Tests réglementaires

87 500 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures de gravité modérée. Immunisés deux fois, ils subissent des prélèvements sanguins à l'oreille sur animal vigile pouvant provoquer une anémie de plusieurs jours, puis un prélèvement intracardiaque terminal sous anesthésie profonde, pour produire du sérum anti-thymocytaire, principe actif d'un médicament antirejet de greffe. Il s'agit d'une production de routine, pas de recherche. Le porteur revendique l'absence de "méthode alternative validée" et écarte les anticorps monoclonaux, dont les tentatives de substitution auraient échoué, en invoquant aussi la lourdeur des procédures réglementaires de modification des autorisations de mise sur le marché.

Objectifs

Le projet a pour objectif de produire la substance active (sérum anti-thymocytaire de lapin) utilisée comme matière première pour la fabrication d’un médicament à usage humain, destiné d’une part à prévenir ou traiter le rejet de greffes d’organes et d’autre part à traiter l’aplasie médullaire (maladie hématologique). Il n’y a pas de méthode alternative validée et disponible pouvant permettre de répondre à ce besoin. La croissance continue du nombre de patients greffés et/ou en attente de greffe à l’échelle mondiale se traduit par un besoin croissant de sérum anti-thymocytaire de lapin pour pouvoir fabriquer la quantité nécessaire de médicament. Il s’agit d’un médicament fabriqué exclusivement en Europe et distribué dans environ 70 pays.

Bénéfices attendus

Le projet étant destiné à produire la substance active utilisée pour la fabrication d’un médicament à usage humain, les bénéfices attendus concernent directement la santé humaine et découlent de l’utilisation dudit médicament. Ces bénéfices sont : 1/ Prévention et traitement du rejet de greffe chez le patient. 2/ Prévention de la réaction du greffon contre l'hôte aiguë et chronique, en cas de transplantation de cellules souches hématopoïétiques (cellules qui renouvellent en permanence les cellules qui sont dans le sang). 3/ Traitement de la réaction du greffon contre l'hôte aiguë contre lesquelles les corticoïdes sont inefficaces. 4/ Traitement de l'aplasie médullaire (maladie du sang). 5/ Amélioration de la qualité de vie des patients (résultant des bénéfices 1, 2, 3 et 4). 6/Réponse à un problème de santé publique considérant d’une part le nombre de patients concernés (environ 70 000 patients traités par an) et d’autre part le nombre de pays (environ 70 pays) dans lesquels ce médicament est demandé.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont : 1/ Port et contention des animaux lors des interventions : au moins 6 fois pour tous les animaux inclus dans le projet. Durée inférieure à 5 minutes. 2/ Pesée des animaux : 1 fois pour tous les animaux. Durée inférieure à 1 minute. 3/ Immunisations : 2 injections espacées de 14 jours. Durée d’environ 30 secondes. 4/ Prélèvements sanguins aux oreilles, sur animal vigile. Durée inférieure à 5 minutes. 5/ Prélèvement sanguin en intracardiaque : sous anesthésie générale profonde, jusqu’à la mort de l’animal sans reprise de conscience. Durée d’environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont rattachés aux procédures et interventions prévues par le projet sur les animaux : 1/ Stress et inconfort potentiellement induits par le port et la contention des animaux pendant les interventions : durée inférieure à 5 minutes. 2/ Stress et inconfort potentiellement induits lors de la pesée des animaux : durée inférieure à 1 minute. 3/ Douleur induite par l’aiguille (piqure) lors des immunisations : durée d’environ 30 secondes. 4./Douleur induite par l’aiguille (piqure) lors des prélèvements sanguins : durée inférieure à 5 minutes. 5/ Accélération transitoire de la respiration possible suite aux prélèvement sanguins : durée inférieure à 30mn. 6/ Déshydratation possible suite aux prélèvements sanguins : durée de 30mn à 1h. 7/ Fatigue, affaiblissement potentiels suite aux prélèvements sanguins : durée de 30mn à 1h. 8/ Mobilité réduite potentiellement suite aux prélèvements sanguins : durée de 30mn à 1h. 9/ Anémie modérée suite aux prélèvements sanguins : environ 7 jours.

Devenir

Imposé par la finalité du protocole : le protocole se termine par la mort du lapin suite au prélèvement sanguin terminal en intracardiaque sous anesthésie générale profonde sans reprise de conscience.

Remplacement

le remplacement n’est pas envisageable car il n’y a pas de méthode alternative validée et disponible pour produire des anticorps polyclonaux. Les anticorps polyclonaux (sérum animal) obtenus par immunisation d’animaux sont des produits thérapeutiques anciens, utilisés depuis plus d’un siècle. En 1975, l’invention de la technologie de production des anticorps monoclonaux obtenus avec peu ou pas d’animaux a fait naître l’espoir de remplacer les anticorps polyclonaux par des anticorps monoclonaux. Ces anticorps ont d’abord trouvé de nombreuses applications au niveau de la recherche fondamentale et du diagnostic in vitro. Dans les laboratoires de Biologie clinique, les anticorps monoclonaux sont de plus en plus utilisés comme réactifs, souvent en remplacement de sérums polyclonaux traditionnels. Il a fallu cependant des décennies de développement et d’innovation pour rendre les anticorps monoclonaux utilisables en thérapeutique humaine. Fort de ces avancées, plusieurs publications scientifiques proposent de remplacer les anticorps polyclonaux (sérum d’origine animal) par des assemblages d’anticorps monoclonaux appelés anticorps multiclonaux ou cocktail d’anticorps monoclonaux, comme une alternative au recours à l’animal. Malheureusement, les tentatives de remplacer les anticorps polyclonaux à but thérapeutique par des cocktails d’anticorps monoclonaux se sont avérées infructueuses à ce jour. En général, l’extrême diversité naturelle des récepteurs sur les anticorps polyclonaux est un des obstacles au remplacement efficace des polyclonaux thérapeutiques par des cocktails de monoclonaux. De plus, l’antigène utilisé dans ce projet pour induire la production des anticorps polyclonaux par le lapin est une cellule (thymocyte), donc complexe par sa nature, cela rend encore plus improbable le remplacement du sérum antithymocytaire de lapin par cocktail d’anticorps monoclonaux. Enfin, si l’alternative par un cocktail de monoclonaux devenait accessible, l’obligation réglementaire pour le donneur d’ordre de démontrer leur équivalence thérapeutique (efficacité, innocuité) avec le médicament à base de sérum animal puis d’engager des procédures très longues et compliquées pour obtenir la modification de chacune des AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) délivrées par plusieurs dizaines de pays serait l’ultime étape à franchir avant que ce remplacement ne puisse être effectif.

Réduction

Réduction : 1/ Le ciblage de la fenêtre optimale du pic d'anticorps dans le sang permet d’obtenir une quantité maximale de sérum polyclonal en utilisant moins de lapins. 2/ La réalisation de 3 prélèvements sanguins tout en préservant le bien être des lapins, permet de récupérer presque 2 fois plus de sérum par lapin que s’il n’y avait eu qu’un seul prélèvement sanguin par lapin. 3/ En utilisant indifféremment des lapins mâles ou femelles, on évite de faire naître plus de lapins qu’il ne faut pour le projet. 4./ Un très faible pourcentage de sérums anti-thymocytaire rejetés (inférieur à 1%) par le donneur d’ordre. Cela découle d’une parfaite maîtrise de la qualité du sérum produit depuis 40 ans par notre établissement et donc une utilisation optimale de chaque lapin inclus dans le projet. En combinant d’une part le ciblage de la fenêtre optimale pour les prélèvements sanguins et d’autre part le nombre de prélèvements sanguins, le protocole déposé dans le dossier d'AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) du médicament permet d’optimiser la quantité de principe actif produite par lapin tout en préservant leur bien-être.

Raffinement

Raffinement : 1/Minimisation de la durée des contentions des animaux grâce à la compétence des techniciens et à une organisation optimale des interventions. 2/Définition et application de points limites spécifiques au protocole. 3/Surveillance accrue des lapins à des moments sensibles du projet. 4/Application d’une grille décisionnelle (grille de scores) pour atténuer ou abréger la douleur. 5/Recours à l’anesthésie générale profonde avant le prélèvement de sang en intracardiaque jusqu’à la mort du lapin sans reprise de conscience. 6/ Hébergement dans des zones protégées confinées conçues pour les protéger contre les infections. 7/ Lapins rassurés par le personnel qui leur parlent continuellement et les manipule de façon apaisante. 8/ Hébergement en groupe harmonieux et l’accès à un enrichissement varié pour que les lapins puissent exprimer un large répertoire de comportements normaux, notamment d’interactions sociales entre congénères. 9/ Absence de stress de transport ni de stress de changement d’environnement (personnel, mode opératoire, aliment…) car les lapins utilisés pour le projet sont nés sur place et maintenus dans les mêmes conditions, qu’ils soient en élevage ou en expérimentation. 10/ Utilisation de lapins répondant à des critères qui les rendent optimums pour le projet. 11/ 11. Application de techniques d’injection entrainant le moins de douleur possible. 12/ Exclusion de toutes substances douloureuses telles que les adjuvants. 13/ Aliment et eau de boisson à volonté. 14/ Formation intensive du personnel, compétent et sensibilisé à appliquer des points limites adéquats.

Choix des espèces

Le lapin est l’espèce utilisée parce qu’il est imposé par le dossier d’AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) du médicament pour lequel notre projet produit le principe actif. Il est utilisé à l’âge adulte quand son système immunitaire est mature pour produire efficacement des anticorps polyclonaux. De nombreuses autres espèces animales dont principalement la souris, le rat, le hamster, le cobaye, le mouton, la chèvre, le lapin et poulet peuvent être utilisées pour la production d’anticorps polyclonaux à visée thérapeutique. Parmi ces espèces, le lapin est celle qui présente le plus d’avantages, notamment pour : sa facilité d’élevage en zone confinée pour le protéger des infections, sa forte prolificité, sa croissance rapide, son cycle de vie court, sa taille « intermédiaire », sa docilité et sa facilité à manipuler, la facilité de lui prélever du sang… Le choix du lapin pour ce projet repose sur ces avantages.

25 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, une plaie est faite dans le pharynx puis suturée et recouverte d'un biomatériau, pour tester un dispositif censé prévenir les fistules salivaires après ablation du larynx chez l'Homme. Le porteur liste comme risques un hématome, une infection, une fistule, des douleurs à l'alimentation et une dégradation de l'état général. Il indique que la mise à mort est nécessaire pour l'analyse histologique et qu'aucun modèle in vitro ou in silico de fistule salivaire n'existe.

Objectifs

Le présent projet vise à développer un biomatériau innovant sous la forme d'un film double couche pour la prévention des fistules salivaires (fuite de salive par défaut de cicatrisation) après une chirurgie du cou / de la gorge (laryngectomie totale). Cette chirurgie consiste en l'ablation du larynx, généralement pratiquée pour traiter un cancer. La fistule salivaire est une complication fréquente de cette chirurgie, et elle est associée à de fréquentes complications, un allongement de la durée d'hospitalisation, des chirurgies répétées, des dépenses de soins accrues, une qualité de vie moindre, voire un décès. Le projet est une collaboration entre un établissement de santé spécialisé en cancérologie, 2 laboratoires de recherche académique spécialisés dans les biomatériaux et 2 partenaires industriels. Ce projet s’appuie sur des résultats préliminaires concernant le design d'un biomatériau. Le projet présenté ici consiste à évaluer le biomatériau sur chirurgie du cou / de la gorge chez le petit animal (n = 25 rats). L'objectif de ce projet est l'étude de la tolérance et l'intégration du biomatériau (bioadhésion et biointégration).

Bénéfices attendus

Développement d'un biomatériau innovant permettant de diminuer le taux de fistule salivaire (fuite de salive par défaut de cicatrisation) après chirurgie du cou / de la gorge (laryngectomie totale) chez l'homme. De nombreux bénéfices secondaires sont attendus, comme une diminution du taux de fistule salivaire et des complications suscitées qui en découlent, et donc de la durée d'hospitalisation moyenne après laryngectomie totale.

Procédures

Une chirurgie sous anesthésie générale consistant à effectuer une plaie dans le pharynx (situé dans le cou / dans la gorge), la suturer et couvrir la suture par le biomatériau. Chirurgie durant 30 minutes environ. Réalisation au cours de la même anesthésie d'un prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

Risque d'hématome, infection du site opératoire (abcès), fistule salivaire (pharyngostome), douleurs à l'alimentation, impact sur le comportement et déterioration de l'état général.

Devenir

Mise à mort nécessaire car l'objectif primaire de l'étude concerne l'étude de la tolérance et l'intégration du biomatériau (bioadhésion et biointégration), requérant une analyse histologique (autopsie).

Remplacement

Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En effet, avant de pouvoir mettre en place les premiers essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de vérifier la bioadhésion et la biocompatibilité de ce biomatériau nouveau dans une étude préalable sur modèle animal. Le dispositif médical n'a jamais été testé in vivo. Les analyses in vitro ont été réalisées, un modèle in silico n'est pas envisageable pour ce projet. De plus, aucun modèle de fistule salivaire in silico ou in vitro n'existe ou n'est envisageable à l'heure actuelle, du fait d'une grande complexité anatomique, histologique et microbiologique.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus, ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature. Des tests in vitro ont été réalisés au préalables afin de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés. 25 animaux sont nécessaires pour atteindre l'objectif de l'étude selon le design suivant : (risque alpha = 10%, 1-beta=90%) et (p0=70%; p1=90%).

Raffinement

Le bien-être animal sera raffiné par une optimisation de la gestion de la douleur. Les animaux seront surveillés avec attention (comportement, prise alimentaire) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. Les difficultés à l'alimentation seront surveillées et la prise alimentaire sera facilitée par les antalgiques et un accès ad libitum à l'eau et à de l'alimentation molle (croquettes ramollies). Elle sera supplémentée par des compléments hypernutritifs en cas de perte de poids. Les cages seront de taille adaptée à la règlementation à savoir un compartiment minimal de 800cm² par animal. Le change sera effectué 2 fois par semaine. Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car une analyse de l'intégration du biomatériau au microscope est nécessaire (autopsie).

Choix des espèces

Rats Whistar mâles sexuellement matures pour plus de robustesse et pour faciliter la chirurgie (pharynx plus grand). Modèle animal de pharyngotomie simple, fiable et robuste, déjà décrit dans la littérature.

70 chevaux vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 50 d'entre eux replacés en fin de projet et les autres tués. Ils sont immunisés à répétition avec un adjuvant qui peut provoquer des inflammations locales, puis soumis à des plasmaphérèses avec réinjection des globules rouges, pour produire du plasma servant de base à des anticorps polyclonaux. Le porteur, une société de biodéfense, indique viser 95 000 à 150 000 traitements contre des menaces NRBC et des maladies infectieuses. Il affirme que le cheval est l'animal producteur de référence et qu'aucune méthode alternative n'est connue pour ces anticorps.

Objectifs

Le nombre croissant de maladies infectieuses émergentes et ré-émergentes, la mondialisation et la propagation rapide des épidémies, l'absence de traitements et/ou de vaccination satisfaisants, le développement des menaces liées au bioterrorisme et l'augmentation de la résistance aux antimicrobiens ont conduit à une augmentation significative des risques de menaces biologiques. Le développement, l'accès et le déploiement rapides de contre-mesures médicales adéquates sont essentiels pour anticiper de telles urgences de santé publique, et constituent des enjeux nationaux et internationaux critiques comme a pu le confirmer l’émergence récente du virus Sars-Cov-2 et la pandémie mondiale de Covid-19 qui en a résulté. La société est spécialisée dans les traitements contre les maladies infectieuses émergentes et sévères, et les intoxications. Elle développe actuellement un produit dans le domaine de la bio-défense / menaces NRBC (Nucléaire Radiologique Biologique et Chimique). L’entreprise est également impliquée dans le traitement des maladies infectieuses émergentes comprenant la COVID-19, mais également la grippe aviaire H5N1, Ebola et la Fièvre Hémorragique de Crimée Congo (CCHF). En effet elle a notamment développé un produit contre la grippe aviaire H5N1 et un produit anti-Ebola sous l’égide de l’OMS et avec le soutien de l’Agence Européenne du Médicament (EMA). Elle capitalise sur une plateforme technologique de développement et de production à base d’anticorps polyclonaux. Cette plateforme robuste et reproductible s’appuie sur une technologie éprouvée, avec des produits enregistrés et administrés dans le monde entier depuis des décennies, témoignant d'un excellent profil de sécurité. Elle permet à partir d’un antigène d’immuniser des chevaux et de produire du plasma. Ce plasma est ensuite hautement purifié en anticorps dans un laboratoire pilote en grade R&D. Et ces derniers sont évalués dans des études précliniques in vitro et in vivo. Après la démonstration d’efficacité, des lots sont purifiés dans des conditions BPF (Bonnes Pratiques de Fabrication) pour les besoins des études précliniques réglementaires et cliniques. L’objectif de ce projet est d’immuniser des chevaux dans le but de produire des plasmas servant de base à la purification d’anticorps polyclonaux dirigés contre des cibles virales et / ou toxiniques (y compris toxines bactériennes).

Bénéfices attendus

Des fragments d’anticorps hautement purifiés apportent une solution thérapeutique à des problématiques majeures de santé publique. En effet, la société développe actuellement un produit dans le domaine de la bio-défense / menace NRBC. L’entreprise est également impliquée dans le traitement des maladies infectieuses émergentes comprenant la COVID-19, mais également la grippe aviaire H5N1, Ebola et la Fièvre Hémorragique de Crimée Congo (CCHF). Ce projet nécessitera l’utilisation de 70 chevaux sur 5 ans. Ces chevaux permettront de : 1- Production de plasma servant de base à l'obtention de 95000 à 150000 traitements ciblant les risques bio défense et les maladies infectieuses. 2- Production de plasmas servant de base au développement de nouvelles thérapies (Développement pré-clinique et clinique avec essais chez l'Homme.)

Procédures

Deux procédures différentes sont prévues dans ce projet. Dans les deux procédures les animaux seront soumis à deux types d’interventions : → Des immunisations par voie sintra-dermique, sous-cutané ou intra-musculaire. → Des prélèvements de sang. Il s’agit là de prélèvement de sang, avec séparation des globules rouges (plasmaphérèse), puis réinjection des globules rouges selon le résultat de l'analyse sanguine.

Impact sur les animaux

Deux éléments peuvent induire des nuisances : - L’adjuvant : Les antigènes seront administrés avec ou sans adjuvant. Cet adjuvant peut entrainer des inflammations locales au point d’injection. Ces inflammations, seront suivies quotidiennement et traitées si besoin par un protocole de traitement adapté. Si un animal nécessite un traitement par voie parentérale, et que ce traitement n’améliore pas son état général après la fin du délai d’attente, les immunisations pourront être suspendues sur cet animal après décision concertée entre les responsables du projet et le vétérinaire. - Baisse de l’hématocrite : Par ailleurs, les prélèvements de sang, peuvent entrainer une baisse de l’hématocrite des animaux. Ainsi, un test d’hématocrite est réalisé après chaque prélèvement et des réinjections de globules rouges (issus de l’animal), et d’agents d’hématopoïèses sont réalisées lorsque l’hématocrite est trop faible.

Devenir

Les animaux ayant terminée une procédure ne peuvent pas intégrer une autre procédure Ainsi, en fin de procédure, si les animaux sont en bonne santé, ils pourront être replacés après concertation des responsables du projet et en accord avec le vétérinaire. Si les animaux ne peuvent pas être replacés ou réutilisés en interne, ils seront mis à mort après anesthésie. Les animaux ne pourront pas être reconduit dans la filière alimentaire.

Remplacement

L’immunothérapie passive utilisant des immunoglobulines polyclonales spécifiques a déjà démontré son efficacité dans le domaine des maladies infectieuses, intoxications et envenimations. Le cheval est l’animal producteur de référence dans le cadre de ces produits. La production de ces anticorps polyclonaux n’est possible que par des moyens in vivo. Aucune méthode alternative n’est aujourd’hui connue.

Réduction

Le nombre de chevaux nécessaire pour un projet augmente au cours du temps. Néanmoins, le nombre de chevaux entrant dans le projet est calculé au plus juste selon l’avancée du projet afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire. - Pour les nouvelles indications/nouveaux antigènes : 2 à 4 animaux seront immunisés afin de tester et déterminer l’efficacité de l’immunisation. - Après la démonstration de l’efficacité de l’immunisation, dans le cadre du développement du produit et selon les études précliniques et cliniques programmées, le volume de plasma nécessaire sera calculé précisément. Ce volume permettra de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour l’ensemble du développement du produit. Les résultats obtenus permettront de déterminer de manière fiable le nombre maximal de chevaux nécessaires pour la production des traitements à base d’anticorps. A minima, une revue annuelle sera faite pour optimiser le nombre de chevaux au plus juste des besoins.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions adaptées à leur espèce, logés sur une aire paillée en groupes sociaux de maximum 12 chevaux, fixes dans le temps. Un suivi quotidien leur est apporté par un personnel qualifié, avec une surveillance intensifiée, dans des conditions conformes à la réglementation et assurant leur bien-être. L'observation de signes cliniques déclenche des soins spécifiques sur les conseils d'un vétérinaire. Les animaux ont accès à la nourriture via un distributeur automatique de concentrés en plusieurs fois, au foin et à l’eau à volonté dans une ambiance musicale. Par ailleurs, le projet met en œuvre des procédures maîtrisées et qui ont déjà fait la preuve de leur efficacité pour la production d’immunoglobulines polyclonales équines. Par ailleurs, depuis 2017 ces procédures sont mises en œuvre dans le cadre de l’autorisation précédente, et ont permis de mettre en place et préciser les procédures pour entrainer les animaux, réduire les douleurs et définir les points limites.

Choix des espèces

Le cheval est un animal corpulent permettant de récolter une importante quantité de plasma. Il présente peu de zoonoses, ce qui limite les risques de présence de contaminants nocifs pour l'Homme dans les plasmas. Les chevaux sont des adultes de plus de 3 ans car à partir de cet âge la production d’immunoglobulines est optimale.

99 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime enrichi en graisse pour développer une stéatohépatite non alcoolique, avec une administration orale quotidienne et des prélèvements sanguins étalés, avant des prélèvements d'organes post mortem. Le porteur décrit une étude menée pour un client afin de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché d'un composé. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'un composé sur le poids et les troubles métaboliques.

Objectifs

L’étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre du développement de composés d'intérêt thérapeutique, destinés à l’amélioration des troubles métaboliques, notamment la stéatose hépatique non alcoolique.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché pour commercialiser un composé thérapeutique luttant contre la stéatose hépatique non alcoolique.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une pesée 2 fois par semaine de D-21 à D-1 - une pesée 3 fois par semaine à partir de D1 - une administration orale quotidienne à partir de D-7 - un prélèvement sanguin à la queue à D1, D29 et D57 - un prélèvement sanguin à partir de la veine caudale à D-7, D29 et D57

Impact sur les animaux

L'allopécie peut survenir dans ce modèle murin de stéatose hépatique non alcoolique. Elle semblerait être un conséquence phénotypique de cette maladie métabolique. Du moment que la peau a un aspect normal et est intact de toute lésion, aucun traitement n'est requis. Les souris peuvent être utilisé en expérimentation. Les prélèvements à D-7, D29 et D57 (7.5% du volume sanguin total) sont assez espacés dans le temps afin de permettre aux animaux de récupérer.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements d'organes pour des analyses post mortem.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages en groupe, de par le caractère social de l'espèce. Les animaux conserverons des contacts visuels avec leurs congénères des autres cages et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de briquettes en bois. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6NTac est un modèle murin de stéatose hépatique non alcoolique. nourris avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

200 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit dans l'abdomen une suspension de toxoplasmes et de cellules de sarcome, puis est tuée par dislocation cervicale 65 à 75 heures plus tard pour récolter le liquide d'ascite riche en parasites, matière première de kits de dépistage de la toxoplasmose. Le porteur reconnaît que des signes de douleur apparaissent au-delà de 60 heures et prévoit une injection d'anti-inflammatoire la veille de la récolte. Il affirme qu'aucun mode de production sur une source non animale n'a pu être validé à ce jour.

Objectifs

La production de suspension de toxoplasmes est utilisée dans la production de kits d’immunoessais associés au diagnostic de la toxoplasmose chez l’Homme. Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire dont les hôtes définitifs sont les félidés. Le parasite est toutefois capable d’infecter de nombreuses espèces animales, dont l’Homme, en tant qu’hôtes intermédiaires. La toxoplasmose est une affection alors transmissible de la mère au fœtus et qui peut entrainer des séquelles très invalidantes pour l’enfant. Il est donc primordial de savoir si la mère est protégée en début de grossesse ou sinon d'effectuer un suivi sérologique mensuel au cours de la grossesse. Ainsi, le diagnostic de la toxoplasmose est obligatoire en France dans le cadre du suivi prénatal. Les 4 réactifs de diagnostic concernés par le projet permettent de diagnostiquer les infections récentes ou passées en dosant, dans le sérum des patients, les immunoglobulines dirigées contre la forme proliférative du parasite.

Bénéfices attendus

Les kits de diagnostics concernés par le projet sont basés sur une méthode immuno-enzymatique, reposant sur la capacité d’un anticorps à reconnaître et à se lier spécifiquement à une molécule. Pour assurer la révélation des anticorps dirigés contre les toxoplasmes, ces kits sont composés de toxoplasmes entiers produits sur ascite de souris. Ce mode de production permet une affinité forte et une reconnaissance complète des différents types d’anticorps existants. L’intérêt est de garantir la fiabilité du résultat rendu : un faux résultat (faux positif, faux négatif ou erreur de dosage) rendu par le test dans un laboratoire clinique peut avoir un impact grave sur la santé, le suivi médical et la prise en charge des patients testés avec ces méthodes.

Procédures

- inoculation en intrapéritonéale d’une suspension contenant des toxoplasmes et des cellules sarcomes TG180 - 48 heures après inoculation initiale : injection sous cutanée d’analgésique de type ketoprofene. - 65 à 75 heures après inoculation initiale : mise à mort par dislocation cervicale

Impact sur les animaux

Les souris sont inoculées avec une suspension contenant des toxoplasmes et des cellules sarcomes. Cela provoque la colonisation des cellules sarcomes par les toxoplasmes. Ce dernier étant un parasite intracellulaire strict, il n'est pas agressif pour la souris tant qu'il est dans la cellule et n'a pas de conséquence sur son état sanitaire. Au-delà de 60 heures d’incubation, des signes de douleurs peuvent apparaitre. Après un temps d’incubation compris entre 65 et 75 heures, l’animal est mis à mort et l’ascite des souris est récoltée. Pour diminuer l’impact douloureux du protocole sur l’animal, il est prévu systématiquement, 48 heures après l’inoculation et 24 heures avant la récolte d’ascite, d’induire une analgésie par injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroïdien de type ketoprofene.

Devenir

La nature du parasite inoculé ne peut conduire à une autre issue que l’euthanasie de l’animal à la fin du protocole. Ce protocole, avec une durée d’incubation optimisée, est celui qui réduit au maximum l’impact pour l’animal, tout en garantissant l’objectif du projet.

Remplacement

Pour assurer la révélation des anticorps dirigés contre les toxoplasmes, ces kits sont composés de toxoplasmes entiers produits sur ascite de souris. Ce mode de production permet une affinité forte et une reconnaissance complète des différents types d’anticorps existants. L’intérêt est de garantir la fiabilité du résultat rendu : un faux résultat (faux positif, faux négatif ou erreur de dosage) rendu par le test dans un laboratoire clinique peut avoir un impact grave sur la santé, le suivi médical et la prise en charge des patients testés avec ces méthodes. Ce protocole est le seul mode de production aujourd’hui validé pour garantir les performances requises des kits de diagnostic concernés. Aucun mode de production de ces toxoplasmes sur une source non animale n’a pas pu être validé à ce jour.

Réduction

Après un temps d’incubation compris entre 65 et 75 heures, l’ascite des souris est récoltée en un prélèvement unique sur l’animal euthanasié. Un rinçage de la cavité péritonéale avec 5mL de sérum physiologique est effectué, dans le but de récupérer le maximum de toxoplasmes afin de diminuer le nombre de souris utilisées. De même l’injection couplée de toxoplasmes et de cellules sarcome TG180 permet d’amplifier la production de toxoplasmes et donc de réduire le nombre d’animaux (le toxoplasme étant un parasite intracellulaire strict). Cette méthode optimisée entraine la production d’un volume moyen de 1mL d’ascite très concentré en toxoplasmes par souris de 30g. Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste en fonction des besoins de production. La quantité produite par animal est constante et le calcul du nombre d'animaux dépend du volume de produit commandé. Ce nombre d’animaux a été optimisé au fil des années d’expérience et permet d’être ajusté au plus près des besoins. 200 000 souris sont nécessaires sur les 5 années de durée du projet. Ce nombre de souris permettra de produire et de mettre à disposition 20 millions de tests de diagnostic à travers le monde, au service de la santé publique.

Raffinement

Les animaux entrent en production après une période d'acclimatation de 14 jours, de manière à ce qu'ils s'habituent aux conditions d'élevage, limitant ainsi le stress lors des différentes manipulations. Ils sont hébergés sur litière (sciure/lanières de carton) assurant l'enrichissement du milieu et permettant aux souris de faire leur nid. Un tunnel PVC est introduit dans la cage permettant aux souris de répondre à un besoin physiologique de bien-être animal. Un suivi quotidien par cage permet de contrôler l’état sanitaire des souris. De même l’injection couplée de toxoplasmes et de cellules sarcome TG180 permet de limiter la colonisation des cellules de la souris de la 1ère heure à la 60ème heures et donc de diminuer la douleur (le toxoplasme étant un parasite intracellulaire strict). Au-delà de la 60ème heure le toxoplasme libéré dans le péritoine colonise alors les cellules de la souris et devient agressif et des signes de douleurs apparaissent. Pour diminuer l’impact douloureux du protocole sur l’animal, il est prévu systématiquement, 48 heures après l’inoculation et 24h avant la récolte d’ascite, une analgésie par injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroïdien de type ketoprofene.

Choix des espèces

La culture de toxoplasmes a été validée sur souris pour assurer la performance des tests de diagnostic in vitro. Les animaux utilisés ont un poids moyen de 30 g. Après une période d'acclimatation de 14 jours les animaux entrent en production.