Tests réglementaires

Une perte de poids de 15 % ou l'apparition de difficultés respiratoires déclenchent la mise à mort immédiate. 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous la peau, huit prises de sang à la veine submandibulaire, deux à dix administrations nasales du vaccin sans anesthésie, puis une inoculation du virus par le nez, le porteur indiquant que l'infection provoque une léthargie et des difficultés respiratoires pouvant entraîner la mort huit jours plus tard. L'enjeu déclaré est d'appuyer une demande d'essai clinique pour un candidat vaccin contre les symptômes du covid long, déjà évalué chez l'humain en prophylaxie.

Objectifs

Le COVID-19, causé par le virus SARS-CoV-2, a affecté des millions de personnes dans le monde, entraînant non seulement des problèmes respiratoires mais aussi des symptômes neurologiques graves, y compris des atteintes cérébrales. Des recherches récentes ont montré que ces complications persistent chez certains patients, formant ce qu'on appelle le 'covid-long'. La vaccination a démontré son efficacité à la fois dans la prévention et le traitement du covid-long. Nous proposons d'évaluer le potentiel thérapeutique de notre vaccin dans un modèle murin, qui reproduisent les symptômes du covid-long, y compris les atteintes cérébrales. Ce modèle animal nous permettra d'étudier comment notre vaccin peut moduler les symptômes persistants du COVID-19, en particulier ceux affectant le système nerveux central. Ce vaccin, conçu pour cibler plusieurs variants du virus, pourrait offrir des perspectives prometteuses pour le traitement de ces formes graves de la maladie.

Bénéfices attendus

Les resultats de ce projet feraient l’objet d’une publication scientifique mais pourraient également servir de données preclinique à une demande d’essais clinique thérapeutique chez l’homme pour le traitement des symptomes liés au covid-long avec le candidat vaccin LVT-001 qui sera déjà évalué en clinque fin 2024 en prophylactique.

Procédures

Tous les animaux, soit 96 souris. Des puces d’identification dorsales en voie sous-cutanée (12 minutes par animal, 1 fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire (5 minutes par animal, 8 fois soit une fois par semaine). Inoculation du vaccin par voie nasale sans anesthésie générale. (10 minutes par animal, entre 2 à 10 fois selon les lots). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale (10 min par animal, 1 fois). Prélèvement d'urine (20 seconde maximum par animal, 1 fois).

Impact sur les animaux

Pour le challenge viral par voie nasale, une perte de poids moyen de 15% est observée en premier lieu entre 3 et 5 jours post infection et suivie très rapidement par une léthargie, des difficultés respiratoires pouvant entrainer la mort 8 jours post infection. Pour éviter toute souffrance aux animaux, une perte de poids moyen de 15% et/ou l’apparition de difficultés respiratoires entrainera la mise à mort sans délai. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. MODIFICATION : Les administrations en voie SOUS-CUTANEE pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection ET SONT MOINS NOCIVE QUE LA VOIE INTRAPERITONEALE, TOUT EN MAINTENANT UNE EFFICACITE COMPARABLE. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations de la puce télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, cerveau, tête, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pour le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique, déjà éprouvé notamment pour l’étude de la réponse immunitaire humorale et cellulaire. Ce nombre d’animaux repose également sur notre experience precedente d’utilisation du même modèle animal dans le cadre d’essais de protection prophylactique avec le même candidat vaccin.

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, avant infection, en animalerie sur des portoirs ventilés puis en isolateur après infection expérimentale (environnement confiné). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Des critères d’arrêt sont prévus dans le projet afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Après chaque prise de sang et chaque instillation nasale sur animaux vigiles, une récompense positive alimentaire de type bouchée fruitée ou rondelle de banane séchée ou popcorn ou graines de tournesol sera réalisée.

Choix des espèces

Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par la vaccination post-infection dans l’étude du covid long. Le modèle murin est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux Covid. Il a été récemment étendu à l’étude des symptômes et pathologies liées au Covid long avec notamment sa propension à reproduire l’infection du SNC par le virus. Ainsi ce modèle est le plus relevant pour l’étude de thérapie contre le covid long. Adulte et immunocompétent : afin d’être représentatif en préclinique de la cible clinique du protocole, le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents.

Une injection ou une implantation de biothérapie à J0, puis une mise à mort programmée à J2, J14, J90 ou J120 pour examiner les organes: le protocole tient en peu de gestes. 4 080 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour l'analyse anatomopathologique. Le projet a pour objet d'évaluer la toxicité de ces produits, et le porteur écrit dans le même document qu'aucun effet indésirable n'est attendu à la suite du traitement. Présenté comme un projet générique sur cinq ans, il déclare un effectif dont le porteur indique lui-même qu'il représentera "une capacité bien inférieure" à ce qui est demandé.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer la toxicité de nouvelles biothérapies. L’évaluation de la toxicité de ces biothérapies chez le petit animal est un pré-requis pour obtenir l’autorisation d’utiliser ces médicaments innovants en essai clinique chez l’homme. Les animaux seront euthanasiés à différents temps après injection (J2, J14, J90 et J120) pour évaluer une toxicité aigüe, subaiguë, subchronique et la formation de tumeurs. Il s’agit d’un projet générique présenté pour une durée de 5 ans, faisant intervenir différents types de biothérapies en essayant d’anticiper les besoins. Les lots d’animaux envisagés correspondent à différents cas de figure et représenteront en réalité une capacité bien inférieure à ce qui est indiqué dans cette saisine.

Bénéfices attendus

Avant de proposer une nouvelle biothérapie chez l’homme, il est nécessaire de démontrer son innocuité chez le petit animal. Pour cela, une analyse systématique de différents organes doit être réalisée pour identifier d’éventuelles lésions associées au traitement. Ces études sont requises pour obtenir les autorisations des instances réglementaires pour la mise en place d’essais cliniques chez l’homme

Procédures

Pour mener ce projet, les souris recevront la biothérapie par injection ou implantation. Une seule injection sera réalisée à J0 sur les animaux vigiles ou anesthésiés.

Impact sur les animaux

• L’ensemble des animaux en expérimentation seront observés quotidiennement et les signes de souffrance (perte excessive de poids, hyperactivité ou au contraire isolement, hérissement des poils, dos voûté) seront recherchés. Si un animal présente un des signes de souffrance décrits précédemment, il sera euthanasié. • Injection des traitements : Douleur légère au site d’injection, courte durée attendue. Pas d’effet thérapeutique ou indésirable attendus à la suite de l’utilisation de ce traitement.

Devenir

À la fin de l’étude, les souris seront euthanasiées. Cela est nécessaire pour permettre de récupérer les organes et réaliser l’analyse anatomopathologique des différents organes de la souris et observer une éventuelle toxicité des traitements

Remplacement

Avant de proposer une biothérapie chez l’Homme, il est important de démontrer l’innocuité de ce traitement dans un modèle pré-clinique pertinent. A ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro permettant de vérifier la toxicité d’un traitement sur l’ensemble des organes d’un organisme. Il n’est pas possible de prévoir une méthode substitutive pour répondre à la question scientifique de ce projet.

Réduction

Nous nous sommes basés sur les étude de toxicité réalisées précédemment au laboratoire et les recommandations des instances réglementaires d’évaluation des essais cliniques pour proposer des groupes de 10 souris avec une égalité entre le nombre de mâles et de femelles.

Raffinement

Surveillance liée aux procédures : Les souris seront observées quotidiennement pour surveiller l’apparition potentielle de lésions et de signes d’infection. Les signes de souffrances seront activement recherchés de manière hebdomadaire et la douleur sera évaluée en utilisant la grille d’évaluation proposée par l’animalerie. La mesure du poids sera réalisée une fois par semaine. Mesures correctrices : • Antalgie : Injection sous cutanées d’antalgique 1fois/jour jusqu’à amélioration des symptômes. • Support nutritif : Mise à disposition dans la litière de la cage de croquettes humidifiées.

Choix des espèces

Ces expériences sont réalisées chez la souris immunodéficiente car les tests de toxicité doivent être réalisés dans une espèce animale chez laquelle le produit testé est biologiquement actif. La souche a été choisie pour permettre l’injection de biohérapies d'origine humaine en évitant une réponse immunitaire et leur rejet. Les animaux sont utilisés à semaine 12, âge de maturité des animaux.

Des cellules tumorales sont injectées dans le ventre de souris femelles pour qu'elles y produisent un liquide d'ascite, récolté sur leur cadavre et versé tel quel dans des réactifs de tests de diagnostic de la toxoplasmose et de la rubéole. 3 000 souris vont être utilisées sur deux ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur abdomen gonfle pendant les deux semaines d'incubation, et le porteur présente comme un raffinement l'absence d'injection préalable d'huile minérale. Il indique que la lignée cellulaire ne survit pas à la congélation, ce qui la maintient conservée dans le corps de souris vivantes, et que des essais de substitution sont "en cours d'étude".

Objectifs

La production de ce liquide d'ascite (produit dérivé) entre dans la formulation de tests de diagnostics de maladies infectieuses tel que la recherche de Toxoplasmose et de Rubéole. Il est utilisé dans son entièreté sans purification préalable et amène une stabilité aux tests.

Bénéfices attendus

Cette ascite issue de la multiplication de la cellule TG 180 est utilisée directement dans nos diluants, sans étape de purification préalable et a un rôle de stabilisant et de ballast. Cela améliore ainsi la spécificité et la stabilité des tests de diagnostics de maladies infectieuses.

Procédures

Selon le protocole chaque souris recevra 1 seule injection de cellules sans injection préalable d'un activateur du système immunitaire. Cette injection dure quelques secondes. L'incubation dure 2 semaines maximum. Durant cette phase de developpement de la cellule, un suivi quotidien est réalisé (à l'aide d'une grille d'évaluation de la douleur afin de d'avoir une objectivité sur l'apparition d'éventuels points limite). La récolte de l'ascite est réalisée stérilement sur les animaux préalablement euthanasiés.

Impact sur les animaux

La multiplication des hybridomes dans le péritoine de la souris induit une production d'ascite. Cela engendre un gonflement de l'abdomen de l'animal. Ce gonflement de l'abdomen fait l'objet d'une surveillance quotidienne. Cependant pour ce protocole, il n'y a pas de phase d'amorce intra péritonéale (pas d'injection d'adjuvant de type huile minérale). Cette absence de phase réduit considérablement la sévérité du protocole.

Devenir

Les animaux dédiés ne sont utilisés que pour ce protocole. A la fin de celui-ci, le liquide d'ascite est récolté post mortem.

Remplacement

La cellule permettant la production de cette ascite est à ce jour conservée in vivo uniquement et il n'y a pas à ce jour d'alternative fiable utilisable en routine pour remplacer cette cellule en l'état, car une perte de viabilité de la cellule très importante est constatée lors des cycles congélation/décongélation. Cela empêche donc la conservation de la cellule en in vitro. Cependant des essais de faisabilité du retrait ou de la substitution de cette ascite sont en cours d’étude.

Réduction

La quantité d'animaux nécessaire est déterminée sur la base de prévisions de fabrication des tests utilisant l'ascite. Afin de réduire l'utilisation de cette ascite, la totalité des cas d'emplois à été répertorié. Chaque cas d'emploi a été analysé afin d'identifier la possibilité d'un retrait ou de substitution de l'utilisation de cette ascite. La réduction de certains cas d'emploi est déjà acquise (arrêt produits et arrêt d'un cas d'emploi). Pour les autres références la faisabilité est en cours d'analyse en travaillant prioritairement sur les plus gros consommateurs de liquide d'ascite. Le développement des nouvelles références se fait systématiquement sans usage de liquide ascite. Développement en cours d'un lignée cellulaire stabilisée congelée afin d'essayer de substituer le mode de conservation in vivo actuel.

Raffinement

Le raffinement sera obtenu par l'application de la recommandation de CNREEA (parue le 28 juin 2017) sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris, cependant, le protocole ne nécessite pas d'amorce intrapéritonéale (pas d'injection de pristane) et cela fait diminuer considérablement la sévérité du protocole. De plus, les animaux sont manipulés par du personnel habilité et sensibilisé au bien-être de l'animal. La mise en place de grilles d'évaluations de la douleur à chaque étape du protocole permet au technicien d'être le plus objectif possible sur l'attitude à adopter face à différents symptômes que l'animal pourrait développer. Les animaux sont en hébergés en cages équipées d'enrichissement de type "maison".

Choix des espèces

Le modèle souris est utilisé du fait de l'origine des cellules à multiplier Pour ce protocole, nous utilisons des animaux adultes âgées à minima de 8 semaines. Il est possible également d'utiliser des femelles dites réformées sans impact sur la production de cette ascite. Le choix d’utilisé des femelles âgé de 8 semaines ou plus est selon la disponibilité d’animaux chez le fournisseur. A ce stade, les animaux sont assez matures et robustes pour supporter l'unique injection de cellules sans mortalité en cours d'expérimentation.

La moitié des animaux repart vers d'autres études et l'autre moitié est tuée pour que les tissus au contact du dispositif implanté soient examinés au microscope. 200 porcs, 200 chiens, 200 lapins et 200 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections le plus souvent sans anesthésie, se font implanter sous la peau des dispositifs comme une pompe à insuline lors d'une opération d'environ trente minutes, et portent parfois un cathéter permanent pour les prélèvements sanguins répétés, avec des risques de douleur post-opératoire de trois à cinq jours, d'infection, d'hématome et d'hypoglycémie. Le porteur écrit que l'utilisation d'animaux est "requise par la réglementation" et qu'aucune méthode ne permet aujourd'hui de se passer d'un "organisme entier" pour suivre l'élimination d'un produit.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer la façon dont des molécules (l’insuline par exemple dans des cas de traitement du diabète) agissent sur le corps et en combien de temps ces molécules sont éliminées par le corps. De plus, certains composants doivent être implantés sous la peau (par exemple : pompe à insuline). Dans cas-là, une analyse au niveau des tissus est réalisée, pour savoir comment les tissus réagissent en contact de ce composant qui a été implanté sous la peau.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux des données de pharmacocinétique (devenir du produit dans l’organisme) et pharmacodynamie (action du produit sur l’organisme) des produits de santé. Ces études permettront le développement de nouveaux traitements et d’améliorer le confort des patients par optimisation des modalités d’administration des traitements. Ainsi, il est possible d'analyser ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché.

Procédures

Les animaux seront mis en contact avec la molécule à tester par injection. Ces injections durent quelques secondes et sont faites sur animaux non-anesthésiés la plupart du temps ou sur animal anesthésié dans le cas d’injection d’un produit visqueux par exemple. De plus une implantation sous la peau peut être réalisée pour certains type de dispositifs (environ 30 minutes -pompe à insuline par exemple). Une fois la molécule mise en contact avec l’animal, des prélèvements sanguins seront réalisées afin de pouvoir évaluer la présence de la molécule dans le sang. Un cathéter permanent ou temporaire pourra être mis en place en cas de prélèvements répétés. Tout au long des périodes de prélèvement, les animaux sont observés afin de détecter les points limites précoces. A la fin des prélèvements les animaux sont soit gardés en vie, soit mis à mort afin de réaliser une analyse sur les tissus qui étaient en contact avec le dispositif afin de voir si ce dernier est bien toléré dans le corps.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - douleur et stress liés à la chirurgie (maximum 3 à 5 jours (le plus souvent 1 à 2 jours)). (Implantation de cathéters ou implantation/injection du produit à tester) - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant maximum 3 à 5 jours (le plus souvent 1 à 2 jours). (nuisance légère) - risque infectieux lié à la chirurgie, dans la semaine qui suit l’implantation des cathéters. - hématome ou œdème au niveau du site opératoire/de prélèvement dans la semaine qui suit l’implantation des cathéters. - Nuisance en cas d’effet secondaire du produit à tester (par exemple : risque d’hypoglycémie après injection d’insuline) pendant quelques heures après injection du produit.

Devenir

Les animaux n’ayant pas d’évaluation de la tolérance du tissu dans le corps pourront être ré-utilisés. Les animaux pour lesquels une évaluation de la tolérance doit être effectué seront mis à mort, car cette analyse est une analyse post-mortem avec analyse histologique des tissus.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est requise par la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer de pharmacocinétique (devenir du produit dans l’organisme) et pharmacodynamie (action du produit sur l’organisme) des produits de santé. De plus pour l’évaluation du devenir du produit, au vu des phénomènes physiologiques en jeu (par exemple l’élimination dans les urines), avoir recours à un organisme entier est nécessaire.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu) pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Des études préliminaires peuvent permettre également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêts à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre avant de lancer des études réglementaires a plus grandes échelles et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc). Le fait de coupler les études de pharmacocinétique (devenir du produit dans l’organisme) et pharmacodynamie (action du produit sur l’organisme) et les évaluations de la tolérance locale permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Des mesures sont mises en place pour limiter : - Le stress des animaux : avant la chirurgie, si nécessaire, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée, pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. - Les enrichissements présents dans l’environnement des animaux sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…), si cela n’impacte pas les résultats de l’étude. En cas de besoin, ajout d’aliments de soutien (gel, pâtée,…). - La douleur des animaux : en phase post-opératoire, les suivis sont renforcés. La présence d'un vétérinaire sur site permet également la réalisation de soins post-opératoires spécifiques et adaptés. Des points limites précoces sont mis en place.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie est définie dans le(s) texte(s) de référence. Les produits de petite taille/miniaturisés seront testés préférentiellement chez le rat et le lapin. Les produits de taille importante seront préférentiellement testés chez les porcs/miniporcs et chiens. Lorsque plusieurs espèces répondent aux critères, le choix est arbitré par la durée de l’essai et par la quantité de sang nécessaire à l’analyse (pour une étude sur le long terme, utilisation d’espèces à longue durée de vie). Les critères pris en considération dans le choix du stade de développement sont les suivants : 1.Suivi des recommandations des textes de référence Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. 2.Propriétés intrinsèques du produit à tester En l’absence de recommandation particulière dans le(s) texte(s) de référence et si la nature du produit le requière (exemple : molécule à destination pédiatrique), le stade de développement est pertinemment sélectionné. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. 3.Cas particulier des porcs domestiques Pas de recommandation spécifique réglementaire d’où le choix d’utiliser des porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines). Etant donné les conditions d’hébergement, le comportement social, la taille et le poids, et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs domestiques en croissance est la plus appropriée dans ce projet. En cas de besoin d’utilisation d’animaux non-adultes pour le projet (hormis pour les porcs), le groupe en charge du bien-être animal au sein de notre structure (Structure du Bien Être Animal).

Un point limite doit permettre de retirer de l'étude tout animal présentant un effet secondaire sévère. 161 rats, 120 lapins et 50 porcs vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, la plupart tués pour prélever les sites d'injection, dix porcs étant gardés vivants en fin d'étude pour être réutilisés. Les dispositifs médicaux injectables leur sont implantés sous la peau ou dans le derme sous anesthésie générale, suivis de prises de sang hebdomadaires puis mensuelles et, chez les porcs, de vingt biopsies cutanées au maximum par animal. Le porteur écrit que le recours aux animaux est rendu obligatoire par le règlement européen 2017/745 et la norme ISO 10993 pour obtenir le marquage CE, et cette modification du projet augmente le nombre de lapins parce que plus de formulations qu'annoncé seront mises au point.

Objectifs

Le projet a pour objectifs d'obtenir des informations relatives à la tolérance locale de dispositifs médicaux injectables résorbables (DM classe III) et de répondre aux exigences quant à la constitution des dossiers réglementaires en vue de leur mise sur le marché. Les exigences relatives à la caractérisation de ces DM sont de plus en plus élevées, afin de garantir la sécurité des patients à court et long terme. La réalisation d'études de tolérance locale sur des modèles animaux appropriés, permettant de détecter au mieux l'apparition d'effets secondaires, est essentielle dans étapes de développement des dispositifs médicaux injectables. Toutes les études réalisées, même très en amont dans le processus de développement, sont susceptibles d'être utilisées dans les dossiers réglementaires, pour la partie "conception". Les études de tolérance sont généralement couplées à des observations d'efficacité des produits évalués (versus des produits de référence), et à la caractérisation de leur comportement dans l'organisme (modification des propriétés physiques du produit, dégradation, intégration dans les tissus...): ainsi une seule étude permet l'obtention de nombreuses informations pertinentes. MODIFICATION : Augmentation du nombre total de Lapin prévu dans la demande d'autorisation de projet, dans la même période d'autorisation. Sur la période d'autorisation, nous développerons plus de dispositifs médicaux biocompatibles innovants qu'il était prévu initialement, dont il est nécessaire d'évaluer la tolérance pour chaque nouvelle formulation. Leur tolérance est mesurée conformément à des protocoles expérimentaux standard et récurrent néccessitant un nombre d'observation minimum par formulation. Ajout également d'un nouveau fournisseur d'animaux.

Bénéfices attendus

Les projet permettra d'obtenir des données fiables concernant la tolérance, l'intégration et la dégradation des dispositifs médicaux injectables. Il permettra également de répondre aux exigences réglementaires concernant la constitution des dossiers en vue d'une mise sur le marché. Ceci afin d'assurer la sécurité des patients recevant ces produits ainsi d'assurer la sécurité des patients recevant les produits.

Procédures

Les animaux auront des injections sous anesthésie génér le à J0, pour une durée totale de 5 à 15 minutes/animal. D'autres actes sont envisagés mais non systématiques: Prises de sang: rats sous anesthésie générale 1/semaine maxi pendant 1 mois, puis 1/mois maxi, 30 seconde par acte. Lapins vigiles avec anesthésie locale: 1 fois par semaine maximum pendant 1 mois, puis 1 fois par mois maximum, 1 minute maximum par acte. Porcs: sous anesthésie générale 1/semaine maxi pendant 1 mois, puis 2 fois par mois maximum. Biopsies cutanées chez le Porc: sous anesthésie générale (injection intramusculaire, 30 secondes), maximum 20 biopsies réparties sur la durée de l'étude, durée 15 minutes environ par biopsie.

Impact sur les animaux

Les produits développés sont constitués de produits biocompatibles en solution aqueuse plus ou moins visqueuse. Il s'agit de composants très bien documentés pour une utilisation chez l'Homme. Ils sont par ailleurs évalués en premier lieu in vitro: les effets néfastes attendus chez l'animal après implantation sont donc mineurs, et constitués majoritairement d'inflammation locale légère à modérée. Dans de rares cas, les implantations intradermiques chez le Lapin peuvent générer des réaction un peu plus fortes, mais restant localisées au niveau du site d'injection.

Devenir

Dans la majorité des cas, les animaux devront être euthanasiés, afin de prélever les sites d'injection à des fins d'analyse. Cependant, chez les porcs, lors d'injections intradermiques, il sera parfois possible de réaliser les prélèvements par biopsie avec un biopsy punch (sous anesthésie générale) et de conserver les animaux en fin d'étude en vue d'une réutilisation.

Remplacement

Les produits étudiés sont d'abord évalués de façon approfondie grâce à des expériences in vitro: culture cellulaire, modèles de peau artificielle, organe isolé. Les essais de tolérance/biocompatibilité in vivo sont indispensables en complément des tests in vitro, lors de la mise au point d'un dispositif médical. En effet, seule l'implantation dans un organisme complet et vivant permettra d'évaluer d'éventuelles réponses immunitaires/inflammatoires ainsi que l'intégration des produits dans les tissus environnants. Par ailleurs, le recours aux animaux est rendu obligatoire par le règlement Européen (UE) 2017/745 tout en suivant la norme ISO 10993, pour l'élaboration des dossiers pour l'obtention d'un marquage CE (équivalent de l'AMM mais pour les dispositifs médicaux) et également demandé pour les dossiers équivalents dans les pays tiers.

Réduction

Le nombre d'animaux à utiliser dans les études réglementaires est imposé par la norme ISO 10993, les préconisations sont donc suivies, sans augmenter inutilement le nombre d'animaux et sans répéter les protocoles. Dans le cas d'études non réglementaires, on veille à n'utiliser que les animaux strictement nécessaires pour l'obtention des résultats voulus, généralement un nombre très inférieur aux exigences réglementaires. La possibilité d'injecter plusieurs produits en différents sites chez un même animal, permet également de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Une période d'acclimatation systématique est respectée (durée selon l'espèce animale, mais toujours minimum 1 semaine). Les animaux sont hébergés en groupe et ont accès à un enrichissement spécifique à leur espèce (matériel de nidification pour les rats, blocs/objets à mâcher pour tous les animaux, jouets…). Des points limites, suffisamment prédictifs, permettent de sortir un animal de l’étude en cas d'effet secondaire sévère, ou de mettre en place des traitements pour des réactions locales (application de cicatrisant, administration d'antidouleur) afin que l'animal soit impacté le moins possible. Toues les manipulations des animaux seront réalisées dans un contexte de renforcement positif, basé sur des interactions amicales avec les personnels en charge des soins, afin de permettre des manipulations sans stress et avec un minimum de contraintes. Les actes trop stressants ou douloureux sont effectués sous anesthésie générale: injections à J0, prises de sang chez le Rat, chez le Porc, et biopsies cutanées chez le Porc. Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de la procédure (observation quotidienne et suivi clinique avec pesée minimum une fois par semaine). Quelles que soient les procédures, toute éventuelle douleur est, si nécessaire, rigoureusement contrôlée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (anesthésie/analgésie).

Choix des espèces

Les 3 espèces font parties des espèces préconisées par la norme en vigeur. Le rat et le lapin sont des modèles d'implantation utilisés et maitrisés dans l'établissement utilisateur depuis 2006. Leur taille est suffisante pour permettre l'implantation de plusieurs produits chez un seul animal, l'utilisation de techniques d'imagerie et d'appareils de mesures de paramètres cutanés. Le porc est l’espèce animale se rapprochant anatomiquement le plus de l’Homme ; notamment dans la structure de la peau (couche cornée et ratio derme/épiderme équivalent). Cette similitude permet d'évaluer avec une plus grande certitude l’effet attendu en clinique. Sa taille, plus importante, permet également l'implantation de plus de produits chez un seul animal, permettant alors de réduire le nombre d'animaux utilisé. Ces modèles sont des modèles de choix (nombreuses données dans la littérature). Leurs comportements sont bien connus, ce qui permet de détecter facilement tout signe de douleur et/ou de mal-être. Les rats utilisés seront de jeunes adultes, environ 300g (=en fin de croissance, paramètres physiologiques stables). Les lapins seront âgés d'environ 14 semaines, soit environ 3.5kg (= présence d'un derme suffisamment épais pour que l'implantation intradermique des produits ne génère pas une contrainte mécanique trop importante). Les porcs utilisés seront de jeunes adultes. En effet, leur taille doit permettre un hébergement en animalerie conventionnelle dans de bonnes conditions. D’autre part, leur poids de 35kg à 70kg permettra de travailler sur des structures épidermiques, comparable à celles de l'homme (couche cornée et ratio derme/épiderme équivalent) ; indispensable pour reproduire les conditions attendues en clinique.

Infectées par des salmonelles au cours d'une contention d'une trentaine de secondes, 2 400 poules vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour compter les bactéries dans leurs organes et noter les lésions. Le protocole ajoute une vaccination, des pesées, un prélèvement de sang à l'aile, et l'analyse des fèces et des œufs pour mesurer l'excrétion de la bactérie. Le porteur indique qu'aucun signe clinique ni mortalité ne sont attendus puisque les oiseaux restent porteurs sains, et attribue le niveau modéré au stress des manipulations plutôt qu'à l'infection elle-même. Ces essais d'efficacité sont exigés pour les dossiers d'autorisation de mise sur le marché des médicaments vétérinaires, et le schéma de vaccination suit le résumé des caractéristiques du produit ou la demande du donneur d'ordre.

Objectifs

Les salmonelles ubiquistes sont un grave problème et pour la santé humaine et pour la filière avicole. La salmonellose est une zoonose majeure, en raison surtout de sa fréquence et de sa gravité médicale pour l’Homme. La contamination à différents niveaux de la filière avicole par la bactérie du genre Salmonella est à l'origine de toxiinfections alimentaires chez l'Homme via la consommation d'oeufs, d'ovoproduits ou de la chair. La maladie humaine se contracte par l’ingestion d'oeufs, d'ovoproduits ou de la chair crue contaminés, et constitue la première cause de toxi-infections alimentaires collectives en France. La prophylaxie repose essentiellement sur une hygiène stricte et de bonnes pratiques d’élevage. Mais les salmonelles sont des germes très difficiles à éradiquer du fait de leur ubiquité et de leur grande résistance dans le milieu extérieur, tant aux agents physiques que chimiques. Il est donc important de trouver de nouvelles stratégies pour renforcer la résistance des poules domestiques à l’infection, de diminuer l’excrétion des germes dans le milieu extérieur et le portage asymptomatique. La vaccination des poules pondeuses et des reproducteurs au couvoir avec des vaccins vivants permet une réduction nette du portage et de l'excrétion, mais cette prévention n'est ni suffisante ni durable. L'objectif de ce projet est de tester différents schémas vaccinaux permettant de réduire significativement et durablement le portage et l'excrétion. Sur les 5 années du projet, nous estimons à 2 le nombre d'études de développement de modèle et à 2 le nombre d'essais d'efficacité, ce qui correspond à un nombre maximal de 2400 oiseaux.

Bénéfices attendus

Le développement de nouveaux vaccins contre les Salmonelles, et plus particulièrement de vaccins destinés aux lignées reproductrices ou aux poules pondeuses permettrait de réduire la contamination de la filière, et ainsi de limiter les risques de toxi-infection chez l'Homme. Une meilleure maîtrise des Salmonelles en élevage aviaire permettrait d'éviter l'abattage d'animaux ou la destruction des œufs ou des carcasses en cas de contamination avérée. Le but recherché est d'induire une immunité forte chez les animaux vaccinés et de protéger la descendance pendant les premières semaines de vie via les anticorps maternels (anticorps maternelles transmis de la mère à la descendance par le jaune d'oeuf). Les stratégies vaccinales permettent également d'éviter l'utilisation des antibiotiques dans les élevages avicoles. En effet, l'utilisation massive d'antibiotiques jusqu'aux années 2000 a engendré l'apparition de souches multiresistantes très préoccupantes pour la santé humaine.

Procédures

L'infection sera induite par administration d'un inoculum contenant une ou plusieurs souches de Salmonelles par la voie décrite dans le protocole. Un seul challenge avec l'inoculum sera effectué par essai. L'inoculation est effectuée sur animaux vigiles et la durée de la contention est d'environ 30 secondes. Dans le cas de l’évaluation de vaccins vétérinaires, ces derniers seront administrés selon les modalités prévues dans le RCP (Résumé des Caractéristiques du Produit) ou demandées par le donneur d’ordre. Une seule administration de vaccin est généralement nécessaire, mais certains protocoles vaccinaux peuvent nécessiter un ou deux rappels. L'administration se fait sur animaux vigiles et la durée de la contention est inférieure à 20 secondes. Au cours du projet, des données seront générées dans le cadre du suivi de l’évolution de la maladie chez les animaux: examens cliniques quotidiens (examen visuel depuis l'exterieur de la case), poids (maximum une fois par semaine; sur animaux vigiles; durée entre 30 et 60 secondes), ingérés alimentaires ou hydriques quotidiens (mesure de la quantité d'aliment/d'eau distribués par case et mesure des refus après 24h). Chez la poule pondeuse, les oeufs seront collectés pour analyses bactériologiques. Des prélèvements de fèces (effectués dans la litière) peuvent également être réalisés pour évaluer l'excrétion de la bactérie dans l’environnement. Un prélèvement sanguin pourra être effectué en fin d'étude dans le cadre du suivi de la bactériémie ou de la réponse humorale après vaccination. L'animal vigile sera tenu en contention pendant environ 1 minute pour effectuer le prélèvement à l'aile. Les animaux seront euthanasiés en fin d'étude afin d'évaluer les lésions des organes, et pour prélèvement d'organes pour identification et numération bactérienne.

Impact sur les animaux

Aucun signe clinique ni mortalité ne sont attendus chez les animaux inoculés puisque les animaux sont porteurs sains. Bien que l'infection n'induise pas de signes cliniques ni de mortalité, le niveau de gravité des modèles d'infections par Salmonelle est classé "modéré" à cause du stress induit par les manipulations d'animaux au cours des pesées, de l'administration du produit d'étude, du challenge, des prises de sang et des euthanasies. La seule douleur sera celle liée à l'insertion de l'aiguille lors de la prise de sang ou pour euthanasie (en cas d'euthanasie chimique).

Devenir

Les animaux entrant dans ce projet seront euthanasiés en fin de procédure pour scoring des lésions et prélèvements de tissus/organes afin de vérifier la charge bactérienne (portage) et/ou d'effectuer des analyses histopathologiques.

Remplacement

Aucune méthode alternative à l’utilisation d’animaux vivants n’est susceptible de répondre aux objectifs du projet. L'utilisation de modèles in-vitro, ex-vivo ou de simulations informatiques ne permet pas de répondre aux objectifs du projet. En effet, l'efficacité d'un médicament, d'un vaccin ou d'un additif ne peut être évaluée qu'après administration du produit à des animaux infectés par la bactérie afin d'évaluer son efficacité (réduction des signes cliniques, de la mortalité, la réponse immunitaire, le portage et l'excrétion) chez l'espèce cible. Les essais d'efficacité sont obligatoires au dossier de demande d'autorisation de mise sur le marché de médicaments vétérinaires et doivent être réalisées chez l'espèce cible correspondant aux indications thérapeutiques du produit à tester. Il n'y a donc pas d'alternative à l'utilisation d'animaux.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux implique au préalable une bonne caractérisation du modèle expérimental afin de réaliser ensuite des calculs d'effectifs fiables et d’éviter l'échec d'étude d'efficacité parce que la variabilité n'est pas maîtrisée (modèles pas assez ou trop sévères) ou parce que le nombre d'animaux est insuffisant. Le calcul d'effectif est basé sur le paramètre d'intérêt spécifique au produit dont l'efficacité est évalué et peut se faire sur un score clinique et/ou sur un paramètre zootechnique (poids ou indice de consommation). Selon le paramètre retenu, le calcul d'effectif doit se baser sur le test statistique qui sera conduit. Pour les études de développement de modèles, le nombre d'animaux utilisé sera déterminé de telle sorte que l'expérimentation soit interprétable, en tenant compte de la variabilité biologique individuelle.

Raffinement

Les conditions d'hébergement seront adaptées aux besoins physiologiques des animaux et leur permettront d'exprimer le plus possible leur gamme normale de comportements. Pour les volailles, l'hébergement sera en bâtiment fermé sur paille ou sciure au sol ou sur caillebottis en cages. Les cloisons seront grillagées afin de permettre des contacts physiques, olfactifs, visuels et auditifs entre animaux. Les animaux seront systématiquement hébergés en groupe d'au moins 2 individus. La température, l’hygrométrie et la luminosité de la pièce seront adaptés à l'espèce et au stade physiologique. Des enrichissements (perchoirs, ficelles, blocs à piquer, balles, grelots) seront proposés et renouvelés régulièrement. La contention visera à minimiser le stress. Le bien-être des animaux sera évalué par le personnel en charge des animaux au moins une fois par jour.

Choix des espèces

La contamination à différents niveaux de la filière avicole par la bactérie du genre Salmonella est à l'origine de toxiinfections alimentaires chez l'Homme via la consommation d'oeufs, d'ovoproduits ou de la chair. Afin de réduire le risque de zoonose, il est important de développer de nouveaux vaccins, médicaments ou additifs vétérinaires chez l'espèce cible. La lignée et le stade de développement des animaux utilisés dépendra de la cible du produit testé. En effet, selon les objectifs de l'étude, des poussins d'un jour, des poulets de chair en croissance, des poules pondeuses ou des reproducteurs pourront être utilisés car ils correspondent aux différentes populations ciblées par les vaccins en développement. La première étude visant à renforcer l'immunité vaccinale de poules reproductrices, l'essai sera conduit sur les animaux adultes (12 semaines au moment de la vaccination).