Tests réglementaires

105 chats et 100 chiens sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucun n'étant tué : tous sont gardés vivants et réutilisés. Chacun subit un prélèvement sanguin sous contention manuelle, un séjour pouvant aller jusqu'à 24 heures seul en cage à métabolisme pour recueillir urine et fèces, ou un prélèvement de peau et de muscle sous anesthésie. Ces prélèvements ne répondent à aucune question scientifique propre : ils fournissent de la matrice témoin, une référence sans molécule active, pour valider les méthodes de dosage d'études réglementaires menées par ailleurs. L'avenant fait passer le nombre de chats de 35 à 105 sans approche statistique déclarée, le porteur écrivant six fois qu'il est "indispensable" de recourir à "l'animal dans son ensemble".

Objectifs

Avenant: suite au renouvellement et à l'accroissement de notre colonie, le nombre de chat est augmenté de 70. L'objectif de ce projet est de fournir des échantillons témoins c'est à dire ne contenant pas le produit test qui sera analysé ( par exemple du sang, du serum, du plasma, des excretas, des biopsies cutanées et musculaires et des liquides céphalo-rachidien) afin de permettre le dosage des échantillons. Il est indispensable d'avoir à disposition de la matrice témoin ou exempte de molécule active pour pouvoir valider la méthode de dosage et valider les dosages.

Bénéfices attendus

Il est indispensable d'avoir de la matrice témoin. Il s'agit d'échantillons témoins c'est à dire ne contenant pas le produit test qui sera analysé pour pouvoir valider la méthode de dosage et valider les dosages. Cela est indispensable pour valider les résultats d'une étude.

Procédures

Les animaux seront soumis à un seul prélèvement de sang. La durée du prélèvement sera de l'ordre de la minute. Ce prélèvement sanguin servira à fournir de la matrice témoin en plasma ou en sang. Pour générer de la matrice d'urine ou de féces, les animaux seront placés en cage à métabolisme de façon individuelle pour une durée maximale de 24h. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. Les échantillons d'urine ou de féces seront juste collectés sans aucune manipulation particulière de l'animal. Pour générer des matrices tissulaires , les animaux seront préalablement anesthésiés. Ces gestes seront réalisés par un personnel formé selon les bonnes pratiques vétérinaires et la règlementation en vigueur. La durée de l'anesthésie est de l'ordre de la minute et la durée de l'euthanasie est de l'ordre de quelques minutes (estimation entre 1 à 2 minutes)

Impact sur les animaux

Pour pouvoir générer de la matrice témoin il est indispensable de recourir à l'animal dans son ensemble. L'animal subira une contention manuelle pour pouvoir réaliser un prélèvement sanguin. Le temps d'immobilisation même de courte durée pourra induire un stress chez l'animal. Dans le cas de recueil d'excrétas, l'animal devra la plupart du temps être hébergé en cage à métabolisme (pour une durée maximale de 24h) pour pouvoir collecter des échantillons d'urine ou de fèces témoins. Ce type d'hébergement entraînant un isolement de l'animal qui peut également engendrer un stress.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie: dans le cas de prélèvement sanguin classique (volume inférieur à 20 % du volume circulant de l'animal) et dans le cas de collecte d'excrétas (urine, féces) ou dans le cas de prélèvement tissulaire sous anesthésie générale.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de générer de la matrice témoin, il est indispensable de recourir à l’animal dans son ensemble . En effet la non utilisation de matrice témoin entraine un bias dans la méthode. Si l'échantillon qui permet la quantification est différent de celui à quantifier, la méthode n'est pas exacte.

Réduction

100 chiens et 105 chats sont prévus dans ce projet. C'est le nombre d'animaux minimal pour générer de la matrice témoin sur une durée de 5 ans. Aucune approche statistique faite pour ce projet. Les mesures prises pour réduire le nombre d'animaux sont l'utilisation d'une méthode avec un seuil de quantification faible , l'appareillage utilisé devra avoir un seuil de détection faible afin de réduire au maximum la quantité d'échantillon utilisé pour la quantification. Le nombre d'échantillon nécessaire pour la quantification sera réduit afin d'assurer l'exactitude de la méthode. Avenant: suite au renouvellement et à l'accroissement de notre colonie, le nombre de chat est augmenté de 70.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe, à même le sol. De l'enrichissement sera présent autant que possible. Pour l'espèce chien , des balles, des cordes, des tablettes seront présentes. Pour l'espèce chat, des griffoirs, coussins, cordage seront présents autant que possible dans les hébergements. Les animaux seront manipulés par un personnel formé et tout geste sera fait selon les bonnes pratiques vétérinaires et conformément à la réglementation en vigueur. En ce qui concerne les prélèvements de sang pour les matrices témoins sang / plasma, 7.5% du volume de sang circulant prélevé en 24h donne lieu à une récupération d'une durée d'une semaine pour l'animal. 10 % du volume de sang circulant prélevé en 24h donne lieu à une récupération d'une durée deux semaines pour l'animal. 15 % du volume de sang circulant prélevé en 24h donne lieu à une récupération d'une durée de quatre semaines pour l'animal.. Pour la collecte d'excretas ( matrice d'urine ou de fèces), l'animal sera placé en cage à métabolisme pour une durée maximale de 24h et sera réduite autant que possible. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. Dans ce projet les points limites sont : - Problèmes hématologique ou biochimique, dans ce cas l'animal ne sera pas inclus dans ce projet - Douleur observée au niveau du site de prélèvement avant la réalisation du prélèvement lui même, l'animal pourra être prélevé au niveau d'un autre site ou il n'y aura pas de prélèvement du tout. - Animal ayant un comportement inhabituel (prostré, poils ébouriffé, signes d'agressivités). Dans ce cas, l'animal sera observé plusieurs fois par jour pour suivre les signes comportementaux et sera exclu du projet. Cette décision sera prise en accord avec le vétérinaire désigné. - Animal présentant une perte de poids supérieur à 20 % par rapport à son poids basal. L'animal sera exclu de ce projet - Animal présentant des fèces liquides, diarrhéiques. En fonction de la fréquence et de la durée cela pourra éventuellement conduire à une exclusion du projet en accord avec la décision du vétérinaire responsable

Choix des espèces

Dans les études précliniques, il est très souvent nécessaire d'avoir de la matrice témoin (sang, serum, plasma, tissus, excretas). Ceci est indispensable pour pouvoir valider la méthode de dosage et valider les dosages. Les espèces chiens et chats sont largement utilisés dans ce type d'étude en tant qu'espèces non rongeurs Cela dépendra des matrices témoins. S'il s'agit de prélèvement sanguin un animal de stade jeune adulte conviendra le mieux. S'il s'agit d'un prélèvement de tissus, un animal adulte vieillissant pourra plutôt être sélectionné. Cela dépendra des objectifs de l'étude pour laquelle la ou les matrices témoins seront collectées.

1 225 rats vont être utilisés dans ce projet, chacun recevant un fil de suture serré autour d'un globe oculaire pour faire monter la pression, puis une anesthésie par semaine pendant un mois et jusqu'à huit instillations de gouttes par jour. Tous sont tués à l'issue pour l'analyse des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit les examens ophtalmiques comme "totalement indolores et non invasifs" parce qu'ils se pratiquent aussi en cabinet chez l'humain, et reconnaît ailleurs que la pose du fil peut causer une douleur légère à modérée pendant les premières heures. Les bénéfices annoncés, identifier des cibles thérapeutiques et fournir des données précliniques avant les essais humains, restent au futur, la mise en place du modèle étant l'objet immédiat du projet.

Objectifs

Le glaucome est une maladie oculaire chronique caractérisée par des lésions progressives du nerf optique, souvent associées à une élévation de la pression intra-oculaire (PIO). Cette pression élevée résulte généralement d’un déséquilibre entre la production et le drainage de l’humeur aqueuse, un liquide clair à l’intérieur de l’œil. Le glaucome peut entraîner une perte de vision irréversible si elle n’est pas traitée. Il existe plusieurs types de glaucome, mais le plus courant est le glaucome à angle ouvert, où le système de drainage de l’œil est partiellement obstrué. Les symptômes peuvent inclure une vision floue, des douleurs oculaires et une perte progressive du champ visuel. Le glaucome touche environ 1 à 2 % de la population mondiale de plus de 40 ans, avec une prévalence qui augmente avec l’âge. En France, environ 800 000 personnes sont traitées pour le glaucome, mais on estime que 400 000 à 500 000 personnes supplémentaires pourraient être atteintes sans le savoir. Malgré les traitements disponibles, certains patients peuvent ne pas répondre adéquatement aux thérapies conventionnelles, ce qui peut conduire à une progression de la maladie. Les traitements actuels visent principalement à réduire la PIO, mais ils ne sont pas toujours efficaces pour tous les patients. La recherche sur le glaucome est donc cruciale pour développer de nouvelles méthodes de diagnostic et de traitement. Comprendre les mécanismes sous-jacents de l’élévation de la PIO et des lésions du nerf optique peut conduire à des thérapies plus efficaces et à une meilleure prévention de la cécité liée au glaucome.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de la mise en place d'un modèle expérimental chez l'animal sont multiples et visent principalement à améliorer la compréhension de cette maladie ainsi qu'à développer de nouveaux traitements. Ce projet pourra nous aider à : 1. Identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l'efficacité de nouveaux traitements potentiels ou de médicaments existants pour ralentir ou inverser la progression de la maladie. 2. Observer comment les traitements sont absorbés, distribués, métabolisés et excrétés dans un organisme vivant, ce qui est crucial pour le développement de médicaments. 3. Fournir des données précliniques sur la sécurité et l'efficacité des traitements avant de passer aux essais sur l'homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d’intervention : 1. L’établissement du modèle est réalisé avec la mise en place d’un fils de suture autour du globe oculaire. 1 seule fois par animal, le jour de l’induction. Cette étape ne devrait pas durer plus de 5 à 10 minutes sans compter l’anesthésie et le réveil de l’animal. Un seul œil est concerné. 2. Les anesthésies qui ne devraient pas durer plus d’une vingtaine de minutes, le temps du réveil. Ces anesthésies seront réalisées 1 fois pour l’induction et lors d’examens pour maintenir l’animal immobile soit 1 fois par semaine et durant 1 mois. 3. Les examens ophtalmiques (lampe à fente, tomographie, électrorétinogramme) qui sont réalisées soit quotidiennement la première semaine pour la tonométrie et la lampe à fente soit 1 fois par semaine. Ces examens ne durent pas plus de 5 minutes par animal. Les animaux seront anesthésiés afin de faciliter l’évaluation et maintenir l’animal immobile. Tous ces examens sont pratiqués chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation et également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ils sont totalement indolores et non invasifs. 4. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces procédures durent moins d’une minute. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour (on estime un maximum de 8 fois). Les injections (intrapéritonéale, sous cutanées...) peuvent être quotidiennes. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, avec une procédure qui dure cinq minutes tout au plus, leur fréquence est limitée, une à deux fois par semaine.

Impact sur les animaux

La mise en place d’un fil de suture autour du globe oculaire est un acte chirurgical sans difficulté́ technique pouvant entrainer pour l’animal un léger inconfort notamment à cause de la pression exercée et des frottements. Les pesées hebdomadaires, les contentions quotidiennes et répétées nécessaires pour les observations, le suivi ou les administrations des produits peuvent induire chez l’animal un stress non négligeable bien que ces actes qui ne durent tout au plus que quelques dizaines de secondes soient réalisés par un personnel sensibilisé et formé au bien-être. Il en va de même pour les piqures réalisées notamment pour l’anesthésie des animaux. De l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un inconfort et un stress supplémentaire est attendue, elle sera minimisée par l’utilisation de lampes ou d'armoires chauffantes. L’administration des produits pourraient entrainer l’apparition de signes d’irritation comme des rougeurs et un inconfort. Bien que les travaux publiés ne montrent pas de changement de comportement, d'effet secondaires ou de manifestations de douleur, on ne peut pas exclure que l'affection recherchée, soit l’élévation modérée de la pression intraoculaire, entraine une douleur légère à modérée durant les premières heures qui suivent la mise en place des fils de sutures.

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour l'analyse des tissus.

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents (très vascularisés ou très innervés pour certains, totalement avasculaires ou faiblement innervés pour d’autres). Il est soumis à d'importantes variations environnementales (température et humidité ambiantes), mécaniques (mouvements des globes, des paupières) et physicochimiques (osmolarité...), ainsi qu'à de nombreuses interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. C'est pour cela que nous utiliserons des animaux vivants dans nos procédures expérimentales.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement. Il tient aussi compte du nombre d'études estimées, des variations du métabolisme et de la robustesse des mesures. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques ; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin non traité. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.

Raffinement

Les animaux, hébergés par deux au minimum, sont maintenus sur toute la période de l’étude dans un environnement enrichi (bouts de bois, tunnel) avec un accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Afin de minimiser au maximum le stress des animaux, le change des cages s’effectue par un personnel sensibilisé à la manipulation des animaux tout comme le suivi sanitaire quotidien. Dans le cas de l’administration de produits par injections péri ou intraoculaire, une anesthésie générale sera pratiquée et associée à une anesthésie locale. L'ensemble des examens envisagés n'engendre pas de douleur pour l'animal, ils sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum tout comme l'administation si nécessaire d'un analgésique. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement

Choix des espèces

Ce modèle est connu et utilisé dans de nombreuses publications scientifiques depuis 2015 et est bien caractérisé chez le rongeur. Ce modèle, chez la souris et le rat est relativement facile et rapide à mettre en place chez ces animaux avec une bonne reproductibilité, une bonne fiabilité et relativement peu de nuisances ou d'effets indésirables. De plus, ces animaux ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée.

Une lésion de la cornée pratiquée sur un œil, des gouttes instillées jusqu'à huit fois par jour, des injections dans l'œil une à deux fois par semaine sous microscope chirurgical, des examens sous anesthésie légère. 2 240 lapins et 2 280 rats vont être utilisés dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, au service à la fois de la recherche, de tests d'efficacité réglementaires et de la formation professionnelle. Le porteur rappelle que la cornée est un tissu "richement innervé et sensible" et attend une gêne ou une douleur de quelques heures après l'induction de la lésion. Tous les animaux ayant suivi la procédure complète sont tués pour les évaluations histologiques et le dosage des produits.

Objectifs

Le but de ce projet est d'utiliser un modèle expérimental de cicatrisation cornéenne consécutif à une lésion de la cornée chez le lapin et le rat. Ce modèle contribuera à participer au développement de substances thérapeutiques qui amélioreront la cicatrisation en luttant contre l’apparition de la fibrose et des opacités. Un modèle expérimental de cicatrisation cornéenne de l’épithélium seul ou de l’épithélium et du stroma a déjà été mis en place dans notre établissement. Le but de cette demande est de pouvoir à nouveau utiliser ces modèles afin de tester l’efficacité de substances thérapeutiques sur l’amélioration de la cicatrisation cornéenne. Les traumatismes de la cornée sont un problème de santé majeur dans le monde et un des principaux motifs de consultation aux urgences ophtalmiques. Les opacités cornéennes sont la quatrième cause de cécité dans le monde. La cornée est le tissu transparent et avasculaire, ne contient pas de vaisseaux sanguins ou lymphatiques, situé en avant de l’œil, elle est finement structurée en trois couches : épithélium séparé par une membrane basale du stroma et un endothélium coté interne. L'organisation des fibres du stroma et l'absence de vaisseaux garantissent la transparence de la cornée. L'épithéllium est en contact avec le film lacrymal et l'endothélium avec l'humeur aqueuse (liquide présent dans la partie antérieure de l'œil entre la cornée et l'iris). La transparence de la cornée, élément crucial pour notre vision, est altérée lors d’une lésion qui peut avoir des origines multiples : infections, traumatismes physique ou chimique, greffes de cornée, complications de chirurgie réfractive au laser pour corriger les défauts de la vision (myopie, hypermétropie, astigmatisme…) ou dystrophies cornéennes (maladies héréditaires entraînant des malformations de la cornée). L’atteinte des différentes couches de la cornée peut aboutir à des réactions cicatricielles au niveau de l’épithélium ou du stroma selon la profondeur de l’atteint, entrainant des apparitions de vaisseaux, des opacités cornéennes permanentes jusqu'à la cécité. Le stroma contient les kératocytes qui secrètent les constituants de la matrice extracellulaire, les kératocytes quiescents se différencient en myofibroblastes activés lors de blessure. L’activation excessive des kératocytes et la présence de fibre de stress dans les myofibroblastes, sont responsables d’une cicatrisation fibreuse générant des opacités.

Bénéfices attendus

Les pathologies de la cornée sont un réel handicap et un problème majeur de santé publique puisqu’elles peuvent conduire à la cécité. Ce projet permettra de participer à la recherche de nouveaux traitements réparateurs pour rétablir la transparence de la cornée après un traumatisme.

Procédures

La mise en place de la pathologie se fera uniquement sur un œil et par un acte unique le jour de l’induction. Les procédures correspondantes décrites en détails dans la partie 4 ne dureront pas plus de 10 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens au biomicroscope) mais certains (examens OCT, HRT) qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes (2-3 minutes pour un examen au biomicroscope, lampe à fente et 5 minutes pour les examens types OCT ou HRT). Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, le modèle induit une lésion de la cornée. La cornée est un tissu richement innervé et sensible, un seul œil sera induit. L’induction de la lésion cornéenne devrait entrainer une gêne ou une douleur pendant quelques heures après l’induction. Elle sera soulagée par l’administration d’un analgésique. Nous avons déjà expérimenté ces modèles dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens au biomicroscope) mais certains (examens OCT, HRT) qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes (2-3 minutes pour un examen au biomicroscope, lampe à fente et 5 minutes pour les examens types OCT ou HRT). Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...).

Remplacement

Les modèles in vitro existants ne permettent pas de recréer un environnement approprié pour conserver simultanément l’épithélium et l’endothélium, les durées de conservation sont limitées, il n’existe pas de modèle de cornée reconstituée complète permettant d’observer la cicatrisation, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétrique ou non paramétrique suivant la distribution des données. Chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Les modèles in vitro existants ne permettent pas de recréer un environnement approprié pour conserver simultanément l’épithélium et l’endothélium, les durées de conservation sont limitées, il n’existe pas de modèle de cornée reconstituée complète permettant d’observer la cicatrisation, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés par deux au minimum en première intention, avec différents enrichissements adaptés à l'espèce. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Une analgésie sera mise en place lors des procédures d'induction. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction de la quantité et des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.

Mis à jeun jusqu'à vingt-quatre heures, puis recevant un candidat médicament par voie orale, sous-cutanée, transdermique, intramusculaire, intraveineuse ou par endoscopie sous anesthésie, 150 chiens subissent des prélèvements de sang sur animal vigile et jusqu'à quarante-huit heures d'hébergement individuel en cage à métabolisme pour le recueil de leurs urines. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les effets indésirables des produits testés ne peuvent pas être anticipés au début du projet, et que le protocole dépend du mode d'administration et de la fréquence demandés. Cent chiens seront réutilisés dans d'autres projets après accord du vétérinaire, quarante seront proposés à l'adoption au bout de quatre à cinq ans si leur état de santé le permet, les autres étant tués pour des prélèvements terminaux.

Objectifs

Le projet consiste à évaluer le profil pharmacocinétique, après administration chez le chien, d'un candidat médicament grâce à la collecte d'échantillons sanguins et/ou d'urine à différents temps après administration du produit à tester. L'objectif est de mesurer sur ces différents prélèvements la concentration du produit et/ou de ses métabolites, et d'éventuels marqueurs biologiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez le chien pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Du fait de la cible thérapeutique, ces composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques sur l’espèce utilisée (Chien) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les animaux pourront éventuellement être mis à jeun la veille de l’administration pour une durée qui est fonction du produit testé (maximum 24h). Les animaux recevront le candidat médicament via différentes voies (orale, intrapéritonéale, sous-cutanée, transdermique, intramusculaire ou intraveineuse) avec -2 min par administration. Dans certains cas, le candidat médicament pourra être administré par endoscopie chez l’animal anesthésié (durée environ 1h). Des prélèvements de sang seront réalisés sur l’animal vigile (2 minutes par prélèvement). Pour les recueils urinaires, les animaux seront placés en cage à métabolisme sur une durée de 48h au maximum (généralement 24h).

Impact sur les animaux

Les chiens de ce projet pourront subir : - un stress lié à la privation de nourriture avant administration du produit, - une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration, de l'anesthésie, et des prélèvements - un stress lié à l'hébergement individuel en cage à métabolisme (24h à 48h) pour la collecte d’urine. Les conséquences éventuellement indésirables des produits ne peuvent pas être anticipés au début du projet. Par conséquent, des discussions seront engagés avec les responsables du bien-être animal pour ajuster les méthodes d'observation des animaux, en vue de préparer des traitements pour d'éventuels symptomes cliniques.

Devenir

Réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire. Lorsque les animaux ne peuvent pas être reutilisés (4 à 5 ans après leur arrivée), ils pourront être mis à l'adoption ( généralement via le GRAAL) si leur état de santé le permet. Enfin certains animaux pourront euthanasiés en fin de projet pour réalisation de prélèvements terminaux.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le chien car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer la pharmacocinétique d’une nouvelle molécule. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le chien est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’etudier le devenir des médicaments dans l'organisme (analyses pharmacocinétiques). Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse pharmacocinétique : 3 à 6 animaux par groupe à raison de 5 études/an. Pour des études exploratoires, un nombre inférieur d’animaux pourra être utilisé. Cependant, une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Le chien est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour la réalisation d’études de pharmacocinétique permettant d’étudier le devenir (absorption, distribution, métabolisation, élimination), d’un produit testé, dans le sang et/ou les urines (lorsque le chien est utilisé au cours du développement préclinique de ce produit). Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Maintenus 5 h 30 sur un portoir de contention, éveillés, 300 lapins reçoivent dans la veine de l'oreille le produit à tester ou son extrait, puis subissent six à neuf prises de température rectale. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, 150 lapins étant tués et 150 réutilisés, un même individu pouvant servir jusqu'à sept tests successifs. L'enjeu est réglementaire, obtenir la mise sur le marché de prothèses, pansements, ovules ou gels lubrifiants, à la demande de clients industriels. Le porteur écrit qu'aucune méthode alternative n'est proposée pour ce test, puis mentionne un test sur monocytes en cours de développement mais non reconnu par les instances, et précise que les lapins sont mis à jeun la veille pour éviter que les défécations ne gênent la prise de température.

Objectifs

Les professionnels de santé utilisent aujourd’hui des dispositifs médicaux (prothèses, pansements, ovule, gel lubrifiant...) que nous appelons « DM ». Le but du projet est d’évaluer la biocompatibilité de ces dispositifs. Autrement dit nous devons déterminer si les dispositifs, qui vont avoir un contact direct avec les tissus et fluides interne, sont compatibles avec le corps humain. Parmi les paramètres à étudier pour évaluer la biocompatibilité d’un DM, il faut évaluer sa pyrogénécité. La pyrogénicité est la capacité d’un agent chimique ou d’une autre substance à induire une augmentation de température. Une contamination par des toxines bactériennes peut être la source d’une réponse pyrogène. C’est pourquoi, en amont du test in vivo, un dosage de ces toxines est toujours réalisé in vitro afin d’écarter tout biais dû à une élévation de température qui ne serait pas dû aux composants du dispostif mais à une contamination. Ce test est une première étape mais il n’est pas suffisant pour évaluer la capacité pyrogène d’un dispositif c’est pourquoi un test effectué chez le lapin est obligatoire. Ces projets sont décrits dans des textes réglementaires. Afin de répondre aux obligations réglementaires avant mise sur le marché de produit, nous réaliserons sur le modèle du lapin des tests pyrogènes (PYR). Il y a deux manières possibles de traiter les animaux, soit nous utilisons le produit pur, soit sous forme d’extrait. L’extrait est un liquide (NaCl) dans lequel le DM va être immergé pendant une durée et à une température donnée, ces extraits seront ensuite utilisés pour faire les traitements. Cette évaluation est imposée par les instances réglementaires. Pour ces tests de pyrogénicité, le produit ou son extrait est administré par voie intraveineuse chez le lapin, l’élévation de la température corporelle est suivie pendant un laps de temps donné. Les temps sont déterminés par les normes.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’obtenir des données expérimentales utilisées pour conclure sur la sécurité biologique d’un DM, et par conséquent sa biocompatibilité. Le projet découle généralement d’une évaluation du risque réalisée au préalable en tenant compte de l’utilisation des DM et des données fournies par le client. Ce projet fait donc partie intégrante de l’évaluation biologique des DM, une exigence essentielle en matière de sécurité requise par le Règlement Européen 2017/745 et exigée par les organismes notifiés afin d'accorder ou non la mise sur le marché. Ces tests pré-cliniques, voués à évaluer la biocompatibilité des DM, a donc pour but d’obtenir une autorisation de mise sur le marché de DM sans risque pour la santé de l’homme.

Procédures

Tous les gestes prévus sont faits sur animal vigile. La contention des animaux dure environ 5h30 selon la norme qui est suivie. Le traitement est administré par voie veineuse dans la veine marginale de l’oreille (2 à 5 minutes). La prise de température par voie rectale dure environ 1 minute. Il y a entre 6 et 9 prises de température en fonction de la procédure. En prenant en compte les prétests et les tests définitifs, les animaux ne présentant aucun signe clinique ou aucun mal-être peuvent être réutilisés jusqu’à sept fois après avis du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Les tests de pyrogénicité peuvent engendrer une élévation de la température corporelle des animaux. Le traitement se fait par injection intraveineuse dans la veine marginale de l’oreille pouvant engendrer une légère douleur et des saignements. Les animaux sont maintenus sur des portoirs à contention durant toute l’expérimentation pouvant engendrer un stress.

Devenir

En fin d’étude les animaux sont soit mis en réutilisation pour être utilisé dans un autre test pyrogène (en cas de test pyrogène négatif) soit mis à mort (en cas de test pyrogène positif). En effet en cas de test positif cela signifie que le dispositif testé n'est pas biocompatible. Même si l’animal ne présente aucun signe de souffrance et que sa température revient à la normal il nous est impossible de l’utiliser pour tester un autre dispositif car nous ne savons pas combien de temps les relargables toxiques restent dans l’organisme de l’animal et cela pourrait induire un biais lors du test d’un nouveau dispositif.

Remplacement

Pour ce projet, tout matériau ayant un pH ≤ 2.0 ou ≥ 11.5 ne doit pas être testé. A l’heure actuelle, aucune méthode alternative n’est proposée pour évaluer la pyrogénécité due aux matériaux composant les dispositifs médicaux. Un test d’activation des Monocytes, dit MAT, est en cours de développement. Il n’est pour l’instant pas reconnu par les instances réglementaires pour évaluer le potentiel pyrogène des dispositifs médicaux, c’est pourquoi ce test sur lapin reste obligatoire.

Réduction

Avant d’initier tout test de pyrogénécité chez l’animal, un test in vitro sera réalisé afin de s’assurer de l’absence de pyrogénécité liée à une contamination du dispositif par des toxines bactériennes. Les projets sont réalisés par étapes. Dans un premier temps, peu importe la norme qui est suivie, 3 animaux seront testés. En cas de résultat ambigu ne permettant pas de conclure sur la capacité pyrogène d’un dispositif le test sera refait sur 3 ou 5 animaux supplémentaires selon la norme utilisée. Dans le cas où aucune conclusion ne peut être apportée, l’étude pourra être poursuivie en impliquant au maximum 3 ou 4 groupes de 3 animaux en totalité selon la norme suivie également. Ces tests sont effectués sur le nombre minimal d’animaux requis par la norme correspondante. Par ailleurs, les animaux impliqués dans ces études sont, autant que possible (jusqu’à 7 fois après avis du vétérinaire), réutilisés pour de nouveaux tests de pyrogénécité après avis d'un vétérinaire. Ceci afin de limiter le nombre d’animaux utilisés et de réduire le nombre de pré-test permettant l’inclusion des animaux en étude.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux sont mis en cage, par groupe de 2, par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien-être animal, elles sont équipées de plateformes, de cloisons transparentes, d’un fond perforé en noryl et d’enrichissements, briquette de bois et foin. Si des bagarres entre congénère surviennent alors les animaux pourront être hébergés individuellement pour assurer leur bien-être. Afin d’éviter les défécations pouvant gêner la prise de température, les animaux seront mis à jeun la veille du test, la nourriture leurs sera restitué dès la fin de l’étude. Hors étude, Les animaux ont un accès à volonté à la nourriture et à l’eau. Le plateau contenant les selles et les urines est recouvert de copaux de bois pour limiter les odeurs et est nettoyé 2 fois par semaine. Des points limites sont définis pour chacun des tests afin d’éviter toutes souffrance inutile aux animaux.

Choix des espèces

L’espèce et le stade de développement des animaux à utiliser sont imposés par les normes ISO et la Pharmacopée correspondantes. Le lapin reste le modèle de choix utilisé pour les tests de pyrogénécité comme cité dans les normes ISO. Nous utilisons exclusivement des lapins Néo Zélandais. Nous utilisons des jeunes adultes de 9 à 16 semaines. Si des femelles sont utilisées, elles ne doivent jamais avoir mis bas et ne doivent pas être gestante.

Le protocole s'achève par un prélèvement de sang poursuivi jusqu'à la mort de l'animal, dix à douze minutes sous anesthésie. Il concerne 120 790 lapins, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque lapin reçoit d'abord deux injections d'une suspension cellulaire à quatorze jours d'intervalle, puis subit deux saignées de cinq à huit minutes à l'artère médiane de l'oreille, maintenu vigile dans une boîte de contention et refermé à la colle chirurgicale, avec une anémie de deux à six jours que le porteur reconnaît. Le sérum obtenu entre dans la fabrication d'un immunosuppresseur commercialisé dans plus de quatre-vingts pays, et le porteur décrit au titre de la réduction une sélection génétique menée sur les reproducteurs de l'élevage pour augmenter la quantité de sérum tirée de chaque lapin.

Objectifs

Le projet a pour objectif la production de sérum de lapin entrant dans la fabrication d'un médicament à usage humain, immunosuppresseur visant à lutter contre le risque de rejet de greffe chez l'Homme et également utilisé dans le traitement de l'aplasie médullaire.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est la production d'un médicament humain, commercialisé dans plus de 80 pays à travers le monde et considéré comme un "life saving drug", c'est-à-dire un médicament vital pour de nombreux patients. Il est utilisé en milieu hospitalier. Ce médicament est un immunosuppresseur sélectif utilisé pour lutter contre les rejets de greffe chez l'Homme en période pré et post-opératoire. Le médicament est également utilisé dans le cadre de la prévention de la réaction du greffon contre l'hôte aiguë et chronique en cas de transplantation de cellules souches hématopoïétiques ainsi que pour le traitement de la réaction du greffon contre l'hôte aiguë corticorésistante. Enfin, le médicament sert au traitement de l'aplasie médullaire. Il est inclus sur la liste des médicaments critiques de l’Union Européenne (Union list of critical medicines), pour lesquels un stock minimal de 4 mois est requis afin d’éviter toute rupture d’approvisionnement des pays.

Procédures

Les animaux sont changés de cage au moment de la mise en place en salle de protocole et pesés individuellement. Puis le protocole comprend différentes étapes pouvant impacter les animaux : - une phase d'immunisation : l’injection d'une suspension sur animal vigile simplement contenu (durée : 1 minute) et l’injection d'une suspension sur animal vigile simplement contenu 14 jours plus tard (durée : 1 à 2 minutes) - un premier prélèvement de sang à l'artère médiane de l'oreille sur animal vigile mis dans une boite de contention (durée : environ 5 à 8 minutes), puis l’application de colle chirurgicale au point de prélèvement pour éviter tout saignement. - un second prélèvement de sang à l'artère médiane de l'oreille controlatérale sur animal vigile mis dans une boite de contention (durée : environ 5 à 8 minutes), puis l’application de colle chirurgicale au point de prélèvement pour éviter tout saignement. - l’anesthésie de l’animal par injection intraveineuse d’un mélange d’anesthésiques sur animal vigile mis dans une boite de contention (durée : 1 minute), puis un prélèvement de sang terminal, jusqu'à la mort de l’animal (durée : environ 10 à 12 minutes).

Impact sur les animaux

Le protocole comprend différentes étapes sur les animaux inclus dans le projet : - une phase d'immunisation avec deux injections d'une suspension cellulaire sur animal vigile réalisées à 14 jours d’intervalle entrainant une douleur légère de courte durée ; - une phase de prélèvements avec deux prélèvements successifs à l'artère médiane de l'oreille sur animal vigile entrainant une douleur légère de courte durée ; - un prélèvement terminal sous anesthésie générale, entrainant une douleur légère de courte durée lors de l’anesthésie. Les prélèvements peuvent entrainer une anémie de courte durée (entre 2 et 6 jours) et celle-ci reste légère à modérée (selon une étude interne réalisée en 2023 sur le suivi de l’anémie des animaux par le biais de la mesure du taux d’hématocrite).

Devenir

Tous les animaux entrant dans la procédure sont mis à mort, puisque le protocole prend fin à la mort des animaux lors du prélèvement de sang sous anesthésie générale.

Remplacement

A l'heure actuelle des connaissances scientifiques, il n'existe pas de modèle alternatif au lapin pour la production d'anticorps polyclonaux tels qu'inclus dans la composition du médicament final. La diversité et la quantité d'anticorps produits par l'animal permettent une compatibilité sans équivalent avec un nombre très élevé de patients receveurs de greffes dans les différents pays du monde. Cette diversité n’est pas reproductible via la production d’anticorps in vitro. En effet, plus de 80 épitopes différents de cellules de l’immunité sont ciblés par le médicament, ce qui provoque chez le patient une immunosuppression majeure et durable.

Réduction

La procédure expérimentale appliquée a été définie afin d'obtenir la plus grande quantité possible de sérum par animal utilisé (sérum contenant la concentration requise en anticorps polyclonaux). De plus, un travail de sélection génétique mené sur les animaux reproducteurs de l'élevage a permis d'optimiser la quantité de sérum prélevée sur chaque lapin lors du prélèvement terminal, et d'améliorer la concentration en immunoglobulines du sérum produit. De plus, la répétition des prélèvements de sang, réalisée sous surveillance du bien-être des animaux, augmente la quantité moyenne de sérum prélevée par animal. Il est donc possible de fabriquer une plus grande quantité de médicament avec un nombre équivalent d'animaux utilisés. Enfin, les lapins mâles et femelles sont utilisés dans le cadre du protocole, ce qui permet d'inclure dans la procédure tous les lapins élevés au sein de l'établissement.

Raffinement

Les lapins sont hébergés dans des cages conformes aux exigences de la règlementation et de respect du Bien-Etre Animal, ils disposent d'un enrichissement adapté (diffusion de radio, mise à disposition de bûchettes de bois à ronger, de tunnels pour se cacher). Les animaux élevés ensemble depuis leur naissance sont de préférence hébergés dans la même cage, afin de limiter le risque d’agression entre lapins. Le suivi quotidien des animaux est assuré par des personnes expérimentées et formées régulièrement ; des fiches de suivi permettent d’enregistrer les soins adaptés prodigués aux animaux et de suivre l’évolution de l’état de santé des animaux. Un suivi renforcé est effectué sur les animaux durant les phases de prélèvements du protocole expérimental. Une évaluation de la souffrance animale en référence à une grille établie est réalisée chaque jour. La grille permet également de fixer les points limites et de cesser immédiatement l'expérimentation sur tout lapin présentant des signes de souffrance excessive. Une prise en charge spécifique de la douleur par l'application d'un protocole d'anesthésie générale validé est appliquée lors du dernier prélèvement de sang. Enfin, l'utilisation de colle chirurgicale lors de chaque injection intraveineuse ou prélèvement de sang assure un meilleur confort à l'animal.

Choix des espèces

A l'heure actuelle des connaissances scientifiques, il n'existe aucune méthode alternative permettant de produire le sérum entrant dans la composition du médicament humain in vitro. De plus, le médicament est sous autorisation de mise sur le marché avec utilisation exclusive du lapin, espèce qui fait référence dans la production d'anticorps polyclonaux pour l'usage pharmaceutique. L’AMM du médicament fixe également l’âge et le poids requis pour utiliser les animaux dans le cadre du protocole expérimental. Les lapins ne sont inclus dans la procédure d'expérimentation animale qu'à partir de l'âge de 14 semaines et pour un poids minimum de 2,8 Kg. C'est en effet à partir de cet âge que leur système immunitaire est capable de produire les anticorps nécessaires à la fabrication du médicament humain, en quantité et concentration suffisantes. Les animaux sont également aptes à supporter les différentes phases de la procédure (prélèvements de sang répétés notamment).

Pour mettre au point une prothèse mammaire biologique destinée à des femmes ayant subi une mastectomie, 10 cochons miniatures, tous des femelles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une lipoaspiration d'une heure, puis l'implantation sous la peau de quatre bioprothèses sous anesthésie générale, avant quinze jours d'hébergement en box individuel et jusqu'à douze pansements sur trois mois. Le porteur retient le cochon pour la ressemblance de sa peau avec la peau humaine, et des animaux de 15 à 30 kilos pour qu'ils aient assez de graisse à aspirer sans écraser les implants en position couchée. Les dix sont tués pour retirer les prothèses de leur corps.

Objectifs

L’objectif de notre projet est de développer une prothèse mammaire biologique permettant une reconstruction définitive, plus sur et de meilleure qualité aux femmes touchées par un cancer du sein (cela concerne plus de 20000 femmes par an subissant une mastectomie). On éspère ainsi reconstituer un sein natif à l'image des bioorganes en cours de developpement (decellularisation-recellularisation de cœur, foie, poumons etc). Cette nouvelle méthode permettrait ainsi d’allier les bénéfices d’une reconstruction par prothèses (simplicité, pas de morbidité du site donneur, une seule cicatrice) aux bénéfices d’une reconstruction à partir des propres tissus de la patiente (définitifs et resultats plus naturels).

Bénéfices attendus

Notre projet prévoit la création d'une bioprothèse mammaire. Cette bioprothèse agirait comme un néo-sein (néo-organe) : la matrice porcine decellularisée servirait d'echaffaudage aux cellules graisseuses de la patiente pour repeupler et recellulariser ce néo- sein. On éspère ainsi reconstituer un sein natif à l'image des bioorganes en cours de developpement (decellularisation-recellularisation de cœur, foie, poumons etc).Cette nouvelle méthode permettrait ainsi d’allier les bénéfices d’une reconstruction par prothèses(simplicité, pas de morbidité du site donneur, une seule cicatrice) aux bénéfices d’une reconstruction autologue (autologues, définitifs et resultats plus naturels).

Procédures

-Lipoaspiration (1h) -Implantation de bioprothèses biologiques en sous cutané (4 par animal sous anesthésie générale en 1h) - Prelevements sanguins si besoin (une fois / semaine pendant toute l'expérience soit 3 mois) si signes d'infections/rejets/inflammation des implants -Hebergements en boxe individuel 15 jours - Pansements (après evaluation par equipe veterinaire, fréquence maximale de 3 par semaine soit 12 au total) -Explantation des implants

Impact sur les animaux

L’implantation des implants biologiques sous cutanés chez le porc pourrait entrainer des douleurs d’intensité faible à modérée ainsi qu’une limitation possible de l’activité. L’infection de site opératoire est un évènement possible. Des douleurs d'intensités faibles à modérée sont possible au site de prelevements de la graisse et d'implantation des prothèses

Devenir

Mise à mort pour explantation des implants

Remplacement

Aucune alternative non animale n’est possible à ce stade du projet. Les expériences in-vitro ont déjà été réalisés et ont permis: 1) d’évaluer les échanges gazeux à travers la membrane de derme porcins décellularisés (passage de l’oxygène selon un gradient donné); 2) de démontrer que la matrice est imperméable à la molécule de transport de l’oxygène (moléule de grande taille); 3)démontrer in-vitro une amélioration de la survie des cellules adipeuses lorsqu’elles sont en contact avec la molécule de transport de l’oxygène comparativement à des cellules seules. Notre matrice est donc perméable à l’oxygène et imperméable à la molécule de transport de l'oxygéne permettant de créer un gradient en oxygène favorable à la survie des adipocytes. Les résultats in-vitro étant en faveur de l’efficacité de notre bioprothèse, nous en sommes donc au stade pré clinique de l’expérimentation.

Réduction

Deux groupes composés de 5 animaux chacun permettront de comparer l'efficacité de la solution Adipolife dans les échanges gazeux à l'intérieur de la bioprothèse et ainsi la survie des cellules graisseuses. Le mise en place de 4 implants par animal est une stratégie de réduction du nombre d’animal. . Ces deux groupes incluent le risque d'échec (2 echecs par groupes) par infection du site opératoire, ainsi en l'absence d'échecs moins d'animaux seront utlisés (6 seulement). 3 animaux par groupes étant indispensable pour obtenir une significativité statistique.

Raffinement

Toutes les conditions nécessaires à une antalgie efficace en per et post opératoire seront mises en place. Ainsi une surveillance accrue de la douleur en post opératoire sera réalisée, ainsi qu’un contrôle quotidien des sites opératoires pour s’assurer de l’absence de réaction inflammatoire ou infectieuse post opératoire. En cas de constatation de modification comportementale des animaux, l'équipe veterinaire sera alertée et consultée afin de determiner l'attitude therapeutique à adopter. Hébergement en boxe individuel – La méthodologie utilisée nous permettra d’assurer l’absence de souffrance inutile et le bien-être des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi). Les animaux sont mis en boxe commun dès que les conditions optimums nous le permettent

Choix des espèces

En matière de recherche en chirurgie plastique et reconstructrice, l’utilisation du porc se justifie par la proximité de la peau porcine avec la peau humaine. Ainsi l’anatomie de la peau du porc est semblable à celle des humains composés de trois couches, l’épiderme, le derme et l’hypoderme. Le prelevement de tissu graisseux par lipoaspiration dans le modèle porcin est une méthode decrite, reproductible et peu douloureuse chez cet animal. Des animaux femelles mini pig Yucatan pesant environ 15 à 30 kg seront utilisés dans cette expérience, nous avons besoin d'animaux présentant un important pannicule adipeux pour réaliser la lipoaspiration mais d'un poids modéré pour ne pas altérer les implants lorsqu'ils sont en position couchées.