballage opaque et fermé. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. Les animaux seront aussi habitués aux dispositifs pour tests comportementaux en amont de la réalisation des tests. De plus, nous effectuons un marquage temporaire de couleur à la base de la queue avec un feutre non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Les animaux seront surveillés tout au long de l’étude à l’aide d’une liste de points limites adaptés et précoces. Pour la prise en charge de la douleur péri-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet accompagné d’une grille de score adaptée pour surveiller le bon rétablissement des animaux. En complément, une grille de score est mise en place afin de surveiller l’état de santé des animaux et de pouvoir mettre en place un traitement précoce et adapté à l’apparition de symptômes.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous avons choisi d'utiliser des modèles murins parce que ces derniers présentent des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Les deux modèles utilisés au sein de ce projet sont déjà bien caractérisés ce qui nous permet de prévoir et gérer l’apparition des symptômes ataxiques ainsi que de tester un traitement par modulation génique avant apparition des symptômes. Les tests comportementaux seront effectués à l’âge où les symptômes ataxiques sont significativement visibles afin de mesurer l’efficacité de notre traitement.
Gestion des prélèvements pour le généotypage des rongeurs rats et souris
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 800
Tués si leur génotype ne convient pas, versés dans des protocoles de recherche s'il convient, 2 500 souris et 800 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit une biopsie de moins d'un millimètre à l'extrémité de la queue vers 15 jours, sur animal vigile, ou à l'oreille sous anesthésie générale à partir de 4 semaines. Le projet ne poursuit aucune question scientifique : il couvre l'ensemble des actes de génotypage de l'établissement. Le porteur présente son bénéfice attendu comme statistique, faire figurer dans les comptes annuels les animaux génotypés de façon invasive, et indique que des techniques non invasives restent "en cours d'évaluation".
Objectifs
L'objectif de ce projet est de couvrir l'ensemble des actes de génotypage de l'établissement de recherche.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de prendre en compte les animaux qui sont génotypés de manière invasive en plus de leur identification par tatouage dans les statistiques annuelles de l'établissement. Cela permet de continuer à travailler sur des mesures de raffinement de ce génotypage et d'encourager les équipes à développer des méthodes non invasives.
Procédures
les animaux sont soumis à une biopsie de tissu à l’extrémité de la queue ou à l’oreille, selon l’âge de l’animal, qui sera inférieure à 1mm. Pour les animaux de moins de 15jours l'intervention sera faite sur desanimaux vigiles et anesthésiés pour des animaux plus âgés. Cette intervention dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
La biopsie de tissu pour génétypage sera réalisée à l’extrémité de la queue ou à l’oreille cela implique un stress léger lors de la contention de l'animal et une douleur de courte durée lors de la coupe de tissu.
Devenir
En fonction du génotype, les animaux seront soit euthanasiés soit incorporés dans des protocoles de recherche.
Remplacement
L’utilisation d’animaux transgéniques permet l’étude d’un gène de façon ciblée ou d’une fonction spécifique de l’organisme. Des techniques génétiques permettent de modifier le génome de façon très précise. De plus, la modification du génome peut induire la perte ou l’activation de l’expression d’un gène, et ceci de façon ciblée dans le temps ou dans un organe, constitutivement ou après induction. Ces modèles animaux sont précieux pour réaliser des recherches scientifiques fondamentales ou précliniques et ne peuvent souvent pas être remplacés car les fonctions étudiées mettent en jeu des interactions inter-organes essentielles au bon fonctionnement de l’organisme, impliquant des réponses hormonales, immunitaires et nerveuses.
Réduction
Le nombre d’animaux pour le maintien d’un élevage de souris est maintenu au minimum pour garantir le fonds génétique et éviter la dérive génétique (environ 10 à 15 animaux maximum /lignée âgées de 6 mois au maximum pour garantir leur fertilité). L’élevage de lignées transgéniques est limité et restreint aux lignées utilisées dansles projets de recherche. En cas d’arrêt ou d’interruption de projets, les lignées sont cryoconservées par congélation de sperme. Les animaux de mauvais généotypes pourront être proposés en interne pour une utilisation par d'autres équipes.
Raffinement
La biopsie de la queue sera réalisée précocement, à l’âge de 15 jours, avant l’ossification de la queue ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. Chez l’adulte, une biopsie de la pina de l’oreille sera privilégiée et sera réalisée sous anesthésie générale. La taille de la biopsie est réduite à son minimum et représente au maximum 1 mm. Des techniques alternatives de biopsie non invasives sont en cours d’évaluation et pourront être utilisées lorsque le génotypage sera validé et si l’absence de contaminations croisées est démontrée.
Choix des espèces
La transgenèse est généralement réalisée chez la souris et depuis récemment chez le rat et l’établissement utilisateur possède à la fois un zone d’élevage et d’expérimentation sur les différents modèles de souris et rats transgéniques utilisées en recherche fondamentale et préclinique. La biopsie caudale sera réalisée à l’âge de 10-15 jours afin de limiter les nuisances du prélèvement. La biopsie de la pina de l’oreille sera réalisée à l’âge de 4 semaines pour éviter l’incision de la queue qui s’est ossifié.
Formation pratique à la manipulation et à l’évaluation comportementale chez le rongeur
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 50
Les gestes appris ici ne produisent aucune connaissance : ils servent à former des étudiants de master et des stagiaires de la formation réglementaire à contenir et piquer des rongeurs. 100 souris et 50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit trois injections sous-cutanées sur animal vigile, et les souris passent en plus cinq tests comportementaux avant d'être tuées, la formation étant alors terminée. Le porteur affirme qu'aucun mannequin ni simulateur ne permet d'apprendre l'injection, qui exige selon lui de percevoir la tonicité musculaire et la réaction de l'animal, et juge "indispensable" de former les futurs utilisateurs.
Objectifs
Ce projet vise à former deux publics distincts à la manipulation des rongeurs dans un contexte d’expérimentation biomédicale : 1. Étudiants de Master : acquisition des compétences nécessaires pour manipuler la souris et le rat de façon douce et sécurisée, dans le respect des règles de bonnes pratiques et de respect du bien-être animal. Les étudiants apprendront la contention, la réalisation d’une injection sous-cutanée, et seront initiés aux principes d’évaluation comportementale au travers de tests simples non invasifs. 2. Participants à la formation réglementaire à l’expérimentation animale (niveaux applicateur et concepteur) : apprentissage et maîtrise des gestes techniques de manipulation, contention, injection sous-cutanée chez le rat et la souris, afin de garantir une pratique conforme aux bonnes pratiques et au respect du bien-être animal. Dans les deux contextes, l’objectif central est de permettre aux futurs expérimentateurs d’acquérir les compétences nécessaires pour une manipulation précise, contrôlée et respectueuse des animaux.
Bénéfices attendus
L'ensemble des étudiants et apprenants acquerront la maîtrise des gestes techniques de base nécessaires à l’expérimentation animale et les compétences pour manipuler en sécurité pour eux-mêmes et pour l’animal. Ils apprendront à manipuler calmement et sans contrainte excessive les rongeurs, à réaliser des injections sous-cutanées en limitant la douleur. Ceci leur permettra de reconnaître les signes comportementaux d’inconfort. Les étudiants de master apprendront également à utiliser correctement des tests comportementaux et ainsi à interpréter les réponses comportementales des souris dans une approche éthique. Ces procédures permettront aux étudiants/apprenants de pouvoir expérimenter dans les conditions réglementaires et de bien-être animal, contribueront à réduire la variabilité expérimentale future, à améliorer la qualité des manipulations de laboratoire et, de ce fait, leur permettront de développer des projets de recherche à impact pour les connaissances scientifiques. Toutes ces compétences contribueront à réduire la souffrance animale dans les projets futurs et à renforcer l’application concrète du raffinement.
Procédures
L'ensemble des animaux recevra 3 injections, espacées d'au moins 3 jours. Ce geste sera réalisé sous supervision des enseignant.e.s, sur animal vigile. Les souris seront également soumises une fois à 5 tests comportementaux visant à évaluer leurs capacités cognitives et leur état émotionnel. La durée de chaque test est comprise entre 5 et 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress léger, transitoire et limité dans le temps, lié à leur manipulation lors des tests comportementaux et lors de l'injection.
Devenir
- A l'issue de la 3ème séance de TP (réalisation d'injections chez le rat), la totalité des rats seront mis à mort car la formation sera terminée. - A l'issue de la 3ème séance de TP (réalisation d'injections chez la souris), les souris seront conservées pour la séance de TP "tests comportementaux". - A l'issue de la séance de TP utilisant les souris en comportement, les souris seront mises à mort car la formation sera terminée.
Remplacement
Afin que les projets de recherches futurs utilisant des animaux à des fins de recherches scientifiques soient effectués dans le respect du bien-être animal, il est indispensable de former les futurs utilisateurs. Aucune alternative possible (mannequin, vidéo, simulateur) ne permet l'apprentissage de la manipulation et de l’injection sous-cutanée, nécessitant la perception de la tonicité musculaire, de la pression digitale et également de la réaction comportementale de l’animal. Cependant, des mannequins de rats et souris seront disponibles pour que les apprenant.e.s puissent apprendre le geste de contention avant de le réaliser sur animal vivant.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, les animaux seront mutualisés entre les sessions de master et de formation réglementaire qui ont lieu à la même période.
Raffinement
Les manipulations sont réalisées dans un environnement calme. Elles seront douces et courtes, avec la possibilité de réaliser des pauses si l’animal montre des signes d’agitation ou d’apathie. Les manipulations se feront sous supervision systématique par des formateurs habilités niveau applicateur ou concepteur. Une grille de surveillance des animaux, des points limites et des actions associées ont été pré-définis. Ces actions seront mises en place en cas d'atteinte d'un point limite.
Choix des espèces
La souris et le rat sont les deux espèces les plus couramment utilisées dans la recherche biomédicale en neurosciences et en physiologie comportementale. Ils présentent des comportements facilement observables et interprétables, une morphologie adaptée à l’apprentissage des techniques de contention et d’injection, et une grande familiarité pour les expérimentateurs en formation. • Souris : leur tempérament généralement calme et leur robustesse en font un modèle adapté à l’acquisition des gestes techniques en dans le cadre d’un apprentissage progressif et contrôlé. • Rats : leur taille plus importante permet aux apprenants de visualiser plus aisément l’anatomie externe et d’acquérir la précision des gestes dans la contention et l’injection. La combinaison des deux espèces contribue à une formation complète et représentative des pratiques expérimentales sur animaux vivants, en particulier en neurosciences. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte jeune à adulte (1,5 – 4 mois selon disponibilité) : les animaux adultes présentent une stabilité comportementale, un poids constant, et une résistance physiologique permettant un apprentissage sécurisé des techniques de contention et d’injection, sans fragiliser l’animal. Aucun animal néonatal, juvénile ou âgé fragile ne sera utilisé dans ce projet.
Modèle de kératopathie neurotrophique chez le rongeur.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 600
Pour reproduire une dégénérescence de la cornée provoquée par la section des nerfs qui l'innervent, 600 souris et 600 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les nerfs ciliaires d'un œil sont sectionnés sous anesthésie générale, puis chaque animal reçoit des collyres jusqu'à six à huit fois par jour pendant une à quatre semaines, des injections intra- ou péri-oculaires parfois quotidiennes et un prélèvement sanguin hebdomadaire, avec examens à la lampe à fente, esthésiométrie et imagerie cornéenne. Une centaine d'animaux écartés avant l'induction pourront être réutilisés dans d'autres protocoles, tous les autres sont tués pour des analyses histologiques et biochimiques. Le porteur annonce une kératite pouvant aller jusqu'à l'ulcération et une opacification de la cornée, et écrit dans le même paragraphe que ces manifestations ne devraient pas générer de douleur manifeste après le réveil.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est de développer un modèle expérimental de kératopathie neurotrophique chez le rongeur afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la dégénérescence cornéenne liée à une altération de l’innervation sensitive. La kératopathie neurotrophique est une affection rare mais sévère de la cornée, résultant d’un dysfonctionnement du nerf trijumeau, et observée dans diverses pathologies humaines telles que l’herpès oculaire, le diabète, ou après des interventions neurochirurgicales. Les modèles développés permettent de reproduire de manière contrôlée une dénervation cornéenne, entraînant une perte de trophicité, une altération de la cicatrisation épithéliale, une inflammation chronique et une apoptose des cellules épithéliales. L’activation des cellules immunitaires locales et la perturbation de l’homéostasie des cellules de la cornée contribuent à la progression de la maladie. Ces modèles offrent une plateforme pertinente pour l’analyse des voies de signalisation impliquées dans la régénération nerveuse, la réponse inflammatoire et le stress oxydatif. Ils permettent également d’évaluer l’efficacité de stratégies thérapeutiques neuroprotectrices, régénératives ou anti-inflammatoires, en amont d’études cliniques. En résumé, ces modèles constituent un outil essentiel pour mieux comprendre la physiopathologie de la kératopathie neurotrophique et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ce projet est la mise au point de modèles expérimentaux robustes permettant d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques visant à préserver ou restaurer l’intégrité cornéenne après une dénervation. La kératopathie neurotrophique (KN) constitue une pathologie sévère, souvent consécutive à des atteintes du nerf trijumeau, et pour laquelle les options thérapeutiques restent limitées. Il est donc essentiel de disposer de modèles fiables reproduisant les mécanismes physiopathologiques observés chez l’humain, afin de tester ces traitements dans des conditions rigoureuses et contrôlées, tout en respectant les principes du bien-être animal. Ces modèles permettront de simuler les altérations cornéennes caractéristiques de la KN, telles que la perte de sensibilité, la diminution de la sécrétion lacrymale et la dysfonction épithéliale. Ils offriront la possibilité d’évaluer avec précision l’effet des traitements sur la régénération nerveuse et la cicatrisation épithéliale. Ces études contribueront à identifier les molécules les plus prometteuses, à optimiser les schémas posologiques et à approfondir la compréhension des mécanismes d’action, tout en garantissant une approche éthique et conforme aux standards réglementaires.
Procédures
Les animaux inclus dans ce projet seront soumis à différentes interventions réparties sur une période de 1 à 4 semaines, selon les objectifs et les résultats obtenus avec les traitements testés, parmi lesquelles : 1. La procédure chirurgicale d’induction de la pathologie avec lésion mécanique unilatérale des nerfs ciliaires. Durée estimée à 10 minutes sous anesthésie générale avec prémédication d’une analgésie administrée en sous-cutanée. 2. Les examens ophtalmologiques : . Comme l’observation à la lampe à fente, le prélèvement des larmes par capillarité et l’esthésiométrie réalisés en baseline, au premier, troisième, cinquième, septième et quatorzième jour après l’induction. La durée de ces examens ne dépasse pas cinq minutes par animal : . Comme la tomographie en cohérence optique (OCT) ou microscopie confocale in vivo seront réalisées avant l’induction et une fois par semaine. Ces deux examens se font après une anesthésie légère afin d’immobiliser l’animal et permettre l’obtention de résultats interprétables. 3. Les administrations de traitements comme : . Les instillations topiques (collyres) durent d’une à deux minutes par application sur animal vigile à une fréquence de trois fois/jour en moyenne (max. six à huit fois/jour) sur la durée totale de l’étude à savoir 1 à 4 semaines ; . Les injections intra- ou péri-oculaires sous anesthésie locale et générale qui ne durent que quelques minutes et peuvent être quotidiennes, comme les injections systémiques sur animal vigile et réparties sur l’ensemble de l’étude à savoir 1 à 4 semaines. 4. Les prélèvements sanguins généralement réalisés une fois par semaine sur animal vigile sont définis en fonction du volume de prélèvement et du temps de récupération de l’animal. Ce prélèvement veineux est rapide puisqu’il ne dure qu’une à deux minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables anticipés dans le cadre de ce projet sont considérés comme modérés. Les données issues de la littérature et des expériences antérieures indiquent que les manifestations les plus fréquentes incluent : une hyperémie conjonctivale liée à une inflammation locale modérée, notamment après les procédures d’induction ou d’administration; un saignement léger et transitoire au site d’incision ou d’injection; des troubles cornéens, tels qu’une opacification, une kératite superficielle à profonde avec ulcération. Une perte de sensibilité cornéenne induite par la dénervation est également attendue et constitue un élément central du modèle. Elle peut aussi s’accompagner d’une diminution de la sécrétion lacrymale et d’une altération de la cicatrisation épithéliale. Toutes ces manifestations ne devraient pas générer de douleur manifeste après le réveil de l’animal, conformément aux observations des modèles de référence et qu’une prémédication analgésique pourra être administrée pour limiter d'éventuelle douleur. Les examens et administrations nécessitent une contention brève, pouvant induire un stress ponctuel de quelques minutes. Des mesures spécifiques (habituation, manipulation douce, environnement calme) seront mises en place pour limiter cet impact. Les procédures plus invasives, telles que les injections péri-oculaires ou les examens nécessitant une immobilisation prolongée, seront réalisées sous anesthésie légère afin de garantir le confort de l’animal. Ces anesthésies peuvent occasionner une gêne transitoire mais ne présentent pas de risque significatif à long terme.
Devenir
À l’issue de la procédure expérimentale, tous les animaux ayant suivi l’intégralité du protocole seront euthanasiés de manière éthique et réglementée, afin de permettre la réalisation des analyses ex vivo nécessaires à la validation des résultats scientifiques (analyses histologiques, dosages biochimiques, études moléculaires, etc.). Cependant, les animaux n’ayant pas été inclus dans la totalité de la procédure — estimés à environ 10 %, hors exclusions liées aux points limites — pourront être réutilisés dans d’autres protocoles expérimentaux compatibles, sous réserve de l’avis favorable du vétérinaire responsable. Ces animaux sont généralement exclus en raison d’un défaut anatomique ou physiologique détecté lors des examens de baseline, notamment au niveau de l’œil, avant le début de l’induction de la pathologie. Ces individus n’auront reçu ni induction de la kératopathie neurotrophique, ni administration de traitement, mais auront uniquement été soumis à des examens non invalidants, parfois réalisés sous anesthésie légère. Leur réutilisation, lorsqu’elle est possible, s’inscrit dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés, conformément aux principes des 3R, tout en garantissant le respect du bien-être animal et des exigences scientifiques.
Remplacement
L’œil est un organe sensoriel d’une grande complexité, composé de structures anatomiques et physiologiques très diverses (cornée, cristallin, rétine, nerf optique...), interagissant de manière dynamique avec leur environnement local et systémique. Il est soumis à des variations mécaniques, physicochimiques et biologiques constantes, qui influencent directement sa fonction et sa réponse aux traitements. Bien que des méthodes alternatives aient été développées ces dernières années, telles que les cultures cellulaires, les organoïdes ou les modélisations in silico, ces approches, bien qu’utiles, ne permettent pas encore de reproduire l’ensemble des interactions fonctionnelles et pharmacocinétiques observées dans un œil vivant. En particulier, elles ne permettent pas de simuler de manière fiable les effets de la dénervation sensitive, les altérations de la cicatrisation cornéenne, ni les réponses neurodégénératives complexes impliquées dans la kératopathie neurotrophique. Dans ce contexte, le recours à un modèle animal reste actuellement indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, notamment pour : 1. Reproduire fidèlement les conditions pathologiques de la kératopathie neurotrophique, 2. Évaluer l’efficacité et la tolérance de nouvelles approches thérapeutiques dans un organisme vivant, 3. Étudier les effets à long terme sur la cornée et les structures nerveuses associées dans un environnement physiologique complet.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été délibérément limité afin de respecter les principes éthiques liés à l’expérimentation animale, tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour permettre une analyse fiable et reproductible des résultats et déterminer l’effectif optimal nécessaire à la détection d’un effet significatif. Ce calcul permettra, le cas échéant, d’ajuster à la baisse le nombre d’animaux inclus dans les procédures, sans compromettre la validité scientifique des conclusions. Dans une démarche active de réduction du nombre d’animaux utilisés, plusieurs stratégies complémentaires seront mises en œuvre. L’utilisation de méthodes non invasives pour le suivi de la pathologie, telles que l’imagerie cornéenne en temps réel (OCT, microscopie confocale), permettra de réaliser des suivis longitudinaux sur les mêmes individus, évitant ainsi la nécessité de sacrifices à chaque point d’analyse. Lorsque cela est scientifiquement pertinent, les deux yeux d’un même animal pourront être analysés, ce qui permet de doubler les données collectées sans augmenter le nombre d’animaux. Par ailleurs, l’optimisation des protocoles expérimentaux (standardisation des conditions d’induction de la dénervation, contrôle rigoureux des paramètres environnementaux et biologiques) contribuera à limiter la variabilité interindividuelle et à maximiser la robustesse des résultats. Enfin, une attention particulière sera portée à la formation des opérateurs et à la qualité des soins apportés aux animaux, afin de garantir leur bien-être tout au long de l’étude.
Raffinement
Un suivi quotidien rigoureux des animaux sera assuré tout au long des études afin de détecter rapidement tout signe de stress, d’inconfort ou d’effet indésirable lié aux procédures expérimentales. Cette surveillance permettra une intervention rapide et adaptée, conformément à des points limites prédéfinis, conçus pour être précoces, prédictifs et spécifiques à la pathologie étudiée. Ces points limites visent à réduire toute douleur potentielle et à garantir une prise en charge éthique et réactive des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages enrichies, avec accès libre à la nourriture et à l’eau (ad libitum). L’environnement sera optimisé par des abris, des matériaux à ronger et des structures d’exploration favorisant le bien-être psychologique et comportemental. Une attention particulière sera portée à la qualité des conditions d’hébergement, à la réduction du stress et à la stimulation des comportements naturels. Dans le cadre du projet, une anesthésie générale sera indispensable lors des chirurgies d’induction afin d’assurer l’immobilité de l’animal. Elle pourra être complétée par une anesthésie locale si nécessaire. Une prémédication analgésique sera administrée pour limiter la douleur, et une antibioprophylaxie locale pourra être appliquée au niveau de l’œil ou de l’incision en cas de risque infectieux. Les examens destinés à évaluer la kératopathie neurotrophique seront principalement non invasifs et similaires à ceux pratiqués en ophtalmologie humaine ou vétérinaire, tels que l’imagerie cornéenne, la mesure de la sensibilité cornéenne et l’évaluation de la cicatrisation épithéliale. Ces techniques permettront des suivis longitudinaux sur les mêmes individus, réduisant le nombre d’animaux nécessaires et évitant leur euthanasie à chaque point d’analyse. Lorsque l’immobilité est requise, une anesthésie légère et courte pourra être administrée pour assurer le confort et limiter le stress. Après chaque anesthésie, les animaux seront sous environnement chauffant pour prévenir l’hypothermie. Une hydratation locale sera réalisée sur les cornées jusqu’au réveil afin d’éviter les complications oculaires. Les animaux seront ensuite replacés dans leur environnement habituel pour réduire le stress post-manipulation. Ce projet a été validé par un comité d’éthique sera suivi par la structure en charge du bien-être animal.
Choix des espèces
Les espèces sélectionnées pour ce projet, le rat et la souris, présentent des caractéristiques anatomiques, physiologiques et métaboliques bien documentées dans la littérature scientifique, ce qui facilite l’extrapolation des résultats vers l’humain, notamment dans le contexte des pathologies cornéennes telles que la kératopathie neurotrophique. Ces deux espèces sont couramment utilisées dans les modèles expérimentaux validés de dénervation cornéenne et de régénération nerveuse, et leur emploi repose sur une expérience étendue au sein de la communauté scientifique. Leur utilisation permet une grande flexibilité expérimentale, notamment en termes de suivi longitudinal, d’imagerie cornéenne et de quantification des marqueurs moléculaires. L’expérience accumulée avec ces modèles garantit la reproductibilité des résultats, la comparabilité avec d’autres études précliniques, et la pertinence des données obtenues pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Le choix de ces espèces s’inscrit dans une démarche scientifique rigoureuse, éthique et translatoire, visant à maximiser la qualité des résultats tout en respectant les principes de l’expérimentation animale. Les animaux utilisés dans ce projet seront des jeunes adultes, âgés d’au minimum 6 semaines pour les rats et d’environ 5 à 6 semaines pour les souris, correspondant à une maturité fonctionnelle et physiologique des structures cornéennes et nerveuses impliquées dans la kératopathie neurotrophique. Ce stade de développement garantit une réponse cohérente aux protocoles d’induction de la pathologie, ainsi qu’une meilleure reproductibilité des résultats. Le choix de cette tranche d’âge permet également d’éviter les biais liés à la croissance ou à la sénescence, tout en assurant une bonne tolérance aux procédures expérimentales.
Travaux pratiques sur poissons exotiques de rivière dans le cadre du module spécifique « poissons sauvages » des formations réglementaires concepteurs et applicateurs
- Formation professionnelle
Capturé à l'électricité dans un bras de rivière, un poisson par stagiaire est paralysé une trentaine de secondes, gardé jusqu'à une heure en bac, anesthésié par immersion pendant trente minutes au plus, marqué par injection sous-cutanée, puis tué par surdose d'anesthésique. 60 poissons exotiques, guppys, porte-épée, laveurs de vitre ou nigros, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les stagiaires, des pêcheurs déjà expérimentés, apprennent à repérer les signes d'une anesthésie trop profonde et à pratiquer une mise à mort conforme. Le porteur affirme que ces gestes sont impossibles à apprendre sur des poissons morts, et souligne que ces individus relèvent déjà d'un programme de lutte contre les espèces exotiques envahissantes, ce qui lui sert d'argument de réduction.
Objectifs
Le projet concerne les travaux pratiques réalisés dans le cadre des formations applicateur/concepteur sur « poissons sauvages ». Les objectifs pédagogiques de cet enseignement pratique sont : 1.Identifier les obligations réglementaires des procédures non invasives : les étudiants devront réfléchir à la nécessité d’une DAP 2.Réaliser une capture de poissons de rivière avec un dispositif de pêche électrique en respectant les bonnes pratiques 3.Réaliser un marquage externe simple et un prélèvement simple sur un poisson sédaté 4.Repérer les signes d’une anesthésie efficace et ceux d’une anesthésie trop profonde 4.Réaliser une euthanasie par surdosage anesthésique 5.Identifier les critères d'observation pour caractériser le bon rétablissement d’un poisson après une procédure expérimentale sous anesthésie légère.
Bénéfices attendus
Les travaux pratiques offriront aux participants une mise en situation réelle en milieu naturel, indispensable pour l’apprentissage des bonnes pratiques expérimentales. Ils permettront d’acquérir des compétences concrètes telles que : l’observation et l’identification des signes de stress chez les poissons, la gestion d’une anesthésie légère et du réveil, la réalisation d’une euthanasie conforme aux principes éthiques, par surdosage anesthésique. Au-delà de ces aspects techniques, le TP abordera également des notions transversales essentielles : préparation et organisation d’une « paillasse expérimentale » en milieu naturel, préparation de solutions anesthésiante et euthanasiant, gestion des médicaments, respect des règles d’hygiène, de sécurité et de gestion des risques, gestion responsable des déchets, en particulier ceux liés aux médicaments, prise en charge et élimination appropriée des cadavres. De façon plus large, la formation concepteur/applicateur – module spécifique “poissons sauvages” représente une opportunité inédite : c’est le premier module national dédié à la faune aquatique sauvage, alors que jusqu’à présent les formations portaient uniquement sur les poissons d’aquarium (ex. zebrafish). Or, ces dernières ne permettent pas d’aborder des thématiques centrales telles que la capture, la contention et l’adaptation des procédures face au stress spécifique des espèces sauvages. En pratique, cette formation sera proposée en moyenne une fois par an, avec environ 12 participants par session. À l’horizon de 5 ans, ce sont donc près de 60 scientifiques qui auront été formés, sensibilisés aux principes des 3R, au bien-être animal et à l’amélioration continue des procédures expérimentales. Cette montée en compétence contribuera directement au développement de pratiques plus responsables et rigoureuses dans le cadre des programmes de pêche scientifique en eau douce et en milieu marin.
Procédures
Les poissons pêchés subiront plusieurs interventions qui seront prises en charge dans le raffinement de la procédure : capture par pêche électrique entraînant une paralysie courte (30 secondes), captivité dans des bacs d’eau de rivière (1h maximum), anesthésie légère par immersion (30min maximum), injection sous cutanée sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les poissons pêchés subiront plusieurs nuisances qui seront prises en charge dans le raffinement de la procédure : paralysie lors de la pêche électrique, stress de contention dans des bacs d’eau de rivière.
Devenir
Tous les individus, en tant qu'espèces exotiques envahissantes, seront euthanasiés à la fin de la procédure conformément à la prévention de l'introduction et de la propagation des espèces animales exotiques envahissantes.
Remplacement
Un premier niveau de formation est assuré sans recours à des animaux vivants : TP sur poissons morts issus de la pêche commerciale pour l’apprentissage du geste technique de marquage., TD sur les signes de stress, douleur et détresse à partir de supports visuels (photos, vidéos). Cependant, certains objectifs pédagogiques concernent des actes ne pouvant être réalisés sur modèles inertes (capture, anesthésie, observation des stades anesthésiques, bonnes pratiques d’euthanasie). L’utilisation de poissons vivants est donc indispensable pour un apprentissage réaliste, permettant aux participants d’acquérir les compétences nécessaires sous la supervision d’encadrants. Le public concerné étant composé de pêcheurs déjà expérimentés, la mise en situation sur poissons vivants est essentielle pour corriger les pratiques issues de la pêche commerciale et les adapter aux exigences de bien-être animal et de la réglementation.
Réduction
L’utilisation a été limitée à un individu par stagiaire, soit le nombre minimal permettant de réaliser l’ensemble des gestes pédagogiques (capture, diagnose, anesthésie, marquage, observation et euthanasie), tout en garantissant la qualité de l’apprentissage. D’autre part, toujours dans un objectif de réduction, nous avons choisi de réaliser la procédure dans un bras de rivière qui héberge quasi exclusivement des poissons exotiques. Ceux-ci sont concernés par un programme de lutte relatif à la prévention de l'introduction et de la propagation des espèces animales exotiques envahissantes. Ainsi, le TP vise à utiliser des individus déjà visé dans une procédure de lutte.
Raffinement
La procédure a été conçue de manière à minimiser le stress et l’inconfort des poissons tout au long du TP : • Sélection des espèces : seules des espèces exotiques sont utilisées, afin d’éviter tout impact sur les populations indigènes. Les individus indigènes éventuellement capturés accidentellement (anguilles) sont immédiatement relâchés. • Capture : la pêche électrique est effectuée à l’aide de dispositifs régulièrement contrôlés et utilisés sous la supervision d’opérateurs formés, afin de limiter la durée de manipulation et de réduire au minimum le risque de blessures. • Anesthésie : l’immersion dans une solution de lidocaïne à faible concentration est employée uniquement pour la contention. Le protocole vise une anesthésie légère, suffisante pour immobiliser l’animal, réduisant ainsi le stress sans recourir à une analgésie profonde, inutile pour ce type de geste. • Ecouvillon cutanée : cet acte, choisi comme exemple pédagogique, est non invasif et encore peu utilisé en expérimentation sur poissons. Il illustre l’intérêt de méthodes non létales permettant de collecter des données à faible contrainte : analyse du mucus (indicateurs de stress, statut immunitaire, qualité de l’eau), étude du microbiote cutané ou détection de pathogènes externes (protozoaires, mycoses, bactéries). • Marquage « spaghettis » : habituellement réalisé sans analgésie (injection sous-cutanée), il est ici associé à une anesthésie générale afin de sécuriser l’apprentissage technique. Cette précaution supplémentaire vise à compenser l’imprécision possible des gestes de participants en cours de formation. • Encadrement : la supervision est assurée par des formateurs expérimentés, avec un ratio de 1 encadrant pour 4 stagiaires, garantissant des gestes rapides, précis et reproductibles. • Surveillance post-manipulation : après manipulation, chaque individu est placé dans un seau de stabulation et observé pendant environ 10 minutes, afin de confirmer sa récupération complète et l’absence de signes persistants de détresse. Ainsi, le protocole privilégie en permanence des méthodes permettant de réduire la douleur, la détresse et la souffrance potentielles, tout en garantissant la qualité pédagogique du TP.
Choix des espèces
Les espèces (Poissons laveur de vitre Ancistrus temmincki, Poisson Porte-épée Xiphophorus hellerii, Poisson guppy Poecilia reticulata ou Poisson Nigro Archocentrus nigrofasciata) ont été choisies en raison de leur statut d'espèces exotiques faisant l'objet d'actions de lutte par ailleurs. Nous veillerons à sélectionner des individus d’une taille minimale de 4 cm, afin de faciliter la réalisation du marquage. Le stade de développement n’est pas déterminant ; c’est principalement la taille qui constitue le critère de choix.
Formation réglementaire pratique aux gestes expérimentaux sur souris et rats
- Formation professionnelle
Rats : 95
Pour 75 à 95 % d'entre eux, ce sont des animaux dits de réforme, déjà présents dans l'établissement et n'ayant pas le génotype attendu par les projets qui les ont fait naître. 1 810 souris et 95 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à la fin de chaque session. Chaque animal vigile subit trois gestes au maximum, une administration, un prélèvement sanguin et un nouvel essai si le premier a échoué, dont un gavage classé douloureux de façon modérée. Le porteur admet que la maîtrise des gestes par des expérimentateurs néophytes est imparfaite et peut générer plus de stress et de douleur, et indique que les planches anatomiques, le puzzle 3D et la peluche utilisés en démonstration ne remplacent pas l'animal vigile.
Objectifs
Les personnels de la recherche amenés à concevoir ou à réaliser des procédures expérimentales impliquant des animaux utilisés à des fins scientifiques ont l’obligation réglementaire d’acquérir une formation spécifique en experimentation animale. Cette formation initiale à l’expérimentation animale vise à délivrer les connaissances réglementaires requises concernant l’expérimentation animale (niveau applicateur). Au cours de cette formation pratique réalisée sur souris et/ou rats, les participants se familiariseront aux gestes techniques réalisés sur animaux vigiles tels que la manipulation et la contention, le sexage, le prélèvement sanguin et l’administration de molécules par différentes voies. La formation du personnel est indispensable pour maîtriser les gestes techniques, éviter la souffrance animale, limiter le risque d'erreur dans les procédures et limiter le nombre d'animaux utilisés. Ainsi, une bonne maîtrise des gestes techniques participe au respect de la règle des 3R. (reduction, raffinement et remplacement)
Bénéfices attendus
Chaque participant recevra ainsi une formation pratique prenant en compte le respect du bien-être animal et la règle des 3R. La qualité de ces formations contribue ainsi à court terme à la maitrise des gestes techniques permettant d’obtenir à moyen terme des résultats scientifiques plus fiables et reproductibles tout en réduisant au maximum le stress et la souffrance des animaux et leur nombre.
Procédures
3 injections = 15s par injection douleur légère; 1 administration orale par gavage = 1 min douleur modérée; 1 prélèvement = 15s douleur légère. Un même animal vigile aura une combinaison maximale de 3 gestes (une administration et un prélèvement et un nouvel essai si l'un des gestes était non concluant)
Impact sur les animaux
La préhension et la contention des animaux peut induire un stress chez les animaux. Les administrations réalisées sur animaux vigiles peuvent induire un stress et une douleur de courte durée. Le prélèvement sanguin réalisé sur animal vigile peut induire un stress et une douleur légère de courte durée. S’agissant d’expérimentateurs néophytes, la maitrise des gestes techniques est imparfaite et peut générer plus de stress et de douleur qu’effectués par des expérimentateurs compétents et expérimentés.
Devenir
A chaque session de formation, l’intégralité des animaux seront mis à mort car il s'agit d'animaux issu d'élevage, n'ayant pas initialement le bon génotype d'intérêt.
Remplacement
Nous avons mis au point diverses méthodes au cours de notre formation pour remplacer l’animal. Ainsi, les travaux dirigés d’anatomie sont exclusivement réalisés à l’aide de planches anatomiques et d’un puzzle 3D inerte. Les méthodes d’identification par pose de bague auriculaire et emporte-pièce sont enseignées sur des morceaux de carton. Un mannequin ou une peluche sont utilisés pour les démonstrations de contention. Néanmoins, pour l’apprentissage des gestes de contention ou de techniques d’administration ou de prélèvements en situation réelle, les réactions comportementales de l’animal vigile ne peuvent être reproduites par des méthodes alternatives et nécessitent l’utilisation de modèles animaux.
Réduction
De notre expérience, 75 à 95% des animaux nécessaires à cette formation sont couverts par des animaux de réforme de l'établissement utilisateur accueillant cette formation (réutilisation des animaux n'ayant subi aucune autre procédure > classe légère). Seuls 5 à 25% maximum des animaux nécessaires à cette formation nécessiteront une provenance d’un fournisseur. Trois sessions par an de cette formation réglementaire seront réalisées.
Raffinement
Pour la séance de travaux pratiques, les animaux seront amenés dans leur cage d’hébergement dans la salle de travaux pratiques quelques heures avant le début de la séance pour habituation. Le stress des animaux sera réduit au maximum en commençant cette session pratique par une approche douce d’habituation aux animaux par des techniques de préhension douce permettant aux participants de maîtriser leur propre appréhension. Les participants seront en situation réelle sensibilisés à la détection et la prise en compte de tout signe de stress de l’animal. Les gestes techniques d’administration et de prélèvement ne seront réalisés par le participant que lorsqu’il maitrisera parfaitement la contention, celle-ci étant validée par l’encadrant. Le nombre de gestes techniques réalisé sur chaque animal est limité et chaque animal fait l’objet au maximum d’une administration et d’un prélèvement sanguin. L’encadrant veille tout au long de la séance de formation pratique au respect du bien-être animal et sensibilise en continu les participants au raffinement des techniques.
Choix des espèces
La formation étant spécialisée sur les rongeurs et les lagomorphes, des rongeurs (souris ou rats) mâles et femelles âgés de 8 semaines et plus seront utilisées dans ce projet.
Formation à la chirurgie de mise en place d’implants télémétriques factices et fonctionnels, à leur calibration et à la vérification de leur fonctionnement dans le cadre de l’installation d’une plateforme de télémétrie rongeurs
- Formation professionnelle
L'objet du projet est l'acquisition d'un geste chirurgical par un service qui veut ensuite le proposer en prestation aux équipes de recherche, et 40 souris y sont utilisées, toutes tuées. Quinze d'entre elles, prises parmi des productions surnuméraires et des reproducteurs réformés, sont opérées sous anesthésie pour la pose d'implants factices et tuées avant tout réveil. Les vingt-cinq autres reçoivent un implant fonctionnel lors d'une chirurgie de moins de quarante-cinq minutes, puis subissent trois tests métaboliques précédés chacun de cinq heures de jeûne, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avant d'être tuées pour que la pose soit vérifiée par autopsie. Le porteur présente la télémétrie implantée comme un gain pour le bien-être des animaux non-humains puisqu'elle évite les prélèvements sanguins répétés.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mettre en place une nouvelle technologie au sein de notre établissement. La technique sera apprise via une formation dispensée par le fournisseur de la technologie installée pour la pose d’implants télémétriques chez les rongeurs. Cette formation de 2 jours devra impérativement être complétée par un renforcement de l’apprentissage sur site de manière à être pleinement opérationnel et maitriser les gestes techniques complexes que nécessite cette approche technologique. Le but, maîtriser le geste au sein du service et pouvoir le mettre à disposition des usagers en tant que service d’accompagnement. Une étude pilote pour la validation de la chirurgie d’implantation, la maîtrise du geste et la réalisation de tests métaboliques permettront de s’assurer que l’ensemble des tests réalisés par la suite pourront être assuré par le service. La télémétrie interne implantable donne la possibilité de réaliser des études longitudinales sur animal conscient et non contraint, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisé, leur stress tout en participant au raffienement de leur bien-être. Il s’agit pour notre service de proposer une approche collaborative et de préstations aux équipes de recherche.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de proposer un service d’accompagnement aux utilisateurs sur le long terme. La mise en place de cette nouvelle technologie au sein du service favorisera l’amélioration du bien-être animal en réduisant le stress des animaux lié aux manipulations. En effet, elle permettra de collecter des données physiologiques, d'activité et de glycémie sur animal non contraint, libre de ses mouvements, maintenu dans sa cage et sans avoir à réaliser les prélèvements sanguins itératifs habituellement utilisés. Dans le cas de l’implant au glucose, les données seront collectées en continu par l’intermédiaire du capteur sur une durée de 6 semaines. Seul 1 prélèvement de sang à la queue réalisé 2 fois (à 2 et 4 semaines après la chirurgie) sur la période d'enregistrement est nécessaire afin d'assurer la recalibration du système. Ainsi, ce dispositif pourra être utilisé sur des modèles animaux (diabète, obésité ect.) qui seront utiles à la santé humaine. De plus une grande diversité d'implants télémétriques étant disponible, nous pourrons transposer la techniques à l'enregistrement d'un ensemble d'autres paramètres physiologiques (ECG, EMG, pression artérielle,...).
Procédures
Les animaux impliqués dans ce projet seront soumis à une chirurgie permettant la pose d'un implant permettant l'enregistrement de paramètres physiologiques en temps réel. Immédiatement après la chirurgie les animaux seront remis dans leur cage d'origine sans aucun changement et il nous sera alors possible d'acquérir en temps réel sans la moindre contrainte supplémentaire pour l'animal, des données physiologiques nécessitant habituellement des interventions directes et plus ou moins lourdes pour l'animal selon les paramètres mesurés. La chirurgie pour la mise en place de l'implant sera réalisée sous anesthésie gazeuse et sous couverture analgésique totale en pré, per et post-opération et durera moins de 45 minutes. Tous les animaux du projet seront soumis à cette procédure chirurgicale. Afin d'acquérir les gestes très précis et complexes que nécessite ce type d'expérimentation, un premier lot d'animaux sera implanté avec des implants factices (15 animaux au maximum) puis un fois le geste parfaitement maitrisé, un second lot dit "fonctionnel" comprenant 25 animaux maximum sera utilisé et implanté avec des implants fonctionnels. Ce lot sera séparé en sous-groupes de 5 animaux qui seront soumis à un test métabolique à 3 temps différents durant les 6 semaines d'activité de l'implant télémétrique. Pour ces tests métaboliques, une injection sera réalisée puis des prélèvements de sang (2 µL chacun) au bout de la queue seront pratiqués pour un volume total de moins de 30 µL par expérimentation. Ces prélèvements de sang permettront, par utilisation d'un lecteur de glycémie externe, de déterminer le taux de sucre sanguin et de le comparer à la valeur fournie par l'implant télémétrique. Les différents gestes réalisés en dehors de la pose de l'implant télémtrique auront des durées très courtes. Les injections par voie intrapéritonéales ou per os nécessiteront une contention d'environ 15 secondes durant laquelle l'injection sera réalisée sur une durée de moins de 5 secondes. Les prélèvements sanguins au bout de la queue se feront sur des animaux maintenus sur le fond de leur cage par la base de la queue pendant moins de 10 secondes juste pour limiter leur déplacement. Cette "préhension" permettra le prélèvement de la goutte de sang pour la mesure de la glycémie, ce prélèvement durera moins de 5 secondes. Enfin pour l'injection intraveineuse de glucose, celle-ci se fera sur animal sédaté à l'isoflurane afin de limiter le stress. La sédation durera moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une chirurgie pour la pose d’un implant de télémétrie. Les animaux peuvent alors ressentir de potentielles douleurs qui seront prises en charge par une couverture analgésique complète pré, per et jusqu’à 48h en post-opératoire. Pour valider la technologie et la fiabilité des dispositifs une fois implantés, les animaux seront soumis à un test métabolique en condition vigile dans le but de comparer les mesures obtenues par le capteur implanté à la réalité physiologique. Le test métabolique sera répété 3 fois durant les 6 semaines d’enregistrement du capteur. Pour ces tests, les animaux seront mis a jeun pendant 5 heures avant chaque test physiologique qui durera 3h. Une potentielle perte de poids consécutive à la mise à jeun peut être observée et sera surveillée de près. Afin de limiter cette possible difficulté, deux semaines de repos seront laissées entre chaque expérimentation. Le suivi de la glycémie sera réalisé durant ces tests par prélèvement d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue. Une potentielle douleur peut être ressentie lors du premier prélèvement, celle-ci sera couverte par un traitement analgésique réalisé 15 minutes avant l’acte. De plus, une asepsie de la queue sera réalisée avant le premier prélèvement et après le dernier afin de limiter le risque d’infection Enfin, pour limiter le stress que pourrait induire la contention nécessaire (moins de15 secondes) aux différentes injections, une habituation des animaux à l’expérimentateur et aux pièces d’expérimentation sera réalisée plusieurs semaines avant le début des procédures. Les injections en elles-mêmes ne généreront pas une douleur supérieure à celle causée par la piqure d’une aiguille.
Devenir
A l’issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de valider la pose de l’implant par autopsie.
Remplacement
L’utilisation de cadavres issus d'autres projets en fin de procédure permettra d’étudier en détail l’anatomie, offrant ainsi un environnement sécurisé pour se familiariser avec les repères physiologiques et anatomiques sans risque pour les animaux et les manipulateurs. Toutefois, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour valider la maîtrise des gestes et la technologie, mais aussi pour assurer un personnel qualifié et compétent permettant ainsi de veiller au bien-être des animaux. De plus, un projet collaboratif visant à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du diabète de type 2 et nécessitant cette technologie est déjà planifié, il est donc important de réaliser ces gestes en amont sur animaux vivants et ainsi se confronter aux conditions physiologiques associées à cette méthode. Aussi, la formation spécifique dispensée par la société ayant installé le dispositif réduira le nombre d’animaux nécessaire sur site, puisque ce projet constituera un renforcement de la qualification du personnel.
Réduction
Dans un premier temps l'emploi d'animaux morts issus d'autres projets et la formation spécifique dispensée en amont de la réalisation de ce projet nous permettront de rédurire le nombre d'animaux nécessaires à la mise en place de notre plateforme. Dans l’objectif de réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous avons divisé les animaux en deux lots dont le premier sera constitué d’animaux implantés avec un dispositif factice. Le nombre maximal sera de 15 animaux et seront issus de reproductions surnuméraires, d’ancien(-nes) reproducteurs(-trices) ou d’animaux présentants des critères non adaptés. Pour le second lot, des mesures métaboliques seront pratiquées sur les animaux implantés, avec maximum de 35 animaux. Dans les deux cas, si un nombre moins important d’animaux nous permettait de valider la technologie, le projet sera considéré comme terminé. Ce nombre n'a pas été déterminé par approche statistique dans la mesure où il s'agit de l'acquisition d'un geste.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront optimisées afin de réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle. Les animaux seront maintenus, au minimum, 3 par cage et maximum 5 pour éviter tout isolement social ou surpopulation. Tous les animaux bénéficieront d’un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum hormis durant les 9h de mise a jeun avant et pendant les tests métaboliques au cours desquelles seul l'accès à l'eau sera maintenu. Cette mise a jeun sera réalisée 1 fois toutes les 2 semaines sur 6 semaines donc 3 fois au total. Un suivi quotidien sera assuré, avant, pendant et après les manipulations, par le personnel soigneur et les responsables du projet. Lors de la réalisation des procédures, une surveillance clinique sera assurée par les manipulateurs. Si des signes de souffrance ou de stress, définis selon des critères préalablement établis, étaient constatés, le suivi des animaux serait renforcé. Parmi ceci, plusieurs signes indicatifs seront observés : comportement de l’animal (absence de toilettage, vocalisations, stéréotypies, léchage, automutilation, prostration, létargie, isolement …), apparence générale (état du poil, position des oreilles, gonflement des yeux, position des moustaches), variation du poids, plaies ou cicatrisation difficile. En cas d'apparition d'un de ces signes une prise ne charge médicamenteuse sera faite par utilisation d'anti-inflammatoires et d'analgésiques adaptés. La procédure de chirurgie, susceptible d’entraîner une douleur, sera réalisée sous anesthésie, avec une prise en charge de la douleur avant pendant et après la procédure par utilisation d'analgésiques spécifiques à chacun des gestes. Pour favoriser la récupération des animaux 2 semaines de repos minimum leur seront laissées entre chaque expérimentation. La prise en charge d’une potentielle douleur et/ou infection lors du prélèvement de gouttes de sang au niveau caudal sera assurée par une injection d’analgésiques 15 minutes avant et l’application d'un antiseptique et antimycosique avant et après le prélèvement. Pour limiter le stress lié à la contention durant les expérimentations une habituation à la salle d’expérimentation et à l’expérimentateur sera systématiquement réalisée en amont.
Choix des espèces
Les équipes utilisatrices du service de ressources biologique utilisent principalement des souris pour leurs études. L’objectif de ce projet étant de développer une plateforme de télémétrie rongeurs, dans la continuité d’une formation pratique dispensée sur modèle rongeur par un prestataire externe, le modèle souris sera alors utilisé et préféré au modèle rat. Les souris seront utilisées à des stades adultes, à partir de 8 semaines, toutefois l’âge des animaux n’impactera que peu le projet et il pourra ainsi être étendu de quelques semaines en fonction des animaux disponibles. Le sexe des animaux n'ayant pas d’incidence sur les procédures prévues, les animaux utilisés proviendront de fins de procédure d'élevage, de productions surnuméraires ou à critères non-adaptés, garantissant ainsi une sélection sans critère de sexe des animaux pour ce projet.
Evaluation précoce de la toxicité de produits futurs candidats médicaments après administration intrathécale
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 2200
2 650 rats et souris vont être utilisés, dont 2 500 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour examen des organes. Une chirurgie de trente minutes leur pose un cathéter dans l'espace qui entoure la moelle épinière, puis les composés y sont injectés jusqu'à trois fois par semaine pendant deux semaines, avec jusqu'à neuf prélèvements sanguins en vingt-quatre heures et un jeûne de seize heures avant la mise à mort chez le rat. Le porteur estime qu'un quart des animaux, ceux qui reçoivent la dose forte, présenteront des signes modérés et exceptionnellement sévères, parmi lesquels stéréotypies, agressivité, tremblements et perte de plus de 20 % du poids. L'objet du projet est d'écarter tôt les molécules toxiques pour éviter des études réglementaires qu'il décrit comme coûteuses "d'un point de vue éthique, en animaux, et économique".
Objectifs
Le projet a pour objectif : • d’étudier les effets liés à l’administration par voie intrathécale d ‘une molécule d’intérêt. L'injection intrathécale est une injection dans l'espace sous-arachnoïdien. L'espace sous-arachnoïdien constitue le canal rachidien et contient le liquide cérébrospinal (LCS). Cela permet d'administrer le médicament dans le LCS. L'administration peut se faire à l'aide d'une aiguille à ponction lombaire ou avec un catheter implanté au cours d'une intervention chirurgicale Ces effets pourront être reliés à la concentration du candidat médicament administré grâce à des données d’exposition générées • de déterminer, dans le cas de toxicité, des biomarqueurs pertinents qui pourront être par la suite étudiés chez l’homme. •de caractériser éventuellement des populations répondeuses ou non à la molécule d’intérêt en analysant les échantillons biologiques obtenus dans le Projet, à l'aide de méthodes d’analyses ex vivo de biologie moléculaire, génomique, protéomique ou métabolomique.
Bénéfices attendus
Le projet vise à détecter très tôt dans le développement d’un candidat-médicament les effets de toxicité du composé- test afin d’arrêter son développement avant même les études de toxicologie règlementaires coûteuses d’un point de vue éthique, en animaux, et économique. Le projet contribue à mettre sur le marché des médicaments sûrs et sécurisés chez l'homme pour des maladies dont les besoins thérapeutiques sont non satisfaits à ce jour dans le domaine du système nerveux. Pour cibler une indication du système nerveux central, certaines molécules ne peuvent pas traverser la barrière hémato-encéphalique lorsqu’elles sont administrées par voie systémique dû, entre autres, à leur taille moléculaire et leur charge ionique négative. Elles doivent alors être administrées localement par voie intrathécale dans le liquide cérébrospinal. Cette voie d’administration est aussi celle utilisées chez l’homme et permet une distribution ciblée de la molécule dans le système nerveux central, ce qui est crucial pour traiter des maladies neurologiques.
Procédures
Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Pose d’un cathéter intrathécal par chirurgie : durée 30 minutes. • Administrations des composés à potentiel thérapeutique : durée quelque secondes sur animaux anesthésiés si administration transcutanée et sur animaux vigiles si animaux porteurs d’un cathéter. Unique ou répétée max 4 fois à un intervalle d’une semaine si administration transcutanée ou 3 fois maximum par semaine pendant 2 semaines avec cathéter. • Anesthésie et analgésie pour des administrations intrathécale : durée de 5 minutes, maximum 4 fois à un intervalle d’une semaine. • Prélèvements de sang : o en microsampling : Durée 60 secondes sur animal vigile. Maximum 9 fois sur 24h. oprélèvement terminal en fin d'étude sous aneesthésie profonde : Durée 1 minute sous anesthésie générale. • Hébergement individuel: o Cage individuelle avec enrichissement complet (litière, matériel de nidification et stick de bois) avec maintien du contact olfactif et visuel. Durée de l’hébergement individuel maximal de 24h. • Préhension douce lors des observations générales et neurologiques : durée 1 minute sur animal vigile, 6 fois maximum par jour. • Test de coordination motrice : 6 sessions d’une durée de 5 minute maximum sur animal vigile, avec une récupération de 15 minutes entre chaque session. •Mise à jeun d‘une durée maximale de 16h chez le rat préalablement à la procédure terminale de l’étude en vu des prélèvements nécessaires.
Impact sur les animaux
L'exposition des animaux à des possibles doses toxiques ou de doses maximales tolérées de composés à tester peuvent provoquer des effets indésirables. Ces effets seront très limités dans le temps par la mise en place de critères d'arrêt anticipés et de suivi très rigoureux des animaux. Les animaux peuvent manifester des signes cliniques légers à modérés généralement et exceptionnellement sévères si la produit s’avère toxique :changements de comportements comme l’apparition de stéréotypie et/ou d’agressivité, barbering, hypomotilité, négligence du toilettage, posture analgésique, baisse de la prise alimentaire ou hydrique, dégradation de l’état général comme l’apparition d’une prostration, modifications de la fréquence respiratoire, manifestation de signes d’origine neurologique comme des tremblements et/ou des contractions, selles diarrhéiques ou perte majeure du poids corporel (
Devenir
Pour l’ensemble des 3 procédure décrites ci-dessus, les animaux sont tous mis à mort en fin de procédure. Pour les besoins de l’évaluation de la tolérance des composés testés, les organes doivent être observés et des analyses tissulaires réalisées qui nécessitent la mise à mort des animaux en fin d'étude.
Remplacement
De nombreux tests in silico (simulations effectuées utilisant des modèles numériques) ou in vitro de toxicité ont déjà été mis en œuvre pour remplacer le recours aux animaux. Les tests actuellement disponibles ne permettent pas encore de répondre à tous les besoins pour écarter la toxicité des molécules en cours de développement. Il n'existe pas de tests englobant l'ensemble des systèmes biologiques d'un animal qui puissent développer des effets secondaires ou toxiques après administration unique ou répétée d'un composé test.
Réduction
Les molécules d’intérêt auront préalablement fait l’objet de test sur des batteries de test in silico et in vitro permettant de ne sélectionner que les candidat médicament les plus prometteurs afin de réduire au maximum la phase vivo du développement. Pour les molécules qui sont développées en phase vivo, le nombre d'animaux est déterminé pour répondre à la question scientifique tout en réduisant au maximum celui-ci. Le nombre d’animaux s’appuie sur des recommandations internationales dans le domaine de la toxicologie et des publications scientifiques. Le nombre minimal par cohorte est réduit au minimum scientifique de 3 pour sélectionner de candidate en phase pré-clinique et cela pourra aller à 8 animaux maximum pour répondre scientifiquement à l’objectif de l’étude si des analyses supplémentaires sont à prévoir ou une variabilité forte est attendu sur le modèle. Les recommandations de l’agence européenne des médicaments demandent également à réduire autant que possible le nombre d’animaux, notamment en évitant d’ajouter des groupes contrôles ou véhicule quand cela est possible, notamment lorsqu’il existe des données déjà publiées ou historiques. Le nombre d’études sur les 5 prochaines années pour ce projet a été déterminé à partir des données historiques et de l‘évolution de la recherche sur certaines modalités utilisées dans le système nerveau centrale. Au total ce projet pourrait utiliser 2650 animaux sur 5 ans. Les données expérimentales sont analysées avec des tests statistiques adaptés. Dans le cadre de la réduction du nombre d’animaux, lors d’administration de fortes doses, un ou deux animaux de la cohorte sont traités afin d’évaluer la tolérance au produit à fortes doses. En cas de signes cliniques majeurs sur ces animaux, le reste de la cohorte ne sera pas traité aux fortes doses. Par ailleurs, les fortes doses lors d’études type Dose Répétée ou Dose Maximale Tolérée après des administrations répétées ou une seule administration, seront administrées, autant que possible, lorsque la certitude d’absence d’effets secondaires sera observée sur les doses inférieures.
Raffinement
L'ensemble des procédures contraignantes jugées douloureuses pour les animaux sont faites sous anesthésie générale par inhalation ou par injection de composés à propriétés anesthésiantes. Les étapes de contention vigiles sont limitées et la durée est inférieur à 5 minutes. L'hébergement individuel est nécessaire après chirurgie pour suivi (maximum 24h). L'hébergement individuel peut survenir pour des raisons vétérinaires. Dans tous les cas, des contacts olfactifs, auditifs et visuels entre congénères seront maintenus ; de plus, un surenrichissement (plus de quantité de litière, tunnel, matériel de nidation) dans le micro-environnement est prévu. Les observations des animaux sont renforcées tout au long de cette période d'hébergement individuel. Lors d'une procédure, l'observation quotidienne des animaux par le personnel dûment formé permet de détecter toute anomalie. Des critères d’alarme et/ou d’interruption ainsi qu’un arbre décisionnel d’arrêt ayant été définis et diffusés à tous les intervenants, l’apparition de trois signes cliniques notables ou d’un signe clinique sévère font l’objet d’une évaluation par le responsable de la mise en œuvre du projet en collaboration avec le vétérinaire clinicien. Les animaux sont manipulés avec des méthodes douces de contention type soft handling pour toutes les manipulations du projet.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est défini par les lignes directrices internationales et sur des bases scientifiques telles que la cible thérapeutique visée, le(s) véhicule(s) envisagé(s) et les données disponibles de pharmacocinétique, de métabolisme et de toxicologie in vitro. Le stade adulte est celui utilisé afin de disposer d’animaux dont les systèmes biologiques sont matures. Exceptionnellement, des animaux juvéniles (de 3 semaines d’âge minimale) pourraient être utilisés si un impact sur le développement de l’animal doit être évalué ou si la population finale humaine pour laquelle la molécule va être utilisée est une population juvénile.
Diplôme Universitaire de Microchirurgie: apprentissage de microsutures vasculaires et nerveuses chez le rat
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Un diplôme universitaire de microchirurgie mobilise 1 380 rats adultes, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Chaque étudiant reçoit un animal par séance et pratique sur lui deux interventions, une suture de l'aorte abdominale et une suture du nerf sciatique, la séance durant trois heures anesthésie et mise à mort comprises. L'objet déclaré est l'apprentissage du geste et du stress opératoire par des étudiants chirurgiens ou vétérinaires. Le porteur indique que les étudiants s'exercent d'abord sur des nouilles japonaises puis sur des pattes de poulet, avant d'affirmer que la pratique sur le vivant est "indispensable" avant le passage à l'homme.
Objectifs
L’objectif de la formation est de permettre l’apprentissage de la microchirurgie en condition opératoire avant l’application chez l’homme. Le but étant d’apprendre à des étudiants chirurgiens ou vétérinaires en formation à réaliser des sutures vasculaires (entre deux bouts d'un vaisseau) et des sutures nerveuses (fragments de nerfs sciatiques). L'apprentissage se déroulera sous forme de travaux pratiques (TP).
Bénéfices attendus
Les étudiants inscrits à ce diplome apprennent des techniques de Microchirurgie qui sont essentielles pour leurs cursus de futurs Chrirugiens
Procédures
Les animaux auront deux interventions chirurgicales, une sur l'aorte abdominale et la deuxième, sur le nerf sciatique. La durée des travaux pratiques sur chaque animal est de 3 heures (anesthésie, rasage, installation du poste de travail, intervention de l’animal, euthanasie, et rangement du poste de travail).
Impact sur les animaux
lIl n'y a pas de réveil de l'animal, ni de test statistique de prévu.
Devenir
Les animaux de ces travaux pratiques ne peuvent être réveillés, ils seront euthanasiés en fin de ces séances.
Remplacement
Après un entrainement technique : au maniement du microscope, des instruments chirurgicaux et de premières sutures sur des nouilles japonaises ainsi que sur des pattes de poulet, la réalisation d’actes techniques sur le vivant est indispensable à la maitrise du geste chirurgical et du stress opératoire (saignement par exemple) avant le passage à l’homme.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés pendant l’année scolaire, la première séance consistera en une vidéo commentée de l’enseignant chirurgien référent qui expliquera notamment les gestes à acquérir pour suturer un vaisseau, un nerf ainsi que de montrer les techniques permettant l’absence de tout germe infectieux. Des nouilles japonaises seront utilisées les deux premières séances des travaux pratiques ; puis des pattes de poulet les séances d’après. Enfin, toujours dans un objectif de réduction, lors de chaque séance, l’étudiant se verra attribuer un seul animal sur lequel sera réalisé l’anastomose vasculaire et nerveuse.
Raffinement
Le jour de la séance, une prémédication se fera 45 minutes avant l’acte chirurgical, afin d'assurer une couverture antalgique. Une analgésie locale sera également réalisée sur la partie abdominale de l’animal ainsi que sur la cuisse.
Choix des espèces
Le rat est un bon modèle pour l’entrainement chirurgical puisque la taille de l’aorte (artère) est très proche des vaisseaux à suturer chez l’homme. Pour cela, des rats adultes de 300g sont nécessaires pour une taille suffisante des organes à suturer.
Culture d’hépatocytes primaires murins : Formation des agents et application expérimentale
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
200 souris vont être utilisées, anesthésiées puis ouvertes au niveau de l'abdomen et tuées avant tout réveil. Une injection intrapéritonéale précède l'endormissement, la paroi abdominale est ouverte et la veine cave perfusée pour récupérer les hépatocytes. Vingt souris sont utilisées pour former le personnel de l'animalerie au geste, les autres sont tuées pour prélever des cellules, à raison de trois par mois pendant cinq ans. Le porteur présente ce projet comme un moyen de réduire à terme l'expérimentation animale grâce aux organes sur puce, tout en affirmant que la souris est le "seul modèle utilisable" puisque les cellules de foie humaines sont difficiles à obtenir et varient d'un donneur à l'autre.
Objectifs
Dans l’idée de reconstituer in vitro des organes-sur-puce, nous aurons besoin de cellules provenant de foie de souris (hépatocytes primaires) car les lignées cellulaires de cellules du foie existantes reproduisent mal les caractéristiques de ces cellules primaires. Nous avons donc besoin de pouvoir obtenir des hépatocytes de la souris. Le but du projet est de former le personnel de l’animalerie pour installer la technique de récupération de ces hépatocytes primaires de souris pour ensuite les utiliser pour nos besoins expérimentaux pour le développement de multiorganes-sur-puces in vitro reproduisant les interactions inter organes dans le corps entier et permettra par la suite de réduire l’expérimentation animale pour l’étude des communications inter-organes car les cellules d’une souris permettent de construire plusieurs organes-sur-puces.
Bénéfices attendus
Deux bénéfices sont attendus : Installation de la technique d’isolement des hépatocytes de souris . Développement d’un multiorgane-sur-puce pour la diabétologie
Procédures
Aucune expérimentation ne se fera sur animal vigile, les nuisances pour les animaux dans ce projet seront les injections intrapéritonéales qui seront suivie d’une chirurgie sans réveil, le temps d’endormissement sera de 5 à 10 min (vérifié par pincement de la patte, et réadministration d’anesthésique si réaction), l’ouverture de la paroi abdominale jusqu’à la perfusion de la veine cave durera 1 à 2 min maximum, au moment de la section de la veine porte, la souris ne sera plus vivante : arrêt de la circulation sanguine.
Impact sur les animaux
Aucune nuisances ou effets indésirables ne sont attendus du vivant de l’animal qui sera hébergé dans des conditions habituelles à 5 animaux par cage, la procédure effectuée sur ces animaux sera sans réveil (après analgésie et anesthésie profonde).
Devenir
Procédure terminale sans réveil.
Remplacement
Les lignées cellulaires de foie reproduisent mal les caractéristiques fonctionnelles des cellules natives. Les cellules de foie humaines sont difficiles à obtenir, ont une très grande variabilité inter-donneurs, et ne permettent pas d’investiguer des modèles transgéniques. Les souris sont donc le seul modèle utilisable dans ce projet. Nous aurons un besoin régulier en cellules de foie natives de souris (3 par mois maximum), les cultures ayant une durée de vie autour de 4 jours.
Réduction
S’agissant ici d’une procédure pour formation de personnel dans le but d’obtenir ensuite des cellules de foie primaires sur 5 ans, le nombre minimum de souris pour permettre aux agents de se former a été estimé à 20 (comprenant le nombre de souris utilisées par le formateur ainsi que les nouveaux-formés). Le reste des animaux servira à nous fournir ensuite en cellules (3 fois par mois maximum) pour nos besoins expérimentaux sur la durée du projet. Ce projet permettra in fine d'utiliser moins d'animaux en expérimentation car une souris peut fournir assez de cellules de foie pour environ 5 organes-sur-puces. Les organes-sur-puce comme ceux développés dans ce projet permettront, à terme, de répondre à un plus grand nombre de questions scientifique du fait de l'environnement contrôlé de la culture primaire en évitant les facteurs confondants et les compensations qui existent in vivo. Bien évidemment, nous utiliserons strictement le nombre d’animaux nécessaire dans un souci de « réduction » et le développement du modèle 4-organes-sur-puce pourrait prendre moins de 5 ans et utiliser moins d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront regroupés à 5 animaux par cage pour éviter les effets délétères de l’isolement de ces animaux. Leur habitat sera enrichi par des dômes, tunnel, morceau de bois, maison rouge, coton de nidification. Un suivi quotidien des animaux sera effectué par le personnel de l'animalerie. Lors de l’utilisation des animaux pour récupérer les cellules du foie, une solution d’analgésique leur sera administrée 30min avant l’anesthésie. La profondeur de l’anesthésie sera mesurée par vérification des paramètres et constantes de suivi de la narcose chez le rongeur.
Choix des espèces
La souris est le meilleur modèle animal car c’est un mammifère relativement proche phylogénétiquement et physiologiquement de l’Homme qui permet l’accès à un maximum de modèles transgénique par la suite lorsque le multiorgane-sur-puce sera mis au point. Les cellules primaires de foie seront récupérées sur souris C57BL/6J mâles et femelles de 6 à 15 semaines.