Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Biodistribution et suivi pharmacologique de vecteurs conjugués VHH chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Sur animal vigile, elles reçoivent des injections intraveineuses ou sous-cutanées de vecteurs-médicaments et des prélèvements de sang à la queue, pour mesurer la biodistribution de molécules censées passer la barrière du cerveau. Le porteur, une société privée, indique un risque de choc anaphylactique parmi les effets possibles. Les bénéfices médicaux annoncés pour les patients sont renvoyés au long terme.
Objectifs
Les neuropathies, myopathies, et maladies rares font partie des causes majeures de handicaps sévères dans le monde. A l'heure actuelle, les besoins médicaux actuels restent malheureusement très insatisfaits, sans aucuns traitements curatifs, ou palliatifs. Les maladies neurodégénératives telles qu’Alzheimer ou démences associées, les maladies lysosomales, les myopathies (Duchenne) sont des exemples d'enjeux de santé publique. C’est dans ce contexte scientifique que notre société a développé un savoir-faire qui consiste en la conjugaison de vecteurs (peptides) à des pro-drogues ou médicaments capables de passer les barrières physiologiques naturelle et dons d’atteindre plus efficacement les tissus cibles (cerveau, muscles…). En effet, la plupart de ces médicaments restent inefficaces par manque de passage et d'accès aux régions ou organes à traiter. L’objectif principal de notre société sera donc de proposer de nouvelles formulations capables de reconnaitre leurs partenaires naturels spécifiques, au niveau des barrières cellulaires protectrices de l'organisme et d'utiliser leurs mécanismes naturels de passage cellulaire pour atteindre le tissu cible. Par cette technique du cheval de Troie, nous faciliterons le passage de médicaments à travers la Barrière Hématoencéphalique (BHE) vers le système nerveux central (SNC). A travers cette demande de projet nous souhaitons développer et optimiser nos « vecteurs » (VHH) pour améliorer la délivrance d’agents au fort potentiel thérapeutique. Par des approches systémiques, en administrations intra-veineuses ou dermiques, en sous cutanées, nous tenterons d’améliorer le potentiel d’actions de nos vecteur-médicaments, sur une lignée murine de fond consanguin, génétiquement modifiée et humanisée pour le récepteur cible de ce projet.
Bénéfices attendus
> Choix d’une lignée murine "Humanisée" pour le récepteur : La transposition de nos recherches sur un modèle murin, aux récepteurs humanisés, permet d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos molécules et les possibles effets secondaires ou toxicités associées. De plus, elle assure de développer au maximum les études sur le modèle souris avant la phase préclinique et la transposition à l’homme, qui aurait nécessité des séries de tests sur divers modèles animaux. Enfin, le fait de pouvoir humaniser notre cible endogène chez la souris constitue un excellent outil stratégique et scientifique, se traduisant par une réduction importante du nombre d’animaux au sein des études, par un gain de temps considérable (et donc économique), tout en réduisant par la suite de potentiels essais sur modèles animaux plus gros. D'un point de vue médical, sur du plus long terme, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos Vecteurs médicaments (VHH) constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures en validant sur un modèle souris pathologique, puis à terme, dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.
Procédures
Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil. Les manipulations expérimentales, sur animaux vigiles, (Pesées, intraveineuses ou sous-cutanées, prélèvements intermédiaires de sang) seront précises et rapides (≤ 2min). • Posologie : Les pesées (calculs posologies), annotations queues des souris (marqueur spécifique pour animaux), et l’ensemble des gestes à suivre seront réalisés par le même expérimentateur. En cas de procédure à doses répétées (≥ 24h), une pesée sera systématiquement effectuée avant chaque administration. • Administrations de VHH : Les administrations se font sur animaux vigiles au niveau caudal pour les intraveineuses, à la base du crâne (nuque), pour les sous-cutanée. Pour les administrations répétées (x3 maximum), un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. • Prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés en cours de cinétique, à différents « time points » sur animaux vigiles en contention spécialisée. Par une micro-incision de l’extrémité caudale, 3 à 5 gouttes de sang (≤50μl) suffiront pour quantifier la 1/2 vie plasmatique de nos VHH. Ces prélèvements de sang se feront aux temps intermédiaires de 4h, 24h, 72h ou encore 168h, en fonction des groupes, contrôles et VHH.
Impact sur les animaux
Dans ce projet nous chercherons à limiter au maximum le stress induit aux animaux. Ainsi, nous ne modifierons pas leur quotidien (cycles) et garderons les mêmes cages et aliments (absence de faim). Les animaux seront groupés par 4, ce, dès leur réception par les animaliers (absence isolement). Une salle spécifique servira de stabulation lors des cinétiques, elle présentera les mêmes conditions de vie qu’en hébergement. Dans ce projet, il n’y aura pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni d’intervention chirurgicale avec réveil (absence douleur, lésions). Les administrations, précises et rapides, se feront sur animaux vigiles et tenus en contention pour les intraveineuses (réduction stress et peur). De plus, nous proposons d’étudier nos VHH sur des temps d’incubations majoritairement courts. Certaines cinétiques pourront être élargies à 1 ou encore maximum 3 mois, en fonction du délai d’action pharmacologique. Si on se fie aux données de la littérature et notre expertise, les cinétiques d'incubations de quelques semaines à 3 mois ne suffisent pas pour générer des effets indésirables ou engendrer des conséquences physiologiques. En effet, les conjugués administrés présentent des demi-vies dites « relativement courtes », de quelques heures à quelques jours, seuls les effets cibles pharmacologiques de nos médicaments optimisés peuvent nécessiter des cinétiques plus longues avant d’en mesurer pleinement leurs efficacités. Ici, post-administration, le principal risque se trouve être la réaction immunitaire (choc anaphylactique), ainsi que d’autres effets indésirables (réaction allergique ; détresse cardio-respiratoire ; modification et troubles comportementaux). Mais là encore, ces problématiques sont étudiées en amonts et en post-expérimentales (immunogénicité) couplées à de la littérature et le savoir de nos experts en chimie et pharmacologie. Nos composés VHH administrés aux souris ne doivent pas présenter de toxicité, il en va de l’intérêts des animaux mais aussi de l’étude. Malgré ces précautions, une observation comportementale des animaux sera faite de manière quotidienne, à la recherche du moindre signe de souffrance, le tout accompagné d'un suivit du poids, du début des administrations à la fin des cinétiques, afin de s'assurer que les animaux ne perdent pas plus de 10% de poids initial.
Devenir
En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements tissulaires en point final. Si, entre temps, en cours de cinétique, un individu atteint un point limite, l'animal sera également euthanasié en urgence après validation du vétérinaire et porteur de projet.
Remplacement
Pour mener à bien nos projets, nous envisageons de réaliser des expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres physiologiques, mécanistiques et homéostasiques, indispensables pour pouvoir étudier une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Le principal désavantage concerne donc le recours à l’utilisation d’animaux. Il s’agit pour cela de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus. Les faibles cohortes d'animaux permettront d’obtenir un maximum de résultats, suffisant pour l’obtention de données statistiques significatives.
Réduction
L’optimisation de nos vecteurs et voies d’administrations permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), de limiter les possibles effets secondaires, mais aussi le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux se répartit sur de petits groupes de n=4, à raison de 240 souris/an, réparties sur 10 études de 24 individus. Cette estimation est basée sur notre expérience et d’anciens projets, similaires, réalisés sur le modèle souris par la société. Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus), sera suffisant et nous orientera vers des tests statistiques adaptés (non-paramétriques) permettant d’utiliser un faible nombre de souris sans compromettre les objectifs de l’étude. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile des souris et permettra d’optimiser la procédure sur plusieurs types de post-expérimentations. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (Prélèvement caudal ≤50 μl) en cours de cinétique permet d'obtenir des données de ½ vies plasmatiques supplémentaires, ce qui va également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
La formation initiale et l’expérience du personnel sont nécessaires afin d’appréhender les moindres signes et/ou comportements caractéristiques d’une douleur ou gène chez l’animal (Annexe II : grille score et points limites). Nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux pour un minimum de 14j dès réception. La veille des tests, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce cyclée (12h/12h), insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), dans la même cage (taille standard pour portoir ventilé + couvercle à filtre), un maximum de 4 individus par cage, litières (copeaux de bois) et raffinements (maison en carton et Sizzle-Nest). Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil. Les manipulations expérimentales, sur animaux vigiles, (Pesées, intraveineuses ou sous-cutanées, prélèvements intermédiaires de sang) seront précises et rapides (≤ 2min). La simplicité des administrations nous permet facilement d’envisager différentes stratégies pharmacologiques plus complexes, à doses uniques ou répétées (x3 maximum) (administration i.v. 5.5ml/kg, s.c. 10ml/kg). Des points limites seront établis en cours de cinétique, lors du suivi des animaux. Un score modéré (7-9) conduira automatiquement à une exclusion et sortie de l’étude, puis à l’euthanasie (cf. 3.3.3) du ou des animaux en question (Pas de maintiens isolés inutiles, ni de soins ou d’utilisation d’analgésique). En point final de l'étude, les animaux seront tous euthanasié sans stress ni douleur, pour collecter les tissus d'intérêt. La lignée humanisée utilisée n’a jusqu’alors jamais présenté d’apparitions de phénotypes dommageables chez les animaux. Nous utiliserons des animaux issus du même élevage et fournisseur.
Choix des espèces
Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières études précliniques. Le développement préclinique nécessite tôt ou tard une première approche in vivo, sur un modèle animal tel que le rongeur, dans notre cas, la souris. C’est le modèle le plus standardisé et utilisé en expérimentation animale, car sa physiologie, bien connue (mammifère), est relativement proche de l’homme. Le modèle rongeur facilite les manipulations, les injections et observations comportementales. Il est aussi plus adapté et intéressant pour la partie pharmacologie (diminution des posologies). En pratique, on l’utilise principalement pour la facilité de mise en place des expérimentations et l’obtention de groupes allant jusqu’à 4-5 individus sans trop de contraintes de stabulation. Notre modèle souris humanisé est particulièrement avantageux dans notre projet car il présente l’avantage d’avoir notre cible endogène humanisée (récepteurs). Les données obtenues sur ce modèle permettront notamment une extrapolation plus pertinente au modèle humain, d’envisager un gain de temps dans le développement futur du projet, mais aussi, d’éviter un certain nombre d’études et une utilisation significative d’animaux. Les animaux seront utilisés pour réaliser des suivis pharmacologiques, des échantillonnages de tissus, organes ou liquides physiologiques, ceci à des fins scientifiques. Pour notre procédure, nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 25-27g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).
Evaluation des effets de nouvelles entités pharmacologiques sur l’activité locomotrice spontanée ou pharmaco induite chez le rongeur
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 4800
9 600 rongeurs, 4 800 souris et 4 800 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 7 200 tués à l'issue et 2 400 réutilisés. Ils reçoivent des administrations répétées de composés par plusieurs voies, avec des mises à jeun pouvant atteindre seize heures et un isolement sans eau ni nourriture jusqu'à quatre heures, pour mesurer les effets de nouvelles molécules sur l'activité locomotrice. Les animaux traités sont tués pour éviter toute interférence avec d'autres essais, tandis que les témoins peuvent être réutilisés. Le porteur décrit ces données précliniques comme "indispensables" avant le passage à l'humain.
Objectifs
Des composés ciblant le système nerveux central, par leur action sur certaines régions cérébrales , peuvent avoir un impact sur l’activité locomotrice générale et donc générer des troubles locomoteurs tels que baisse de l’activité exploratoire, activité motrice diminuée ou augmentée. Ce projet a pour objectif d’étudier les effets de nouveaux produits synthétisées ou acquis au sein du laboratoire sur le comportement locomoteur spontané ou pharmacologiquement induit de rongeurs (rats ou souris). Le but de ce projet est d'obtenir des données comportementales chez le rongeur nécessaires pour poursuivre de développement de nouvelles molécules en phase clinique chez l’humain. Il s'agira de - détecter sur l'activité locomotrice l'existence d'effets secondaires chez l’animal avant administration à l’Homme , - de mesurer la capacité de composés à agir sur l’activité locomotrice soit spontanée, soit induite pharmacologiquement (en général une hyperlocomotion induite).
Bénéfices attendus
A court terme, il s’agira de démontrer à l’aide de données précliniques l’efficacité potentielle de nouveaux produits pharmacologiques : les procédures mises en œuvre permettront de mesurer l’efficacité de nouvelles molécules vis-à-vis d’activités locomotrices pharmaco induites, de les comparer et ainsi de choisir la meilleure selon des critères de sélection pour l’application thérapeutique ciblée. Il s’agira aussi de vérifier l’absence d’effets locomoteurs importants de nouvelles entités pharmacologiques sur l’activité spontanée. A long terme, ce projet permettra de d'obtenir des données scientifiques pré-cliniques robustes indispensables pour le développement de nouveaux candidats médicaments, notamment avant le passage en phase de tests chez l'Homme.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à des administrations dont la voie (orale, intrapéritonéale, sous-cutanée) ainsi que la fréquence d’administration (aigüe ou chronique, dans ce cas 2 administrations/jour max) seront adaptées en fonction des objectifs de recherches. Les délais d'administration avant les phase de test d'activité locomotrice seront de 0 à 4h. Pour chaque administration, une courte contention (
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, les animaux recevront des administrations de composés avant les évaluations comportementales. Il est possible que la courte contention alors nécessaire (
Devenir
Les animaux traités avec des composés pharmacologiques qui risqueraient d’interagir avec d’autres expérimentations dans le but d’une réutilisation seront mis à mort. Certains animaux, les animaux contrôles, pourront cependant être soumis à une autre procédure expérimentale du projet si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée, ou pourront être réutilisés pour d’autres projets en fonction des objectifs de recherche. La décision sera prise par le responsable projet (une personne compétente désignée par lui) ou le vétérinaire.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de nouvelles entités pharmacologiques sur l’activité motrice dans le cadre du développement de nouveaux médicaments. Il n’existe à ce jour pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet c’est pourquoi l’utilisation de modèles in vivo est indispensable avant toute administration à l’homme, rat et souris étant ici les espèces les plus adaptées.
Réduction
Un effectif minimum et suffisant de 12 animaux par groupe expérimental est prévu afin d’obtenir une robustesse satisfaisante des tests statistiques. En fin de procédure, les animaux (en particulier les contrôles) seront au maximum réutilisés dans d’autres projets comportementaux ou bien pour des analyses histologiques faisant l’objet d’autres projets.
Raffinement
Les animaux (rats, souris) sont hébergés en animalerie centrale et restent 5 jours en acclimatation avant toute expérimentation. Tout au long des études, les animaux sont hébergés en groupe (nombre maximal défini par la règlementation en cours) dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement de milieu (tunnel, Sizzle pad pour nidification…). Le change des cages se fait 2 fois par semaine. Les animaux sont observés chaque jour (week-end compris), et font l’objet d’un suivi SBEA (Structure Bien-être Animal) par l’expérimentateur chaque semaine avec entrée des observations (et des éventuelles actions prises) dans une base de données. Les membres de la SBEA (Structure Bien-être Animal) effectuent une observation mensuelle de tous les animaux. En cas d’atteinte d’un des points limites définis plus loin, l’animal est écarté de l'étude pour subir les soins essentiels ou être euthanasié si nécessaire. Le raffinement sera aussi obtenu grâce au recours à des procédures les moins invasives possibles ainsi qu’à la familiarisation des animaux aux procédures expérimentales (période d’habituation aux pièces et dispositif expérimental, phase de familiarisation aux manipulations, administrations…).
Choix des espèces
Le rat et la souris sont déjà largement caractérisés d’un point de vue comportemental et neurochimique et ils ont un système nerveux suffisamment évolué pour envisager raisonnablement une extrapolation à l’homme de certains résultats. De nombreux parallèles existent en effet entre les caractéristiques comportementales étudiées chez le rat ou la souris et les caractéristiques du comportement humain. Ce sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets de substances sur l’activité locomotrice. Les animaux sont utilisés au stade adulte chez la souris comme chez le rat. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets de produits sur l’animal à d’autres stades de développement. De plus, les tests de locomotion décrits dans ce projet sont classiquement réalisés dans la littérature sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités motrices et cognitives fonctionnelles.
Evaluation de la toxicité orale aiguë de composés naturels et de nouveaux aliments administrés chez le rat femelle Wistar
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
1 200 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Après un jeûne de seize heures, chaque animal reçoit par voie orale une dose unique d'un des cinquante composés testés puis est observé quatorze jours avant euthanasie et autopsie, pour évaluer la toxicité de nouveaux aliments. Le porteur précise qu'aucun traitement antidouleur ne peut être administré dans une étude de toxicité, un animal convulsant ou paralysé étant mis à mort. Il retient les femelles, jugées plus sensibles, et affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'évaluer la toxicité sur un "organisme entier".
Objectifs
La toxicité est la mesure de la capacité d’une substance à provoquer des effets néfastes et mauvais pour la santé ou la survie chez toute forme de vie (animale telles qu’un être humain, végétale, bactérienne...), qu'il s'agisse de la vitalité de l'entité ou d'une de ses parties (ex: foie, reins, poumons.... chez l'animal). La toxicité orale aiguë est l'effet néfaste qui se produit dans un court laps de temps et qui résulte de l'administration par voie orale d'une dose unique d'une substance. Une étude de toxicité aiguë aboutit classiquement à la détermination de la dose maximale tolérée (DMT). La DMT orale est la valeur dérivée d'une dose unique de substance dont l'administration par voie orale peut provoquer la mort de 50 % des animaux d'expérience. C'est une technique exploratoire, permettant de "trier" les produits les plus toxiques et le but d’une étude de toxicité orale aiguë est d'évaluer les effets d'une forte exposition, préalablement à la réalisation d’études de toxicité avec une exposition pendant 90 jours. L’objectif de ce projet d’une durée de 5 ans, réalisé selon les exigences réglementaires de lignes directrices, sera d’évaluer la toxicité éventuelle de 50 composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments, administrés par voie orale en traitement unique en prenant une dose de départ selon les données d’études in vitro effectuées au préalable. Ces études seront réalisées chez des rats femelles uniquement, celles-ci étant considérées comme étant plus sensibles que les mâles aux effets toxiques potentiels de substances. Après mise à jeun la veille au soir, les animaux seront traités le lendemain matin par une administration orale unique de chacun des composés à tester. Les animaux seront ensuite observés et évalués pendant 8 heures après l’administration orale de chacun des 50 composés à évaluer, l’aliment usuel étant redonné 3 heures après l’administration orale, puis les animaux seront observés deux fois par jour au minimum au cours des 14 jours de suivi, week-end et jours fériés compris, afin de détecter tout comportement anormal ou atteinte de point limite pouvant nécessiter leur euthanasie. Les animaux seront pesés régulièrement pendant les 14 jours de suivi jusqu’à leur euthanasie avant la réalisation d'une autopsie macroscopique.
Bénéfices attendus
Un nouvel aliment, appelé également Novel Food, reste défini dans le Règlement de l'Union Européenne comme étant un aliment pour lequel la consommation humaine est restée négligeable dans l’Union Européenne avant le 15 Mai 1997, lorsque la première réglementation sur les nouveaux aliments est entrée en vigueur. Les nouveaux aliments ne peuvent pas être mis sur le marché ou utilisés dans des denrées alimentaires destinées à la consommation humaine tant qu’ils ne sont pas inscrits sur la liste de l’Union Européenne, qui stipule les spécifications du nouvel aliment et ses conditions d’utilisation dont la notion de dose, et regroupant les nouveaux aliments autorisés à être mis sur le marché dans l’Union Européenne. Une demande dite Novel Food doit prouver la sécurité du nouvel aliment et sera transmise aux autorités pour évaluation. Un tel dossier a pour objectif de caractériser le nouvel aliment et prouver sa sécurité à travers des tests toxicologiques notamment. L’enjeu social est donc de prouver l’absence éventuelle de toxicité des 50 composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments pour une utilisation future chez l’homme et d’un point de vue économique de permettre le développement de la consommation de ces 50 composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments par l’industrie agro-alimentaire afin de proposer de nouvelles solutions pour l’alimentation de demain.
Procédures
La totalité des rats utilisés dans ce projet, entre 300 et 1200 au maximum, sera soumise à une mise à jeun de 16 heures (20h00-12h00), une administration orale unique d’un composé à évaluer effectuée sur animale vigile nécessitant une dizaine de secondes pour être réalisée, à des observations régulières, chaque heure pendant 8 heures puis 2 fois par jour pendant 14 jours suivant l’administration orale, avec la réalisation de tests de réflexe de retournement, 1 par heure pendant 8 heures suivant l’administration orale unique effectuée, réalisé en moins d’une minute à chaque fois.
Impact sur les animaux
Au cours de l’évaluation de la toxicité orale aiguë de 45 composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments que nous avons menée sur un projet précédemment autorisé, après administration d’une forte dose unique de chacun de ces composés, nous n’avons observé aucun signe de toxicité pour l’ensemble de ces 45 composés évalués, aucune perte de poids significative, aucun comportement anomal, et surtout aucune mortalité ni directe ni retardée. Les observations effectuées sur l’ensemble des organes et tissus après euthanasie des animaux n’ont jamais montré d’anomalies liées à l’administration des 45 composés évalués, en dehors de quelques anomalies spontanées retrouvées dans la souche de rat même sans aucun traitement. Nous ne devrions pas non plus observer de toxicité pour les 50 nouveaux composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments que nous serons amenés à évaluer dans ce projet, d'autant que des points limites stricts et spécifiques à celui-ci seront suivis afin de ne pas observer de mortalité ou dans de très rares cas.
Devenir
Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 1200 rats au maximum nécessaires à la réalisation de ce projet seront euthanasiés avant la réalisation d’une autopsie macroscopique des organes et tissus pour s'assurer de l'innocuité des composés testés.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’évaluer la toxicité d’ingrédients et d’aliments sur un organisme entier. Cela ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ces évaluations toxicologiques permettant d’obtenir des résultats prédictifs quant aux objectifs envisagés, selon les recommandations internationales en vigueur. La dose de départ la plus élevée possible sera déterminée sur la base des résultats d’études in vitro effectuées sur les composés à évaluer afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux. Ainsi, et sur la base de l’évaluation de la toxicité orale aiguë de 45 composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments que nous avons menée sur un projet pécédemment autorisé et pour laquelle nous n’avons observé aucun signe de toxicité pour l’ensemble de ces 45 composés évalués à partir d’une dose de départ de 2000 mg/kg correspondant à la dose limite à utiliser, nous devrions avoir à utiliser seulement 6 animaux pour chacun des 50 nouveaux composés à évaluer, soit un maximum de 300 animaux. Cependant, en cas de toxicité avérée, ce nombre pourrait être porté au maximum à 24 animaux pour chacun des 50 nouveaux composés à évaluer, soit un maximum de 1200 animaux. Aucune analyse statistique ne sera effectuée pour l’ensemble de ce projet.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’administration orale des composés à évaluer et à la suite de celle-ci. Les animaux seront ainsi observés chaque heure pendant 8 heures après l’administration orale de chacun des 50 composés à évaluer, l’aliment usuel sera redonné 3 heures après l’administration orale, avec réalisation d’un test de réflexe de retournement toutes les heures. Ils seront ensuite observés deux fois par jour au minimum au cours des 14 jours de suivi, week-end et jours fériés compris, afin de détecter tout comportement anormal ou atteinte de point limite. Les animaux seront pesés régulièrement pendant les 14 jours de suivi jusqu’à leur euthanasie avant la réalisation d’une autopsie macroscopique. Etant donné qu’il s’agit d’études de toxicité, aucune médication ne pourra être donnée aux animaux pour soulager leur éventuelle souffrance. Par contre si un animal présente un niveau de souffrance trop important se traduisant par des tremblements importants (convulsions), une paralysie, une immobilité complète, un arrêt de prise alimentaire…, il sera mis à mort en conformité avec les recommandations éthiques. Le jour et l’heure de son euthanasie seront notés avec le plus de précision possible et une autopise macroscopique sera réalisée pour détecter toute anomalie en terme de forme, taille et couleur sur l’ensemble des organes et tissus des cavités abdominales et thoraciques et de la surface corporelle. Une analyse des organes et tissus anormaux observés, prélevés et fixés sera réalisée. Les rats seront hébergés par 3 dans des cages transparentes (48x27x20 cm), avec pour enrichissement une maisonnette ouverte (16x15x9 cm), en matière spéciale certifiée sans contaminant, transparente, lavable, et suffisamment grande pour que les 3 rats puissent s’y positionner dessous. Cet enrichissement sera toutefois retiré lors de la mise à jeun des animaux jusqu’à la remise de l’aliment usuel dans la cage, soit pendant une durée de 16 heures, pour éviter qu’ils ne le grignotent et ingèrent des particules pouvant induire un effet toxique. Les rats étant des animaux nocturnes, actifs donc la nuit, ils seront placés en cycle de lumière jour/nuit inversé (obscurité de 8h00 à 20h00) pour respecter leur rythme biologique et observer leur comportement pendant leur phase active.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet et celle qui est recommandée par les lignes directrices suivies pour mener de telles études de toxicité orale aiguë. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 8 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 9 semaines pour le démarrage des expérimentations, avec un poids de 175-200 g. Cela correspond au poids de rat recommandé par les lignes directrices qui seront suivies pour mener de telles études.
Modèle de sécheresse oculaire chez le rongeur et le lapin induit par un dysfonctionnement des glandes de Meibomius.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 1000
Lapins : 1000
3 000 souris, rats et lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sécheresse oculaire est provoquée par un dysfonctionnement des glandes de Meibomius, avec administrations souvent quotidiennes de produits par gouttes, injections ou voie intraconjonctivale, entraînant picotements, brûlures, rougeurs et gonflements des paupières, avant mise à mort pour des analyses ex vivo. Le porteur présente les examens comme non invasifs et proches de ceux pratiqués en cabinet. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne mime l'œil "dans sa globalité" et retient trois espèces pour couvrir leurs particularités anatomiques.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de proposer des modèles expérimentaux de sécheresse oculaire chez le rat, la souris et le lapin afin de tester l'efficacité de nouveaux traitements. L’œil sec est une maladie multifactorielle des larmes et de la surface oculaire, plus fréquente chez les femmes et les personnes âgées. Elle concerne 5 à 35% de la population. Les manifestations cliniques sont variées et impactent considérablement la qualité de vie des patients. Les modèles de sécheresse oculaire chez les rongeurs et le lapin sont relativement bien décrits dans la littérature. Les dysfonctionnements des glandes de Meibomius (DGM ou MGD) sont des troubles chroniques répandus affectant la santé et le bien-être de millions de personnes dans le monde. Ces dysfonctionnements constituent une anomalie chronique et diffuse des glandes de Meibomius, caractérisée, en principe, par une obstruction des canaux excréteurs et/ou des modifications qualitatives/ quantitatives des secrétions glandulaires, dont les conséquences potentielles sont : Altérations du film lacrymal, symptômes d’irritation oculaire, inflammation clinique, maladie de la surface oculaire. Les DGM sont classifiés selon deux grandes catégories, en fonction des sécrétions meibomiennes : hypoexcrétion (la cause la plus fréquente du DGM) et hyperexcrétion. En conclusion, les DGM peuvent provoquer des altérations du film lacrymal, des symptômes d’irritation, d’inflammation et de sécheresse oculaires. C’est de loin la première cause de sécheresse dite « évaporative ».
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.
Procédures
Les procédures expérimentales nécessitent l'administration, le plus souvent quotidienne, de différents produits par instillations (gouttes oculaires), par voie intramusculaire, intrapéritonéale, intraconjonctivale. Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations au biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles, sous anesthésie locale ou sous anesthésie légère. Leurs durées sont réduites au maximum pour le bien-être de l'animal. Ces examens ne durent que quelques secondes pour la plupart, 5 minutes environ pour le plus long.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont essentiellement celles observées dans la maladie à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brûlure, des rougeurs palpébrales, des gonflements des paupières. Toutes ces manifestations sont imputables à la composante inflammatoire de la maladie. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une gêne transitoire de courte durée et éventuellement une hyperémie des conjonctives comme on peut le constater chez l’homme.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre des réalisés les évaluations ex vivo (évaluations histologiques sur tissus, dosages de produits...).
Remplacement
L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents. Il est de plus soumis à d'importantes variations environnementales mécaniques et physicochimiques, ainsi qu'à d’importantes interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans sa globalité fonctionnelle et environnementale. C'est pour cela que l’utilisation d’animaux vivants dans ces procédures expérimentales sont nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide des tests statistiques Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger et un abri. Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent l’immobilité de l'animal pourront être réalisés pour son confort sous anesthésie. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 12 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 3 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.
Etude de l’effet de différents candidats médicaments sur la coordination motrice chez les rongeurs (rat et souris) en utilisant le test du rotarod.
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1515
3 030 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la moitié réutilisée dans d'autres projets, l'autre tuée pour des prélèvements terminaux. Ils reçoivent des candidats médicaments par diverses voies puis sont placés sur un axe en rotation, le rotarod, pour mesurer les effets moteurs, avec des prélèvements de sang et parfois une chute de l'axe. Le porteur décrit un léger stress et une douleur comparable à une piqûre d'aiguille. Il indique qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne suffit à évaluer la coordination motrice et présente l'animal comme un "passage obligatoire" avant l'homme.
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer les effets potentiels d'un candidat médicament sur le système nerveux central des rongeurs ( rat et souris) en particulier les effets moteurs des candicats médicaments (type sédatif ou myorelaxant) en utilisant le test du rotarod.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments traitants les troubles du système nerveux central, et la réduction des effets secondaires des médicaments candidats sur la coordination motrice pour le patient. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Du fait de la cible thérapeutique, ce composé pourrait avoir aussi une application en médecine vétérinaire.
Procédures
Les animaux seront administrés avec les composés à tester par différentes voies (-2 min par administration) puis seront placés sur l’axe du rotarod pour une durée de 3 à 5 minutes maximum. Des prélèvements de sang sur animal vigile pourront être effectués (2 minutes par prélèvement). Et l'animal pourra être anesthésié en fin d'expérience pour les prélèvements terminaux de fluides corporels et tissus.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront des administrations de candidats médicaments et des prélèvements de sang qui peuvent être réalisés sur animal vigile ou anesthésié suite auxquelles ils pourront ressentir une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille. Les animaux pourraient présenter un léger stress par le fait de devoir s'accrocher à un axe en rotation. Les animaux pourront de même ressentir une légère douleur liée à la chute de l'axe en rotation du rotarod.
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal ou réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthodes de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une molécule sur la coordination motrice. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat et la souris sont les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 12 par groupe.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire , • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un nouveau médicament sur la coordination motrice. Seuls des animaux adultes seront utilisés. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Evaluation de l’efficacité, de l’innocuité, de la durabilité de nouvelles méthodes et dispositifs en faveur de la santé de la Femme et pour le diagnostic et le traitement des pathologies gynéco-obstétricales par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Moutons : 90
180 animaux non-humains, 90 cochons et 90 moutons, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements sanguins réguliers, des anesthésies générales et des interventions chirurgicales pouvant durer plusieurs heures pour l'implantation de dispositifs médicaux, avant une autopsie et une analyse des tissus. Le projet évalue des dispositifs et techniques chirurgicales pour la santé gynécologique et obstétricale des femmes. Le porteur qualifie le recours à l'animal vivant d'"indispensable" et d'"incontournable", en le présentant comme une obligation réglementaire pour valider les dispositifs implantables.
Objectifs
La santé de la Femme regroupe l’ensemble des spécialités et domaines de la médecine s’intéressant à diagnostiquer, soigner et guérir les troubles, désordres, pathologies ainsi que leurs suites, comme les affections gynécologiques et de la sphère génitale (organes génitaux internes et externes et appareil suspenseur), les troubles obstétricaux, les dysendocrinies, l’infertilité, les pathologies de la glande mammaire comme le cancer du sein et ses conséquences, ou à assurer le suivi des cycles hormonaux ou de certains états physiologiques comme la grossesse par exemple. Le développement des techniques et méthodes d’imagerie et de chirurgie interventionnelles, l’essor de la thérapie génique et cellulaire ou la découverte et l’amélioration des connaissances vis-à-vis de nouvelles entités pathologiques comme par exemple l’endométriose dont la lutte est une stratégie nationale depuis 2021, permettent d’envisager le développement de nouvelles techniques chirurgicales et dispositifs médicaux implantables pour améliorer la santé des patientes, et parfois aussi celle du fœtus ou du nourrisson. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. L'évaluation et le développement des nouveaux dispositifs, méthodes et techniques chirugicales en faveur de la santé de la Femme, pour le diagnostic et le traitement des pathologies gynécologiques et obstétricales par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives requièrent une phase pré-clinique de recherche et de développement. La réponse tissulaire et les modifications anatomophysiologiques au cours des cycles ne peuvent être simulés à l’heure actuelle par des méthodes de remplacement. Durant ce projet le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patientes est indispensable. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans sa phase initiale, puis ces versions entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).
Bénéfices attendus
L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patientes, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patientes, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patientes, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections par le recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - les suites post-opératoires (inflammation, douleur : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique), pour cela des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple la protection des plaies, l'usage de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur).
Devenir
Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.
Remplacement
La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. La réponse tissulaire, les cycles hormonaux et les modifications anatomo-physiologiques correspondantes en particulier durant la grossesse ne peuvent être simulés à l’heure actuelle par des méthodes de remplacement. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patientes est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patientes représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.
Réduction
Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s'assurer de la pertinence de cette estimation.
Raffinement
Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (Anti-Inflammatoires Non Stéroïdiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques détaillés dans la procédure ANIM-WI-015 sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.
Choix des espèces
Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de la femme avec les mêmes dimensions, ce qui impose l’expérimentation sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles. L'atteinte de l’objectif scientifique passe par l'utilisation d'animaux ayant une anatomie et/ou un contexte clinique (création de défect, modèle lésionnel) comparables à ceux observés chez la Femme.
Evaluation de la pharmacocinétique, pharmacodynamie et la sécurité préclinique des candidats médicaments chez le miniporc génétiquement modifié (exprimant des anticorps humanisés)
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
350 miniporcs génétiquement modifiés vont être utilisés, une partie tuée pour des prélèvements terminaux et environ 125 réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des candidats médicaments par voie intraveineuse ou sous-cutanée de façon répétée sur deux mois, avec des prélèvements de fluides et de tissus, pour évaluer la pharmacocinétique et la sécurité de ces molécules avant leur première administration humaine. Le porteur décrit un modèle au système immunitaire "plus proche de l'Homme". Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité d'un "organisme entier".
Objectifs
Un médicament n’est mis sur le marché et rendu disponible aux patients qu’après une longue phase de Recherche et de Développement. Le défi majeur pour la recherche biomédicale est de découvrir de nouveaux médicaments plus efficaces et mieux tolérés. Actuellement, de nouveaux besoins et enjeux apparaissent concernant des candidats médicaments biothérapeutiques dans la recherche contre les maladies cancéreuses, les maladies rares et les maladies immuno-inflammatoires. Ce projet utilise le modèle miniporc génétiquement modifié présentant un système immunitaire fonctionnel plus proche de l’Homme en exprimant des anticorps humanisés. Ces animaux génétiquement modifiés sont plus tolérants aux médicaments biothérapeutiques. Les anticorps dirigés contre le candidat médicament dans les études précliniques peuvent réduire l’exposition des candidats médicaments, réduire leur efficacité et dans certains cas peuvent induire des effets secondaires. L’utilisation de ce modèle permet d’être plus prédictif quant à la formation dans l’organisme d’anticorps dirigés contre le candidat médicament et donc de générer des données précliniques davantage transposables à l’Homme.
Bénéfices attendus
Grâce à l’utilisation du modèle miniporc génétiquement modifié, ce projet permettra de générer des informations essentielles avant la première administration chez l’Homme et de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs et/ou d’arrêter plus précocement le développement de molécules ayant un profil non satisfaisant en termes de sécurité, d’efficacité et/ou de pharmacocinétique au regard de l’indication thérapeutique.
Procédures
Les molécules sont administrées aux animaux par différentes voies (principalement intraveineuse et sous-cutanée) de façon unique ou répétée (en général hebdomadaire ou toutes les 2 à 3 semaines) sur une durée maximale de 2 mois. Des prélèvements de fluides et/ou tissus biologiques associés à une contrainte légère ou modérée de quelques minutes (en début et fin d’étude) sont nécessaires pour évaluer les effets des candidats médicaments et/ou de leurs métabolites. Leur fréquence et volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie quand ils sont invasifs (entre 15 et 60 minutes). Des mesures, comme par exemple la température corporelle (avec une puce électronique) et le poids (deux fois par semaine) sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude.
Impact sur les animaux
Les effets attendus chez les animaux seront limités à une contrainte modérée. Ces contraintes correspondent à celles de l’administration des molécules pouvant se traduire chez l’animal par exemple par une baisse d’activité, une modification du comportement de l’animal, une baisse de la consommation alimentaire, une perte de poids ou une modification de la température corporelle. Par ailleurs, les prélèvements et examens nécessaires au cours des études peuvent entraîner des nuisances de courte durée (ex : contention, isolement de l’animal de quelques heures pour le recueil d’urine).
Devenir
Ces études nécessitent souvent des prélèvements terminaux (analyse anatomo-pathologique ou quantification de l’exposition tissulaire des candidats médicaments). C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas ces analyses que certains animaux pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre d’animaux est d’environ 30-40%.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans une démarche globale qui intègre revue bibliographique, modélisation in silico, tests in vitro (cellulaires et organoïdes) ainsi que des données recueillies chez les patients, ce qui permet de limiter le recours à l’animal de laboratoire. Cependant, le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe aujourd’hui aucun modèle in vitro mimant la complexité des interactions (notamment via le système immunitaire) d’un organisme entier et les effets possibles d’un candidat médicament sur celui-ci.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (bibliographie et données historiques) et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les différents effets. De plus, lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le vétérinaire, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés. Enfin, ce projet permet indirectement de réduire le nombre de primates non humains utilisés dans d’autres projets de Sécurité Préclinique grâce à l’utilisation de ce modèle miniporc.
Raffinement
Ce projet fait l’objet d’une démarche qualité rigoureuse avec la réalisation des études par du personnel formé et compétent, le respect des impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvements réalisés sous anesthésie-analgésie pour les plus invasifs, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique. La contrainte des prélèvements et administrations sous contention est minimisée par la mise en place d’habituations et training avec distribution systématique de récompenses alimentaires (par exemple, pour certains prélèvements sanguins, mis en hamac après training avec renforcement positif). L’état clinique des animaux est surveillé au moins quotidiennement, des pesées ou autres mesures (températures, examens sanguins, etc.) sont réalisées régulièrement afin d’anticiper au maximum l’apparition de toute douleur et de mettre en place des mesures spécifiques (changement de dose, arrêt anticipé de l’étude, mise en place de soins de support ou analgésie) par le responsable d’étude en concertation avec le vétérinaire en application des points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
Le choix de cette espèce est défini par ses similitudes immunologiques à l'Homme qui font du miniporc génétiquement modifié l’espèce appropriée pour générer des données précliniques transposables à l’Homme. Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes afin d’évaluer de manière satisfaisante les profils PK, PD, et toxicologiques des candidats médicaments.
PROJET MACROFILL VACCUM – Test d’un dispositif de lipofilling sur un modèle de xénogreffes sur 53 souris nude immunodéprimées
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
53 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit deux greffes de tissu adipeux humain sur les flancs, est anesthésiée à quatre reprises pour la chirurgie et des scanners, puis tuée au bout de deux mois pour analyser le greffon, afin de tester un dispositif de lipofilling destiné à être commercialisé. Le porteur relie le projet à un "réel besoin" en chirurgie reconstructrice. Il affirme qu'un modèle in vitro ne peut pas reproduire la rétention du greffon dans un organisme vivant.
Objectifs
Le but de ce projet est de tester le dernier dispositif de lipofilling de notre sponsor. Un modèle de xénogreffes sur souris immunodéprimées a été choisi, en s’appuyant sur la bibliographie existante. 100 xénogreffes (2 par souris, sur 50 souris) seront réalisées à partir du tissu adipeux prélevé sur 10 patients par lipoaspiration à l’aide du nouveau dispositif testé. Un lot de 5 souris sera utilisé pour chaque lipoaspiration. Nous avons décidé de travailler sur un modèle de souris nude, athymique et donc immunodéprimée. Ceci nous permettra de nous abroger des risques de rejet de la greffe. Notre étude bibliographique a permis de mettre en avant divers obstacles au maintien des xénogreffes. Ainsi, tous les paramètres physiques liés aux étapes d'aspiration, de préparation du tissu adipeux mais aussi d'injection influencent la prise de greffe. Les paramètres physiques choisis par notre sponsor seront donc ici testés. De même, divers paramètres biologiques influencent la prise de greffes : le statut des donneurs et la présence de maladies métaboliques notamment. De même, la mise en place d’une vascularisation de qualité améliore la rétention de la greffe et donc son maintien. Les donneurs prélevés lors des liposuccions seront donc exempts de maladies métaboliques et seront tous d’un IMC inférieur à 30. La vascularisation mise en place au niveau de la greffe sera observée après récupération du tissu et coloration. D’autres paramètres seront alors étudiés en histologie (quantité et diamètre des adipocytes dans le tissu greffé, qualité et quantité de la matrice extracellulaire mise en place, présence de zones de nécrose éventuelles, …). Enfin, l’emplacement de la greffe ainsi que son suivi par imagerie a fait l’objet d’une recherche bibliographique. Nous souhaitions pouvoir suivre son évolution et quantifier son éventuelle résorption au fil du temps. Le suivi par micro-CT (examen tomodensitométrique par rayons X) a été mis au point sur un modèle de xénogreffes au niveau du calvarium. Nous souhaitions cependant garder les flancs comme zones de xénogreffes car celles-ci présentent plusieurs intérêts. Cette zone sera donc testée lors d'un premier screening, réalisé sur un premier groupe de 3 souris. L'étude utilisera donc un total de 3+50 = 53 souris sur l'ensemble du projet.
Bénéfices attendus
Cette étude pourrait permettre de valider le nouveau dispositif de lipoaspiration, dans le but de le commercialiser. La technique de lipofilling serait alors utilisée en médecine humaine à la suite d'interventions chirurgicales délabrantes (Tumeurs mammaires par exemple, retrait de masses, ...) pour des chirurgies reconstructrices et répond donc ici à un réel besoin. Une étude clinique sera réalisée en complément de cette étude préclinique afin de valider l'utilisation du nouveau dispositif chez l'homme.
Procédures
Chaque souris sera anesthésiée une première fois (Durée : 30 minutes), dans le but de réaliser les deux xénogreffes (une sur chaque flanc). 4 injections sous-cutanées seront réalisées :1 injection SC d'analgésique sera réalisée le jour de la chirurgie et 3 injections SC d'antibiotiques seront réalisées à raison d'une par jour à partir du jour de la chirurgie. Les souris seront anesthésiées 3 fois de plus (Durée : 10 minutes), afin de les imager (CT-scan). Elles seront enfin mises à mort à la suite de la dernière imagerie donc au bout de 2 mois afin de récupérer le tissu greffé pour analyses.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues de cette étude sur les 53 souris utilisées seront : - Les deux xénogreffes réalisées sur les souris, à raison d'une greffe par flanc sur chacune des 50 souris - La douleur éventuelle associée à cette chirurgie - Les anesthésies réalisées (1 pour la chirurgie (Durée : 30 min) et 3 pour les imageries (Durée : 10 minutes)) et l'hypothermie éventuelle en résultant - 4 injections sous-cutanées minimum (1 pour l'analgésie, 3 pour l'antibiothérapie) - Le stress éventuel tout au long des différentes étapes de la procédure - La mise à mort en fin d'étude pour la récupération du tissu greffé. Une attention particulière sera cependant portée aux animaux : tout signe de douleur, stress, et/ou tout comportement anormal sera pris en compte. De plus, la chirurgie se déroulera sous anesthésie volatile (Isoflurane) et analgésie (Buprénorphine 0.05mg/kg) et une antibiothérapie permettra d'atténuer voire d'éviter tout risque d'infection (Amoxicilline 15mg/kg, durant 3 jours)
Devenir
Les souris seront maintenues en vie à la suite de la chirurgie et des différentes imageries. Elles devront cependant être mises à mort dans les jours suivant la dernière imagerie afin de récupérer le tissu adipeux greffé et d'en faire une analyse histologique.
Remplacement
Remplacer : Pour répondre à notre objectif scientifique, un modèle in-vitro ne peut être mis en place. Nous avons en effet besoin d’un modèle animal afin d’étudier le processus de rétention des greffes dans son ensemble, avec les contraintes que ce tissu peut subir dans un système vivant (Inflammation locale, nécroses éventuelles, …).
Réduction
Réduire : L’utilisation de l’imagerie nous permet de suivre la rétention de la xénogreffe sans avoir besoin de sacrifier l’animal, ce qui nous permettra de réduire le nombre total d’animaux utilisés. De plus, le nombre d’animaux utilisés a été minimisé grâce au calcul préalable effectué sur R à partir de la bibliographie et de la fonction power.t.test, nous permettant ainsi d’utiliser un nombre réduit de 5 animaux par groupe. De même, le nombre d'animaux nécessaires à l'étape de screening a été minimisé.
Raffinement
Raffiner : Une étude pilote (screening) sera réalisée afin d’optimiser les protocoles de chirurgie, d’imagerie et d’histologie, sur un premier groupe de 3 souris. Elle nous permettra ainsi d’affiner les techniques utilisées pour l'étude. Ainsi, les expérimentateurs pourront s’entraîner à la technique chirurgicale et les comportements anormaux éventuels des animaux suite aux différentes procédures seront pris en compte. La liste des points limites sera de même actualisée si besoin. Elle comprend pour points limites spécifiques au projet : - Mauvaise cicatrisation cutanée suite à la xénogreffe et/ou Infection cutanée suite à la xénogreffe - Hypothermie persistante, avec une température inférieure ou égale à 34°C de façon durable - Réveil incomplet supérieur à 2h à la suite de la chirurgie - Perte de poids supérieure à 20% Afin de diminuer les éventuelles douleurs pouvant survenir suite à la chirurgie et le risque d'infection, une analgésie et une antibiothérapie seront mises en place (par injection sous-cutanée). De plus, les souris seront étroitement surveillées pendant la phase de réveil puis dans les jours qui suivront la chirurgie. Elles seront hébergées en cages groupées afin de satisfaire leurs besoins sociaux, sur des portoirs ventilés afin de tenir compte de leur phénotype dommageable. Un enrichissement adapté à l'espèce (paille, tunnels, dômes, ...) sera mis dans les cages afin de leur laisser exprimer les comportements naturels de l'espèce (enfouissement par exemple).
Choix des espèces
Le modèle animal choisi pour cette étude est la souris. C’est une espèce largement utilisée dans la recherche préclinique, en chirurgie notamment. La lignée nude choisie pour cette étude est une lignée de souris sans poils et athymique. Ceci nous permettra notamment de nous abroger des risques d’incompatibilité inter-espèces et donc de rejet de la xénogreffe. La lignée choisie est de plus facile à élever et à manipuler. Elle est peu coûteuse et largement utilisée dans toutes les disciplines de la recherche médicale. C’est également une lignée ne présentant pas de phénotype dommageable à l’état basal. La physiologie de la souris ressemblant à celle de l’homme, ceci facilitera la translation. De plus, la souris nude étant peu grasse, il sera plus simple de constater l’évolution des xénogreffes de cellules adipeuses sur cette souche. Enfin, le modèle de la souris immunodéprimée est un modèle standard connu pour la xénogreffe. A leur arrivée, les souris seront âgées de 6 semaines. La greffe sera réalisée 2 semaines après réception, afin d'effectuer une semaine de quarantaine puis d'habituation des animaux. Ainsi, les souris nude seront âgées de 8 semaines au moment de la chirurgie, pour un poids moyen de 20 grammes. A ce stade de développement, les organes des souris seront matures. De plus, nous nous abrogeons des problèmes éventuels liés à la vieillesse de notre modèle.
developpement d’un inhibiteur protegeant les cellules T regulatrices genetiquement modifies contre l’activite lytique des cellules NK
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
2 394 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent du busulfan puis une greffe de cellules immunitaires humaines, avec prélèvements sanguins répétés et imagerie par bioluminescence. Le porteur décrit une possible réaction du greffon contre l'hôte, avec perte de poids importante, poils hérissés et prostration. Il affirme que la complexité de l'effet des cellules NK ne peut être reproduite in vitro et que seules les souris NOG acceptent les greffes humaines.
Objectifs
Les objectifs du projet sont : 1) Mise au point d’un modèle de souris permettant la prise de greffe des cellules NK et des cellules T régulatrices du système immunitaire 2) Validation d’un modèle récapitulant la lyse de cellules T régulatrices génétiquement modifiées par les cellules NK. 3) test des inhibiteurs de la lyse des cellules T régulatrices génétiquement modifiées par les cellules NK. 3) Etude de la persistance des CAR-Tregs en présence de l’inhibiteur de l’activité cytolytique des cellules NK.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont 1) l'identification d'un inhibiteur permettant de protéger notre produit thérapeutique contre la lyse des cellules NK et ainsi de garantir leur efficacité chez le patient 2) obtenir des données précliniques de sécurité de l'inhibiteur identifié avant tout test chez l'humain dans des maladies autoimmunes comme la sclérose en plaque ou la maladie de Crohn.
Procédures
24h avant l'injection des cellules NK, une injection de busulfan sera réalisée. L'injection du busulfan et des cellules prend environ 1 minute par souris, une seule injection par animal. Selon notre expérience, la dose de busulfan que nous utilisons n'est pas toxique pour la souris. Après 8 à 9 semaines, une deuxième injection de cellules humaines sera réalisée (1 min par souris), Nous prélèverons 100 uL de sang tous les 14 jours à partir de J14 (jusqu'à J56 maximum) ou J21 (jusqu'à J63 maximum) après injection des cellules humaines en fonction des résultats obtenus lors de la procédure de mise au point du modèle puis un prélèvement terminal de plus de 100uL soit au total 4 à 5 prélèvements. Chaque prélèvement sanguin prend environ 2minutes/souris maximum. Le prélèvement terminal sera fait sous anesthésie locale et générale gazeuse sans réveil (anesthésie gazeuse à l'isoflurane 5% (mélange isoflurane/air) pendant 3minutes pour le prélèvement et mise à mort par asphyxie progressive par augmentation graduelle de la dose de CO2 qui prend environ 5min). L'anesthésie locale prend environ 3 à 4 min/souris. Pour l'analyse par bioluminescence, les souris seront injectées avec un produit permettant la bioluminescence. L'injection prend environ 1 min par animal à chaque analyse hebdomadaire, 3 analyses maximum. Pour cette analyse par bioluminescence, les souris seront anesthésiées avec de l'isoflurane (4% (induction), maintenance 1-2% en air) pendant le temps de l'imagerie (3 anesthésies maximum). L'analyse dans le bio-imager prend environ 25min pour 5 souris à la fois. La douleur des animaux pourra être atténuée par injection de buprénorphine.
Impact sur les animaux
Perte de poids qui se résout entre 5 et 7 jours après injection du busulfan. Développement de signes de rejet de l'hôte par le greffon qui est une réaction immunitaire entraînant une réaction inflammatoire sévère due à la réaction des cellules immunitaires humaines greffées contre les tissus de la souris. Ces signes se caractérisent par une perte de poids importante, une pilo-érection et la prostration de l'animal. Les nuisances liées aux gestes techniques sont pour l'injection intra-peritonéale la perforation de l'intestin ou de la vessie, un durcissement de la région abdominale; pour les injection en intra-veineuse, la formation d'un hématome au point d'injection, d'une plaie pouvant aboutir à une nécrose ou à une mort subite en cas de bulle d'air dans la seringue; pour les prélèvements de sang en sub-mandibulaire, une hémorragie et une plaie au site de prélèvement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure pour des prélèvements d'échantillons biologiques. Les animaux surnuméraires qui n'ont pas reçu le produit thérapeutique seront réutilisés pour la formation du personnel et le maintien de leurs compétences puis également mis à mort.
Remplacement
Avant toute administration de produit à visée thérapeutique chez l'homme, la mise en évidence de l'efficacité et de l'innocuité du produit doit être démontrée chez l'animal. En effet, l'emploi des modèles animaux est nécessaire au projet car il n'existe pas à l'heure actuelle de méthodes alternatives permettant de reproduire in vitro la complexité physiologique de l'impact des cellules NK sur les Tregs et de leur éventuelle protection à long terme due à la distribution des cellules dans l'organisme.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisé, chaque groupe contiendra le nombre minimum indispensable à l'obtention de résultats statistiquement pertinents.
Raffinement
Dans une approche éthique, nous prévoyons de limiter au maximum le nombre d'animaux avec des scores cliniques sévères et mettre en place des points limites adaptés. Nous utiliserons également une litière adaptée (douce, non-poussiéreuse) et un enrichissement qui favorise l'expression des comportements normaux de la souris (enfouissement, nidification...). Un apport de gel hydrique dans la cage est réalisé pour simplifier l'accès des animaux à une source hydrique et sera mis à disposition des animaux dès le début de leur hébergement pour les habituer à cette source hydrique. Les souris immuno-déficientes NOG sont hébergées en portoir ventilé par groupe de 5 souris maximum par cage dans la zone SOPF de l'animalerie. Pour la préhension des animaux et éviter le stress nous utiliserons un tunnel auquel nous les habituerons lors de leur phase d'acclimatation. Si possible, nous ferons un suivi longitudinal des cellules humaines injectées par bioluminescence. Pour les études par bioluminescence les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse en air. Pour limiter la douleur des animaux, des analgésiques de type morphiniques pourront être administrés.
Choix des espèces
Seules les souris immunodéficientes comme la souche NOG acceptent les greffes de cellules humaines. Il n'existe pas d'autre modèle animal immuno-déficient. L'injection de cellules humaines dans une souris immuno-compétente ou des primates ne serait pas possible car les cellules et les tissus humains seraient rejetés par le système immunitaire murin ou du singe (xénogreffe). Souris adultes de 6-8 semaines car la prise de greffe des cellules NK prend environ 4 à 6 semaines selon la littérature pour pouvoir analyser leur effet sur les cellules T régulatrices dans des souris adultes de 10-14 semaines qui auront alors un poids relativement stable en fin de croissance. A ce stade de développement, les souris sont plus facilement manipulables pour les prélèvements et l'analyse des échantillons et d'évaluation physique (bien-être)
Conception d’un modèle murin avec implantation de tumeur bronchique humaine pour l’étude et le développement de nouvelles thérapies.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles respiratoires
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une tumeur bronchique humaine leur est implantée dans le poumon par chirurgie, puis suivie par imagerie mensuelle et traitée par voie intranasale deux fois par semaine. Le porteur reconnaît que la croissance de la tumeur pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires, et prévoit de tuer les animaux dont la tumeur atteint un certain volume. Les bénéfices annoncés se réduisent à confirmer que l'inhibition de certaines voies de signalisation ferait de bons candidats thérapeutiques.
Objectifs
Le cancer du poumon est la première cause de décès par cancer dans le monde et la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques est un challenge majeur. A l’heure actuelle, des traitements existent, mais présentent des récidives quasi systématiques à moins de 5 ans. Notre équipe s’intéresse à l’implication des différents voies de signalisation majeurs dans le cancer bronchique et la possibilité d’en faire des cibles thérapeutiques. En effet, il a été montré que certains de ces cibles potentielle sont impliquée dans le développement de tumeurs dans différents organes et notamment sont retrouvée surexprimée fréquemment dans les cancers pulmonaires. Avec accord préalable des patients, nous souhaitons récupérer des pièces opératoires de tumeurs bronchiques afin de les implanter dans le poumon de souris afin d’obtenir un modèle proche de la pathologie humaine puis nous les traiterons avec différents inhibiteurs de ces voies de signalisation a fin de vérifier leur effet thérapeutique.
Bénéfices attendus
Cela nous permettra de confirmer que l’inhibition de certaines voies de signalisation seront de bon candidat pour le traitement des tumeurs bronchiques.
Procédures
Procédure chirurgicale (1 fois sous anesthésie et avec administration d'antalgique): pour l'implantation tumorale (soit sous curtanée (10mn), soit au niveau du poumon(40mn)) / Imagerie (1 fois/mois): administration intraveineuse d'un radiotraceur (1mn) puis une fois sous anesthésie, imagerie (30mn) / Traitement intranasal 2 fois/semaine sous légére anesthésie (1 à 2mn)
Impact sur les animaux
La pousse de tumeur dans le poumon peut entrainer des difficultés respiratoires mais ceci sera prévenu par une surveillance quotidienne des animaux ainsi qu'une imagerie permettant de visualiser l'évolution des tumeurs et d'anticiper un éventuel inconfort des animaux.
Devenir
Un premier groupe d'animaux sera euthanasié lorsque leur tumeur atteint 500mm3. Les tumeurs seront récupérés afin d'être réimplantés directement dans le poumon. Pour le second groupe d'animaux (dont les tumeurs ont été implanté dans le poumon); les animaux seront euthanasiés afin de récupérer le matériel biologique pour analyse moléculaire.
Remplacement
Nous avons remplacé dès que possible le modèle vivo par des modèles de cultures cellulaires. En effet nous avons fait plusieurs tests qui nous ont permis d’identifier les traitements les plus adéquats pour cette expérimentation.
Réduction
Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux tout en gardant en tête les objectifs scientifiques, nous utiliserons 10 animaux/groupe. Nous exploiterons au maximum ces animaux en réalisant des courbes de survie ainsi qu’en assurant les prélèvements de plusieurs organes après sacrifice dans le but d’études anatomopathologiques et moléculaires.
Raffinement
Afin d’améliorer la vie des souris, elles sont maintenues dans des cages d’une superficie supérieure à 500cm2. La litière est faite à base de copeaux de peuplier et le milieu est enrichi avec des bûchettes de bois ou des frisottis. La méthodologie utilisée, implique la notion de points limites : nous porterons une attention particulière au bien-être des animaux et nous prendrons en charge la contrainte que les animaux subissent au cours des procédures expérimentales et particulièrement après l’induction tumorale. Pour cela, nous effectuerons un suivi régulier des animaux et dès lors qu’un animal présentera des signes cliniques pouvant être apparentés à un point limite, il sera euthanasié.
Choix des espèces
Des modèles de souris développant des cancers bronchiques ont déjà été utilisés dans des études précliniques et se sont montrés être un bon modèle de la pathologie humaine. Des souris d'au moins 5 semaines seront utilisées. Ainsi, il s'agira d'animaux déjà adultes mais suffisamment jeunes pour que le vieillissement n'entre pas en jeu dans les courbes de survie.
Contrôle qualité des médicaments radiopharmaceutiques marqués au Tc99m sur rongeurs en conformité des méthodes de la Pharmacopée EU.
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Rats : 1275
1 680 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil pour 1 275 d'entre eux et impliquant un niveau de souffrance léger pour 405. Anesthésiés, ils reçoivent l'injection d'un médicament radiopharmaceutique puis sont tués pour le prélèvement de leurs organes, afin de contrôler la biodistribution de chaque lot avant sa commercialisation. Le porteur indique que ce contrôle qualité est exigé par les pharmacopées européenne et américaine. Il signale qu'une évolution réglementaire a déjà permis d'arrêter la biodistribution sur 30 lots par an, sans étendre ce remplacement aux autres.
Objectifs
Ce projet a pour objet de permettre au laboratoire pharmaceutique de continuer à pouvoir contrôler des médicaments radiopharmaceutiques dans le respect des AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) octroyées par les autorités de santé de tous les pays concernés (notamment la FDA « Food and Drug Administration ») et des méthodes de la Pharmacopée Européenne. Pour cela le laboratoire pharmaceutique a besoin de pouvoir réaliser des tests de distribution physiologique appelés « tests de biodistribution » in vivo sur des rongeurs, afin de valider l’efficacité de chaque lot de médicament radiopharmaceutique concerné avant son administration humaine.
Bénéfices attendus
La mise sur le marché des médicaments marqués, à usage thérapeutique et diagnostique pour l'homme, exige des essais d'efficacité : la distribution physiologique du produit sur rongeurs. Le recours à des rongeurs dans le cadre de contrôle qualité de médicaments radiomarqués est préférable à d'autres espèces car ces animaux permettent de fournir des résultats pertinents en utilisant la voie d'administration identique à celle de l'homme lors de diagnostic par scintigraphie.
Procédures
Dans le cadre du contrôle qualité du médicament radioactif à réaliser avant mise sur le marché, le test d'efficacité du produit sur 3 rats de faible poids se fait sous anesthésie générale par un mélange d'anesthésie/analgésique chimique avant injection du produit. Le volume à injecter est fonction du poids du rat. L'acte d'injection de ce mélange de faible volume dure quelques secondes. Une fois l'animal anesthésié, au remps indiqué dans la procédure, le technicien injecte le produit radioactif de faible volume à la seringue en quelques secondes. La voie d'injection avec un médicament marqué à usage diagnostic ou thérapeutique est la voie utilisée chez l'homme. Après un temps déterminé dans la procdure, le technicien s'assure que les animanux soient toujours anesthésiés avant de mourir, avant d'effectuer les gestes chirurgicaux nécessaires au test. L'euthanasie des animaux s'accompagne d'un prélèvement de sang au niveau de l'aorte abdominale. Elle est suivie des prélèvements d'organes cités dans la procédure de contrôle en vigueur. Concernant le test d'efficacité du produit radioactif chez les 3 souris, celles-ci sont soit anesthésiées par un mélange d'anesthésie/analgésique chimique avant injection du produit, soit elles sont injectées vigiles selon la procédure de contrôle en vigueur. Une fois l'animal anesthésié, au temps indiqué dans la procédure, le technicien injecte le produit radioactif de faible volume à la seringue en quelques secondes. Dans le cas des souris anesthésiées avant injection du produit radioactif, la pratique d'euthénasie appliquée est la dislocation cervicale avant d'effectuer les gestes chirurgicaux nécessaires au test. Elle est suivie des prélèvements d'organes cités dans la procédure de contrôle en vigueur. Dans le cas de souris vigiles, l'injection du produit radioactif d'un faible volume à la seringue se fait en quelques secondes. Après un temps déterminé dans la procédure, elles sont anesthésiées par un mélange d'anesthésie/analgésique chimique en tenant compte du poids de l'animal. Le technicien s'assure que l'animal est correctement anesthésié (immobilité, myorelaxation, pas de retrait lors du pincement de la patte) avant d'effectuer les gestes chirurgicaux nécessaires au test. L'euthanasie s'effectue par section de la carotide. Elle est suivie des prélèvements d'organes cités dans la procédure de contrôle en vigueur.
Impact sur les animaux
Nous pourrions attendre des effets indésirables si les molécules étaient défectueuses. C’est le but de notre test : identifier la qualité, ou les défauts de nos molécules radiomarquées. Si elles ne sont pas marquées correctement, elles sont rarement toxiques. Si une contamination quelconque était intervenue pendant la fabrication, les animaux pourraient subir des effets indésirables, comme un choc anaphylactique, mais ils sont anesthésiés et des mesures seraient rapidement prises pour prendre en charge cette situation.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin de manipulation du fait de la manipulation de biodistribution consistant aux prélèvements d’organes.
Remplacement
Les autorisations de mise sur le marché et la Pharmacopée Européenne exigent des contrôles de qualité in vivo sur les médicaments radiopharmaceutiques avant leur administration à l'homme. Les médicaments sont fabriqués selon leur AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) et sont soumis à des tests impératifs de contrôle qualité et libératoires avant commercialisation, dont la biodistribution fait partie. Ce test est appliqué selon les méthodes décrites dans la pharmacopée européenne et américaine et/ou du dossier d'Autorisation de Mise sur le Marché. Les méthodes physico-chimiques commencent à être prises en compte selon les produits par les autorités comme il est indiqué dans le paragraphe Réduction. 1) Les obligations réglementaires (pharmacopée européenne/américaine) évoluent et permettent l'arrêt des tests de biodistribution pour certaines spécialités pharmaceutiques. Nous profitons de cette opportunité pour cesser tout test de biodistribution sur la spécialité concernée. 2) Des démarches sont entreprises pour demander une variation du dossier d'AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) ; celle-ci consiste à supprimer le test de biodistribution en s'appuyant sur la corrélation existante entre les résultats obtenus via le test de biodistribution et les tests physico-chimiques réalisés en parallèle. 3) Décision stratégique d'arrêt de certains produits pour lesquels la biodistribution était requise. 4) Lors de la formation pratique d'un nouveau technicien, l'utilisation du "rat trainer" s'est substituée à l'utlisation d'animaux pour apprendre les injections.
Réduction
Une étude de marché a induit l’arrêt de 2 produits. Une variation réglementaire du dossier d’AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) de 2 autres produits a été acceptée par l'Agence du médicament, en s'appuyant sur les tests physico-chimiques. Cela implique l'arrêt de la biosdistribution sur 30 lots/an sur les 120 lots testés à ce jour.
Raffinement
Une amélioration continue de nos locaux permet d’accroitre la prise en compte des besoins des animaux au cours de procédures. Dès que les animaux sont anesthésiés, tout est mis en œuvre pour les maintenir au chaud et éviter toute perturbation. Tous les transports entre les lieux de vie des animaux et les laboratoires sont encadrés de précautions. Un tapis chauffant, par exemple, est placé au fond de la cage pendant l’attente, puis pendant le réveil. Un personnel expérimenté et formé manipule les animaux avec précautions. Nos procédures sont de courte durée et ne sont pas douloureuses.
Choix des espèces
La mise sur le marché de produits de contraste radioactifs exige des essais d'efficacité : la biodistribution sur rongeurs (rats ou souris) comme l'imposent les autorités européennes et américaines à l'industrie pharmaceutique qui produit ces marqeurs. Les tests réalisés par groupe de 3 rongeurs adultes permettent de valider l'innocuité et l'efficacité des marqueurs utilisés chez l'homme en utilisant la même voie d'administration, afin de fournir des résultats pertinents.
Modèles expérimentaux d’allergie oculaire
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 1800
Cochons d'Inde : 900
6 900 animaux non-humains, 4 200 souris, 1 800 rats et 900 cobayes, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont sensibilisés à l'ovalbumine et au pollen d'ambroisie, puis reçoivent des gouttes oculaires et des injections répétées, pour tester des substances contre la conjonctivite allergique. Le porteur indique que le nouveau contact avec l'allergène provoque un gonflement de la conjonctive, une hyperémie et un larmoiement, et que des nodules peuvent apparaître au site d'immunisation. Il affirme qu'aucune méthode ne reproduit l'œil dans sa globalité et conclut à la nécessité de recourir à ces animaux.
Objectifs
Comme l’allergie respiratoire, l’allergie oculaire est associée à une hypersensibilité allergique de type immédiat. Elle concerne essentiellement les conjonctivites allergiques bégnines c’est-à-dire la conjonctivite allergique saisonnière et la conjonctivite allergique péri-annuelle. Cette hypersensibilité concerne aussi pour partie les conjonctivites sévères compliquées de kératite comme la kératite conjonctivale vernale et la kératite conjonctivale atopique. Les allergènes responsables sont des pneumallergènes, aussi responsables de symptômes respiratoires, tels que les acariens ou les pollens ainsi que des trophallergènes comme l’arachide ou le blanc d’œuf. Ce projet a pour but de contribuer au développement de nouveaux traitements médicaux en permettant d’identifier et de tester l’efficacité de substances thérapeutiques visant à diminuer l’effet des allergènes dans la conjonctivite allergique. Dans ce cadre, nous proposons de mettre en place un protocole de sensibilisation à deux antigènes (l’ovalbumine et le pollen d’ambroisie) chez la souris, le rat ou le cobaye. Dans un second temps, nous testerons différents types de traitements.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.
Procédures
Les procédures expérimentales nécessitent l'administration de différents produits par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale (anesthésies). Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations au biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements de sang se feront par ponction et dureront moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Après un nouveau contact entre l'allergène et l'organisme « sensibilisé » par une précédente exposition, les nuisances attendues se manifesteront au niveau local par un gonflement de la conjonctive accompagné d'une hyperémie et d'un larmoiement. Au niveau du site d'immunisation, une réaction inflammatoire avec potentiellement la présence de nodules sous-cutanés peut être observée. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une gêne transitoire de courte durée.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre des réalisés les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosages...).
Remplacement
L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents. Il est de plus soumis à d'importantes variations environnementales mécaniques et physicochimiques, ainsi qu'à d’importantes interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans sa globalité fonctionnelle et environnementale. C'est pour cela que l’utilisation d’animaux vivants dans ces procédures expérimentales sont nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger. Si la procédure expérimentale le permet un abri sera ajouté. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent l’immobilité de l'animal pourront être réalisés pour son confort sous anesthésie légère. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des cobayes ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les rongeurs ont minimum 6 semaines au début de l’étude, les cobayes 8 semaines. Ce qui correspond à de jeunes adultes ayant atteint leur maturité de développement oculaire comme il convient au modèle.