Tests réglementaires

Fournir un modèle expérimental pour tester des traitements des complications oculaires du diabète : 2 180 souris et 2 180 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils sont rendus diabétiques par une injection de streptozotocine qui détruit les cellules du pancréas produisant l'insuline, puis une kératopathie leur est provoquée sur un œil après huit à seize semaines de diabète. Le porteur indique qu'au bout d'un mois les rats malades pèsent 50 à 60 % du poids des rats témoins du même âge, et décrit les examens oculaires comme semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet. Les gouttes peuvent être administrées six à huit fois par jour et les injections dans l'œil une à deux fois par semaine, pour des études d'efficacité relevant en partie de l'usage réglementaire.

Objectifs

Le taux élevé de sucre dans le sang entraine une cascade d’évènements impliquant des médiateurs de l’inflammation qui conduisent à la dégradation des cellules neuronales et des capillaires sanguins de la rétine.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est de proposer un modèle expérimental pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements des complications du diabète au niveau de la rétine et de la cornée qui sont invalidantes pour les patients et peuvent aboutir à la cécité. La recherche de traitement est en constante évolution, pour intervenir à différents stades de la maladie et preserver au mieux la visions des patients.

Procédures

L’induction du diabète chez les rats et les souris se fait par injection intrapéritonéale d’une molécule qui rend les animaux diabétiques. Le taux de glycémie sera contrôlé sur bandelette une à trois fois dans l'étude par le prélèvement d'une goutte de sang à la queue de l'animal ou au niveau de la mandibule. L'induction de la kératophatie se fera uniquement sur un œil et par un acte unique après une période de 8 et 16 semaines de diabète, la procédure ne durera pas plus de 10 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens au biomicroscope) mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les animaux sont rendus diabétiques par injection de Streptozotocine. La streptozotocine détruit les cellules du pancréas qui ne produit plus d’insuline et ne peut plus controler la glycémie. L’hyperglycémie altère vaisseaux et nerfs avec une répercussion sur différents organes, comme la neuropathie, les troubles cardiovasculaires, la néphropathie, et la rétinopathie. Les animaux diabétiques ont un besoin de boire et des urines accrus, et perdent du poids. Ils perdent du tonus et prennent un aspect vouté au cours du temps. Les animaux n’ont plus ou peu de gain de poids malgré une consommation d’eau et de nourriture accrue. Au bout d’un mois de diabète, le poids des rats malades représente 50 à 60 % du poids des rats contrôles du même âge, la différence semble moins importante chez la souris et serait plutôt autour de 80% du poids des souris contrôles non induites au bout d'un mois de diabète.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. Le recours à un modèle animal est nécessaire en raison de la physiologie particulière l'oeil composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen) en interaction les uns avec les autres. Le développement de la kératopathie diabétique ne peut être mimé par un modèle alternatif.Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur l'efficacité ou non d'un traitement. Une analyse de puissance avec un calcul de l’effectif sera réalisé ce qui permettra d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. L'analyse des deux yeux sera effectuée chaque fois que possible afin de réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum, de l’enrichissement adapté (abri et morceaux de bois à ronger). En raison de la polydipsie et de la polyurie des animaux diabétiques, la litière sera changée plus fréquemment (1 fois par jour), et un biberon supplémentaire sera ajouté. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.

Choix des espèces

Ce modèle est bien décrit sur ces espèces dans la littérature et l’apparition des signes cliniques recherchés de la cornée diabétique est bien documentée chez la souris pigmentée (Young L, et al 2014) ou le rat albinos. Les animaux, rats et souris, seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie, âgés de 6 semaines minimum à l'induction du diabète conformément aux publications de référence qui servent de base à ce modèle. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation d'un minimum de 5 jours.

Un prélèvement sanguin de grand volume par piqûre dans le cœur, sous anesthésie sans réveil et pouvant provoquer un arrêt cardiaque, attend chaque souris en fin d'expérience. 1 440 souris CD-1 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et environ 288 d'entre elles, écartées du protocole faute d'un poids suffisant ou à cause d'un problème à l'injection, sont d'abord utilisées pour l'entraînement à des gestes techniques avant d'être tuées. Les autres reçoivent une injection dans la veine de la queue puis quatre prélèvements de sang par éraflure de cette même veine, sur vingt-huit jours, pour mesurer la tolérance de candidats médicaments anticancéreux. Le porteur affirme qu'un "organisme entier" et vivant est "nécessaire" et qu'"aucune alternative" ne peut se substituer à la souris.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer la tolérance lors de l’administration des candidats de thérapie ciblée anticancéreuse. Les données de tolérance sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats anticancéreux dans la circulation sanguine en dose unique. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de tolérance (projet actuel), seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, à définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Ils permettront également d’objectiver des évènements indésirables. La première dose de cette étude sera déterminée en se basant sur une dose de référence connue, efficace et bien tolérée.

Bénéfices attendus

Les données de tolérance seront nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats anticancéreux dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et ainsi, à terme, de déterminer les doses et les fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

# Une contention et des prélèvement(s) sur animal vigile seront prévues sur chaque animal : -lors de l’injection par voie intraveineuse dans le veine de la queue des candidats anticancéreux J(0) (5minutes) -lors de chacun des prélèvements sanguins (en éraflant la veine de la queue pour ne prélever qu'une goutte de sang) à chaque temps (J(-3), J(0), J(3) et J(9) post-traitement - 5 minutes). Une anesthésie générale sans réveil sera effectuée sur chaque animal en fin d’expérimentation et/ou atteignant les critères éthiques pour effectuer un prélevement sanguin final de grand volume, suivie d’une mise à mort (10 minutes).

Impact sur les animaux

Projet en sévérité modérée: # Les animaux subirons un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions et (4) anesthésies. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de l’injection par voie intraveineuse des candidats anticancéreux (au temps J(0)), et (2) de chacun des prélèvements sanguins (en éraflant la veine de la queue pour ne prélever qu'une goutte de sang) à chaque temps (J(-3), J(0), J(3) et J(9) post-traitement). Ces prélèvements faibles sont généralement très bien tolérés par l'animal. # S’agissant d’une expérience de tolérance, les composés de la classe thérapeutique utilisée peuvent induire des évènements indésirables à haute dose (parmi les plus attendus : perte d’appétit, fatigue, diarrhées, perte de poils…). Il est à noter que ces effets sont généralement transitoires (environ une semaine pour les doses les plus fortes et culminant autour du 3ème jour post-traitement). Il est à noter que ces études ne sont pas conditionnées à une atteinte de la dose maximale tolérée chez l'animal et que la dose maximale de cette étude est plafonnée à une dose considérée comme bien tolérée en clinique pour cette classe de médicaments. # Un prélevement sanguin final de grand volume, pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil sur l’ensemble des animaux arrivant en fin d’expérience (à 28 jours post-traitement) ou en cas d'atteinte des critères éthiques.

Devenir

# Tous les animaux ayant atteint les critères éthiques ainsi que les animaux arrivant en fin d’expérience à 28 jours post-traitement auront un prélèvement sanguin de grand volume (par piqure dans le coeur) effectuée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil. # Les animaux non entrées en protocole (problème à l'injection, poids inférieur à 24g... env 20%), seront réutilisées pour pouvoir pratiquer des entrainement aux geste techniques, puis mises à mort selon les critères de la formation sous controle de la SBEA et/ou controle vétérinaire.

Remplacement

S’agissant d’analyses de tolérance, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse étudiés dans ce projet ayant une efficacité comparable entre humains/souris aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le procédé de micro-échantillonnage lors des prélèvements sanguins permet d’obtenir l’ensemble des valeurs pour un même animal en ne lui prenant que de très faibles quantités de sang. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus seront également mieux maîtrisées. En cas d’obtention de la dose maximum tolérée, les animaux prévus pour les doses suivantes seront annulés. Les animaux étant livrés chaque semaine pour les différents tests de dose, cela permettra de diminuer le nombre d’animaux entrés en protocole. Pas d’utilisation de groupe contrôle nécessaire par rapport aux échantillonnages de par l’utilisation d’un prélèvement sur les souris en expérience à J(-3) avant traitement par les candidats anticancéreux (permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux).

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Chaque essai de dose sera séparé du précédent d’une semaine, ce qui permettra d’ajuster au mieux les doses (ainsi que la souffrance résultant d’utilisation de doses trop élevées). Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et d’éviter au mieux toute souffrance animale. Les animaux seront observés sur critères physiques et comportementaux deux fois par jour pendant les trois premiers jours de traitement, puis une fois par jour jusqu’à la fin de l’expérience à J(28), et seront pesés une fois par jour pendant la première semaine, puis trois fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience à J(28). Un système de surveillance est mis en place au sein de l'établissement utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le week-end et les jours fériés. Les animaux inclus dans la grille de score n'atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement...). Une pommade antalgique/anesthésique pourra également être utilisée en cas d’inflammation au site d’injection. Le prélèvement sanguin final de grand volume sera effectuée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil et la mise à mort de l'animal sera assurée par surdose d'anesthesiques. Les prélèvements d’organes seront réalisés après la mort de l'animal.

Choix des espèces

S’agissant d’analyses de tolérance, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse étudiés dans ce projet ayant une efficacité comparable entre humains/souris, aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études. En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de pharmacocinétique (le devenir du médicament dans le sang au cours du temps) seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux les doses et les fréquences d'administration de ces candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse chez l'Homme. Les animaux seront livrés à 7 semaines de développement et inclus en expérience à 8 semaines . A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une tolérance pertinente par rapport au type de thérapies utilisées dans ce projet.

Préparer les études réglementaires à venir est la fonction déclarée de ce projet cadre, qui prévoit jusqu'à cinquante études par espèce sur cinq ans, avec trente rats ou cinquante souris par étude. 2 500 souris et 1 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 000 d'entre eux étant réutilisés ensuite dans d'autres projets, à des fins de formation ou pour constituer des bibliothèques de tissus, les autres étant tués. Un même animal peut subir une vingtaine d'interventions par semaine, dont douze prélèvements de sang, jusqu'à seize heures en cage métabolique et autant de mise à jeun. Le porteur ne nomme aucun des tests comportementaux employés, désignés par les seuls domaines explorés, locomotion, sociabilité, communication, sensoriel, et fonde le recours au rongeur sur une exigence réglementaire, la norme ICH M3(R2).

Objectifs

Ce projet ne comporte qu’une seule procédure, au sein de laquelle seront réalisées des études exploratoires multidisciplinaires dans un modèle rongeur. Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier, en recherchant/vérifiant les homologies avec l'Homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce). Ces études peuvent permettre de comprendre grâce à des investigations perfectionnées les mécanismes de toxicité (toxicité rénale, hépatique, testiculaire, etc.) ou de carcinogénicité observée dans des études précédentes, d'établir la pertinence de certains effets observés chez le rongeur en comparaison avec l’Homme (ex : effets sur le système immunitaire, recherche de biomarqueurs, effets sur le comportement), avec pour but d'assurer la santé des patients humains (composés pharmaceutiques) et/ou la sécurité des personnes exposées (produits chimiques). Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans une espèce rongeur. Ces études sont aussi utilisées pour choisir une voie d'administration efficace et adaptée chez le rongeur, ou pour démontrer la validité de nouvelles techniques d'investigations. Il est prévu d'utiliser en moyenne 30 rats, ou 50 souris par étude, et de réaliser jusqu'à 50 études par espèce sur la durée du projet (5 ans).

Bénéfices attendus

Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier. De plus ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, et aussi de bien choisir les doses dans les premières études règlementaires. Ces études permettent d’obtenir une meilleure connaissance du composé et du modèle animal, pour une meilleure conception/design des études réglementaires à suivre, que ce soit du point de vue du choix des doses, mais aussi dans le choix des voies d’administrations, du nombre d’animaux, etc. D’un point de vue éthique, une réduction du nombre d’animaux dans les études futures est potentiellement possible, et la douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables sera minimisée au maximum. L’utilisation de tests neurocomportementaux dans le cadre de ce projet permet une approche par des méthodes non invasives, dans le cadre des 3Rs (Raffinement).

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi par injection intramusculaire, voies sous- cutanée ou intraveineuse, etc.) de façon journalière ou hebdomadaire avec le composé d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études varie entre 1 jour et 1 an. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) et des recueils d’urines et /ou de feces sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h). Pour les tests de comportements, ils sont toujours faits après une administration unique par test, les tests sont non invasifs, avec manipulation et contraintes limitées des animaux et observation par suivi video (domaines explorés : locomotion, sociabilité, communication, sensoriel), d’une durée maximale d’une heure ; un seul test est réalisé par jour maximum et dans la limite de 3 dans la même semaine d’examen, sur une durée d’étude de 3 mois maximum. Dans tous les cas où l’hébergement individuel est requis , les animaux restent en contacts visuels, auditifs et olfactifs avec les autres animaux en hébergement individuel ou non.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent : - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle) ; - aux effets systémiques du composé testé (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire). - à l’hébergement individuel (rare) en cas de nécessité absolue

Devenir

Si l’état de santé des animaux le nécessite, l’avis et/ou l’intervention d’un vétérinaire seront requis, mais si la souffrance d'un animal est jugée trop importante et si aucun soin ne peut lui être apporté, il sera euthanasié selon une procédure éthiquement acceptable. Chaque fois que cela sera envisageable (ex : animaux contrôles), les animaux seront réutilisés dans d’autres projets, ou à des fins de formation, ou pour réaliser des bibliothèques de tissus.

Remplacement

Les explorations dans ce projet s'appuient parfois/souvent sur des études vitro préalables, mais ne peuvent pas être menées in vitro. Il n’existe pas toujours de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Il n'existe pas de méthodes alternatives à l'heure actuelle qui permettent de remplacer les tests neurocomportementaux prévus dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude : un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, etc En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel, consommation de nourriture et/ou d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés, etc.), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin (ex : via veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire, saphène, etc.) sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, comme les administrations intramusculaires et intra-articulaire. Les rongeurs sont hébergés en groupe (il doit être évité le plus possible tout hébergement individuel d’individus). Cependant, certaines situations expérimentales exigent l’hébergement individuel et devront être dûment argumentées (comportements antisociaux comme chez la souris mâle, voie d’administration dermale, par exemple). Pour certains produits (exemple : CNS) une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant la toute première administration.

Choix des espèces

Au-delà des aspects opérationnels (manipulation), le recours à une espèce rongeur dans le développement préclinique est une exigence réglementaire (ICH M3(R2), CPM/SWP1042). C’est aussi une espèce de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) qui permet le classement de produits chimiques dans de nombreuses classifications de dangers. Le rat est souvent utilisé car il reste d'une taille suffisante pour l'observation des lésions (la souris étant petite et plus sujette à variabilité ou parfois plus sensible à certaines classes de produits) ou car il est le seul modèle validé (exemple perturbateur endocrinien). La souris est parfois préférée au rat pour raison d’homologies avec l’homme (exemple paramètres immunologiques). Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs dont notamment : résultats déjà existants, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique, ou incompatibilité avec une autre espèce animale, par exemple. Les animaux ont en général 5 à 12 semaines d’âge en début de traitement pour assurer une administration pendant la phase de croissance. Dans certains modes d'administration, (voie dermale, souris) les animaux pourront être plus âgés de quelques semaines pour répondre à des conditions expérimentales particulières (ex : pour avoir un poids plus élevé, ou un âge en adéquation avec la maturité sexuelle) ou pour des raisons scientifiques (ex : maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux.

Provoquer des démangeaisons chez des chiens en bonne santé pour trier des molécules candidates à la mise sur le marché : c'est l'objet de ce projet, qui concerne 200 chiens dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun peut recevoir jusqu'à cinq injections intraveineuses d'une solution prurigineuse, espacées d'une semaine, chaque crise durant environ deux heures pendant lesquelles il se gratte, se lèche et se mordille. S'y ajoutent des prises de sang sur animal éveillé et, à l'occasion, des raclages ou des biopsies de peau, le porteur affirmant qu'aucune méthode alternative ne reproduit un comportement de prurit et que cette étape reste "indispensable". Aucun chien n'est tué : 180 seront réutilisés dans d'autres projets, 20 proposés à l'adoption.

Objectifs

L’objectif du projet est d’utiliser un modèle validé de prurit transitoire et modéré, provoqué par une administration intra-veineuse dune solution prurigineuse chez le chien, pour la sélection de futures molécules thérapeutiques pouvant entrer dans la composition de nouveaux médicaments destinés à une mise sur le marché pour traiter entre autres, la dermatite atopique canine (DAC) ou d’autres pathologies entraînant des comportements de prurit chez le chien. L’utilisation a de ce modèle maitrisé permettrait d’évaluer, premièrement l’efficacité, secondairement la tolérance, le profil pharmacocinétique de molécules et également de suivre l’évolution de certains bio-marqueurs de l’inflammation dans notre modèle avec et sans traitement.

Bénéfices attendus

La DAC est la deuxième cause de démangeaisons chez le chien avec environ 10% de la population canine mondiale touchée. C’est une dermatose inflammatoire, prurigineuse liée à une prédisposition génétique associée au développement d’allergie à des allergènes variés entrainant des altérations de la barrière cutanée. Elle se caractérise par du prurit, des lésions cutanées plus ou moins caractéristiques et nécessite des soins coûteux et chronophages de la part du propriétaire tout au long de la vie de l’animal. Sa gravité réside principalement dans son impact sur la qualité de vie du chien et de son propriétaire. Tout ceci pouvant, à terme, être une cause de demande d’euthanasie. Le traitement et la gestion à long terme de la dermatite atopique sont difficiles. La majorité des traitements anti-inflammatoires ou immunomodulateurs sont susceptibles de causer des effets secondaires, surtout quand ils sont utilisés à forte dose et/ou de façon répétée, quotidienne ou prolongée. La recherche de nouveaux traitements pour un contrôle efficace et sûr de cette maladie chronique doit être évaluée sur l’espèce de destination lors d’un épisode clinique. La maitrise et le maintien d’un modèle induisant des signes cliniques similaires aux crises de prurit observées chez les chiens souffrant de DAC spontanée, permettent d’évaluer l’efficacité d’un traitement dans des conditions réelles, d’améliorer les phases de screening de nouvelles molécules et ainsi de sélectionner plus vite et de façon plus sûre, des molécules présentant une probabilité de succès importante sur un nombre optimisé d’animaux. Un modèle de prurit présente plusieurs avantages par rapport aux dermatites atopiques de terrain. Lors d’un comportement de prurit expérimental, les caractéristiques du prurit sont suivies en temps réel et en continu pendant toute la période d’expression, standardisée lors de la validation du modèle. Un suivi rapproché par des personnes formées dans des conditions standardisées permet une évaluation de l’efficacité. Ce modèle permet aussi une évaluation de la tolérance, du profil pharmacocinétique des molécules testées et offre la possibilité de rechercher et/ou de suivre l’évolution des bio-marqueurs d’intérêt. C’est un grand avantage de pouvoir récolter autant d’informations dans l’espèce de destination par procédure expérimentale dans un modèle transitoire, représentatif d’un comportement observé dans la DAC spontanée.

Procédures

Au cours de ces études, les animaux pourront recevoir, par voie intraveineuse, une solution entrainant des démangeaisons raisonnables et contrôlées. Ses administrations pourront être répétées au cours d'une étude, sans toutefois dépasser les 5 fois avec au minimum 1 semaine de récupération entre les administrations. Des voies d'administration telles que la voie intramusculaire, la voie sous-cutanée, la voie transcutanée ou la voie orale pourront être utilisée pour l'administration du produit a tester. Les volumes administrés seront en accord avec les bonnes pratiques vétérinaires. Selon l’objectif de l’étude, des prélèvements sanguins pourront être réalisés. Ces derniers sont réalisés sur animaux vigiles. Les volumes totaux de sang prélevés suivent les volumes définis pour respecter le bien-être animal. Exceptionnellement, selon l’objectif de l’étude, des prélèvements de cutanés par raclage ou biopsie pourraient être réalisés. Selon les prélèvements à réaliser, une anesthésie associée à une analgésie adaptées seront mises en place selon les procédures en vigueur de l'établissement utilisateur.

Impact sur les animaux

Les chiens recevant une injection d’une solution prurigineuse développent des signes modérés et transitoires de prurit, pouvant provoquer de l’inconfort : grattage, léchage, mordillements ou frottements de n’importe quelle partie du corps. Les signes cliniques apparaissent généralement dans les 30 minutes après l’injection et tous les signes de prurit disparaissent spontanément quelques heures après cette injection (le plus généralement dans les 2 heures suivant l’injection). Des prélèvements sanguins répétés pourront également générer un inconfort. Des biopsies de peau pourraient être collectées peuvent également générer un inconfort et/ou une douleur légère à modérée. Avant de conduire des études d’efficacité en utilisant ce modèle, des informations de tolérance chez le chien sont disponibles pour les produits à tester (dose maximale tolérée chez le chien et/ou une autre espèce pertinente, effets secondaires potentiels). Des réactions d’intolérance sévère liées aux produits évalués ne sont donc pas attendues. Les phases de traitement/prélèvements sur un animal vigile peuvent occasionner un(e) léger(e) stress/gêne/contrainte en raison de la légère contention nécessaire pour le traitement/recueil des échantillons le cas échéant.

Devenir

Ils seront réintroduits dans la colonie des animaux hébergés dans les locaux de l’EU. Les informations concernant chaque animal sont conservées et consultées avant une réutilisation potentielle d’un animal dans un autre projet.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de reproduire un comportement clinique de prurit chez le chien et d’évaluer l’impact de nouvelles molécules sur l’intensité de l’expression clinique de la crise de prurit. L’utilisation de techniques in vitro préalables à l’utilisation de ce modèle in vivo permet de sélectionner en amont des molécules avec un fort potentiel d’activité sur le processus d’apparition du prurit impliquant certaines interleukines et ainsi de minimiser le recours au modèle in vivo. Cependant, la complexité des mécanismes biologiques en jeu ne pouvant pas être reproduite in vitro, cette étape demeure indispensable avant de prendre une décision sur la potentielle efficacité clinique d’une molécule chez le chien et l’éventuelle poursuite de son développement à des fins thérapeutiques.

Réduction

Les comportements de prurit présentent une variabilité entre individus. L'expérience avec ce type de modèle nous montre qu'il faut déterminer le nombre minimal d'animaux par groupe permettant d’obtenir des résultats exploitables et répétables. Ce sont le plus souvent, des études de preuve de concept/pilotes, étapes précoces de l'évaluation d'un nouveau produit/composé actif utilisant 3 à 6 animaux par groupe, qui permettront de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour des études ultérieures réglementaires. L'évaluation et l'interprétation des résultats sont faites avec une échelle de score adaptée pour ce modèle. Il est possible de réduire le nombre d'animaux par groupe, au cas par cas, selon la finalité de la procédure expérimentale. Cette décision sera dûment justifiée dans le plan d'étude spécifique dans le cadre de ce projet. Dans le plan d'étude, le nombre d'animaux par groupe sera toujours argumenté et justifié sur la base des informations déjà disponibles, de manière à optimiser l'utilisation des animaux et à en réduire leur nombre tout en s'assurant que ce nombre d'animaux permette d'atteindre l'objectif de l'étude, c'est-à-dire que les résultats de l'étude permettent de prendre une décision sur le niveau de sensibilisation et/ou l'efficacité du produit/des produits évalués. En plus d'étudier le contrôle du prurit (effet pharmacodynamique), l'utilisation d'un modèle permet d’obtenir éventuellement un profil pharmacocinétique en parallèle. Ces paramètres pourront être combinés et permettre par modélisation pharmacocinétique/pharmacodynamique (PK/PD) d’établir une relation entre l’effet et la dose et ainsi proposer une dose thérapeutique adaptée. Lors de ce modèle pourra aussi être réalisée une évaluation de la tolérance générale de la molécule. Toutes les informations obtenues lors d’une seule étude sur ce modèle permettent de diminuer le nombre d’études à réaliser pour statuer sur l’intérêt d’une nouvelle molécule ou de contribuer au développement d’une molécule à des fins thérapeutiques, et de ce fait, de diminuer le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont observés et manipulés quotidiennement depuis leur arrivée sur le site afin de les habituer à la contention et au contact du personnel formé et impliqué dans les études. Les traitements et prélèvements sont réalisés généralement sur animaux vigiles selon les procédures en vigueur au sein de l’EU. Pour les chiens, une contention légère est suffisante pour l’administration du traitement et les collectes d’échantillons, et elle n’induit pas de nuisance au bien-être des animaux autre que d’être maintenus pendant des temps très courts. Les volumes prélevés et les temps de récupération des animaux sont déterminés de manière anticipée pour s’assurer que le bien-être ne sera pas altéré. Dans le cas d’administrations ou de prélèvements spécifiques (biopsie de la peau ), les animaux pourront être anesthésiés localement ou totalement pendant la durée de l’acte. L’anesthésie et le réveil des animaux se feront sous la surveillance d’un vétérinaire et selon les procédures en vigueur au sein de l’EU. Dans le cadre de ce Projet, les animaux sont préalablement testés pour leur capacité à exprimer un comportement de prurit modéré, reproductible, contrôlable et de durée limitée (environ 2h). Depuis leur inclusion dans une étude du projet jusqu’à la fin de la phase animale, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel formé. Des observations plus fréquentes (toutes les 15 minutes) sont prévues après l’injection de la solution prurigineuse et l’administration des produits testés, pendant au moins 2h30, pour s’assurer que l’apparition des signes cliniques attendus (prurit) n’entraine pas de dégradation importante de l’état général et du bien-être de l’animal ainsi qu'une bonne tolérance au traitement. Le comportement général, la respiration, le grattage et l’aspect de la peau sont évalués avec une grille qui permet de définir si les réactions sont absentes, légères, modérées ou sévères. Ces critères constituent des points limites qui une fois atteints ou dépassés, entraineront un examen vétérinaire et éventuellement l’administration d’un traitement adapté à sa condition clinique. La réaction aigue induite et l’inconfort que l’injection de prurigineux engendre, peuvent être contrôlés avec des molécules anti-prurigineux. La grille d’évaluation des observations et les points limites sont validés par le comité d’éthique et pourront être révisés après analyse rétrospective par la SBEA, des résultats obtenus pendant chaque étude.

Choix des espèces

Les produits vétérinaires doivent réglementairement être testés dans l’espèce pour laquelle le produit est développé (animal de « destination »), dans ce cas, le chien. Les modèles seront réalisés chez des chiens jeunes adultes sains, c’est à dire des animaux de plus de 6 mois avec un système immunitaire mature.

Caractériser un candidat médicament développé par une société privée, l'O2L-001, en vue d'un essai clinique annoncé dans deux ans: 160 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués pour l'histologie ou pour quantifier les traceurs injectés. Cinquante d'entre eux reçoivent une injection du produit directement dans le cerveau, cinquante autres dans les ventricules cérébraux, soixante subissent la pose d'un cathéter intraveineux et cent passent une IRM de quatre-vingt-dix minutes. Sur les effets subis par les rats, le RNT tient en une ligne, des douleurs, sans autre précision. Le projet relève à la fois de la recherche fondamentale, du contrôle qualité et des tests réglementaires d'efficacité et de tolérance, pour un produit dont l'entrée en clinique est déjà annoncée.

Objectifs

Cette étude cherche à examiner les caractéristiques d'un nouveau médicament appelé O2L-001, développé par la société Op2lysis pour traiter les hématomes qui se forment après des saignements cérébraux. Ce médicament contient un ingrédient actif nommé OptPA, qui est une version améliorée d'une substance utilisée pour dissoudre les caillots sanguins. L'OptPA a été modifié de manière à être moins toxique et à provoquer moins d'effets secondaires que les traitements actuels. Pour le rendre encore plus efficace, il est mélangé avec un matériau spécial appelé Poloxamère 407. Ce matériau se comporte comme un liquide lorsqu'il est injecté, mais se transforme en gel à la température du corps (37°C) pour libérer le médicament lentement dans l'hématome, aidant ainsi à dissoudre le caillot plus efficacement. L'objectif principal de cette recherche est d'en savoir plus sur les propriétés de l'OptPA et de comprendre comment O2L-001 fonctionne dans le corps.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'apporter de nouvelles connaissances sur l'O2L-001 et sur son principe actif l'OptPA. L'O2L-001 est une nouvelle génération de thrombolytique qui vise à être testé en clinique d'ici 2 ans pour le traitement et l'évacuation des hématomes formés suite à un AVC hémorragique.

Procédures

1- Pose de cathéter intraveineux pour injection d’OptPA, tPA ou NaCl (30 minutes/animal, n=30 animaux) 2- Pose de cathéter intraveineux pour récupération de sang (30 minutes/animal, n=30 animaux) 3- Injection intracérébral d’O2L-001, de Nacl ou O2L-001+Gadolinium (1h/animal, n=50 animaux. 4- Injection intraventriculaire d’O2L-001, de Nacl ou O2L-001+Gadolinium (1h/animal, n=50 animaux) 5- IRM (90 minutes environ, n=100 animaux) 6- Imageur IVIS® (5 minutes environ, n=20 animaux)

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'apparaitre chez les animaux seraient des douleurs.

Devenir

Les animaux feront l'objet d'une mise à mort, soit, afin de générer des tissus permettant des observations histologiques, soit, pour quantifier les traceurs injectés.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Le rat est l’une des espèces les plus utilisés dans les études de pharmacocinétique et de pharmacodynamique. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 160 rats seront nécessaires pour réaliser cette étude et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrales et d’étudier la distribution du produit permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux : 160 animaux) a été évalué via un test statistique.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad lithium. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Après le réveil des animaux à l’issu de la chirurgie, les animaux seront observés jusqu’à l’obtention d’un comportement animal normal. La moitié de la cage des animaux sera placé sur une couverture chauffante leur donnant le choix quant à la température de la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour accès plus simple à l’alimentation après la chirurgie. Le transport des animaux en salle d’expérimentation sera réalisé en limitant les secousses et le bruit. La température de la salle d’expérimentation est contrôlée et adaptée au bien être des animaux.

Choix des espèces

Le rat est l’une des espèces animales les plus utilisées pour les études de pharmacodynamique et de pharmacocinétique. L’anatomie du système nerveux ainsi que la physiologie du rat sont également documentés et relativement proches de ceux de l’Homme. C’est donc via l’utilisation d’approches expérimentales fiables et maitrisées, que le rat représente un bon modèle pour ce projet de recherche. En effet, l’ensemble des connaissances dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement adéquate à cette étude. Les rats utilisés dans cette étude seront âgés de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte, ce stade est adapté aux études de pharmacocinétique et pharmacodynamique.

Obtenir l'autorisation de mise sur le marché de dispositifs médicaux, prothèses, pansements, ovules ou gels lubrifiants : 434 lapins vont être utilisés dans des tests d'irritation cutanée, oculaire, vaginale, rectale et intradermique, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les réactions attendues vont de l'érythème à l'escarre, avec destruction de l'épiderme et du derme, œdème, et pour l'œil larmoiement, œdème de la cornée et atteinte de l'iris, effets pouvant persister jusqu'à la fin de l'étude, soit vingt et un jours. Les lapins sont hébergés seuls jusqu'à sept semaines et maintenus dix à vingt minutes sur un portoir de contention pour les traitements vaginaux quotidiens. Le porteur précise que les antalgiques ne sont administrés que dans les tests oculaires, "puisque ce sont les exigences de la norme utilisée", et que cette même norme impose l'espèce, 232 lapins peu ou pas irrités étant réutilisés dans un autre test et les autres tués.

Objectifs

Les professionnels de santé utilisent aujourd’hui des dispositifs médicaux (prothèses, pansements, ovule, gel lubrifiant...) que nous appelons « DM ». Le but du projet est d’évaluer la biocompatibilité de ces dispositifs. Autrement dit nous devons déterminer si les dispositifs, qui vont avoir un contact direct avec les tissus et fluides interne, sont compatibles avec le corps humain. Parmi les paramètres à étudier pour évaluer la biocompatibilité d’un DM, il faut évaluer sa tolérance locale, autrement dit sa capacité à ne pas induire de réactions d’irritation. Afin de répondre aux obligations règlementaires avant mise sur le marché de produit, nous réaliserons sur le modèle du lapin des tests d’irritation cutanée, oculaire, vaginale, rectale, et intradermique. Cette évaluation est imposée par les instances règlementaire européennes.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’obtenir des données expérimentales utilisées pour conclure sur la sécurité biologique d’un DM, autrement dit sa biocompatibilité. Ce projet fait partie intégrante de l’évaluation biologique des DM, une exigence essentielle en matière de sécurité requise par le Règlement Europpéen et exigée par les organismes notifiés afin d’accorder ou non la mise sur le marché. Le but est d’obtenir une autorisation de mise sur le marché de DM sans risque pour la santé de l’homme.

Procédures

* Tolérance cutannée : Un traitement local (maximum 24h) sur 3 animaux vigiles. En fonction du projet le traitement peut être répétés, la durée peut varier. Deux pesées. Observations macroscopiques tous les jours jusqu’à la fin de l’étude. Euthanasie (1minute). *Tolérance intradermique : Un traitement (5minutes) sur 3 animaux vigiles. Deux pesées. Observations macroscopiques tous les jours. Euthanasie (1minute). *Tolérance oculaire : Analgésie (30 sec) au début de l'étude et si besoin pendant le déroulé du projet. Un traitement local dans le sac conjonctival sur 3 animaux vigiles (1minute). Deux Pesées. Observations macroscopiques tous les jours, nécessitant un colorant (2minutes). Euthanasie (1minute). * Tolérance sur muqueuse vaginale et anale : Traitements vaginaux quotidien (espacés de 24h) sur 6 (traitement d’un produit pur) ou 12 (traitement par extrait) animaux vigiles. Les animaux restent sur le portoir de contention entre 10 et 20 minutes selon le nombre d’animaux à traiter. Deuxpesées. Observations macroscopiques tous les jours. La durée de l’étude et le nombre de traitement peut varier en fonction du projet. Euthanasie (1minute). Autopsie et prélèvement des organes.

Impact sur les animaux

*Tolérance cutanée : les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Il peut y avoir une sécheresse cutanée, une perte de souplesse de la peau, un érythème pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte, une destruction de l’épidermes et du derme, et de l’œdème. Les effets observés peuvent restés jusqu’à la fin de l’étude, soit 14 jours. *Tolérance oculaire : les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Il peut y avoir du larmoiment, de l’œdème, des conjonctives, de l’érythème, une atteinte cornéenne (opacitée, néovascularisation, œdème cornéen), une atteinte de l’iris. Les effets observés peuvent restés jusqu’à la fin de l’étude, soit 21 jours. * Tolérance intradermique : les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Il peut y avoir un érythème pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte et de l’œdème. Les effets observés peuvent restés jusqu’à la fin de l’étude, soit 3 jours. * Tolérance sur muqueuse vaginale et anale : les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Il peut y avoir un érythème, de l’œdème et des écoulements. Les effets observés peuvent restés jusqu’à la fin de l’étude, durée du traitement varie en fonction du projet. L'ensemble des procédures sont classées en modérées. Les animaux étant hébergés individuellement, ils ont un contact limité avec leurs congénères ce qui limite également l’expression de comportements grégaires (durée d'hébergement maximal: 7 semaines).

Devenir

Concernant les tests de tolérance cutannée et oculaire, les lapins n’ayant pas présenté de signes d’irritation ou des signes très légers et uniquement sur les trois premiers jours d’observation peuvent être récupérés pour être réutilisés dans une autre procédure utilisant une voie d’administration différente. Ceci dans un souci d’éthique animale et de réduction des animaux utilisés. Si les signes d’irritation observés sont plus importants, alors les animaux ne pourront être réutilisés car ils auront été traités avec une substance d’essai classée à minima irritante pour la peau. Dans ce cas là les animaux seront euthanasiés. Pour les tests de tolérance intradermiques, les animaux sont euthanasiés à la fin de l’étude. Les tests de tolérance sur muqueuse vaginale ou anale conduisent également à l’euthanasie des animaux puisque des analyses histopathologiques sont nécessaire à la conclusion de l’étude.

Remplacement

Pour l’ensemble des études de tolérance locale, tout matériau connu pour être irritant pour la peau, les yeux ou les muqueuses ou ayant un pH ≤ 2.0 ou ≥ 11.5 ne doit pas être testé. Dans des cas exceptionnels où une caractérisation/évaluation des risques est nécessaire malgré cela, ces cas doivent être justifiés et documentés. Par ailleurs, les tests d’irritation ne doivent être envisagés que si les données de sécurité ne peuvent pas être obtenues par d’autres moyens. A l’heure actuel un test in vitro est aujourd’hui accepté par les autorités règlementaires et peut être utilisé pour remplacer certains tests in vivo. Ce test est également régi par la norme 10993-23 (+ adaptation de l’OCDE 439). Il permet d’évaluer la tolérance locale pour les extraits des DM en contact avec une peau saine et lésée. Néanmoins lorsque le dispositif est un mélange, un implantable long terme, permet une communication interne externe ou qu’il est en contact avec les muqueuses les tests in vivo seront toujours recommandés. Le test in vitro repose sur la mesure de la viabilité cellulaire à travers l’utilisation d’épiderme reconstruit. Ces épidermes sont constitués de plusieurs couches de cellules épidermiques et d’une couche cornée enfin de créer une véritable barrière cutanée qui pourrait donc s’apparenter à la peau. Pour mesurer cette viabilité nous utilisons un produit chimique qui va pénétrer dans les cellules vivantes et sera réduit par les mitochondries en sel bleu de formazan et donc donnera une couleur violette. La lecture de la viabilité se fait ensuite par mesure de densité optique. Aujourd’hui, aucun test in vitro n’est accepté par les autorités règlementaires pour évaluer l’effet irritant d’un dispositif médical sur les yeux (norme ISO 10993-23). Une veille technologique et scientifique est effectué régulièrement par le groupe afin de rester attentif à des avancés scientifique et parution de nouvelles normes qui permettrait d'utiliser des méthodes in vitro à la place de methode in vivo.

Réduction

Tolérance locale : Les animaux utilisés dans ces études peuvent être issus d’autres études de tolérance locale où ils ont été traités avec une autre voie d’administration. Cela n'est possible que lorsque aucun effet ou des effets très légers ont été observés. Les animaux utilisés dans ces études sont de sexe indifférent à l’exception de l’irritation vaginale qui est réalisée sur des femelles. Pour l’ensemble des projets lapins, nous ne faisons pas de témoins positifs afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Les études précédentes présentant des scores nous servent de témoins. Le nombre d'animaux par étude est exigé par la norme ISO et le nombre de test annuel est basé sur une estimation au vue du nombre de test effectué les années précédentes. Aucun test statistique n'est utilisé dans ces projets.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, dans des cages individuelles. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles sont équipées de plateformes, de cloisons transparentes, d’un fond perforé en noryl et un enrichissement par briquettes de bois est mis à leur disposition. S’il y a atteinte des points limites alors l’animal sera euthanasié pour raison éthique avant la fin de l’étude. Les points limites sont définis pour chacun des tests afin d’éviter toutes souffrance inutile aux animaux. Concernant le projet d’irritation oculaire, des analgésiques sont utilisés avant, pendant et après le traitement. L'analgésie continuera aussi longtemps que nécessaire. Les antalgiques ne sont possibles que pour les tests oculaires puisque ce sont les exigences de la norme utilisée.

Choix des espèces

L’espèce et le stade de développement des animaux à utilisé est imposé par la normes ISO 10993-23. Le choix d’une autre espèce doit être justifié. Pour la totalité des projets présentés, nous utilisons des lapins jeunes adultes de 9 à 15 semaines. Si des femelles sont utilisées elles doivent être nullipares et non gravides.

Réutilisés d'un projet à l'autre tant que le vétérinaire juge leur état général suffisant, 225 porcs et 135 chiens vont être utilisés pour évaluer la tolérance de candidats médicaments, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir jusqu'à quarante administrations en dix semaines, subir dix prélèvements sanguins en vingt-quatre heures, être mis à jeun vingt-quatre heures, passer deux fois par semaine en cage à métabolisme et subir une biopsie d'organe sous deux heures d'anesthésie générale. Le porteur indique que les effets indésirables des produits testés ne sont pas prévisibles au début du projet. Sur les 135 chiens, 100 sont annoncés comme réutilisés et 20 comme adoptables, les autres étant tués pour des prélèvements terminaux, tout comme 25 des 225 porcs.

Objectifs

L’étude de la sécurité de nouveaux médicaments est une étape importante lors de leur développement. Ces études permettent d’identifier, d’atténuer les risques associés à l’activité du médicament. Lors d’une modification de la formulation, de la voie d’administration ou d’un ajustement de la dose thérapeutique, il peut être nécessaire d’étudier les effets des candidats médicaments. L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérabilité locale et/ou systémique de futurs candidats médicaments après leur administration chez le porc et le chien. Pour ce faire, les animaux seront régulièrement observés après l’administration du composé suivant une grille de surveillance définie et des prélèvements de sang et/ ou de tissus pourront être effectués au cours et/ou à la fin des études.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments ou des nouvelles formulations de médicaments déjà mis sur le marché, présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Suivant la cible thérapeutique, les composés testés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire.

Procédures

Les animaux seront administrés avec les composés à tester par différentes voies (environ 3min/administration avec un maximum de 40 administrations sur 10 semaines). Pour l'administration intraveineuse, une sédation ou anesthésie sera réalisée pour la pose de l'accès veineux (durée de 30min à 1h). Après administration, des observations des animaux seront réalisées suivant des grilles prédéfinies. Des prélèvements de sang (durée 2min, maximum 10 prélèvements sur 24h) et d'urine (maximum 24h en cage à métabolisme, 2 fois par semaine) pourront également être réalisés. Enfin, une biopsie d'organes pourra être faite soit sous anesthésie générale (environ 2h avec maximum 1 prélèvement sur 24h) soit sous anesthésie locale dans le cas d'une biopsie de peau (environ 15 min avec un maximum de 5 prélèvements sur 24h). Les animaux pourront être mis à jeun au maximum 24h préalablement à l'anesthésie ou administration du candidat médicament.

Impact sur les animaux

Les animaux de ce projet pourront subir un stress de courte durée équivalente à la piqure d'une aguille lors des administrations, prélèvements de sang et induction de l'anesthésie. Ils pourront également subir un stress lié à la mise à jeun avant administration ou anesthésie et à l'hébergement individuel en cage à métabolisme pour le recueil d'urine. Les effets potentiellement indésirables du/des produits testés ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet et feront l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place les traitements de potentiels signes cliniques.

Devenir

Les animaux seront généralement réutilisés pour d'autres projets si l'état général des animaux (attesté par le vétérinaire) le permet. Si leur état de santé le permet, les chiens ne pouvant plus être réutilisés pourront être mis à l'adoption. Enfin certains animaux seront euthanasiés en fin de projet pour réalisation de prélèvements terminaux.

Remplacement

Avant toute administration chez l’homme d’un nouveau candidat médicament, l’animal constitue un passage obligatoire qui permet d’évaluer l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique de ce nouveau médicament. Il n’existe pour l’instant pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pouvant se substituer en totalité à l’administration chez l’animal. Dans ce projet, les chiens et les porcs sont parmi les espèces non rongeur les plus adaptées à l’évaluation de la tolérabilité d’un composé.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe (3 à 6 par groupe) est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, sera envisagée et permettra également de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Le recours aux procédures d’anesthésie/analgésie adaptées dès que nécessaire • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales, • La mise en groupe des animaux, • La mise en place de jouets dans les cages , • La sortie régulière des animaux mis en cage à diurèse.

Choix des espèces

Les espèces (chien et porc) qui seront utilisés dans ce projet, sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour la réalisation d’études de tolérabilité et de pharmacocinétique permettant d’étudier le devenir (absorption, distribution, métabolisation, élimination), d’un produit testé, dans le sang et/ou les urines (lorsque ces espèces sont utilisées au cours du développement préclinique de ce produit). Ces espèces présentent des similarités physiologiques et cliniques avec l'homme et peuvent développer des pathologies analogues aux pathologies humaines. Animaux sevrés en croissance et animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.