Tests réglementaires

Seize heures sans nourriture avant le test de l'aliment caché, une nuit de test de préférence au sucre, deux tests d'anxiété, un conditionnement de peur sur deux jours : 504 souris enchaînent neuf épreuves comportementales après sept jours d'instillations nasales d'antibiotiques sous anesthésie. Elles reçoivent ensuite par le nez des bactéries ou du microbiote de patients parkinsoniens, ce qui peut déclencher deux mois plus tard une maladie de Parkinson expérimentale, avec malnutrition, troubles de la motricité et faiblesse musculaire. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et toutes sont tuées pour l'analyse de leurs tissus nasaux, nerveux, sanguins et intestinaux. Le porteur présente le recours à la souris comme un moyen d'éviter d'utiliser des primates non humains.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente en France, après la maladie d'Alzheimer. C’est une maladie complexe, d’étiologie encore inconnue, caractérisée par une destruction d’une population spécifique de neurones, entraînant un déficit au niveau de l’initiation et du contrôle des mouvements. Sur le plan moléculaire, des lésions sont retrouvées et correspondent à des amas pathogènes formés par une protéine : l’α-synucléine. Les troubles olfactifs sont fréquents dans la MP et sont souvent présents plusieurs années ou décades avant l'apparition des symptômes moteurs. Les troubles précoces de l’odorat dans la MP pourraient être la conséquence d’un déséquilibre du microbiote nasal. Dans cette étude, nous émettons l’hypothèse qu’il existe un lien entre le microbiote nasal et les déficits olfactifs de la MP. Ce modèle expliquerait tout d’abord les lésions inflammatoires de la muqueuse olfactive constatées chez les patients MP, ainsi que l'accumulation de la protéine neurotoxique dans les structures olfactives. Nous proposons d’élucider le rôle du microbiote nasal et de ses métabolites dans la perte de l’odorat observée au décours de la maladie de Parkinson (MP). Nos trois principaux objectifs sont de clarifier (1) le rôle exact de profils spécifiques de microbiotes nasaux avec les performances olfactives, (2) l’impact de l’environnement sur le microbiote nasal et (3) tester le lien entre microbiote nasal et MP. L’opportunité d’étudier deux populations ayant une exposition environnementale très différente, en France métropolitaine et aux Antilles, devrait permettre d’identifier des anomalies du microbiote spécifiques à la maladie de Parkinson. Les souris constituent un modèle pertinent pour ce projet car (1) elles peuvent facilement être colonisées par des microbiotes d’origine humaine et (2) elles peuvent développer des maladies proches de la MP très rapidement après gavage avec des échantillons provenant de selle de patients MP.

Bénéfices attendus

Nous proposons d’élucider le rôle du microbiote nasal et de ses métabolites dans la perte de l’odorat observée au décours de la maladie de Parkinson (MP). Nous couplerons notre analyse moléculaire du microbiome avec l’analyse métabolique de la muqueuse nasale et du sérum de patients MP et de souris transplantées avec du microbiote humain de patients MP. Ce projet nous permettra d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans le déséquilibre du microbiote nasal et de proposer des biomarqueurs et des nouvelles cibles thérapeutiques. Les résultats de ce projet pourraient améliorer la prise en charge médicale des patients.

Procédures

Chaque animal sera soumis à : - une instillation intranasale d’antibiotiques (30 secondes) tous les jours pendant 7 jours sous anesthésie légère (5 minutes) - une seule instillation intranasale de bactéries (30 secondes) trois jours après la dernière instillation d’antibiotiques, sous anesthésie légère (5 minutes) - une restriction alimentaire de 16 heures avant de passer le test de la nourriture cachée (durée : 15 minutes). - Un test d’anxiété (20 minutes) - Un test de reconnaissance de nouveaux objets (20 minutes) - Un test de préférence au sucrose (une nuit) : mesurant leur préférence à boire une solution sucrée plutôt que de l’eau plate (test effectué sur une nuit, biberons additionnés de sucre et biberon normal). - Un second test d’anxiété (10 minutes): - Un test mesurant la perception aux odeurs des souris (15 minutes) - Un test des capacités morices (5 minutes) - Un test d’évitement des prédateurs (10 minutes). - Un test de test de conditionnement de peur (10 minutes pendant 2 jours)

Impact sur les animaux

Chaque animal sera soumis à : - une instillation intranasale d’antibiotiques (30 secondes) tous les jours pendant 7 jours sous anesthésie légère (5 minutes) L’anesthesie gazeuse provoque un inconfort de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection d’anesthésique entraîne une douleur légère de courte durée. L’instillation intranasale d’antibiotiques provoque un inconfort de courte durée. - une seule instillation intranasale de bactéries ou de microbiote humain (30 secondes) trois jours après la dernière instillation d’antibiotiques, sous anesthésie légère (5 minutes) L’anesthesie gazeuse provoque un inconfort de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection d’anesthésique entraîne une douleur légère de courte durée. - L’instillation intranasale de microbiote humain ou de bactéries comme des Staphylocoques provoque un inconfort de courte durée et peut induire deux mois après l’instillation une maladie de Parkinson expérimentale chez la souris qui présentera alors des signes de malnutrition, des problèmes de motricité et une faiblesse musculaire. - Une restriction alimentaire de 16 heures avant de passer le test de la nourriture cachée (durée : 15 minutes). La restriction alimentaire induit habituellement un stress physique modéré et de la détresse modérée pendant une durée de 16 heures avant la réalimentation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire que tous leurs tissus nasaux, nerveux, sanguins et intestinaux soient analysés en détail pour identifier les mécanismes sous-tendant le développement de la maladie de Parkinson.

Remplacement

Malheureusement, à l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour tester la perception, la mémoire et la coordination motrice.

Réduction

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire le plus possible le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux estimé pour ce projet a été calculé par un biostaticien de manière à ce que, pour chaque expérience, les groupes utilisés soient constitués de 12 souris, le nombre minimal requis pour que l’analyse statistique ultérieure permette une évaluation pertinente des résultats. Nous avons calculé qu’un nombre de 12 souris minimum par groupe est nécessaire.

Raffinement

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire tout stress et inconfort de l’animal. Après l’instillation intranasale de bactéries ou de microbiote humain, chaque animal fera l’objet d’une évaluation quotidienne pendant 2 jours puis tous les 7 jours pour s’assurer de sa bonne santé (mesure du poids, analyse de l’allure du pelage, de l’état de vigilance, de la posture, du comportement moteur général et du comportement exploratoire dans la cage). Nous allons particulièrement surveiller l’apparition de signes chroniques parkinsoniens comme un trouble de la motricité (allure de la marche, activité locomotrice, comportement exploratoire dans la cage, coordination motrice et équilibre) et une faiblesse musculaire (incapacité à bien se mouvoir sur la grille de la cage). Ces signes cliniques sont habituels dans les modèles expérimentaux de maladie de Parkinson chez la souris. Si l’animal présente des signes parkinsoniens, il fera l’objet d’un suivi plus poussé : Il sera pesé tous les jours et du gel hydrique sera disposé sur la litière pour améliorer la prise alimentaire. Si cet animal en plus des signes parkinsoniens se met à présenter une perte de poids ≥20% du poids basal, est déshydraté ou reste prostré, il sera mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

Le système nerveux des souris est proche de celui de l’humain et sensible au développement de pathologies expérimentales parkinsoniennes comme par exemple après l’administration de microbiote intestinal humain provenant de patient parkinsonien. Nous disposons d’un nombre important d’outils et de données avec ce modèle qui devraient nous permettre de tester les liens entre déséquilibre du microbiote nasal et neuropathologie parkinsonienne et d’établir des schémas thérapeutiques, voire préventifs pour les humains, en évitant donc de recourir à des primates non humains. Nous utiliserons des souris surexprimant un gène humain qui nous permettront d’appréhender le facteur génétique de l’hôte dans la pathologie. Adulte, à partir de 6 semaines après la naissance, car la maladie touche les adultes.

Mesurer combien de nouveaux antibiotiques passent dans le liquide cérébro-spinal, en vue d'ouvrir la voie à un essai clinique : 848 souris femelles vont être utilisées pour cela, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes seront tuées pour analyser leur cerveau. Elles reçoivent dans le ventre un lipopolysaccharide destiné à mimer une inflammation infectieuse, puis un inhibiteur de transporteurs, puis l'antibiotique. Le crâne est rasé et la peau incisée sur un centimètre pour ponctionner cinq microlitres de liquide cérébro-spinal, avant un prélèvement de sang à la veine de la queue. Le porteur qualifie le recours aux souris d'"indispensable" et décrit un effectif calculé "au plus juste", qui comprend 10 % de souris supplémentaires prévues en cas de mortalité.

Objectifs

Les infections bactériennes au niveau cérébral sont des pathologies graves, avec un taux de mortalité élevé. Le traitement de ces infections repose sur un traitement antibiotique adapté. Cependant, en cas de résistance des bactéries, les options thérapeutiques peuvent être limitées. A l’heure actuelle, plusieurs molécules sont recommandées dans les infections cérébrales cependant ces antibiotiques peuvent présenter des effets indésirables sévères et générer des résistances bactériennes. De nouveaux antibiotiques, actifs sur les bactéries résistantes, possèdent de plus longues durées d'action et moins d'effets indésirables. Cependant, il n’existe pas de donnée à l’heure actuelle sur leur diffusion au niveau cérébral. L’inflammation, qui peut être présente en situation infectieuse a également une influence sur la diffusion au niveau cérébral. Il est donc primordial d’étudier la diffusion de ces molécules en conditions saine et inflammatoire. Ainsi, l’objectif de notre travail est d’étudier la diffusion dans le système cérébral de ces nouveaux antibiotiques dans un modèle de souris.

Bénéfices attendus

La possibilité d’usage de ces nouveaux antibiotiques pour lutter contre les infections cérébrales par des bactéries résistantes est un chalenge. Les données de diffusion de ces nouvelles molécules dans le système cérébral de la souris pourront ouvrir les portes à un essai clinique chez l’Homme.

Procédures

Nous administrerons aux souris, par voie intra-péritonéale en 10 à 15 secondes : des antibiotiques, du lipo-poly-saccharide (afin de mimer une inflammation liée à une infection), ainsi que des molécules inhibitrices des transporteurs de médicaments afin d’explorer les mécanismes de passage des antibiotiques au niveau cérébral. Nous réaliserons des prélèvements de sang (200µl) et de Liquide Cérébro-Spinal (5µl) sur ces animaux. Un seul prélèvement de chaque liquide biologique sera réalisé par animal. Dans l'ordre et après anesthésies de l'animal, le liquide cérébro-spinal puis le sang seront prélevés. Pour prélever le liquide cérébro-spinal, le crâne de l'animal, placé sur un tapis chauffant (37°C), est rasé et la peau incisée sur 1cm après injection sur le site de prélèvement d'un anesthésiant 10 min avant l'intervention. Le prélèvement lui-même prend environ 5 min. Puis, le sang sera prélevé dans la veine caudale de l'animal. Pour se faire, l'animal aura au préalable reçu une injection d'antalgique 30min avant l'acte et ce afin de diminuer la douleur liée à ce prélèvement. L'inflammation systémique est induite par l'administration de lipo-poly-saccharide par voie injectable en 10 à 15 secondes. L’administration des antibiotiques aura lieu 30 minutes après l’administration de lipo-poly-saccahride et 2 heures après l'administration de la molécule inhibitrice.

Impact sur les animaux

Douleur légère lors de l’injection intraveineuse d’antibiotiques sans effet secondaire. Douleurs légères à modérées suivant l’administration intra-péritonéale de lipo-poly-saccharide.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront sacrifiés, afin de pouvoir réaliser l’étude histologique et pharmacocinétique au sein des tissus cibles (cerveau).

Remplacement

L'utilisation des animaux est indispensable en raison des nombreux mécanismes impliqués dans la diffusion du médicament. L'approche in vitro qui permet l'analyse de paramètres définis ne peut pas remplacer l'utilisation des animaux car elle ne prend pas en compte le devenir du médicament dans l'organisme ou des effets comme l'inflammation. Pour cette étude seront utilisés des souris. La souris est le plus petit mammifère utilisable en recherche expérimentale. Son élevage aisé en animalerie permet des conditions environnementales contrôlées. La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système cérébral de cette espèce est assez proche de celle de l'Homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum. Le nombre de souris (n = 24) par groupe de traitement a été calculé pour avoir un nombre minimum de points de dosage des médicaments (8 points) permettant de réaliser une courbe des concentrations du traitement testé en fonction du temps, dans le plasma et dans le liquide cérébro spinal. Afin d'obtenir un résultat statistique cohérent, un minimum de 3 animaux par point de dosage est nécessaire. Des analyses statistiques des résultats sont réalisées. Le nombre de 848 souris nécessaires au total (8 groupes de traitement + 10% de souris supplémentaires en cas de mortalité) a été calculé au plus juste afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux.

Raffinement

Les prélèvements du liquide cérébro spinal (5µl) et du sang (200µl) se font sous anesthésie. Dans l'ordre et après anesthésies de l'animal : le liquide cérébro spinal, puis le sang seront prélevés après injection d'un antalgique général 30 min avant le prélèvement sanguin à la veine caudale et d'une anesthésie locale par voie injectable 10min avant prélèvement du liquide cérébro spinal. L'inflammation systémique est induite par l'administration de lipopolysaccharide, et les souris recevront un traitement antidouleur par voie injectable 30 minutes avant l’injection du lipopolysaccharide. La douleur de l’animal sera suivie toutes les heures suivant l’administration du lipopolysaccharide. Réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse : les animaux sont hébergés à raison de 5 souris par cage de type 2L)). Ils seront expérimentés par du personnel formé et qualifié. Ils seront surveillés quotidiennement et auront en permanence accès à l'eau et à la nourriture. Durant les périodes d'expérimentation, ils seront anesthésiés sous isoflurane. Des points limites précis de douleur ressentie par les animaux (cf partie suivante) sont définis et les animaux seront euthanasiés si on ne peut soulager leur douleur. L'estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Le score limite est de 12. Au-delà l’animal sera euthanasié sans attendre. SURVEILLANCES REALISEES: Une surveillance quotidienne du poids des animaux sera effectuée. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères prépondérant sont les suivants selon les critères de : - Perte de poids des animaux par rapport au poids initial>20%

Choix des espèces

Pour cette étude seront utilisés des souris. La souris est le plus petit mammifère utilisable en recherche expérimentale. Son élevage aisé en animalerie permet des conditions environnementales contrôlées. La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine. Des souris femelles seront utilisées au stade adulte (8 semaines). Le choix d’une souris adulte est nécessaire pour pouvoir étudier les concentrations des médicaments dans le sang et le liquide cérébro spinal.

Mis en quarantaine vingt et un jours puis engagés dans le protocole dès l'âge de trois mois, des lapins New Zealand White sont immunisés par paires, deux par commande d'anticorps. 3 615 lapins vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit dix injections d'antigène mêlé à un adjuvant, qui peuvent ulcérer les points d'injection et provoquer fièvre et baisse de mobilité, puis subit cinq prélèvements de sang de vingt-cinq à quarante minutes, jusqu'à un dixième de son volume sanguin. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode substitutive aussi efficace, les banques d'anticorps produites hors animal ne donnant pas, selon lui, une gamme comparable en temps, en budget et en matériel.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une substance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

10 injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 5 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à un adjuvant (hors adjuvant complet de Freund) peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

Greffées d'une tumeur sous la peau en état vigile, mesurées trois fois par semaine, traitées par injection dans la veine de la queue puis mises à mort quand la tumeur atteint 1 500 mm3 ou se nécrose, 4 644 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie est immunodéprimée pour éviter le rejet des cellules tumorales humaines. Le porteur affirme que les preuves d'efficacité hors organisme vivant ont déjà été obtenues et qu'aucune alternative ne peut se substituer à la souris, les candidats médicaments visant une cible commune à la souris et à l'être humain. 928 souris sont réutilisées dans une autre procédure, et celles qui n'entrent pas en protocole sont réformées pour l'entraînement aux gestes techniques avant d'être tuées.

Objectifs

Ce projet dans son ensemble consite à développer et analyser l'efficacité de nouvelles thérapies "ciblées" à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques, tout en diminuant drastiquement les effets secondaires. Elle représentent ainsi l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats d’efficacité permettront de désigner le meilleur candidat ainsi que sa dose minimale efficace et les meilleures fréquences d’administration. Ce projet est articulé en trois procédures consécutives et dépendantes les unes des autres : # La Procédure-1 permettra mettre au point différents modèles tumoraux d’intérêt (tumeur/ souris) et d’effectuer un premier tri parmi ceux-ci. # La procédure-2 consiste en une étude Pilote d’efficacité antitumorale en utilisant un/des médicament/s contrôle de référence sur les meilleurs modèles de procédure-1. # La Procédure-3 permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales en utilisant le/les meilleurs modèles sélectionnés dans les Procédures 1 et 2.

Bénéfices attendus

Ce projet dans son ensemble consite à développer et analyser l'efficacité de nouvelles thérapies "ciblées" à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques, tout en diminuant drastiquement les effets secondaires. Elle représentent ainsi l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Les données d’efficacité (combinées avec les données de tolérance), permettent de choisir les candidat médicaments ayant la meilleur fenêtre thérapeutique chez les patients (c'est à dire la meilleur efficacité pour le moins d'effets indésirables). Ainsi, ces études permettront de définir quels seront les meilleurs candidats médicaments contre les cancers ciblés et de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser lors des premières études cliniques chez l’Homme. La première et la seconde procédure permettront de sélectionner et caractériser le/les meilleurs modèles tumoraux. La troisième procédure permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales (en vue d’une phase clinique chez l’Homme), en utilisant le/les modèles sélectionnés dans les procédures précédentes.

Procédures

# Greffe tumorale sur souris vigile en sous-cutané (2-3 minutes). # Les prises de mesure seront effectuées trois fois par semaine et quotidiennement en cas d'approche des points limites. # Traitement des animaux par les différents médicaments par voie intraveineuse sur souris vigiles (2-3 minutes). # Les animaux atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mis à mort.

Impact sur les animaux

# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : change, pesée, contention et anesthésie. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de la greffe tumorale sur animal vigile par injection souscutanée ainsi que lors (2) de l’injection par intraveineuse dans la veine de la queue sur souris vigiles des candidats médicaments. # Pour les groupes traités, une diminution de la croissance tumorale est attendue.

Devenir

Pour chacune des trois procédures: Tous les animaux ayant atteint les points limites ou en fin d’étude seront euthanasiés. De même, les souris non entrées en protocole seront réformés pour l’entrainement aux gestes techniques avant d’être mises à mort. La Structure Bien Etre Animal (SBEA), assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Remplacement

Les preuves de concept d’efficacité de ces candidats médicaments anticancéreux hors organisme vivant (dits in- vitro et ex-vivo), ont déjà été effectuées avec succès. A présent, seul un modèle physiologique complexe (organisme vivant) est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique afin d’obtenir des résultats représentatifs en terme de doses et de fréquences. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant cross-réactif (cible anticancéreuse comparables entre l’Homme et la Souris), aucune alternative ne peux se substituer à un modèle Souris.

Réduction

La procédure-1 et 2 permettent de mettre au point les modèles, de les caractériser au mieux et de diminuer les nombres d'animaux utilisés en procédure-3. Elles sont toutes deux effectuées sur un nombre limité d’animaux (sans toutefois mettre en péril l’interprétation des résultats). En effet, seul(s) le(s) modèle(s) ayant donné satisfaction lors des procédures 1 et 2 seront utilisés pour la procédure-3 avec un nombre d'animaux optimisé par rapport à chaque modèle. Par ailleurs dans les procédures 2 et 3, le fait de tester une dose en injection unique ou répétée une à deux fois en fonction des résultats obtenus au fil de l’eau, permet de diminuer drastiquement le nombre de groupes utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger).Il est à noter que les enrichissements de type nid ou rouleaux en cartons seront proscris à partir de la greffe tumorale afin d'éviter toute plaie sur les tumeurs et seront compensés par une augmentation des quantités de balles de coton et de bâtons à ronger. Avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées (période de stabulation) pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et éviter au mieux toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera quotidienne et les prises de mesure effectuées trois fois par semaine avec une analyse scorée des critères physiques et comportementaux, du poids corporel et du volume tumoral et de la qualité de la tumeur (homogénéité, permettant la mobilité de l’animal…). Le point limite du volume tumoral sera de 1500mm3. La nécrose ou la gêne à la mobilité due à la tumeur constitueront également des points limites. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'Etablissement Utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le weekend et les jours fériés. Les animaux inclus dans la grille de score mais n’atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins conservateurs adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement, isolement...). Les souris atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mises à mort. Les souris non entrées en protocole seront réformées pour entraiment des gestes techniques avant d’être mises à mort. La Structure Bien-Etre Animal (SBEA) assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Choix des espèces

# S’agissant d’analyses d’efficacité in-vivo par voie intraveineuse, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. Pour les modèles modèles de tumeurs humaines, des animaux immunodéprimés sont nécessaires afin d’éviter tout rejet des cellules humaines par le système immunitaire. Dans le cas des tumeurs de souris, l’utilisation de la souches consanguine dont sont issues les cellules cancéreuses est indispensable. # La souris est une espèce animale à la fois petite et parfaitement caractérisée pour ces études (avec des données permettant de transposer les résultats chez l’Homme). En plus, les données de tolérances et de pharmacologie seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. # Les animaux seront livrés entre 7 et 8 semaines de développement et inclus en expérience entre 8 et 9 semaines (après 7 jours d’acclimatation dans l’établissement utilisateur). A cet âge-là, les animaux sont adultes avec des organes matures permettant leur comparaison avec les patients humains. Pour les animaux non-immunodéprimés, leur système immunitaire sera complètement mature et adulte. # Il est à noter que le phénotype « immunodéprimé » ne sera pas un phénotype dommageable dans nos condition d’hébergement et d’expérimentation (statut sanitaire sans pathogènes ni opportunistes et expérimentation en condition stérile).

Pesées puis numérotées par poinçonnement de l'oreille sur animal vigile, 600 souris reçoivent une injection dans la veine de la queue, suivie de prélèvements sanguins à dix minutes, six heures, un jour, trois jours et sept jours, puis deux fois par semaine pendant quatre semaines. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Une partie subit en fin d'étude un prélèvement de grand volume par piqûre dans le cœur, sous anesthésie sans réveil, qui peut provoquer un arrêt cardiaque, suivi d'une dislocation cervicale. L'objet est de mesurer le passage dans le sang de candidats médicaments anticancéreux, en vue de fixer les doses des premiers essais chez l'être humain. Les souris qui n'entrent pas en protocole, et celles qui n'ont pas atteint les points limites, sont "reformées" pour l'entraînement du personnel aux gestes techniques.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer les données de pharmacocinétiques, c’est à dire le devenir du médicament dans le sang, au cours du temps. Ces données pharmacocinétiques sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront d’évaluer au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité antitumorale et de tolérance qui seront également effectuées sur des modèles souris. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de pharmacocinétique (projet actuel), d’efficacité et de tolérance seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, de définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Une méthode de micro-échantillonage (prélèvement d’un échantillon de volume faible par le biais d’un dispositif adapté) sera utilisée afin d’améliorer la significativité de ces études, tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires en prélevant beaucoup moins de volume sanguin et à des fréquences adéquates.

Bénéfices attendus

La pharmacocinétique de composés thérapeutiques est un élément essentiel pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et de tolérance et permettront, à terme de déterminer les doses et fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

1/ Après une semaine de stabulation, les souris seront pesées (maximum 1 min) et numérotées vigiles par poinçonnement auriculaire (maximum 3 min). 2/ Une contention suivie d'une injection/prélèvement sur animal vigile sont prévues sur chaque animal (1 à 3min) : - lors de l’injection par intraveineuse dans le veine caudale des candidats médicaments (t-0). - Lors de chacun des prélèvements dans la veine caudale et échantillonnage par microcapillaire. 3/ En fonction des expériences, un prélèvement sanguin terminal de grand volume (3 min), pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil (maximum 3 min), suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale (maximum 1 minute).

Impact sur les animaux

1/ La contention et les injections/prélèvements induisent un stress de l’animal durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte - de 1 à 5 minutes). 2/ les injections/prélèvements induisent un stress et une douleur de type modérée durant plusieurs secondes (pendant l’acte - de 1 à 5 minutes). Note : Les composés de cette classe thérapeutique, injectés à cette dose sont parfaitement tolérés dans la littérature et n'induisent pas d’évènements indésirables à la dose utilisée. Ces derniers seront néanmoins surveillés lors de chaque manipulation. 3/ En fonction des expériences, un prélèvement sanguin final de grand volume, pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil, suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale.

Devenir

Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, seront euthanasiés. En fonction des besoins de l'expériences et de l'avis vétérinaire, les animaux inclus en expérience n'ayant pas atteint les points limites seront soit euthanasiés en fin de procédure pour un prélèvement terminal sans réveil suivi d'une nécropsie, soit reformées pour entrainement aux geste techniques sur avis vétérinaire. Les souris non entrées en protocole seront reformées pour entrainement aux geste techniques.

Remplacement

S’agissant d’analyses pharmacocinétiques, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs et robustes. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet se comportant de façon identique dans la souris comme chez l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le procédé de micro-échantillonnage lors des prélèvements sanguins permet d’obtenir l’ensemble des valeurs pour un même animal en ne lui prenant que de très faibles quantités de sang. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus sont également mieux maitrisées. Ainsi, seuls 4 à 5 animaux par groupe seront nécessaires pour ces expériences. Une majoration de 20% sur ce nombre d’animaux est appliquée en cas de problèmes à l’injection ou en cas de manque d’homogénéité entre les différents animaux au moment de l’entrée en expérimentation (pouvant mettre en péril les résultats de cette expérience).

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté ainsi qu'un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Afin de de mettre en évidence tout signe de souffrance ou d’évènements indésirables pouvant provenir du traitement, les animaux seront suivis quotidiennement et avant chacun des prélèvements (10 min, 6h, 1 jour, 3 jours, 7 jours) puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux seront également pesés avant le traitement, puis 1 jour, 3 jours, 7 jours post-traitement, puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux seront euthanasiés à la fin du dernier prélèvement (à 28 jours post-traitement). Une grille de score suffisamment prédictive et adaptée à l’étude, permettra d'éviter la souffrance des animaux avec une surveillance physiologique et comportementale. Un système de surveillance sera mis en place avec l’Etablissement Utilisateur (EU) pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue les autres jours, y compris le WE. Un prélèvement sanguin final de grand volume (par piqure dans le coeur) pourra être effectué sous anesthésie/antalgie générale sans réveil suivi d’une mise à mort par dislocation cervicales. Les prélèvements d’organes seront réalisés après la mort de l'animal.

Choix des espèces

Les études pharmacocinétiques nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (permettant de transposer ces données chez l’Homme). En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront également générées sur cette espèce animale afin de déterminer au mieux les doses cliniques à injecter de ces candidats médicaments. Des souris de souche CD-1 seront utilisées car plus massive et bien adaptée à ces expériences nécessitant des prélèvements répétés. Ces animaux seront inclus en expérience à des âges de 8-9 semaines. A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une pharmacocinétique pertinente par rapport au type de thérapies utilisées dans ce projet.

Tués pour analyse des tissus dans les études d'efficacité, ou réutilisés après retrait des points de suture pour la moitié des animaux utilisés dans la formation du personnel, 500 lapins et 500 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. La paupière d'un œil leur est cousue sous anesthésie générale pendant une vingtaine de minutes, opération qui peut irriter la cornée, déformer ou faire saillir la membrane nictitante, et dont les points peuvent s'arracher au grattage, les griffes étant coupées pour l'éviter. L'objet déclaré est d'améliorer l'absorption de traitements oculaires en empêchant le clignement, une partie des animaux ne servant qu'à entraîner du personnel à ce geste. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de mimer l'œil dans sa globalité fonctionnelle.

Objectifs

La blépharorraphie est une intervention chirurgicale courante en ophtalmologie vétérinaire pour des multiples indications thérapeutiques, notamment : le soin des ulcères de la cornée ou de plaies/érosions cornéennes, le soin des œdèmes cornéens, le soin des kératites. Le but de projet sera donc celui d'effectuer cette pratique chirurgicale dans le cas où cela améliorerait l'absorption de certains traitements oculaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'optimiser l'efficacité de certains traitements en utilisant la blépharorraphie, qui permettra une meilleure libération de certains principes actifs en contrant le clignement des yeux.

Procédures

La seule intervention effectuée sera la suture de la paupière (blépharorraphie) d'un seul œil (sauf dans le cas particulier d’études pharmacocinétiques à temps courts si les animaux restent endormis) effectuée sous anesthésie générale avec administration d’anti-douleurs. L'intervention aura lieu une seule fois dans chaque étude et dure environ une vingtaine de minutes. Des prélèvements de sang pourront être effectuée en cours d'étude sur animaux vigiles, en suivant les recommandations scientifiques qui détaillent le volume maximum prélevable selon le poids de l'animal suivant un temps de repos adapté.

Impact sur les animaux

La blépharorraphie est une pratique chirurgicale couramment utilisée en ophtalmologie vétérinaire et humaine, sans difficultés techniques majeures et avec d'excellents résultats. Mis à part les manipulations lors des pesées des animaux et la contention des animaux pour les observations journalières ainsi que la piqûre pour l'injection des produits anesthésiants, cette technique pourrait induire : -irritation de la cornée par contact avec les fils de suture -déformation du cartilage de la membrane nictitante -protrusion de la membrane nictitante (souvent réversible) - infection à la suite de la chirurgie (risque très faible mais présent avec tout acte chirurgical). Ces phénomènes restent rares, réversibles et indolores. La douleur de l'acte chirurgical sera soulagée par injection d'un analgésique en plus de l'anesthésie. De l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue, elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant (lapin) ou d'armoires chauffantes (rats) selon les espèces. Les points de suture peuvent s’enlever (grattage de l’animal, par exemple) au bout de quelques jours, mais il sera possible de les refaire sous anesthésie et sans douleur. Afin d’éviter que les animaux s’arrachent des points de suture lors d’un éventuel grattage, une coupe des griffes sera effectuée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour analyse des tissus dans le cas des études d'efficacité des traitements. Pour la formation du personnel, la moitié des animaux seront euthanasiés pour analyse des tissus en histologie et l'autre moitié sera reutilisée une fois le retrait des points de suture effectué.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse …) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques suivant la distribution des données, avec possibilité d'effectuer des comparaisons multiples suivant le choix du test (paramétrique ou non paramétrique). Chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien- être. Les animaux auront des enrichissements adaptés. Aucun examen invasif ne sera réalisée sur les animaux à la suite de la suture des paupières. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Des enricchissements supplémentaires (une balle de cellulose en plus, par exemple) sont prévus dans le cas des lapins qui seront hebergés individuellement.

Choix des espèces

L'espèce animale choisie a une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, cette pratique chirurgicale est largement connue en médecine vétérinaire et s'effectue très bien chez le lapin et chez le rat. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux.

Des dispositifs médicaux dentaires, purs ou sous forme d'extraits, sont appliqués dans les poches des joues de hamsters dorés, un collier maintenu jusqu'à quatre heures les empêchant d'avaler l'élément testé. 570 hamsters vont être utilisés, tous tués à l'issue pour les analyses histopathologiques, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Leurs joues sont examinées pour repérer un érythème, effet qui peut persister jusqu'à la fin de l'étude en cas d'exposition répétée, l'objet du test étant l'autorisation de mise sur le marché exigée par la réglementation européenne. Le porteur indique renoncer aux témoins positifs et à toute analyse statistique, et ne précise ni le nombre de tests prévus chaque année ni le nombre d'animaux par test, tous deux renvoyés à la norme.

Objectifs

Pour de nombreuses pratiques à visées médicales, les professionnels de santé ainsi que les particuliers utilisent au quotidien des dispositifs médicaux (prothèses, pansements dentaire, produit dentaire...) que nous appelons « DM ». Le but du projet est d’évaluer la biocompatibilité de ces dispositifs médicaux. Autrement dit nous devons déterminer si les dispositifs, qui vont avoir un contact direct avec les tissus et fluides interne, sont compatibles avec le corps humain. Parmi les paramètres à étudier pour évaluer la biocompatibilité d’un DM, il faut évaluer sa tolérance locale. Ce projet est décrit dans une norme règlementaire. Afin de répondre à ces obligations règlementaires avant mise sur le marché de produit, nous réaliserons sur le modèle du hamster un test de tolérance sur la muqueuse buccale (test d'irritation). Il y a deux manières possibles de traiter les animaux pour ces tests, soit nous utilisons le produit pur, soit sous forme d’extrait. Pour réaliser ces extraits le DM est immergé dans des solvents (liquide définis par la norme) à une température et pendant une durée donnée, ces extraits seront ensuite utilisés pour faire les traitements. Cette évaluation est imposée par les instances règlementaire européennes. Pour les tests de tolérance locale ou d’irritation, le produit à tester ou son extrait est appliqué dans les poches des joues des hamsters. Cela afin de vérifier, par l’observation d’érythème et autres signes cliniques locaux, si une réaction d’irritation apparaît.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’obtenir des données expérimentales utilisées pour conclure sur la sécurité biologique d’un dispositif médical, autrement dit sa biocompatibilité. Ce projet fait partie intégrante de l’évaluation biologique des DM, une exigence essentielle en matière de sécurité requise par le Règlement Europpéen et exigée par les organismes notifiés afin d’accorder ou non la mise sur le marché. Le but est d’obtenir une autorisation de mise sur le marché de DM sans risque pour la santé de l’homme.

Procédures

Les animaux sont pesées deux fois: en début et en fin d'étude (1minute/pesée), un vidage du contenu des poches des joues et rinçage (1 à 2minutes) est effectué avant le début du premier traitement journalier, les animaux sont manipulés avant chaque traitement afin d'observer l'aspect des abajoues (30 secondes), des traitement successifs espacé de minimum 1h sont effectués (de 30 seconde à 1minute) le nombre de traitement dépendra de l'utilisation clinique du disposistif. Lorsque des dispositifs solides ou pâteux sont testés la mise en place d'un collier est nécessaire pour que l'animal n'ingurgite pas l'élément (placement du collier 1min), ce collier reste en place jusqu'à ce que l'élément soit retirés ou que le test soit terminé (maximum 4h).

Impact sur les animaux

Les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Il peut y avoir un érythème. Les effets observés peuvent restés jusqu’à la fin de l’étude lors d’une exposition répétée, la durée du traitement varie en fonction du projet.

Devenir

Les tests de tolérance sur muqueuse buccale conduisent à la mise à mort des animaux puisque des analyses histopathologiques sont nécessaires à la conclusion de l’étude.

Remplacement

Tout matériau irritant pour la peau, les yeux ou les muqueuses ou ayant un pH (potentiel hydrogène: acide, neutre ou basique) ≤ 2.0 ou ≥ 11.5 ne doit pas être testé. Dans des cas exceptionnels où une caractérisation/évaluation des risques est nécessaire malgré cela, ces cas doivent être justifiés et documentés. Par ailleurs, les tests d’irritation ne doivent être envisagés que si les données de sécurité ne peuvent pas être obtenues par d’autres moyens. Aujourd’hui, aucun test in vitro n’est accepté par les autorités règlementaires pour évaluer l’effet irritant d’un dispositif médical sur la muqueuse buccale. Une veille technologique et scientifique est effectuée régulièrement par le groupe afin de rester attentif à des avancés scientifique et parution de nouvelles normes qui permettrait d'utiliser des méthodes in vitro à la place de methode in vivo.

Réduction

Les animaux utilisés dans ces études sont de sexe indifférent. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous ne faisons pas de témoins positifs. Les études précédentes présentant des scores nous servent de témoins positifs. Le nombre d'animaux par étude est exigé par la norme et le nombre de test annuel est basé sur une estimation au vue du nombre de test effectué les années précédentes. Aucun test statistique n'est utilisé dans ces projets.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, dans des cages individuelles, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles sont enrichies avec un tunnel en carton, d'une balençoire et des frisottis. Les animaux ont un accès à volonté à la nourriture et à l’eau et la litière est change 1 fois par semaine. Des points limites sont définis afin d’éviter toutes souffrance inutile aux animaux.

Choix des espèces

Le hamster reste le modèle de choix utilisé pour les tests de tolérance sur muqueuse buccale comme cité dans la norme règlementaire. Nous utilisons exclusivement des hamsters Golden Syrian. Nous utilisons des jeunes adultes de 7 à 9 semaines, le stade de développement étant également réagi par la norme règlementaire à suivre.

Élevés par un fournisseur installé sur le même site que le laboratoire, 300 chiens vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, puis restent disponibles pour d'autres expériences après une période de repos. Chacun subit douze à trente prélèvements de sang, quatorze possibles sur les seules 24 premières heures d'après la description des procédures et seize d'après celle des nuisances, l'administration du produit testé, et parfois trois à six ponctions de la vessie à travers la paroi abdominale sous anesthésie locale. Le porteur reconnaît que le stress engendré par ces prélèvements répétés sera "non négligeable" pour l'animal. Aucune analyse statistique n'est prévue, le nombre d'animaux étant ajusté et justifié par le "Donneur d'Ordre" pour chacune des deux à cinq études menées chaque année.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d'étudier la pharmacocinétique de nouveaux produits vétérinaires chez le chien.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la mise à disposition de nouveaux produits permettant de mieux protéger/traiter les chiens face à différentes maladies canines.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées sur l'ensemble des chiens : 1) Prélèvements sanguins sur animaux vigiles (quelques secondes) : plusieurs prélèvements sanguins espacés de façon croissante et régulières durant toute la durée de l’étude soit 12 à 30 prélèvements selon la durée de la procédure (avec un maximum de 14 prélèvements sur 24 heures). 2) Administrations du produit sur animaux vigiles (quelques secondes) selon la posologie, la fréquence et la voie d’administration recommandée par le fabricant. 3) Prélèvement éventuel d’urine par ponction de la vessie échoguidée à travers la paroi abdominale sur animaux vigiles (ou tranquillisés) avec une anesthésie locale (intervention de quelques dizaines de minutes) : plusieurs prélèvements espacés de quelques jours, soit 3 à 6 prélèvements selon la durée de la procédure.

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n’est attendus suite à l’administration du produit d’essai dont la non-toxicité et la tolérance locale aura au préalable été vérifiée par le Donneur d'Ordre. Selon la voie testée (Sous-cutanée, Intra-musculaire), seule l’administration des produits pourra entrainer une nuisance correspondant à l’introduction de l'aiguille pour l’injection entraînera une douleur légère de courte durée . Les prélèvements des animaux peuvent entrainer un stress physique de l’animal lié à sa contention répétée et l’introduction de l’aiguille entraînera une douleur légère et transitoire au point de prélèvement. Jusqu’à 16 prélèvements sanguins pouvant être réalisés les 24 premières heures, le stress engendré par cette action répétée sera non négligeable pour l’animal.

Devenir

A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à un repos suffisant.

Remplacement

Le recours aux chiens sur ce projet est justifié car ils représentent l’espèce cible du produit en développement et qu'il n’existe pas de méthode alternative pour ce type de test. La pharmacocinétique du produit doit être optimisée et validée pour le bon développement du traitement. L’étude sur l’espèce cible est une étape obligatoire pour le développement et la mise sur le marché d’un nouveau médicament vétérinaire.

Réduction

Aucune approche statistique ne sera réalisée pour ce projet. Le nombre d’animaux utilisés correspond au minimum pour que chaque test inclut le nombre d’animaux requis afin d’obtenir des résultats interprétables, selon les guidelines européennes (EMA/CVMP/EWP/133/1999-Rev.1 et EMA/CHMP/CVMP/JEG :450091/2012). Le nombre d’animaux sera ajusté et justifié par le Donneur d’Ordre pour chaque étude en fonction des besoins définis par les objectifs scientifiques et des données bibliographiques existantes sur la molécule testée. Le nombre d’animaux pourra être réduit par des études en cross-over après un temps de repos suffisant.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’âge des animaux avec divers enrichissements (jouets, tunnel/plateforme). Des isolements relatifs (les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore avec leurs congénères) pourront être appliqués dans les quatre heures suivant l’administration du traitement. Tout sera mis en œuvre pour limiter le stress qui pourrait être induit sur les animaux avec une surveillance accrue des animaux pendant cette période. Tout au long de la procédure, les animaux auront accès à volonté à l'eau et une alimentation adaptée sous forme de croquettes sera distribuée de façon à répondre à leurs besoins énergétiques. Pour obtenir une absorption similaire du produit sur chaque individu, les condition d'alimentation des animaux pourront être standardisées avant le traitement avec par exemple une mise à jeun la veille au soir de l’administration du produit (pour une durée maximum de 16 heures), ou au contraire une ration équivalente pour tous les animaux dans les heures précédant le traitement. L’établissement se trouvant sur le même site que le fournisseur, les animaux ne subiront pas le stress lié au transfert (transport et changement d’environnement, de nourriture, de personnel…). Les volumes et les fréquences de sang prélevés et les doses administrées respecteront les recommandations internationales de bonnes pratiques. Les éventuels prélèvements d’urine seront réalisés par cystocentèse échoguidée sur un animal anesthésié localement au point de prélèvement. Les animaux auront préalablement été habitués à la contention sur le dos nécessaire à ce type de prélèvement. En cas d’apparition d’un signe de souffrance ou d’un signe clinique inatendu chez l’animal (exemple : vomissements très intenses à répétition, prostration de l’animal, difficultés respiratoires…), il sera pris en charge par le vétérinaire désigné et pourra recevoir un traitement adapté pour le soulager et si nécessaire être exclus de la procédure expérimentale. Ce projet incluant 300 animaux permettra de réaliser 2 à 5 études par an.

Choix des espèces

Le chien est l’espèce cible du produit en développement. La pharmacocinétique du produit doit être optimisée et validée pour le bon développement du nouveau traitement. Il n’existe pas de méthode de remplacement pour ce type d’évaluation. Chiens en bonne santé de plus de 6 mois, correspondant au stade de développement indiqué pour le traitement vétérinaire.