Tests réglementaires

30 bovins, veaux et génisses, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent deux vaccinations intramusculaires, sept prises de sang et trois prélèvements par poche, puis des écouvillonnages nasaux, pour tester un candidat vaccin contre le virus respiratoire syncytial bovin. À la fin, tous sont tués pour prélever des tissus lymphoïdes et du sang. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro pour évaluer la réponse vaccinale et relie l'intérêt du projet à la réduction des antibiotiques en élevage.

Objectifs

La vaccination contre le virus respiratoire syncycial (VRS) bovin a été identifiée comme une priorité en élevage en raison de la prévalence de cette infection virale (qui touche les veaux dans leur première année) et de la morbidité et mortalité qu’elle occasionne. De plus, le VRS bovin peut favoriser la survenue de surinfections bactériennes et pour prévenir ce risque, les éleveurs traitent fréquemment avec des antibiotiques dès l’apparition de troubles respiratoires dans leur troupeau. Un vaccin efficace dès le plus jeune âge en élevage aura un impact fort sur la santé et le bien-être des veaux. Un enjeu majeur de la vaccination contre le VRS chez le veau est d’induire une immunité protectrice dans les premières semaines de vie, en présence des anticorps d’origine maternelle (acquis par la buvée du colostrum). Notre candidat vaccin est une protéine virale, la protéine de fusion F, produite in vitro sous une forme stabilisée dite préfusion (preF). Un candidat vaccin similaire est également en cours de développement pour protéger contre le virus respiratoire syncytial humain responsable des bronchiolites infantiles. Or il a été montré chez l’homme que les déterminants antigéniques portés par cette protéine preF qui sont reconnus par les anticorps neutralisant l’infection virale, diffèrent entre les nouveau-nés (0-2 mois) et les enfants plus âgés (6 mois et au-delà). Pour les bovins, nous avons déjà fait la preuve de l’efficacité du vaccin preF pour protéger contre l’infection virale après une seule administration par voie intramusculaire avec un adjuvant vétérinaire classique. Le projet actuel a pour premier objectif d’identifier les déterminants antigéniques qui sont dominants en réponse au vaccin preF chez les veaux de 2-3 semaines et qui sont mineurs chez les veaux plus âgés (6-9 mois). Notre deuxième objectif est de concevoir un nouveau candidat vaccin ne comportant que ces déterminants antigéniques dominants en période néonatale puis de l’évaluer chez des veaux de 1 mois pour son efficacité meilleure par comparaison avec preF en présence des anticorps d’origine maternelle.

Bénéfices attendus

- Un vaccin efficace contre le VRS dès le plus jeune âge en élevage aura un impact fort sur la santé et le bien-être des veaux qui sont fortement affectés par des infections respiratoires. Un vaccin efficace réduira l’utilisation des traitements antibiotiques par les éleveurs lorsque des troubles respiratoires apparaissent dans leur troupeau et que les éleveurs veulent prévenir le risque de sur-infections bactériennes. - Comprendre comment élaborer des vaccins efficaces dans la période néonatale en présence des anticorps d’origine maternelle est une avancée majeure en vaccination pour les animaux d’élevage, de compagnie et aussi pour le nourrisson.

Procédures

Les 30 animaux du projet seront soumis aux 3 gestes techniques suivants : 1) Vaccination 2 fois en intramusculaire J0 et J30 post-vaccination et moins de 5 minutes par animal. 2) Prise de sang/poche : 7 prises de sang une fois par semaine en moyenne et 3 poches de sang à 20 jours d'intervalle entre 5 à 10 minutes par animal. 3) Ecouvillonage nasal non invasif et moins de 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les vaccins évalués dans ce projet sont de type protéique sous-unitaire (inerte, non réplicatif) et adjuvés avec un adjuvant vétérinaire classiquement utilisé pour les bovins. De ce fait les réactions locale et systémique attendues sont faibles (évenutellement douleur locale et fièvre), et la durée de la phase inflammatoire sera limitée à quelques heures. Il est possible que cette zone soit douloureuse localement dans les 24 à 48 heures. Une réaction cliniquement détectable de plus de 24 h entrainerait la mise en place d’un traitement anti-inflammatoire. La contention de l’animal pour les prises de sang engendre du stress et que la prise de sang peut également engendrer un hématome.

Devenir

Tous les animaux (n = 30) seront mis à mort à la fin de l’étude. Des tissus lymphoides seront prélevés et des poches de sang pour collecter pour récupérer les cellules immunitares.

Remplacement

Il n'a pas de modèles in vitro alternatifs pour évaluer la réponse vaccinale.

Réduction

Des effectifs de 5 génisses de 6-9 mois et 5 veaux mâles ou/et femelles de 3-4 semaines seront suffisants pour isoler des lymphocytes B du sang ou des ganglions en réponse à la vaccination. Des expériences antérieures nous ont en effet permis de valider la quantité d’antigène preF, l’adjuvant et la voie de vaccination pour générer des réponses anticorps robustes. Trois individus dans chaque groupe avec les réponses les plus fortes seront sélectionnées pour l’analyse des répertoires. Ce sont également nos données antérieures qui nous ont permis de déterminer le n=5 par groupe de veaux de 2-3 semaines pour avoir des comparaisons statistiquement significatives. Ce nombre d’animaux permettra de réaliser des tests statistiques non paramétriques. Les bovins pourront recevoir un traitement si nécessaire lors de la vaccination car il y a un risque de réponse inflammatoire locale modérée avec une légère fièvre pendant 24h.

Raffinement

Les bovins sont hébergés en groupe dans une animalerie conventionnelle fermée, avec un environnement enrichi (pierre de sel, brosse, paille, aire d’exercice). Cependant les animaux sont suivis plusieurs fois par jour (enrichissement social) pour détecter les signes cliniques précoces et afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites. Les bovins pourront être traités avec des anti-inflammatoires ou des antalgiques en cas de réaction à la vaccination. Une réaction cliniquement détectable de plus de 24 h entrainerait la mise en place d’un traitement anti-inflammatoire à base de méloxicam (voie sous-cutanée), éventuellement répétée après 48h. Il sera mis en place une récompense positive, type céréales ou boucons de paille, après chaque prise de sang.

Choix des espèces

Le bovin est l'hôte naturel du virus respiratoire syncytial bovin et le veau doit être protégé par la vaccination. Veaux de 2-4 semaines : période néonatale avec présence d’anticorps circulants spécifiques du virus respiratoire syncytial bovin et d’origine maternelle. Génisses de 6-9 mois : stabilisation d’un répertoire B de type adulte

155 agneaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infestés par voie orale de milliers de larves de trichostrongles, dont une espèce se nourrit de leur sang, ils peuvent développer inflammation intestinale, diarrhées, perte de poids et baisse de l'hématocrite, un point limite étant fixé à 15 % de perte de poids. L'objet du projet est de produire du matériel biologique, larves et vers adultes, pour des études ultérieures sur la résistance aux antiparasitaires. Le porteur n'infeste que des mâles, jugés plus sensibles, et affirme que le passage sur l'ovin est une étape obligatoire du cycle du parasite.

Objectifs

Le projet a pour objectif de produire le matériel biologique (oeufs, larves infestantes) nécessaire pour les analyses que nous menons au laboratoire (adaptation des parasites aux anthelminthiques, à leurs hôtes ou au changement climatique). Nous inoculons aux moutons 6000 (isolat sensible) à 10000 larves (isolat résistant) de trichostrongle par voie orale (dose de larves permettant une infestation correcte sans toutefois déclencher de signes cliniques; variable en fonction de la pathogénicité de l'isolat). Le cycle de développement complet se déroule sur environ 21 jours. A partir de ce stade, les larves sont devenues adultes (mâles et femelles), se reproduisent et excrètent des oeufs dans la lumière du tube digestif qui sont expulsés avec les matières fécales hors de l'hôte. Ainsi, à partir de J+21 nous prélevons les matières fécales et réalisons des contrôles coproscopiques pour déterminer le point de départ de l'excrétion d'oeufs dans les fèces. Lorsque l'excrétion se stabilise, nous prélevons les matières fécales pour réaliser les coprocultures qui nous permettent d'obtenir des larves infestantes notamment. Différents procédés permettent de récupérer suffisamment de matières fécales : 1) lorsque nous avons un faible besoin de matériel biologique, les matières fécales sont obtenues par prélèvement rectal 2) lorsque nous avons des besoins intermédiaires et s'il s'agit d'une souche sensible de nématodes, les moutons sont équipés de harnais permettant de collecter les fèces. 3) Lorsqu'il s'agit d'isolats résistants, les moutons sont placés en cage métabolique 24 à 48h (au pic d'excrétion des oeufs de nématodes) pour collecter la totalité des matières fécales émises et limiter au maximum les risques de dispersion d'un isolat résistant. Dans ce cas les moutons peuvent être placés individuellement en cage mais ne sont jamais seul dans l'espace qui leur est dédié et ont la possibilité d'échanges visuels avec leurs congénères. 4) Lorsque les besoins sont plus importants, deux moutons sont inoculés avec le même isolat et sont placés ensemble en cage métabolique le temps de récolter suffisamment de matériel. La durée maximale de collecte pour obtenir suffisamment de matériel de travail et minimiser le nombre d'animaux utilisé est de 12 semaines.

Bénéfices attendus

Le projet vise à produire le matériel biologique de base (larves et adultes) aux études visant à mieux contrôler les trichostrongles de ruminants en i) comprenant les mécanismes de la résistance aux divers anthelminthiques, ii) en interrogeant leur capacité d'adaptation au changement climatique et iii) en recherchant de nouveaux composés naturels permettant de s'affranchir des anthelminthiques chimiques.

Procédures

Lorsque les vers adultes sont développés, nous collectons des matières fécales quotidiennement pour les mettre en culture (environ 15-30 min). Les volumes varient en fonction des besoins et sont associés a des techniques appropriées (cage métabolique ou harnais pour de grosses quantités ou prélèvement intra-rectal pour des besoins plus réduits). Le trichostrongle H. contortus se nourrit du sang de son hote. A ce titre, il est impératif de controler le niveau de perte sanguine des animaux infestés et déclarer le point limite atteint ou non. Pour ces infestations, une prise de sang de 5 mL à la veine jugulaire sera réalisée avant infestation (pour établir le niveau d'hématocrite physiologique) et 30 jours, 40j et 60j après l'infestation (mois de 5 min). Toute coproscopie supérieure ou égale à 15000 opg nécessitera un contrôle hématocrite.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont de deux ordres: 1. l'effet de l'infestation: les trichostrongles peuvent induire une inflammation intestinale (associée à une perte de poids, des diarrhées) ou une baisse de l'hématocrite. 2. la mise en cage métabolique des moutons peut engendrer un stress consécutif à l'isolement relatif des animaux.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin d'infestation pour collecter et stocker les vers adultes nécessaires aux tests moleculaires (compréhension de l'architecture genétique des résistances aux anthelminthiques). Par ailleurs, les isolats multi-résistants ne peuvent pas être éliminés, ni disséminer dans l'environnement.

Remplacement

De manière à obtenir le matériel biologique nécessaire à la réalisation de nos tests biologiques et moléculaires, nous avons besoin d'entretenir nos isolats sur leur hôte naturel, l'ovin. Le passage sur l'animal est une étape obligatoire du cycle parasitaire. Nous ne sommes pas en mesure de réaliser un cycle complet du parasite in vitro.

Réduction

Les effectifs sont calculés sur la base des projets en cours et des besoins passés de l'équipe (soit 155 agneaux sur 5 ans).

Raffinement

Des harnais équipés de pots de collecte ont été spécialement conçus pour que la collecte des matières fécales soit la moins invasive possible. Durant la mise en cage métabolique individuelle, les animaux gardent un contact visuel avec un autre congénère situé dans une cage adjacente. La dose infestante est minimisée pour permettre la production de parasites en limitant les effets indésirables sur l'hôte: elle est de 6000 larves infestantes pour l'isolat sensible et de 10000 larves infestantes pour les isolats résistants dont les capacités d'installation, de reproduction et de développement sont moindres. D'autre part nous limitons les infestations aux agneaux mâles car ils sont plus sensibles aux infestations parasitaires que les femelles, ce qui permet de produire plus de parasites avec moins d'animaux. Cependant les animaux sont suivis plusieurs fois par jour (enrichissement social) pour détecter les signes cliniques précoces et afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites. Si une perte de poids (supérieure ou égale à 15% du poids initial), une modification de l’apparence physique (abbatu, bellements) ou une modification du comportement (animal prostré, peu mobile) est observée, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Les trichostrongles d'intéret sont inféodés à l'espèce ovine. Les agneaux auront entre 3 et 4 mois (environ 30 kg). A cet âge, le système immunitaire est développé mais reste permissif aux vers gastrointestinaux. Cela permet d'obtenir une efficacité d'installation et donc de production de matériel biologique optimum.

2 000 souris, 1 500 rats et 100 cochons d'Inde vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un composé à tester puis subit jusqu'à neuf prélèvements de sang en vingt-quatre heures et des séjours en cage à métabolisme en isolement, certains portant un dispositif chirurgical pour recueillir la bile, pour mesurer le devenir de molécules candidates. Le porteur reconnaît un stress lié à la contention et à l'isolement ainsi que des douleurs et des lésions internes possibles aux sites de prélèvement. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la diffusion d'un produit dans l'organisme entier, ce qui rendrait le recours à l'animal "indispensable".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de pouvoir conduire différents protocoles dans lesquels différents éléments d'essai seront testés (classe thérapeutique anti inflammatoire, anti cancéreux, antibiotique, neurologie principalement) ainsi que l'évaluation des excipients et des produits exploratoires. Suite à ces différentes études, l'objectif est de pouvoir identifier de nouveaux éléments qui pourront pas la suite peut être donner lieu à de nouveaux médicaments. Il peut s'agir de conduire des études de PK simple: suivre les paramètres de l'élément testé dans les matrices plasma/serum principalement. Il peut s'agir de conduire des études PK/PD: suivre les paramètres de l'éléments testés dans les matrices plasma/serum principalement mais également de suivre les effets de ces éléments test en suivant certains paramètres biologiques. Il peut s'agir de conduire des études pour mettre en avant les phases Administration, Distribution, Métabolisme et Elimination. Dans ce cas les éléments test peuvent être suivis dans les urines, fécès, bile ...

Bénéfices attendus

L'intéret de ce projet est de pouvoir mener différentes études en testants différents éléments d'essai sur des rongeurs. Cela permettra d'identifier les composés intéressants qui pourront peut être déboucher sur de nouveaux médicaments humain ou vétérinaires. Les différents protocoles entrant dans le scope de ce projet (études PK, études PK/PD, études ADME) seront primordiaux pour avoir des données sur les paramètres phamacocinétiques et pharmacodynamiques des éléments testés pour pouvoir déterminer les relations dose/effet.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents types d'intervention - Premièrement l'administration de l'élément test. Cela sera fait sur animal vigile par un personnel formé pour éviter tout stress à l'animal -Puis des prélèvements de sang seront réalisés. En fonction de l'espèce animale les volumes et le nombre pourront varier. Pour les rats et les cobayes, 9 prélèvements maximum sur 24h, volume prélevé environ 60 μL Pour les souris, 9 prélèvements maximum sur 24h , volume prélevé environ 30 μL. La durée d'un prélèvement est inférieur à la minute. Les animaux pourront être placés en cage à métabolisme pour des recueils d'excrétas si demandés. La durée de l'hébergement dans ces cages à métabolisme sera réduite au maximum. Jusqu'à 7 jours maximum pour le recueil d'urine ou de fecès et jusqu'a 72h maximum pour le recueil de bile. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux.

Impact sur les animaux

Suite aux différentes administrations et durant les prélèvements sanguins, les animaux peuvent ressentir du stress, de la peur à la contention. Les prélèvements sanguins seront réalisés à différents sites de prélèvements, mais il peut y avoir de la douleur, des lésions internes. Lors des recueils de bile, de fécès ou d'urine, les animaux seront hébergés en cage à métabolisme. Cela signifie un hébergement individuel. Cela peut également occasionner du stress pour l'animal. Si l'animal a subit une chirurgie pour un recueil de bile, ou une administration duodénale cela necessite que l'animal porte un dispositif particulier qui peut influer sur sa liberté de mouvements. Tous ces gestes seront réalisés par un personnel expérimenté pour éviter au maximum toutes ces nuisances

Devenir

A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort. Cela sera pratiqué par un personnel expérimenté conformément à la réglementation en vigueur.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux ni d'évaluer les effets d'une molécule sur un ou plusieurs paramètres pharmacodynamiques au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier.

Réduction

Pour ce projet, il est envisagé d'utiliser environ 1500 rats, 2000 souris, 100 cobayes sur 5 ans. Ce sont des chiffres approximatifs pour une durée de 5 ans. Le nombre d'animaux inclus dans chaque étude entrant dans le scope de ce projet sera réduit au minimum pour avoir des résultats interprétables. Par exemple en utilisant la technique du micro sampling ( prélèvement de 30 µL de sang par animal) ou en utilisant des animaux cathétérisés cela permettra de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés car 9 points de pK pourront être réalisés sur le même animal.

Raffinement

Une attention particulière sera portée à l'enrichissement du milieu. Animaux hébergés en groupe autant que possible avec présence d'enrichissement au maximum au niveau des hébergements ( présence de buchettes, cachettes, tunnels ...) Les animaux seront observés quotidiennement pour une prise en charge rapide. Pour préserver les sites de prélèvement au maximum, un point de compression sera réalisé aprés chaque prélèvement avec la possibilité d'appliquer de la glace afin d'éviter la formation d'hématome. Les sites seront alterner autant que possible et le nombre de prélèvement de sang par site sera réduit au minimum.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont les espèces majoritairement utilisées dans ces études. Ces espèces sont bien décrites et caractérisées dans la littérature et leur utilisation est conseillée (OCDE) pour les essais de produits pharmaceutiques. Le cobaye est minoritairement utilisé mais peut permettre d'identifier des métabolites absents chez les deux précédentes espèces, par exemple. Nouveau nés, jeunes, adultes. Le stade de développement sera justifié pour chaque étude. Cela dépendra de la cible concernée pour le produit testé.

12 750 animaux non-humains, soit 5 100 souris, 5 100 rats et 2 550 lapins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation de l'œil leur est provoquée par injection oculaire ou systémique, suivie d'examens ophtalmologiques parfois sous anesthésie, avant mise à mort pour analyse des tissus. Le porteur attend des modèles servant à évaluer de futurs traitements et décrit une inflammation, un gonflement au point d'injection et de possibles diarrhées. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'œil "dans sa globalité fonctionnelle".

Objectifs

Les uvéites sont des inflammations, réactions de défense de l'organisme à une agression, de la partie de l'oeil appelée uvée qui est composée de plusieurs structures internes de l’oeil. Elles entrainent une rougeur de l'oeil, altèrent la vision, occasionnant des troubles ou l'apparition de taches, et peuvent conduire à la cécité en l'absence de soins. Dans les pays occidentaux, elles seraient à l’origine de 5 à 20% des cas de cécité. Les causes des uvéites sont variées: d’origine infectieuse, associées à une autre pathologie ou auto-immunes. L’objectif du projet est la mise en place de modèles expérimentaux d'uvéite chez le rongeur et le lapin, afin de contribuer au développement de nouveaux traitements médicaux pour diminuer les symptômes. Compte tenu des particularités physiologiques et anatomiques de l’organe concerné et l’absence pour l’instant de modèle alternatif, nous devrons avoir recours à des animaux pour établir notre modèle. Les informations bibliographiques recueillies, les analyses statistiques ainsi que notre expérience, nous permettrons de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements contre les signes et les origines des uvéites est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.

Procédures

Selon la procédure, l'induction de la pathologie peut se faire soit par une injection directement au niveau de l'oeil soit par une injection systémique, intraveineuse pour le lapin, sous cutanée pour le rat, sous-cutanée ou intrapéritoneale pour la souris. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations par une lampe à fente d'phtalmologie). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif ou tout autre marqueur d'intérêt. Les prélèvements de sang se feront par ponction et basé sur des recommandations et durent moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Les signes cliniques attendus sont une inflammation de tissus de l'oeil, conjonctive, iris, humeur aqueuse, rétine, vitré et photophobie. De même un gonflement au niveau du site d'injection de l'inducteur est attendu (patte, dos, et base de la queue). Des diarrhées peuvent se produire, les animaux seront pesés juste avant l’induction le lendemain et chaque semaine qu’à la fin de la procédure.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo sur les tissus impactés (évaluations histologiques, dosages de produits...).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’oeil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse) de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur la présence ou l'absence d'effet de la molécule testée sur le paramètre étudié. Des évaluations non invasives des structures internes de l'oeil par des techniques d'imagerie ou de mesure de la fonctionnalité de la rétine sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. L'analyse des deux yeux sera effectuée chaque fois que possible afin de réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum pour les rongeurs, de l’enrichissement adapté (abri et morceaux de bois à ronger). Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'oeil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie légère pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l‘établissement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’oeil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dans les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les rongeurs ont minimum 6 semaines au début de l’étude, les lapins 8-12 semaines, âge minimum pour la maturation de la rétine comme il convient au modèle.

7 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'antigènes, parfois adjuvés, et subissent des prélèvements sanguins répétés jusqu'à quatre par jour, pour environ cinquante études d'immunisation par an. Le prélèvement final, mortel, récupère un volume important de sang. Le porteur affirme qu'une immunisation in vivo reste "nécessaire" dans certains cas et indique avoir réduit d'environ 20 % le nombre d'animaux par rapport au projet précédent.

Objectifs

L’objectif des protocoles d’immunisations sont utilisés à des fins scientifiques et médicales. Les applications pour leur utilisation peuvent être diverses comme par exemple : Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine, Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine (médicaments biologiques), Applications diverses en recherche et développement.

Bénéfices attendus

Ces études d’immunisation sont utilisées à des fins scientifiques et médicales. Ces études sont bénéfiques pour les patients à court terme (e.g. fabrication de tests de diagnostic de type ELISA) et à moyen/long terme (eg. Phase de recherche et développement pour la mise à disposition de médicaments biologiques). Réalisation d’environ 50 études par an d’immunisation avec une moyenne de 30 animaux par étude.

Procédures

Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à des injections d’antigène et des prélèvements sanguins répétés. Concernant les injections, les volumes maximum sont de 0.5 mL / site (4 sites maximum) pour la voie sous-cutanée, 0.05mL/site (2 sites maximum) pour la voie intra-musculaire, 0.2mL pour la voie intraveineuse, 1mL pour la voie intra péritonéale. Une injection de dose solide est également possible (diamètre de la seringue maximal 1.4mm). - Temps minimum entre deux injections : 1 semaine sur des sites différents (sauf intraveineuse : 1 jour), à condition qu’aucune réaction anormale n’ait été observée sur l’animal. La durée d’injection est d’une dizaine de secondes à 5 minutes selon la voie. Le nombre d’injections dépend de la voie d’injection et du protocole du scientifique. Concernant les prélèvements (durée maximum 5 minutes), les animaux peuvent être soumis à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements par jour). Une pesée hebdomadaire d’une durée inférieure à 5 minutes est réalisée jusqu’à une fois par jour selon le protocole et l’état clinique de l’animal.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : Douleur, stress, perte de poids et inflammation localisée au site d’injection liés à des injections répétées d’antigènes (+/- adjuvés), Douleur, stress, perte de poids et saignements et/ou inflammations localisés aux sites de prélèvements liés aux prélèvements sanguins répétés, La contention de l’animal d’une manière générale qui peut amener à du stress chez l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Lors du prélevement final un volume significatif de sang est récupéré.

Remplacement

La production d’anticorps par méthode in-vitro exclusive comporte des avantages mais dans certains cas (exemples :besoin de concentration en anticorps élevée, glucosylation appropriée, affinité des anticorps spécifique…), une immunisation de type in-vivo reste encore nécessaire de nos jours. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Réduction

A travers les années d’expertises gagnées par l’établissement utilisateur, il n’est pas nécessaire de commander plus d’animaux que demandés par le scientifique pour réaliser le projet. Si une exception à cela devait avoir lieu, une revue par les membres de la SBEA serait nécessaire avant d’initier le projet. Avec l’expérience acquise, le nombre d’animaux prévu dans ce projet est diminué de l’ordre de 20% par rapport au projet précédant. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux, avec différents enrichissements dans leurs cages (e.g. tunnel, nidification…) . Elles sont observées chaque jour par du personnel formé et compétent et des points limites sont mis en place. Les techniciens animaliers sont encouragés à favoriser la manipulation sans stress des animaux (contention avec la technique de la cuillère ou utilisation de tunnels). Des signes cliniques spécifiques aux protocoles d’immunisation sont reconnus et appliqués comme points limites intermédiaires - entraînant une surveillance accrue avec mise en place de raffinements et traitements – et points limites terminaux - entraînant la mise à mort immédiate de l’animal. Avant les injections intra-veineuses les souris sont positionnées dans une enceinte chauffante à 38°C pendant 10 minutes pour faciliter l’injection intra-veineuse. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la «Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisés que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique Également après prélèvement intermédiaire de sang supérieur à 250μL, une injection est effectuée en sous cutané pour réhydrater l’animal (minimum 40ml/kg). Un anesthésiant local est appliqué en amont de l’injection d’une dose solide (15/30 minutes avant l’injection).

Choix des espèces

La souris est une espèce adaptée pour les études d’immunisation étant donné la qualité du sérum produit et elle répond donc aux demandes des scientifiques. L’âge minimal des souris à J0 est de 8 semaines. A cet age, les souris ont un système immunitaire permettant la réalisation des études de type immunisation.

2 000 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'antigènes, parfois adjuvés, et subissent des prélèvements sanguins répétés jusqu'à quatre par jour, dans le cadre d'études d'immunisation destinées à produire des tests de diagnostic et des médicaments biologiques. Le prélèvement final, mortel, récupère un volume important de sang. Le porteur reconnaît que la production d'anticorps in vitro existe mais affirme qu'une immunisation in vivo reste "nécessaire" dans certains cas, notamment pour la qualité du sérum.

Objectifs

L’objectif des protocoles d’immunisations sont utilisés à des fins scientifiques et médicales. Les applications pour leur utilisation peuvent être diverses comme par exemple : Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine, Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine (médicaments biologiques), Applications diverses en recherche et développement.

Bénéfices attendus

Ces études d’immunisation sont utilisées à des fins scientifiques et médicales. Ces études sont bénéfiques pour les patients à court terme (e.g. fabrication de tests de diagnostic de type ELISA) et à moyen/long terme (eg. Phase de recherche et développement pour la mise à disposition de médicaments biologiques). Réalisation d’environ 40 études par an d’immunisation avec une moyenne de 10 animaux par étude.

Procédures

Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à des injections d’antigène et des prélèvements sanguins répétés. Concernant les injections, les volumes maximum sont de 10mL / kg (4 sites maximum) pour la voie sous-cutanée, 0.5mL/site (2 sites maximum) pour la voie intra-musculaire. Une injection de dose solide est également possible (diamètre de la seringue maximal 1.4mm). Temps minimum entre deux injections : 1 jour, sur des sites différents à condition qu’aucune réaction anormale n’ait été observée sur l’animal. A noter qu’en routine, le temps entre deux injections est supérieur à 1 semaine La durée d’injection est d’une dizaine de secondes à 5 minutes selon la voie. Le nombre d’injections dépend de la voie d’injection et du protocole du scientifique. Concernant les prélèvements (durée maximale de 5 minutes), les animaux peuvent être soumis à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements par jour). Une pesée hebdomadaire d’une durée inférieure à 5 minutes est réalisée jusqu’à une fois par jour selon le protocole et l’état clinique de l’animal.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : Douleur, stress, perte de poids et inflammation localisée au site d’injection liés à des injections répétées d’antigènes (+/- adjuvés), Douleur, stress, perte de poids et saignements et/ou inflammations localisés aux sites de prélèvements liés aux prélèvements sanguins répétés, La contention de l’animal d’une manière générale qui peut amener à du stress chez l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Lors du prélevement final un volume significatif de sang est récupéré.

Remplacement

La production d’anticorps par méthode in-vitro exclusive comporte des avantages mais dans certains cas (exemples :besoin de concentration en anticorps élevée, glucosylation appropriée, affinité des anticorps spécifique…), une immunisation de type in-vivo reste encore nécessaire de nos jours. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Réduction

A travers les années d’expertises gagnées par l’établissement utilisateur, il n’est pas nécessaire de commander plus d’animaux que demandés par le scientifique pour réaliser le projet. Si une exception à cela devait avoir lieu, une revue par les membres de la SBEA serait nécessaire avant d’initier le projet. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Raffinement

Les cobayes sont hébergés en groupes sociaux, avec différents enrichissements dans leurs cages (e.g. tunnel, mousqueton…) . Ils sont observés chaque jour par du personnel formé et compétent et des points limites sont mis en place. Des signes cliniques spécifiques aux protocoles d’immunisation sont reconnus et appliqués comme points limites intermédiaires - entraînant une surveillance accrue avec mise en place de raffinements et traitements – et points limites terminaux - entraînant la mise à mort immédiate de l’animal. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la «Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. En cas d’hémorragie inattendue lors d’un prélèvement sanguin, une réhydration via injection sous cutanée est effectuée (minimum 10ml/kg). Un anesthésiant local est appliqué en amont de l’injection d’une dose solide (15/30 minutes avant l’injection).

Choix des espèces

Le cobaye est une espèce adaptée pour les études d’immunisation étant donné la qualité du sérum produit et il répond donc aux demandes des scientifiques. Le poids minimal à J0 est de 250 grammes. A cet âge, les cobayes ont un système immunitaire mature permettant la réalisation des études de type immunisation.

970 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés ensuite dans d'autres projets après avis vétérinaire. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie de 1h30 à 2h, parfois une seconde chirurgie pour une mini-pompe, puis reçoivent des candidats médicaments par diverses voies pendant plusieurs jours, avec des périodes d'isolement et de mise à jeun jusqu'à 20 heures. Le porteur décrit ces atteintes comme un stress modéré et transitoire. Il affirme qu'avant toute administration à l'homme l'animal constitue un "passage obligatoire" et qu'il n'existe pas de méthode de substitution pour évaluer les effets cardiovasculaires.

Objectifs

Chaque étude de ce projet consiste à évaluer les effets cardio-vasculaires de différents candidats médicaments chez le rat éveillé en utilisant un enregistrement automatique des paramètres cardio-vasculaires (télémétrie). Pour cela, des chirurgies sont prévues afin d'implanter de manière définitive un dispositif d'enregistrement. Les enregistrements se feront en cage de vie et sur des animaux libres de leur mouvements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Les procédures de ce projet nécessitent différents types d'interventions. Dans un premier temps, une chirurgie sous anesthésie générale sera pratiquée afin d'implanter un dispositif (émetteur de télémétrie) permettant l'enregistrement automatique des paramètres cardio-vasculaires (durée: 1h30-2h). Les animaux seront tenus afin de pouvoir leur administrer des produits anesthésiques et analgésiques (durée: environ 1-2minutes). Après la chirurgie d’implantation de l’émetteur de télémétrie, 10 à 15 jours de récupération, au minimum, sont prévus avec isolement des animaux pour optimiser la cicatrisation. Pour certains protocoles, une seconde chirurgie pourra être pratiquée après récupération de la première chirurgie (durée: 30-45min). Le but de cette seconde chirurgie est d’implanter une mini-pompe sous la peau pour perfuser le produit à tester de façon continue. Dans ce cas, les soins post-opératoires ne pourront pas être suspendus et leurs durées seront fonction du type de mini-pompe implantée (durée maximale: 1 semaine). Le candidat médicament ou du placebo seront administrés aux animaux par voie orale, intrapéritonéale, sous-cutanée (continue ou non), transdermique, intramusculaire ou intraveineuse (bolus ou perfusion ou continue) (durée 1-2minutes et non applicable pour les administrations continues via une mini-pompe). Ainsi, leur potentiel effet sur les paramètres cardiovasculaires pourra être évalué. Cette évaluation se fera chez un animal éveillé et libre de ses mouvements dans sa cage d'hébergement pendant plusieurs heures ou jours. Dès que possible, les animaux seront hébergés avec un animal compagnon afin de ne pas être isolé. Des prélèvements sanguins pourront être effectués durant les phases expérimentales sur animal vigile ou anesthésié (durée des prélèvements: moins de 3min). Pour certains protocoles, des animaux pourront être mis à jeun (durée maximale: 20 heures). En cas de mise à jeun, une période minimale d’une semaine sera respectée entre chaque expérience de télémétrie (à l'inverse de 24h sans mise à jeun).

Impact sur les animaux

Les contentions des animaux vigiles pour induire l'anesthésie et administrer le produit peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. La chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie et la potentielle chirurgie d'implantation d'une mini-pompe peuvent induire des douleurs post-chirurgicales qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, analgésie et un protocole de soins post-opératoire. Post-chirurgie.s, les animaux pourront être isolés: 10/15 jours maximum post chirurgie d'implantation de l'émetteur de télémétrie et éventuellement, 1 semaine supplémentaire maximum post chirurgie d'implantation d'une mini-pompe. Cet isolement engendra un stress de durée moyenne et d'intensité modérée (désocialisation). Cependant en contrepartie, l'isolement permettra aussi d'accélérer la récupération post-chirurgicale. Finalement, les animaux pourront être mis à jeun avant l'administration du produit (et de façon exceptionnelle, avant les chirurgies). Cette période de jeun durera maximum 20h. La mise à jeun engendre un stress physiologique et psychologique d'intensité modérée mais de courtes durées.

Devenir

Réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire (sauf en cas de prélèvements d’organes / fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal).

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur la fonction cardiovasculaire. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’une des espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe (6 à 12) est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. L'utilisation de la télémétrie permet de faire des suivis sur de longues périodes. De plus, en général, les mêmes animaux sont utilisés pour les administrations des placebos et des produits (avec un temps de récupération entre les 2). Ainsi, la technique de télémétrie permet de diminuer le nombre d'animaux en ne multipliant pas les animaux pour l'étude de divers temps et groupes expérimentaux. Enfin, une réutilisation des animaux pour plusieurs études, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra aussi de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement est obtenu par : l'utilisation d'animaux libres de leurs mouvements pendant les enregistrements, la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, la validation du système de télémétrie et validation pharmacologique du modèle, le suivi des signes cliniques et des points limites, le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, des protocoles chirurgicaux avec une anesthésie et une analgésie adaptées et maitrisées, le suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux. L'ensemble des mesures décrites ci-dessus permet de réduire les contraintes potentielles pour l'animal à leur minimum.

Choix des espèces

Le rat est l'une des espèces de rongeurs les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur le système cardiovasculaire car il s'agit d'une espèce bien connue et décrite dans les premières étapes de l'évaluation des effets cardiovasculaires des candidats-médicaments. Des animaux adultes seront utilisés. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.