Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Approche thérapeutique pour le diabète de type II : validation d’un candidat médicament
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection puis, sous anesthésie, une capsule sous-cutanée délivrant un candidat médicament, avant un test de tolérance au glucose avec quatre prises de sang. Le porteur vise à valider l'association de deux médicaments contre le diabète de type 2 et à conforter le passage à un essai clinique. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité d'un organisme vivant.
Objectifs
En 2015, la France comptait 3,7 millions de personnes traitées pour un diabète dont 90% présentaient une insulino-résistance. La résistance à l’insuline, qui se caractérise par une perte de sensibilité des tissus périphérique (muscle, tissus adipeux) à cette hormone, s’installe progressivement et silencieusement chez les sujets à risques (âgés, en surpoids ou obèses) et est la cause majeure de l’apparition du diabète de type II. Nous développons une protéine dont le mécanisme d’action anti-inflammatoire et antioxydant permet de diminuer la résistance à l’insuline dans 2 modèles murins différents. Des premières études ont permis d’identifier une dose efficace de notre candidat médicament démontrant son efficacité sur la résistance à l’insuline. En raison de son mécanisme d’action lui permettant de cibler la cause du diabète de type II à savoir la résistance à l’insuline, notre médicament pourra être utilisé en combinaison avec les antidiabétiques oraux actuellement sur le marché qui ont spécifiquement un effet hypoglycémiant. L’objectif d’une telle combinaison chez l’homme sera de retarder voire de stopper l’utilisation de l’insuline comme dernier recours thérapeutique en bloquant la progression de la résistance à l’insuline.
Bénéfices attendus
Valider la synergie de l’association de 2 médicaments permettant une prise en charge globale du diabète de type II en ciblant plusieurs mécanismes moléculaires à l’origine de la pathologie. Les résultats obtenus renforceront donc le positionnement de notre médicament pour la prise en charge du diabète de type II et confirmeront la pertinence d’un essai clinique de type II chez des patients diabétiques.
Procédures
Au cours de ce protocole, nos animaux seront soumis à 3 interventions : - l’Administration de molécule par une injection abdominal nécessitant de tenir l’animal pendant qq secondes - Mise en place d'une capsule délivrant notre médicament sous la peau nécessitant une anesthésie générale d'environ 15-20 minutes par animal -Evaluation sur 120 min de la tolérance au glucose sur animal vigil par une administration oral de glucose suivi de 4 prises de sang afin de réaliser des dosages.
Impact sur les animaux
Au cours de cette étude, nous avons cibler 1 nuisance qui pourrait impacter nos animaux, elle pourrait survenir à la suite de la mise en place de la capsule délivrant notre médicament par l’induction légère d’une inflammation au niveau du site d’implantation. Elle sera atténuée par une injection d'anti inflammatoire systématique. Une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée tout au long de l’étude.
Devenir
La fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de prélever des tissus sur lesquels on pourra réaliser des analyses et des dosages ultérieurement.
Remplacement
Notre projet correspond à un travail de phase préclinique visant à tester l'effet anti-diabétique d'une nouvelle molécule. C'est donc un passage obligé vers la clinique et l'Homme. Il n'existe pas actuellement de modèle in vitro permettant de reproduire la complexité d'un organisme vivant.
Réduction
Pour ce projet nous utiliserons 15 animaux par groupe afin d’ observer une diminution significative la glycémie à jeun. Les résultats de cette étude seront validés par l’usage rationnel de tests statistiques.
Raffinement
L’ensemble des procédures de ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et la prise en charge de la douleur est prévue avant pendant et après l’opération. De plus, des points limites adaptés (chute importante de la glycémie au cours du test, perte d'un implant...) aux procédures expérimentales ainsi que des critères d'arrêt des souffrances (perte de poids supérieur à 15%...) sont mis en place.
Choix des espèces
Les souris ont une physiologie métabolique proche de l'Homme notamment en ce qui concerne la régulation de la glycémie et sont souvent utilisées comme modèles de pathologie humaine comme le diabète. Il s'agit de jeunes adultes, âgés de 11 semaines.
Evaluation de l’efficacité des produits immunologiques dans le cadre de développements de produits destinés à protéger des espèces domestiques contre un agent pathogène – Avenant à l’autorisation de projet #23290
- Formation professionnelle
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
Cochons d'Inde : 600
Hamsters dorés : 7000
Chats : 150
Chiens : 1200
Furets : 50
13 000 animaux non-humains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Chiens (1 200), chats, furets, souris, cobayes et 7 000 hamsters dorés reçoivent un agent pathogène, virus ou bactérie, puis sont suivis pour la maladie qu'il déclenche, afin d'évaluer l'efficacité de produits immunologiques vétérinaires destinés au marché. Le porteur indique que certains animaux développeront des signes cliniques sévères et douloureux pouvant conduire à la mort et seront mis à mort aux points limites. Il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est reconnue par la pharmacopée et que l'évaluation sur l'espèce de destination est "requise par la loi".
Objectifs
Dans le cadre du développement de produits immunologiques à destination vétérinaire tels que les vaccins, la démonstration des propriétés protectrices du produit contre la maladie cible est requise par la loi, et réalisée selon des réglementations précises. L’évaluation de l’efficacité du produit vis-à-vis d’une épreuve virulente est également nécessaire pour définir et caractériser le produit candidat (choix de la dose, de la voie d’administration, des adjuvants/excipients…). Toutes ces informations participent au développement et à la constitution finale du dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM). Ce projet vise ainsi à présenter 2 procédures expérimentales répétitives ayant pour but d’évaluer l’efficacité de produits immunologiques chez les carnivores domestiques. Ces deux procédures concernent : 1/ la mise au point d’épreuve nécessaire pour cette évaluation, 2/ l’évaluation de l’efficacité en elle-même. A noter que par la suite, pour des raisons de simplification, on parlera par défaut d’animaux vaccinés à la place d’animaux ayant reçu le produit immunologique d’intérêt. Ces deux procédures seront réalisées sur l’animal de destination (chiens, chats, furets) ou lors d’essais préalables sur un modèle rongeur (souris, hamsters essentiellement). Les essais consisteront à administrer le pathogène (type virus ou bactéries), selon une ou plusieurs voie(s) d’administration, à une ou plusieurs dose(s), à des animaux sains préalablement vaccinés ou non et sensibles à ce pathogène. L’efficacité des produits immunologiques sera évaluée par comparaison des données obtenues chez les animaux vaccinés par rapport aux animaux non vaccinés. Il s’agira du suivi des signes cliniques spécifiques de la maladie, associé ou non à un suivi de paramètres biologiques (taux d’anticorps, excrétion virale ou bactérienne…).
Bénéfices attendus
Ce projet contribue au développement et à la mise à disposition de produits immunologiques sûrs et efficaces auprès des vétérinaires et des propriétaires d’animaux de compagnie en accord avec les requis pour la mise sur le marché de ces produits. Ce projet s’inscrit dans la prévention de maladies pouvant être graves et causer de la souffrance animale et des zoonoses. Les produits immunologiques ainsi développés permettent de protéger les espèces domestiques par la réduction des signes cliniques de maladie voire la mortalité ainsi que par la réduction de sa propagation auprès de ses congénères et de l’Homme (dans le cas de zoonoses). Dans le cadre du développement de nouveaux produits ou amélioration de produits existants sur le marché, les bénéfices envisagés de cette procédure seront la meilleure connaissance et compréhension du fonctionnement de ces produits (dose, voie d’administration, adjuvants/excipients, innocuité, efficacité, mécanisme d’action) et la réalisation des études nécessaires à la constitution du dossier d'autorisation de mise sur le marché (AMM).
Procédures
En fonction du produit immunologique testé et donc du type d’agent pathogène inoculé, les animaux seront soumis à différentes interventions nécessaires à la bonne évaluation de son efficacité, selon les réglementations en vigueur. L’ensemble des interventions possibles, et variables selon le produit évalué, sont les suivantes : -Injection(s) de l’agent pathogène (ex, virus ou bactéries) à une ou plusieurs reprises (administrations répétées jusqu’à 4 fois) -Suivi clinique régulier des signes typiques de la maladie inoculée, associé ou non à une prise de température rectale (carnivores) et une pesée, permettant de surveiller et d’évaluer l’état de santé des animaux et nécessaires à l’appréciation de l’efficacité clinique du produit étudié -Prélèvements d’échantillons variés permettant des mesures répétées de marqueurs biologiques et nécessaires à l’appréciation de l’efficacité biologique du produit étudié. Ces prélèvements sont réalisés à des volumes et intervalles réguliers dans la limite des recommandations par espèce. -Euthanasie en fin d’épreuve par une méthode adaptée. La durée de l’épreuve pourra varier de 1 semaine à 2 ans (cas d’une infection lente).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir une légère douleur transitoire aux sites d’injection lors de l’administration du pathogène, d’anesthésique ou de médication liée à l’introduction d’une aiguille. En revanche pour d’autres voies telles que intraoculaire ou intranasale, une anesthésie sera mise en place afin de prévenir tout stress ou douleur. Le suivi de la température par voie rectale pourra causer de l’inconfort temporaire et/ou de la douleur transitoire. Des signes cliniques plus ou moins sévères, spécifiques de la maladie et connus (retour terrain ou bibliographie relative aux modèles expérimentaux) pourront être observés, tels que des atteintes de l’état général (hypo/hyperthermies, pertes de poids, déshydratation, dépression…), et/ou plus spécifiques à certains organes type atteintes digestives (diarrhées, vomissements…), respiratoires (toux, éternuements, dyspnée, …), oculaires (conjonctivites…), rénales, neurologiques, dermiques et autres. Dans de rares cas, en fonction de la maladie, les animaux présentant des atteintes cliniques sévères et douloureuses, pouvant conduire à leur mort, seront euthanasiés dès l’atteinte des points limites définis et ceci afin d’éviter ou limiter dans le temps ces altérations graves. Tous ces signes peuvent induire des gênes ou inconforts, voire des souffrances, allant de quelques heures à quelques jours. A chaque fois que cela sera possible, des mesures visant à minimiser les effets indésirables sur le bien-être des animaux, en termes de sévérité et de durée, seront mises en place.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode adaptée en conformité avec la loi et ceci pour chacune des deux procédures.
Remplacement
L’efficacité du produit immunologique doit être évaluée sur chacune des espèces de destination conformément aux monographies de la Pharmacopée Européenne. A ce jour, aucune méthode alternative in vitro n’est reconnue par la pharmacopée permettant de répondre à la demande. La réalisation d’essais préliminaires sur modèle rongeur sera privilégiée lorsque cela est possible.
Réduction
Ces procédures s’appuient sur le nombre d’animaux stipulé dans les monographies ou autres textes réglementaires relatifs au produit testé et/ou sur une analyse statistique et/ou des données préliminaires obtenues sur des essais passés ou de la littérature. A chaque fois, le nombre minimum d’animaux est utilisé afin de répondre à l’objectif de l’étude. Chaque fois que cela est possible, deux ou plusieurs produits, pourront être testés simultanément afin d’utiliser des témoins communs (surtout dans le cadre de sélection de produits dans les modèles rongeurs).
Raffinement
Des mesures seront prises afin de limiter le stress et la douleur lors de l’expérimentation : -Observation d’une période d’acclimatation et mise en place de séances d’habituation et socialisation des animaux (standard à renforcée), -Hébergement en groupe, et enrichissement adapté, afin de respecter le comportement inné des animaux et les interactions entre individus nécessaires au maintien du bien-être -Observation quotidienne et suivi clinique régulier, effectué aussi souvent que cela sera jugé nécessaire, pour surveiller l’apparition de tous signes cliniques d’atteintes de l’état de santé des animaux -Réalisation de certains actes (administrations ou prélèvements) avec anesthésie/analgésie si nécessaire afin de garantir le bien-être animal. Une surveillance sera mise en place jusqu'au réveil complet de l’animal. -Médication pour le traitement de tous symptômes, tant que le traitement reste compatible avec l’objectif de l’étude -Mise en place de mesures compensatoires telles qu’un régime spécial (pâté en cas de perte d’appétence), enrichissement supplémentaire, nettoyages supplémentaires, surveillance accrue et renforcée,… De plus, pour chaque étude, l’état général de l’animal est suivi et l'utilisation de critères d’arrêt de souffrance sera systématiquement mise en œuvre pour réduire douleur, souffrance et angoisse.
Choix des espèces
De par la réglementation, l’efficacité d’un produit doit être établie sur l’espèce de destination (chien, chat ou furet) afin de garantir la fiabilité des résultats. Des essais préalables peuvent être réalisés sur des modèles rongeurs afin de limiter le nombre de carnivores à utiliser. Les études seront réalisées sur des animaux sevrés juvéniles ou adultes conformément à la réglementation.
Etudes non-cliniques de biodistribution, toxicité et tumorigénicité en conformité aux Bonnes Pratiques de Laboratoire
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
2 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'une thérapie ou de cellules souches, puis des prélèvements sanguins répétés, dans des études réglementaires de biodistribution, toxicité et tumorigénicité menées pour des sponsors avant une demande d'essai clinique. Le porteur décrit des points limites incluant une perte de 20 % du poids ou une tumeur dépassant 2 000 mm³, et indique que les souris sont mises à mort par dislocation cervicale en fin d'étude. Il affirme que cette étude réglementaire sous contrôle de l'ANSM ne peut "pas, pour l'instant, être remplacée" par d'autres moyens.
Objectifs
Le projet consiste à étudier les effets de tumorigénicité, toxicologie et biodistribution d'un traitement (thérapie innovante ou cellules souches) dans le but d'obtenir l'autorisation de l'ANSM pour les essais cliniques sur des adultes ou des enfants.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal de ces études est de pouvoir mettre sur le marché des médicaments à usage humain qui sont soit plus efficaces que ceux existants ou qui répondent à une demande pour pallier un manque au niveau thérapeutique.
Procédures
Tatouage : une fois par étude, pour tous les animaux. Cet acte est effectué lorsque l'animal est anesthésié. Il ne dure qu'une minute. Injections : une fois par étude, pour tous les animaux. Ces injections sont pratiquées par voie veineuse (à la queue (5 minutes)) ou par voies intra-péritonéale ou intra-dermique. Les prélèvements sanguins pourront être effectués sur les animaux vigiles (région mandibulaire) ou anesthésiés par Isoflurane (sinus rétro-orbital) et n'excèdreont pas la minute. Quelle que soit l'étude, un prélèvement sera réalisé en début et en fin (au moment de la nécropsie) ; selon sa durée, trois prélèvements intermédiaires pourront être demandés par le sponsor. Pour une souris de 25 g le volume prélevé sera de 150 µl maximum.
Impact sur les animaux
Lors des tatouages, les animaux sont anesthésiés. Ils sont observés par un zootechnicien jusqu’à leur réveil complet. En cas d'apparition d'une anomalie, la surveillance de l’animal sera renforcée et une note sera mise sur la cage. Les injections de l'élément d'essais par voie intraveineuse peuvent présenter une douleur en cas d’administration à la veine caudale. Une analgésie locale type Lurocaïne sous forme de pommade, sera déposée sur le lieu d’injection. Pour les gavages et dans la mesure du possible et pour diminuer toute irritabilité, l'élément d'essais sera dilué dans une substance "gélifiante". Plusieurs prélèvements seront nécessaires au cours de l’étude et les volumes seront adaptés selon leur fréquence et selon la stature de l'animal. Ils s’effectueront par voie mandibulaire ce qui ne nécessite pas d’anesthésie, en alternant côtés gauche/droit. S’il est besoin de faire des analyses d’urines parfois demandées pour les études de toxicité, les animaux seront mis durant 24 heures dans une pièce dédiée et calme, dans des cages métaboliques permettant la séparation de l’urine et des fèces. Les souris garderont le contact visuel avec leurs congénères.
Devenir
Après le tatouage les animaux sont remis dans leur cage, avec leurs odeurs et le même groupe social. Après les injections et les prélèvements, dans le cas de petits saignements, nous nettoyons le site du prélèvement ou de l'injection pour qu'il ne reste aucune trace de sang qui pourrait stresser les autres animaux de la cage. Ensuite les animaux sont remis dans leur cage dans les mêmes conditions que pour le tatouage. A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort. Les méthodes de mises à mort sont soit par dislocation cervicale soit, les animaux sont préalablement anesthésiés pour récupération du sang total suivi d'une dislocation cervicale.
Remplacement
Une étude BPL est la dernière étude menée sur les animaux avant de passer à la phase clinique du développement d'un médicament. Cette étude est règlementaire. Elle est menée sous la surveillance de l'Agence Nationale du Médicament et des produits de santé (ANSM). Elle ne peut pas, pour l'instant, être remplacée par d'autres moyens. Par contre, avant de mettre en oeuvre cette étude, des tests in vitro ont été menés.
Réduction
Le nombre d'animaux prévu dans une étude BPL est le nombre minimum nécessaire pour avoir des statistiques sûres et quelques animaux de plus pour remplacer ceux qui risquent de décéder durant l'étude. Cela nous permet de pouvoir mener et suivre l'étude jusqu'à son terme et de pouvoir retirer une conclusion sur la nocivité du produit étudié dans un rapport envoyé aux autorités. Le nombre prévu ne peut pas être réduit aux risques de devoir commander à nouveau la totalité des animaux. Par contre, le savoir faire des zootechniciens, qui est contrôlé par plusieurs acteurs, nous permet de limiter au maximum ce nombre d'animaux.
Raffinement
out au long de leur vie au sein de l'Etablissement hébergeant les animaux, une surveillance est mise en place. Chaque animal est suivi et tracé via un logiciel. Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées avec l'eau et l'aliment ad libitum. A minima, de l'essui-tout et du sizzle-net est mis dans la cage pour que les souris puissent nidifier. Les animaux ne sont séparés qu'en cas de stress ou de blessures ou pour prélèvement d'urines. Sinon, ils sont gardés dans leur groupe social. En cas de bagarre, nous rajoutons de l'enrichissement comme des igloos, des bâtonnets de bois à ronger ou des carrés de coton. Les points limites mis en place sont les suivants : rostration, poil hérissé, perte de poids correspondant à au moins 20% de poids des animaux contrôles, infection ou ulcération et taille de la tumeur excédant 2000 mm3. Des analgésiques de surface de type Lurocaïne seront utilisés lors des injections via la veine caudale. L'anesthésie à l’isoflurane sera pratiquée pour les prélèvements et injections via le sinus rétro-orbitaire ou lors des tatouages.Tout le personnel intervenant sur ces animaux a reçu une formation théorique diplômante, est formé sur le terrain via un système de compagnonnage et est audité avant de pratiquer un geste sur l'animal dans le cadre de ces études. Lors des analyses hématologiques ou biochimiques le volume des prélèvements est réduit au minimum par l'utilisation d'automates développés pour l'application chez les rongeurs.
Choix des espèces
Nous utilisons des rongeurs car ils font partie des espèces animales sur lesquelles les éléments d'essais doivent être testés dans le cadre d'études non cliniques règlementaires. Les études se feront sur des animaux sevrés, âgés de 1 jusqu'à 18 mois. 1 mois pour "mimer" une étude clinique réalisée chez les enfants et 18 mois dans le cadre de médicaments développés en gériatrie.
Evaluation de l’efficacité et de l’innocuité de nouvelles technologies de robotique chirurgicale pour la thermoablation percutanée mini-invasive de tumeurs sur modèle porcin
- Recherche appliquée
- Cancers
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
36 porcs vont être utilisés, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Chaque animal reçoit sept insertions d'aiguille, quatre dans les poumons et trois dans le foie, suivies de séances de destruction de tissu par la chaleur, pour valider des dispositifs robotisés de thermoablation destinés à l'humain. Le porteur indique que la procédure, sans réveil, dure jusqu'à cinq heures et que les nuisances attendues concernent surtout le stress des phases d'isolement et de préparation. Il affirme que ces dispositifs, déjà testés en laboratoire, doivent être validés sur un animal vivant pour tenir compte des mouvements respiratoires et de la proximité des organes.
Objectifs
D’après l’Organisation Mondiale de la Santé, le cancer est une cause majeure de décès dans le monde, à l’origine de 10 millions de décès en 2020. Le choix du traitement du cancer dépend de l'organe cible et du stade d’avancée de la maladie. Par exemple, la transplantation hépatique, la résection chirurgicale ou la destruction percutanée sont les traitements proposés pour un cancer diagnostiqué à un stade peu avancé. La chimioembolisation, la chimiothérapie, les thérapies ciblées, les traitements palliatifs sont proposés dans le cas de cancers plus avancés. La destruction percutanée est envisagée chez les patients ayant des masses tumorales bien définies. Ce traitement peu invasif est une alternative à la chirurgie consistant à introduire une sonde sous repérage scanner afin d’atteindre la tumeur et la détruire par la chaleur (micro-ondes ou radiofréquences). Ce traitement est rapide avec peu de complications reportées. L’insertion de la sonde peut être réalisée manuellement ou à l’aide d’une plateforme robotique. Les objectifs de ce projet sont double: valider de nouvelles technologies de thermoablation, et tester de nouvelles technologies robotisées permettant la réalisation de biopsies et la destruction percutanée mini-invasive de tumeurs. Ces plateformes robotisées proposent une atteinte très précise et sécurisée des tumeurs. Elle sera une alternative pour les patients n’ayant pas recours à la transplantation ou aux traitements par chimiothérapie ou radiologie. Des tests in-vitro ont été réalisés afin de s’assurer du bon fonctionnement du robot et/ou du générateur de thermoablation. Néanmoins, il est nécessaire d’évaluer l’efficacité de ces appareils en réalisant des tests sur animaux pour prendre en compte les éléments qui ne peuvent pas être démontrés par des tests in-vitro (mouvements naturels engendrés par la respiration, proximité d’autres organes et des vaisseaux sanguins).
Bénéfices attendus
A l’issu de cette étude, les meilleures combinaisons de conditions seront sélectionnées pour une efficacité optimale des générateurs de thermoablation (puissance et durée d'action). Cette étude permettra également de valider, pour les stations robotisées de positionnement d'aiguilles, le protocole standard et de s’assurer d’avoir une méthode reproductible permettant plusieurs atteintes des cibles, ainsi qu’une évaluation de la sécurité du dispositif.
Procédures
Chaque animal sera impliqué dans une procédure sans réveil après 7 jours d'acclimatation. Les animaux concernés seront isolés la veille de l'intervention en petit groupe de 2 à 3 et mis à jeun ensemble. Le jour de l'intervention, l'anesthésie est précédée d'un isolement de l'animal dans un box vide afin de réaliser la prémédication par piqûre intramusculaire du mélange (Kétamine, calmivet, robinul). cette étape ne dure que 5 minutes car l'animal est piqué au niveau de la cuisse par une aiguille de 19G reliée à une grande tubulure permettant une injection lente du produit sans contention. Sous anesthésie générale (avec intubation, anesthésie volatile et administration de morphiniques), les animaux auront 7 insertions d'aiguille de thermoablation sous repérage scanner (4 dans les poumons et 3 dans le foie). Des évaluations de zones de thermoablation permettront de valider des générateurs de thermoablation et de standardiser des protocoles en fonction des dispositifs. Des imageries scanners seront réalisées tout au long de la procédure dans un but de repérage anatomique, de vérification de la localisation des aiguilles et de l'efficacité du générateur après thermoablation (zone d'ablation visible au scanner). Les protocoles utilisés (temps et puissance) pour chaque procédure seront déterminés en fonction des caractéristiques du matériel utilisé (fournis par le fabricant), ceux-ci seront compris entre 50 et 150 Watt pour une durée de 2 à 15 minutes pour chaque ablation. La procédure aura une durée de 5h maximum en prenant en compte les possibles contre-temps techniques (30minutes de préparation de l'animal, imageries basales, installation du robot et du générateur, mise en place des aiguilles (n=7), temps de thermoablations, imageries scanner de vérification à chaque positionnement d'aiguille et à chaque ablation).
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale étant sans-réveil, les nuisances ou effets indésirables attendus concernent principalement les périodes d'acclimatation et de préparation. Celles-ci peuvent, en effet, être source de stress, notamment la veille de l'intervention pendant la phase d'isolement en petit groupe (n=2 ou 3) pour la mise à jeun. Le jour de l'intervention, l'anesthésie est précédée d'un isolement de l'animal dans un box vide afin de réaliser la prémédication par piqure intramusculaire du mélange (Kétamine, calmivet, robinul), cette étape ne dure que 5 minutes (piqure avec une grande tubulure permettant l'injection lente du produit sans contention) mais peut également être source de stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure expérimentale afin d'effectuer des analyses histologiques et immunohistichimiques sur les organes cibles.
Remplacement
Il s’agit d’une étude ayant pour objectif d'évaluer l’efficacité et l’innocuité de nouvelles technologies de thermoablation et de plateformes robotiques chirurgicales pour la pose d'aiguille de thermoablation percutanée. L'ensemble de ces appareils ont été testés in vitro, cependant, il est nécessaire d’évaluer l’efficacité de ces appareils en réalisant des tests sur organismes vivants pour prendre en compte les éléments qui ne peuvent pas être démontrés par des tests in-vitro (mouvements naturels engendrés par la respiration, proximité d’autres organes et des vaisseaux sanguins). Le projet a pour objectif de valider les aspects d’efficacité et de sécurité dans un modèle in-vivo, ne pouvant être validés lors des tests in-vitro. Le modèle porcin, de par sa taille, présente l'avantgae d'avoir des tailles d'organes comparables à l'Homme, ce qui permet de tester directement les appareils dédiés à l'Homme après validation.
Réduction
Pour chaque session (nouvel appareil à tester), 6 animaux seront nécessaires. Cette étude permet de combiner des essais de plateformes robotisées à l'évaluation de générateurs de thermoablation, permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux. En effet, un nombre de 6 animaux permet d'obtenir un total de 42 insertions d'aiguille robotisées et zones de thermoablations (4 dans les poumons et 3 dans le foie, ce qui fait 7 insertions par animal; pour 6 animaux: 6 x 7= 42 insertions et thermoablation). Le nombre d’animaux a été réduit en veillant toutefois de travailler sur un nombre suffisant pour obtenir une différence significative entre les différents groupes pour les comparaisons ( variation de la puissance et du temps de thermoablation en fonction des générateurs à tester, selon les recommandations du fabriquant). La plupart des analyses de positionnement robotisée dépendront de données qualitatives, par expérience, un nombre de 6 cochons par session permettra d'obtenir des résultats interprétables, en tenant compte de la variabilité interindividuelle.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement ont été optimisées. Les gestes interventionnels seront toujours réalisés sous anesthésie générale avec utilisation de morphiniques, par du personnel formé, permettant un temps interventionnel réduit au maximun, afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal dans les phases de préparation (prémédication, pose de cathéter). Le bien-être de l'animal sera contrôlé en veillant aux conditions d'hébergement et au comportement des animaux durant l'acclimatation, d'une durée d'une semaine avant d'entrer dans le protocole. Lors de celle-ci, des observations quotidiennes seront réalisées par une personne compétente basées sur l'apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (bruits...).
Choix des espèces
Le porc est devenu l'animal de taille humaine de référence parce qu'il est très proche de l'homme d'un point de vue physiologique et anatomique (taille, structure et morphométrie des organes, stabilité génétique). De nombreuses constantes biologiques sont très similaires à l'Humain. Une fratrie habituelle de 10 à 12 animaux fournit un groupe de stabulation et d'expérimentation homogène. Les dispositifs médicaux de la clinique humaine peuvent directement être utilisés chez le Porc. Ainsi, l'utilisation d'équipements d'imagerie médicale destinés à l'Homme permet d'avoir une qualité d'imagerie équivalente à celle obtenue chez l’humain. Pour des raisons de nursing et de manutention l’animal sera un porc de 40 +/- 5 kg ce qui correspond à un porc de 4 à 6 mois.
Evaluation de candidats médicaments dans un modèle murin de drépanocytose
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris transgéniques Townes développent une drépanocytose avec anémie et atteintes du foie, des reins et de la rate, et reçoivent des candidats médicaments ainsi que des prélèvements de sang répétés au sinus de l'œil sous anesthésie. Le porteur indique que toutes seront tuées en fin de procédure pour prélever leurs organes. Il affirme que la complexité de la maladie impose d'en faire la preuve dans un "organisme intégré" et que le remplacement total par la culture cellulaire est impossible.
Objectifs
Il est aujourd’hui estimé qu’il naît chaque année dans le monde, plus de 300 000 enfants atteints de drépanocytose, une forme grave d’hémoglobinopathie à transmission autosomique récessive touchant le gène codant pour l’hémoglobine. La drépanocytose se caractérise par une altération de la forme native du globule rouge suite à la formation de polymères d’hémoglobine S mutée. Elle se manifeste des crises vaso-occlusives récurrentes et douloureuses ainsi que par une anémie hémolytique notamment dues à une inflammation vasculaire et un stress oxydant chroniques. Le caractère imprévisible des crises vaso-occlusives et les dommages tissulaires sévères et multifocaux subséquents rendent extrêmement difficile l'établissement d'un traitement efficace, expliquant pourquoi, à ce jour, il n'existe encore aucun traitement curatif applicable à l'ensemble de la population drépanocytaire. Il est donc nécessaire de continuer de développer des médicaments ciblant mieux les mécanismes d'action de la pathologie. Pour cela nous devons évaluer, sur des modèles physiologiques intégrés, l’impact de nouveaux candidats pharmacologiques pour mieux traiter la drépanocytose. La complexité de cette maladie nécessite de pouvoir faire la preuve de concept et d’efficacité dans un organisme intégré comme l’animal. Ce projet a pour objectif d'étudier l'effet de nouvelles molécules sur la physiopathologie de la drépanocytose dans un modèle murin transgénique développant la maladie. Dans ce contexte, nous évaluerons l'impact des molécules à tester sur l'érythropoièse, la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), l'hématocrite, la falciformation des globules rouges, ou encore le dosage de l'hémoglobine. L’utilisation de la souris se fera en accord avec la règle des 3R (réduire, raffiner, remplacer). Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au maximum afin de permettre des analyses statistiques solides. Des points limites destinés à limiter l'inconfort et la douleur des souris seront mis en place dans chaque procédure afin de veiller à leur bien-être. Une étude préliminaire pilote permettra de s’assurer de la faisabilité des mesures des paramètres listés ci-dessus et sera suivie d’études principales dont l’objectif sera d’évaluer l’efficacité de futurs candidats médicaments, seuls ou en combinaison avec l’hydroxyurée. Ce projet de recherche nécessitera au total 380 souris sur 3 ans.
Bénéfices attendus
Ce projet propose d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin d’améliorer le traitement des patients drépanocytaires. Ce projet permettra également de comparer de futurs candidats médicaments au traitement de référence de cette maladie, l’hydroxyurée. Plusieurs voies d’administration de ces composés seront envisagés afin de couvrir au mieux les effets potentiels sur la sévérité et la progression de la drépanocytose.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvement sanguins au sinus rétro-orbital, sous anesthésie isoflurane 3% et suivant une cinétique de prélèvement définis par le sponsor (en sachant qu'un prélèvement sanguin de 7,5% du volume total nécessite une semaine de récupération). Dans l'étude principale, les animaux recevront l'administration des composés à tester. La fréquence, la durée et la voie d'administration dépendra de la demande du sponsor (détails dans le rubrique Procédure 2). Sur animal anesthésié à l'isoflurane 3%, un prélevement en point final de sang sera effectué au sinus rétro-orbital. Puis un prélèvement d'organes (selon la demande du sponsor) aura lieu après mise à mort de l'animal pour histologie, analyse cellulaire, moléculaire et fonctionnelle ex- vivo.
Impact sur les animaux
Les effets indésiréables attendus sont ceux induits par le phénotype drépanocytaire spontanné des souris transgéniques Townes. Les souris Townes présentent une anémie, une demi-vie érythrocytaire raccourcie, une atteinte hépatique, rénale et splénique ainsi qu'une augmentation de l'érythropoïèse. Ces souris présentent un phénotype drépanocytaire dont l’ensemble des manifestations cliniques de la maladie serviront de paramètres d’évaluation d’efficacité de l’ensemble des composés pharmacologiques à tester, en les comparant et ou les combinant au traitement de référence, l’hydroxyurée.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure et des prélèvements sont réalisés pour étudier l'effet du composé testé sur la physiopathologie de la drépanocytose.
Remplacement
Lorsque cela est possible les composés sont évalués sur culture cellulaire ou organe isolé préalablement aux tests animaux afin de remplacer ou de réduire le nombre d’animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement total de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible pour l'étude de la drépanocytose. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de la maladie sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche subsitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents (modèle Townes) pour permettre une recherche fondamentale et appliquée tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.
Réduction
Nous avons une approche en deux temps pour bien définir les meilleures conditions d’expérimentation. Une expérience préliminaire pilote permettra de valider les paramètres à évaluer avant d'administrer les composés à tester dans l'étude principale et de confirmer la robustesse du modèle, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux. Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d’expérience, tout en prenant en compte la disponibilité du modèle transgénique Townes.
Raffinement
Les souris seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, à raison de 6 animaux par cage maximum, en unités ventilées. Un cycle jour/nuit de 12h/24 est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Leur environnement sera enrichi (igloo, buchette) afin d'éveiller leur sens, leur curiosité, leur activité physique. Les animaux seront pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement en accord avec le comité de suivi du bien-être animal de notre établissement. et reporté sur une feuille clinique par les animaliers et les expérimentateurs. L’atteinte d’un point limite défini dans la procédure avant la fin de l’expérimentation entrainera la mise à mort de l'animal.
Choix des espèces
Dans ce projet, les expériences in vivo sont indispensables car il n’existe pas de procédé in vitro ou in silico pour évaluer d’une part la délivrance des composés mais également leur efficacité sur la physiopathologie de la drépanocytose. La souris a été choisie car le modèle Townes a été développé afin de reproduire au mieux génétiquement et cliniquement la pathologie drépanocytose. Les souris utilisées auront 7-8 semaines au début de la procédure afin d'avoir des souris adultes avec un système immunitaire mature et ayant développé la pathologie.
Effet de nouveaux médicaments candidats dans le traitement des infections bactériennes et évaluation de leur innocuité dans un modèle de souris
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
4 355 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des bactéries pathogènes par instillation dans les narines, puis un candidat médicament par injection, pour cribler de nouvelles molécules contre l'antibiorésistance. Le porteur indique que l'inoculation peut provoquer une perte de poids, des tremblements et des troubles de la locomotion, et que les souris sont tuées en fin de protocole pour prélever leurs organes. Il revendique un "besoin médical et sociétal" et affirme que la validation dans un "modèle mammifère" est obligatoire avant tout passage en clinique.
Objectifs
Les bactéries résistantes aux antibiotiques représentent l'une des plus grandes menaces de ce siècle. Il est impératif d’accélérer la découverte de nouveaux antibiotiques. L'objectif du projet est de trouver de nouveaux médicaments pour traiter les infections bactériennes résistantes aux antibiotiques. Le projet vise à tester dans un modèle murin l'efficacité de ces molécules dans le cadre d'infection par des bactéries importantes en pathologie chez l'homme. Ce projet répond donc à un besoin médical et sociétal et devrait permettre de trouver des alternatives aux antibiotiques actuels pour lutter contre les phénomènes d’antibiorésistance.
Bénéfices attendus
Nous proposons d'utiliser un modèle mammifère pour valider l'efficacité et la toxicité des candidats médicaments que nous avons préalablement identifiés. Sur la base de nos résultats préliminaires très prometteurs, notre objectif est de tester l'efficacité de ces inhibiteurs sur des bactéries pathogènes présentant un intérêt thérapeutique élevé et de valider l'innocuité des molécules vis-à-vis de l'hôte. Nous visons à obtenir au moins une molécule candidate préclinique avec un potentiel thérapeutique élevé. Ce projet répond à un besoin médical et sociétal et devrait permettre de trouver des alternatives aux antibiotiques actuels pour lutter contre les phénomènes d'antibiorésistance.
Procédures
Interventions : inoculation des bactéries par une instillation nasale dans chaque narine après anesthésie par injection, durée de l'intervention 10 à 20 min. Puis traitement par molécule médicament par injection sans anesthésie (de une à 3 injections sur 24h), durée de l'intervention 1 à 5 min.
Impact sur les animaux
L'injection de bactéries même à des doses subléthales peut entrainer des effets indésirables sur les souris tels que perte transitoire de poids, tremblements ou défaut de locomotion.
Devenir
Les souris ayant reçu des bactéries ou des molécules ne peuvent pas être réutilisées et seront euthanasiées à la fin de chaque protocole pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Notre projet se base sur de nombreux résultats préliminaires qui ont permis de valider l'innocuité des molécules et leur efficacité sur des modèles in vitro, sur cellules eucaryotes et sur un modèle in vivo d'insectes. Toutes ces étapes préalables permettent de réduire le nombre de souris nécessaires pour valider l'efficacité et la toxicité des médicaments candidats les plus prometteurs. Ce projet vise à obtenir de nouveaux médicaments qui pourraient être utilisés pour des études précliniques. En raison de son application en thérapeutique humaine, les données doivent obligatoirement être validées dans un modèle mammifère d'infection.
Réduction
Tout d’abord, une étude pilote sera entreprise pour déterminer les paramètres optimums d’inoculation (640 souris max.). Les conditions optimales déterminées à partir de l’étude pilote seront utilisées dans une étude finale pour analyser l’effet antimicrobien des molécules pendant l’infection (1460 souris pour la toxicité, 540+1350= 1890 souris pour l’efficacité des molécules contre 6 pathogènes d’intérêt médical et 365 souris pour les tests de spécificité des molécules). Au total 4355 souris seront nécessaires à cette étude. Le nombre d’animaux est ainsi adapté au plus juste pour permettre une évaluation de l’innocuité des molécules et leur efficacité.
Raffinement
Le protocole expérimental prévoit l’anesthésie des animaux pour limiter la douleur. D’autre part, il permettra de décider d’une euthanasie prématurée en cas de comportements anormaux des animaux suite à l’infection traduisant un mal être. Les marqueurs classiques de la santé animale seront surveillés, tels que le poids, le comportement général, la récupération et des signes de détresse. Les animaux seront hébergés dans les conditions standard d’habitat avec enrichissement. Les animaux seront regroupés à 5 par cage pour respecter le caractère social des souris.
Choix des espèces
La souris, avec sa polyvalence, sa facilité d'utilisation et sa remarquable similitude (99%) avec le génome humain a été largement utilisée dans le domaine de la Recherche et Dévelopement pharmaceutique. Les souris développent naturellement des pathologies qui imitent les maladies humaines. Dans ce projet la seule utilisation du modèle insecte in vivo n’est pas suffisante pour la sélection de molécules et pour une validation préclinique de cibles. D’une part, tous les pathogènes ne peuvent pas être testés chez l’insecte, d’autre part, ce modèle est limité de par son immunité (uniquement innée), et enfin, pour toute validation de molécules d’intérêt biomédical, un modèle mammifère est nécessaire. L’utilisation du modèle souris est nécessaire pour notre projet et le plus opportun car les données préliminaires menant à ce projet ont été validées à l'aide de modèles murins. Des souris femelles conventionnelles C57BL/6J âgées de 6-8 semaines sont utilisées pour le projet. Le génome de cette espèce a été séquencé, ce qui rend possible des analyses en aval. De plus, cette espèce a été couramment utilisée pour les tests de sécurité et d'efficacité pharmaceutique. L’âge adulte des souris, après le sevrage, assurera la présence d’un microbiote et d’une immunité développés. Des souris femelles conventionnelles C57BL/6J âgée de 6-8 semaines et chez lesquelles l'activité d'un gène codant pour une molécule impliquée dans l'immunité a été inactivé seront utilisées pour déterminer la spécificité du meilleur candidat médicament vis-à-vis du système immunitaire de l’hôte.
Effets d’anticorps sur les symptômes liés à l’obésité chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
108 souris rendues obèses par un régime enrichi en graisses vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales d'anticorps, sont hébergées en cage individuelle et tuées par ponction cardiaque sous anesthésie pour prélever leurs organes. Le porteur reconnaît que l'isolement en cage individuelle et le régime gras constituent des nuisances pour ces animaux sociaux. L'étude est menée pour un client en vue de la "mise sur le marché" d'un anticorps anti-obésité.
Objectifs
L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Dans ce contexte, notre client souhaite évaluer l'effet des nouveaux composés sur les symptômes liés à l'obésité chez les souris obèses (induites par une alimentation enrichie en graisses). Dans ce contexte, notre entreprise mènera, au nom de notre client, une étude in vivo visant à évaluer les effets des composés clients sur la prise alimentaire, le poids corporel et le métabolisme du glucose chez les souris obèses (induites par une alimentation enrichie en graisses). L’étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre du développement de composés d'intérêt thérapeutique, destinés à l’amélioration des troubles métaboliques, notamment l'obésité. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré que ces composés induisent une perte de poids corporel associée à une diminution de prise alimentaire chez des souris obèses. L’objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l’impact à plus long terme de ces composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris soumises à une alimentation enrichie en graisses (HFD; 60% de l'énergie fournie par les lipides). Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'anticorps anti-obésité. Cette étude vise à tester leur composé sur le poids et la composition corporels sur la souris obèse.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que de nombreuses molécules anti-obésité ont été commercialisées puis retirées du marché en raison d'effets secondaires graves, seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis à l'administration quotidienne de véhicule par voie intrapéritonéale de D-7 à D-1 (10mL/kg ; 20mg/kg). A partir de D1, les injections intrapéritonéales du composé d'intérêt aura lieu une fois par semaine (10mL/kg ; 20mg/kg). La mesure de la composition corporelle sera réalisée une fois par semaine à partir de D-3 sur animal vigile (durée : 1-2 min).
Impact sur les animaux
De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance sur les animaux. Ces animaux garderont toutefois un contact visuel avec les autres congénères. Le régime riche en gras nuira également aux animaux car il s'agit d'un régime différent du régime normal chow habituel et peut constituer une atteinte à la liberté sur l'absence de faim, soif et malnutrition. De plus, le changement de régime de 3 groupes de 12 animaux en régime enrichi à 45% de graisse au lieu du 60% initialement peut également constituer une nuisance sur les animaux. La présente étude s'appuie sur des approches peu invasives. Les traitements seront administrés intrapéritonéalement une fois par semaine sur des animaux qui seront en amont habitués à cette voie d'administration. Les mesures de prise alimentaire, de poids corporel et de composition corporelle sur animal vigile s'avèrent être des gestes rapides et n'induisant pas d'effets indésirables particulier. Par ailleurs, le composé à tester est déjà connu pour présenter un excellent profil toxicologique, sans effet secondaire. Les variations de poids qui pourront être observés liées à la restriction calorique et/ou au traitement peuvent générer une nuisance sur les animaux. Enfin, le jour du sacrifice, l'ensemble des animaux seront anesthésiés par un mélange de kétamine/xylazine. Une fois anesthésiés, une ponction cardiaque sera réalisée.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes (tissu adipeux, foie...) sont prévus après euthanasie pour mesures biochimiques ultérieures.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel (en g et %), prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire (Gain de poids en g/Prise alimentaire cumulée en g), composition corporelle (% masse maigre, masse grasse, masse fluidique), poids des muscles (gastrocnémiens, quadriceps), poids des tissus adipeux (inguinal et périgonadal), poids du foie et histologie du foie.
Raffinement
L'ensemble de l'animalerie respecte un cycle de 12h jour/12h nuit, une température comprise entre 20 et 22°C et une hygrométrie de 40% +/- 10%. Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cage individuelle du fait de la nécessité de mesurer précisemment l'impact du composé sur la prise alimentaire individuelle des animaux. Néanmoins, les animaux conserverons des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques (Buprénorphine notamment).
Choix des espèces
Le modèle de souris C57BL/6J nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge de 19-20 semaines au début des traitements. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testé, à savoir une population adulte et par le fait qu'un préconditionnement de 12 semaines avec une nourriture enrichie en graisse est nécessaire pour les souris obèses. Ce préconditionnement démarre à l'âge de 6 semaines chez notre fournisseur agréé.
Test d’absorption du fer au point d’injection chez le lapin selon la Pharmacopée Chinoise
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
100 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque lapin est sédaté puis reçoit une injection de fer dans un muscle de la cuisse, avant d'être mis à mort une semaine plus tard pour prélever et analyser ce muscle, afin de contrôler des produits vétérinaires destinés au marché chinois. Le porteur indique que ce test in vivo est exigé par la Pharmacopée Chinoise, tout en visant à démontrer que les contrôles physico-chimiques déjà réalisés en France suffiraient à s'en passer. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour cette exigence réglementaire.
Objectifs
Les injections de fer sont très souvent utilisées chez les jeunes animaux de rente (porcins, ovins, caprins, bovins…) dans le cadre de la prévention et du traitement de l’anémie ferriprive après la naissance. Dans le cadre de l’élevage porcin, les injections de fer sont presque systématiquement réalisées dans les 3 jours suivant la naissance. La Chine est le 1er producteur de porcs au monde et un marché important pour les industries pharmaceutiques vétérinaires. Ce projet est réalisé dans le cadre de demande d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) en Chine de produits vétérinaires injectables composés de fer, possédant déjà des AMM en France. A chaque libération d’un nouveau lot de ces produits en France, un contrôle qualité est réalisé à l’aide de différents tests physico-chimiques décrits dans la Pharmacopée Européenne. Pour la commercialisation sur le marché chinois, les autorités chinoises demandent la réalisation d’un test in vivo d’absorption du fer au point d’injection chez le lapin. Ce test fait partie des tests de contrôle qualité réalisés lors de la libération de lots de produits contenant du fer en Chine. Il permet de valider la qualité du lot en analysant l’absorption du fer après une injection unique et de s’assurer que la quantité de fer non absorbée au niveau du point d’injection ne dépasse pas 20% de la quantité injectée. Le but de cette vérification est de s’assurer que chaque lot commercialisé est conforme, et que le produit est sûr, aussi bien pour la santé animale que pour la consommation humaine. Ce projet a donc 2 objectifs : 1) la réalisation du test d’absorption de fer au point d’injection demandé par les autorités chinoises dans le cadre d’une demande d’AMM. 2) démontrer que les contrôles physico-chimiques réalisés en France sont suffisants pour pouvoir s’affranchir de l’utilisation de lapins lors de la libération de chaque lot de produit commercialisé sur le marché chinois.
Bénéfices attendus
1) Obtenir l’autorisation de mise sur le marché en Chine des produits testés. Ainsi, chaque lot commercialisé et autorisé sera conforme et sûr, aussi bien pour la santé animale que pour la consommation humaine. En effet, ce projet va permettre de valider en Chine des produits permettant de lutter contre l’anémie ferriprive rencontrée dans les élevages. 2) Prouver que les contrôles physico-chimiques réalisés en France sont suffisants pour pouvoir s’affranchir de l’utilisation de lapin lors de la libération de chaque lot de produit commercialisé sur le marché chinois.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont : 1) Injection pour la sédation des animaux : durée inférieure à 30 secondes. 2) Les animaux sédatés recevront une injection unique dans le muscle vaste médial de l’un des membres postérieurs, l’autre servant de contrôle non injecté : durée inférieure à 30 secondes. La sédation permet de diminuer le stress de l’animal et facilite sa contention. Elle facilitera également l’injection qui doit être réalisée précisément dans le muscle vaste médial. 3) Une semaine plus tard, pour l’euthanasie des animaux : durée inférieure à 30 secondes. 4) Sur les animaux euthanasiés, dissection et analyse du muscle vaste médial de l’un des membres : couleur du muscle au point d’injection et prélèvement du muscle pour doser la quantité de fer restant au niveau du point d’injection. Les résultats obtenus avec le muscle traité sont comparés avec ceux obtenus avec le muscle témoin qui n’a pas reçu d’injection.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont rattachés aux procédures et interventions prévues par le projet sur les animaux : 1) Stress et inconfort potentiellement induits par le port et la contention des animaux avant la sédation : durée inférieure à 5 minutes. 2) Stress et inconfort potentiellement induits lors de la pesée des animaux : durée inférieure à 1 minute. 3) Douleur induite par l’aiguille (piqure) lors de l’anesthésie des animaux : durée d’environ 10 secondes. 4) Stress potentiel dans la phase où l’animal redevient complètement vigile au fur et à mesure de la disparition de la sédation.
Devenir
Les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort afin de pouvoir prélever et analyser le muscle injecté étudié. Ces prélèvements de muscle sont primordiaux pour répondre aux objectifs de ce projet.
Remplacement
Remplacement : le remplacement n’est pas envisageable car le test d’absorption du fer au point d’injection est une procédure expérimentale in vivo demandée par la réglementation chinoise, dans le cadre de la commercialisation sur le marché chinois de produits vétérinaires composés de fer. L’absorption de fer est un processus dynamique nécessitant le passage de la molécule étudiée du site d’absorption vers le sang pour pénétrer dans la circulation systémique. Ce type d’étude doit se réaliser sur animaux. Cependant, l’un des buts de ces études est de démontrer que les contrôles qualité réalisés en France sont suffisants pour permettre à terme de s’affranchir de l’utilisation d’animaux pour chaque nouvelle libération de lot. Afin de démontrer ceci, l’utilisation d’animaux est ici nécessaire et aucune méthode substitutive n’existe. En effet, l’utilisation des animaux dans le cadre de ce projet, ne peut pas être remplacée par des méthodes alternatives n’impliquant pas l’utilisation d’animaux.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été calculé à partir des directives mentionnées dans la Pharmacopée Chinoise, dans laquelle il est stipulé qu’il faut utiliser 2 animaux par lot testé, et à partir des besoins pour le projet (estimation du nombre de lots à tester sur la durée du projet). De plus l’un des objectifs du projet est de démontrer que les contrôles physico-chimiques réalisés en France sont suffisants pour pouvoir s’affranchir de l’utilisation de lapins lors de la libération de chaque lot de produit commercialisé sur le marché chinois. Il a été estimé que 10 lots seraient testés par an, soit 100 lapins au total sur la durée du projet qui est de 5 ans.
Raffinement
Raffinement : 1) Les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. 2) La surveillance, les soins des animaux et l’administration du traitement prescrit sont assurés par du personnel formé, qualifié, compétent et sensibilisé à appliquer des points limites spécifiques au protocole 3) La surveillance des lapins sera accrue à des moments sensibles du projet tels que pour gérer/désamorcer les risques de bagarres entre lapins après la constitution des binômes dans les cages, durant la sédation et l’injection, après sédation et injection, jusqu’à ce que l’animal redeviennent complètement vigile. 4) Une grille décisionnelle/scores est appliquée pour atténuer ou abréger la douleur. 5) Une sédation du lapin sera pratiquée avant l’injection du produit à tester (anesthésie générale légère) pour diminuer le stress de l’animal et faciliter sa contention pour l’injection. La douleur, souffrance et angoisse de l’animal sont d’abord réduites puis supprimées pour que la manipulation puisse être réalisée dans les meilleures conditions. Il est primordial que l’injection soit réalisée précisément au niveau du muscle vaste médial, pour cela l’animal ne doit pas bouger. 6) Les lapins sont hébergés dans des conditions optimales en zones confinées, conçues pour protéger leur statut sanitaire Exempt d’Organismes Pathogènes Spécifique et les préserver des infections. 7) Les paramètres critiques d’ambiance tels que la température et la ventilation sont maintenus stables, régulés en permanence et sous alarmes. 8) Les lapins sont rassurés par le personnel qui leur parle continuellement et les manipule de façon apaisante. 9) Les animaux sont hébergés en groupe harmonieux et ont accès à un enrichissement varié pour exprimer un large répertoire de comportements normaux, d’interactions sociales entre congénères. 10) Les animaux ne subissent ni stress de transport, ni de changement d’environnement (personnel, mode opératoire, aliment…) car ils sont nés sur place et maintenus dans les mêmes conditions, qu’ils soient expérimentation qu’en élevage. 11) Le respects de critères d’inclusion des lapins (age, bonne santé et poids) permettant de n’utiliser que des lapins les plus optimum.12) L’aliment et l’eau de boisson sont à volonté, leur disponibilité est vérifiée quotidiennement.
Choix des espèces
Le lapin est l’espèce utilisée pour ce projet car c’est l’animal demandé et décrit dans la Pharmacopée Chinoise pour la réalisation de tests d’absorption du fer au site d’injection. Conformément à la Pharmacopée Chinoise, les animaux utilisés seront des adultes pesants entre 1,5 et 2,5 kg.
Programme d’immunisation de rats en vue de la production d’anticorps polyclonaux
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit huit injections d'antigène, dont certaines avec l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux servant au contrôle de protéines-médicaments. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, chaque antigène empêchant selon lui leur réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable", aucune méthode in vitro n'étant selon lui aussi efficace.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.
Procédures
Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.
Devenir
Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux (10 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant, notamment dans le contrôle et la qualification de protéines médicaments. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.
Raffinement
Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.
Choix des espèces
Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.
Etudes d’efficacité d’un médicament destiné aux chiens ou chevaux par administration de l’agent pathogène chez des espèces non-cibles ou production de l’agent pathogène
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Hamsters dorés : 425
Cochons : 50
825 animaux non-humains, souris, hamsters dorés et porcs, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Ils reçoivent des agents pathogènes, dont Bordetella, la leptospirose, la leishmaniose ou le tétanos, y compris des essais de dose létale 50 où la mort d'une partie des animaux est le critère mesuré. Le porteur décrit des tableaux cliniques incluant état moribond, perte de poids de plus de 20 %, respiration agonique et crampes généralisées, qui déclenchent la mise à mort. Il justifie ces épreuves par une exigence réglementaire et qualifie le recours à l'animal d'"indispensable".
Objectifs
Pour démontrer l’efficacité d’un produit contre un agent pathogène, la mise au point d’un modèle d’épreuve est indispensable. L’épreuve correspond à l’administration de l’agent pathogène pour reproduire, de manière expérimentale, la pathologie le plus fidèlement possible à la réalité. Une étape intermédiaire dans les études d’efficacité est de développer des tests analytiques ainsi que de produire et caractériser l’agent pathogène. Pour certains pathogènes il est nécessaire d’utiliser un système in vivo. L’objectif final d’une étude est de déterminer le ou les effet(s) bénéfique(s) du produit lors de l’épreuve. Justification règlementaire : Les études d’efficacité par administration de l’agent pathogène sont des obligations règlementaires (Pharmacopée Européenne et autres règlementations applicables) pour déposer un dossier d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) d’un médicament. L’utilisation d’espèces alternatives est une demande exigée par la Directive Européenne 2010/63/UE, afin de choisir des méthodes susceptibles de produire les résultats les plus satisfaisants et de causer le moins de douleur, de souffrance ou d’angoisse. Cette justification est valable lors du développement et de la réalisation de tests analytiques utilisant des animaux, de la production de souche d’épreuve ou du produit, détermination de la dose létale 50. Justification scientifique : En fonction de l’évolution des connaissances, il n’existe pas de méthode alternative plus adaptée pour la production de souche, le développement de modèle d’épreuve et la réalisation des tests analytiques.
Bénéfices attendus
L’intérêt final des études (réalisées selon les procédures expérimentales décrites ci-après) est de permettre de développer ou de contrôler des produits efficaces contre des maladies infectieuses.
Procédures
L’administration de différents produits est réalisée, ce qui est un acte technique de courte durée dont la voie et les modalités dépendent du produit administré et de l’espèce (cf. procédure spécifique). Lors des procédures, des prélèvements peuvent aussi être réalisés (écouvillons nasaux, prise de sang, prélèvements organes post mortem…). La fréquence, le volume et le nombre de ces derniers dépendent également de l’espèce, de la pathologie étudiée et de l’objectif expérimentale. Chaque acte est justifié d’un point de vue scientifique et/ou règlementaire. Lorsque l’anesthésie n’est pas plus traumatisante que l'acte en lui-même pour l’animal, une sédation peut être réalisée pour les différents actes décrits ci-dessus. Le choix de la sédation sera dépendant de l’espèce et de la durée de la procédure à réaliser. Cette décision sera prise par des vétérinaires compétents, disposant des connaissances nécessaires pour réaliser le choix le plus approprié. Lors de l’administration de souche d’épreuve, le suivi réalisé engendre une contention (pesée, observation des signes cliniques) à une fréquence adaptée aux pathologies. Les durées approximatives des phases d’épreuve sont comprises entre 2 et 15 jours environ. Durant cette période, une surveillance accrue des animaux entraine une manipulation fréquente des animaux pour veiller à la détection des points limites. Les actes sont réalisés par des opérateurs hautement qualifiés qui assurent une contention adaptée pour que le geste sur l’animal soit le moins douloureux et le moins stressant pour ce dernier.
Impact sur les animaux
Le développement de la maladie chez l’animal peut donner lieu à des signes cliniques provoquant une contrainte ou une douleur à l’animal. L’administration de produits ainsi que les prélèvements peuvent aussi engendrer un stress. Pour limiter la douleur potentielle ou le stress induit par ces actes, les procédures sont réalisées par des opérateurs hautement qualifiés qui assurent une approche et une contention adaptées à chaque animal. Une tranquillisation\anesthésie\analgésie de l’animal peut être réalisée si nécessaire. Des signes cliniques, liés au développement des pathologies peuvent également apparaitre. Un suivi clinique adapté (fréquence augmentée dès l’apparition de signes cliniques) est réalisé de manière à détecter des signes comportementaux anormaux (spontanés ou provoqués) et/ou des anomalies physiques et assurer une prise en charge rapide des animaux. Des points limites spécifiques sont définis en fonction des pathologies étudiées (comme visible dans le tableau ci-dessous – liste non exhaustive) entrainant une euthanasie de l’animal par un opérateur qualifié. Procédure étudiée Etat Moribond (animal prostré, dos voussé, reins creusés, pas de réponses aux stimulis) Gain ou perte de poids anormal Dégradation importante de l’état général (animal isolé, sale, apathie, immobile) Difficultés motrices, paralysies, (corps cambrés, pattes écartées) Autres Epreuve Bb chez le porc x (perte de poids >20% ; anorexie > 3 jours) x (absence de réponse aux stimuli) Respiration agonique ; comportement anormal (automutilation, décubitus permanent, stéréotypie…) Epreuve Leptospirose chez le hamster X Epreuve Leishmania chez le hamster X x L’état clinique est frustre mais en cas de détection de signe → Pesée Epreuve Rhinopneumonie équine chez le hamster X x Epreuve Bb chez la souris X x x Déshydratation DL 50 Bb chez la souris X x x Déshydratation Titrage Ac anti-tétanique sur la souris X x x Crampes généralisées De manière générale, tout tableau clinique évocateur d’une souffrance de l’animal entraine, en fonction de l’anomalie, l’euthanasie, l’exclusion de l’étude et/ou un traitement. Les critères sont en constante évolution pour les améliorer afin qu’ils reflètent au mieux l’expérience du terrain et l’état actuel des connaissances vétérinaires (bibliographie et pratiques en vigueur).
Devenir
Les animaux atteignants des points limites après administration d’un agent pathogène sont euthanasiés pour raison éthique. De même, des animaux pour lesquels des prélèvements terminaux sont requis sont euthanasiés. Et lors de l’administration d’agents pathogènes nécessitant des zones de confinement spécifiques, les animaux entrés dans ces zones ne peuvent pas ressortir par mesure de sécurité pour l’environnement et les différents opérateurs. Ainsi, toutes les procédures de ce projet amènent à une euthanasie à la fin des procédures pour 100% des animaux.
Remplacement
Lorsque cela est possible, une première étape dans le projet de développement d’un produit consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection de ces derniers, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le recours à l’espèce animale est, à l’heure actuelle, une exigence règlementaire. Ce recours est indispensable pour observer le plus fidèlement possible les effets sur les espèces cibles qui pourront bénéficier de ces traitements.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux à inclure est très souvent une exigence réglementaire. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste (historique, définition des objectifs…) de façon à minimiser le nombre d’animaux utilisés en limitant le risque d’études non conclusives. De plus, dans certaines études d’efficacité, plusieurs produits sont testés en parallèle de manière à mutualiser le groupe témoin ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Des points limites spécifiques à chaque pathologie ont été définis afin de limiter le plus précocement possible la douleur des animaux. Ces critères sont en constante évolution de manière à ce qu’ils reflètent au mieux l’expérience du terrain et l’état actuel des connaissances vétérinaires. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Une anesthésie et une analgésie peuvent être réalisées lors de certains actes si nécessaire. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et stabiliser leur état physiologique. La durée optimale est de 7 jours (au minimum 4 jours pour les porcs et 2 pour les rongeurs). Tous les animaux sont hébergés en groupe et des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie des animaux. La mise en place des revues rétrospectives est un outil permettant la remontée d’informations (positives comme négatives) menant à l’amélioration continue du bien-être animal et des techniques utilisées à ces fins.
Choix des espèces
L’utilisation d’espèces alternatives s’inscrit dans l’exigence de la Directive Européenne à utiliser les espèces les moins susceptibles de ressentir de la douleur, souffrance, de l’angoisse et de subir des dommages durables tout en ayant une extrapolation optimale des résultats sur l’espèce ciblée. Dans le cas du porc, Bordetella bronchiseptica est un pathogène naturellement présent chez cette espèce et la symptomatologie est comparable à celle du chien. Par ailleurs, de la bibliographie est disponible sur ce modèle expérimental, ce qui est en faveur de sa robustesse. Pour les rongeurs, les souris et hamsters sont des modèles sensibles aux agents virulents administrés, qui sont démontrés par la bibliographie. Les animaux sont inclus dans une procédure à la fin de leur sevrage : - 4 semaines au minimum pour les porcs - 21 jours au minimum pour les rongeurs (souris et hamsters) Pour les procédures utilisant des rongeurs, le sevrage est effectué à 21 jours. Le modèle est bien décrit chez les animaux de cet âge et qu’il s’agit d’un standard reconnu (bibliographie, avis d’expert…).
Etude de la tolérabilité ou toxicité subaiguë de molécules à potentiel thérapeutique.
- Formation professionnelle
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 240
480 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent chaque jour par gavage des molécules à visée thérapeutique et subissent des prélèvements de sang sous anesthésie, le porteur annonçant des effets indésirables attendus dans le groupe recevant les doses les plus élevées. Tous sont mis à mort pour le prélèvement des organes et leur analyse histologique. Le porteur affirme que les tests in vitro ne suffisent pas encore à éviter l'expérimentation sur l'animal entier avant l'administration à l'homme, et rattache le choix des espèces à une obligation réglementaire.
Objectifs
La mise en place d’un programme d’optimisation de molécules, depuis la synthèse jusqu’à la qualification d’une molécule comme potentiel candidat clinique pouvant entrer dans les phases de test de toxicité et de tolérance chez l’animal, est un long processus avec des coûts très importants. Ce programme consiste en une série d’études obligatoires comprenant notamment des tests de toxicité. Les épreuves de toxicité (tolérabilité) par administration réitérée ont pour objet de mettre en évidence les modifications physiologiques et anatomopathologiques consécutives aux administrations répétées d’un composé et d'établir les conditions de l'apparition de ces modifications en fonction de la posologie.
Bénéfices attendus
Les épreuves de toxicité (tolérabilité) par administration réitérée ont pour objet de mettre en évidence les modifications physiologiques et anatomopathologiques consécutives aux administrations répétées d’un composé et d'établir les conditions de l'apparition de ces modifications en fonction de la posologie.
Procédures
Les animaux recevront des molécules à visée thérapeutiques dans le but de déterminer leur tolérabilité (tous les jours de l'étude, par gavage, 15 secondes). Afin de déterminer les paramètres biologiques éventuellement impactés, un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie gazeuse (2 minutes maximum par prélèvement, 3 maximum par animal et par semaine), dans la limite des volumes autorisés par les instances éthiques nationales et europééennes. Les prélèvements d'organes auront lieu post mortem.
Impact sur les animaux
Par le choix des doses, il est attendu des effets indésirables sur les animaux du dernier groupe. Ils seront néanmoins surveillés quotidiennement afin de ne pas présenter de signes cliniques importants. Les gestes techniques réalisés (gavage, pesées) ne devraient pas impacter les animaux, ni leur imposer de souffrance.
Devenir
La mise à mort des animaux est nécessaire dans la mesure où les organes seront prélevés pour analyse histologique.
Remplacement
Les tests in vitro apportent des renseignements sur la toxicité potentielle des substances, mais ils ne sont pas encore suffisants pour éviter l'expérimentation sur l'animal entier avant l'administration à l'homme. Un composé qui réussit les premiers tests de sécurité et de toxicologie peut être pris en considération pour les études à doses répétées sur les animaux. Ces études apportent l'essentiel des informations fondamentales sur la façon dont le composé agit sur l'organisme. La relation entre la dose et la réaction de l'animal au composé est étudiée plus en détail et les organes ayant subi d'éventuels effets toxiques sont examinés. Ces premières informations sont essentielles pour évaluer la dose initiale sûre pour les essais cliniques chez l'Homme.
Réduction
Des tests in vitro sont réalisés au préalable afin de tester nos composés. Les données ADME des différents composés ainsi que leur profil pharmacocinétique seront obtenus avant le début des procédures. Nous ne testerons donc que les composés les plus puissants en pharmacologie primaire et ceux présentant les caractéristiques d’un potentiel futur médicament.
Raffinement
Afin de limiter le stress causé aux animaux, les composés testés seront administrés par voie orale. Cette technique est bien tolérée par les animaux, un volume maximal de 10mL/kg leur sera administré. Les tests statistiques qui seront utilisés seront les suivants : le test t de Student pour échantillons indépendants nous permettra de comparer l’efficacité de notre composé par rapport à un contrôle ou un test Mann-Whitney dans le cas où les échantillons ne suivent pas une loi normale. Dans le cas ou plusieurs molécules seraient testée dans la même étude alors un test one-way-Anova sera utilisé. Ces différents tests nous permettrons de démontrer l’efficacité de nos molécules par rapport à un contrôle ou encore un potentiel effet-dose. Un résultat sera jugé significatif si la p value < 0.05.
Choix des espèces
Selon les textes réglementaires, « les essais de toxicologie par administration réitérée devront être effectués sur deux espèces de mammifères dont l'une ne sera pas un rongeur ». Nous pouvons alors réaliser la première étude sur rongeur. Comme mentionné plus haut, l’espèce de rongeur sera choisie en fonction de la connaissance de la molécule, des études antérieures et préliminaires de PK et de métabolisme. Nous travaillerons avec des rats Sprague Dawley ou des souris C57Bl/6 (mâles et/ou femelles). Nous utiliserons des animaux adultes de 8 semaines environ. Il n’est pas justifié d’utiliser des animaux jeunes ou encore des animaux âgés. Il n’y a donc pas de nécessité d’ajuster des doses ou de prendre des dispositions particulières liées au jeune âge ou au contraire à l’âge avancé.
Programme d’immunisation de rats en vue de la production d’anticorps polyclonaux
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit huit injections d'antigène, souvent couplées à l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, un antigène différent empêchant selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable" et qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.
Procédures
Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux (20 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole
Raffinement
Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.
Choix des espèces
Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.