Tests réglementaires

60 souris génétiquement modifiées, rendues obèses et diabétiques, vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Hébergées seules pendant 78 jours, elles reçoivent un régime gras, un gavage quotidien pendant huit semaines, des mises à jeun répétées et des tests de tolérance au glucose et à l’insuline, avant une ponction cardiaque terminale, pour évaluer un composé anti-obésité pour le compte d’un laboratoire client. Le porteur situe la finalité du côté d’un dossier d’autorisation de mise sur le marché. Il affirme qu’aucune méthode de substitution ne permet d’étudier l’effet d’un composé sur le poids et le métabolisme et conclut au recours à la souris.

Objectifs

L’étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre du développement d'un composé d'intérêt thérapeutique, destinés à l’amélioration des troubles métaboliques, notamment l'obésité. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré que ce composé induit une perte de poids corporel associée à une diminution de prise alimentaire chez des souris obèses. L’objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l’impact à plus long terme de ce composé sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris génétiquement modifiées obèses et diabétiques.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché pour commercialiser un composé thérapeutique luttant contre l'obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une pesée trois fois par semaine sur une durée de 11 semaines - une administration orale quotidienne pendant 8 semaines - une mise à jeun de 4h pour un prélèvement sanguin à partir de la veine caudale (2 fois ; durée du prélèvement : 1-2 min) - une analyse de la composition corporelle de l'animal vigile (3 fois ; durée de la mesure : 1-2 min). - un test oral de tolérance au glucose (OGTT) (1 fois ; durée totale de l’OGTT : 16h) [Mise à jeun pendant 12-14h, Prélèvements sanguins (6 fois sur 2h ; 5min/prélèvement), Administration orale (durée : 1 min)] - un test de tolérance à l'insuline (ITT) (1 fois ; durée totale de l’ITT : 8h) [Mise à jeun pendant 6h, Prélèvements sanguins (6 fois sur 2h ; 5min/prélèvement), Injection intrapéritonéale (durée : 1 min)]

Impact sur les animaux

Les animaux seront hébergés individuellement sur l’ensemble de l’étude (78 jours). De par leur caractère social, ce type d’hébergement les prive de leur liberté d’expression d’un comportement normal de leur espèce. Le régime alimentaire riche en gras (71 jours) et l’obésité induite peuvent conduire à un inconfort sur les animaux. Les interventions ci-après peuvent constituer une source de stress sur l’animal. Le poids corporel [1 min] sera mesuré sur l’ensemble de l’étude, deux fois par semaine. De J22 à J28, l’ensemble des animaux recevront quotidiennement une administration orale [1 min] de véhicule afin de les habituer à cette voie d’administration. A J26, J50 et J70, une mesure de la composition corporelle sera mesurée sur animal vigile (durée de la mesure : 1-2min). A J26 et J50, à l’issue de l’analyse, les souris seront mises à jeun (atteinte à l’absence de faim) pendant 4h, et auront un prélèvement sanguin [5 min] pour mesurer leur glycémie et récupérer du plasma. A partir de J29, les animaux recevront une administration quotidienne [1-2 min] per os de leur composé d'intérêt ; ceci impliquerait potentiellement une perte de poids. A J58, les animaux seront mis à jeun toute la nuit (atteinte à l’absence de faim) et un test de tolérance au glucose [2h30] sera réalisée. Ceci consiste à mesurer la glycémie 30 min avant, et immédiatement avant (0 min) administration per os du glucose [1 min] puis 5 min, 20 min, 60 min, 90 min et 120 min après administration du glucose. Du plasma sera également récupéré pour mesurer l’insulinémie sera mesurée immédiatement avant (0 min) puis 20 et 60 minutes après administration du glucose. A J65, les animaux seront mis à jeun 6h (atteinte à l’absence de faim) et un test de tolérance à l’insuline sera réalisé [2h]. Ceci consiste à mesurer la glycémie immédiatement avant (0min) l'injection intrapéritonéale d'insuline [1 min] puis 15, 30, 45, 60 et 120min après administration de l'insuline. A J71, les souris seront mises à jeun pendant 4h (atteinte à l’absence de faim), pour mesurer leur glycémie [1min]. Après une anesthésie à l'aide d'un mélange kétamine/xylazine pouvant créer un inconfort, un prélèvement par ponction cardiaque sera réalisé. Une deuxième méthode de mise à mort par dislocation cervicale aura lieu pour s'assurer de la mort de l'animal. Ainsi, la durée de l’anesthésie avant sacrifice durera environ 15min.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements post-mortem sont nécessaires à l'étude afin de réaliser des analyses histologiques et biochimiques sur les tissus.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel, prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire, composition corporelle, glycémie à jeun, test de tolérance au glucose par voie orale, test de tolérance à l’insuline, poids des différents organes, analyses sur plasma.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisément l'impact du composé sur leur prise alimentaire individuelle. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dôme en carton et de briquettes en bois. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. A la fin du protocole, après une anesthésie à l'aide d'un mélange d'anesthésique/analgésique, un prélèvement sanguin par ponction cardiaque sera réalisé. Une deuxième méthode de mise à mort par dislocation cervicale aura lieu pour s'assurer de la mort de l'animal.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J nourris avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une polyarthrite leur est provoquée par une injection de collagène, puis ils reçoivent un anticorps trois fois par semaine pendant deux semaines, avant d'être tués pour prélever sang, rate, ganglions et une patte, afin de tester une immunothérapie contre la polyarthrite rhumatoïde. Le porteur indique que ce modèle entraîne une inflammation des articulations puis une atteinte du cartilage et des os. Il affirme que le produit n'a jamais provoqué d'effet dommageable chez le rat et que la phase préclinique sur l'animal est nécessaire avant un essai clinique.

Objectifs

L'objectif du projet est, dans un premier temps, d'identifier une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde ; puis de tester l'efficacité d'un traitement par injection d'anticorps anti-CD45RC et enfin d'optimiser ce protocle de traitement dans l'objectif finale de réaliser une étude pré-clinique chez le rat pouvant aboutir sur un essai clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait mettre en évidence le potentiel d'un nouveau traitement de la polyarthrite rhumatoïde et découler sur un essai clinique dont un grand nombre de patients pourrait bénéficier.

Procédures

Les animaux vont d'abord subir sous anesthésie une injection sous-cutanée au niveau de la base de la queue pour induire l'arthrite (10min de procédure de l'endormissement au réveil). Par la suite, les rats (vigiles) receveront un traitement par injection intrapéritonéale 3 fois par semaines pendant 2 semaines (pour chaque injection, 2min de procédure de la prise en contention à la fin de l'injection) . Deux fois au cours de la procédure, les animaux seront anesthésiés pour effectuer le prélèvement d'une petite quantité de sang dans la veine caudale après anesthésie locale (10min de procédure de l'endormissement au réveil).

Impact sur les animaux

Le modèle d'arthrite induite par injection de collagène chez le rat est déjà utilisé depuis plusieurs années. Celui-ci se caractérise par une inflammation des articulations avec, sur le long terme, une atteinte du cartilage, des os et l'installation d'une fibrose.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés pour permettre d'effectuer les différents prélèvement (sang, rate, ganglions et patte) et réaliser une analyse immunologique et anatomopathologique.

Remplacement

Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'étude pré-clinique réalisée chez l'animal lorsque le modèle expérimental existe. Le modèle d'arthrite induite par injection de collagène chez le rat reproduit les caractéristiques principales de la pathologie humaine. L'utilisation de celui-ci est nécessaire pour évaluer de manière exhaustive les effets ciblés, et potentiellement systémiques, du traitement sur les différents organes et fonctions de l'organisme.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet a été détermineé de manière à pouvoir effectuer différents tests statistiques qui pourront permettre d'obtenir des résultats significatifs pour conclure sur l'efficacité ou non du traitement. Par ailleurs, la réalisation d'une première étude pilote sur un faible nombre d'animaux permettra de s'assurer de l'intérêt et de la bio-sécurité du projet avant de faire entrer un plus grand nombre d'individus dans la procédure.

Raffinement

Avant même le début de la procédure les animaux seront entrainés à la contention de manière à ce que les injections répétés de traitement puissent se dérouler sans créer de stress supplémentaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les animaliers et les symptômes seront évalués 3 fois par semaine par les personnes responsables de la procédure. Les rats seront hébergés à plusieurs dans des cages dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (rouleau en carton, batôn de bois,...).

Choix des espèces

Le rat a été choisi car il est utilisé dans le modèle d'arthrite induite par injection de collagène depuis de nombreuses années. Ce modèle animal s'avère pertinent car il reproduit les caractéristiques principales de la pathologie humaine. De plus, nous avons déjà testé notre traitement dans d'autres modèles expérimentaux chez le rat, ainsi nous savons que notre produit n'a jamais induit d'effets dommageable chez cette espèce. Les rats seront utilisés au stade adulte (environ 8 semaines) qui est le stade le plus couramment utilisé pour le modèle d'arthrite induite par injection de collagène.

2040 rongeurs, 1440 souris et 600 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une intoxication au paracétamol leur est provoquée pour léser le foie, puis ils reçoivent un candidat médicament et jusqu'à cinq prélèvements de sang en une journée, avant d'être tués pour prélever leurs organes, afin de tester des traitements de l'insuffisance hépatique aiguë. Le porteur affirme que ces lésions du foie ne sont pas douloureuses et décrit une baisse d'activité et de température pendant au moins vingt-quatre heures. Il indique qu'aucune méthode de substitution ne modélise cette atteinte multi-organes et que l'animal est un passage obligatoire avant l'humain.

Objectifs

L’intoxication au paracétamol est la première cause d’insuffisance hépatique aigue (IHA) dans les pays industrialisés. Elle se traduit par une attaque brusque et massive du foie chez les patients. Il s’agit de situations d’urgence qui peuvent nécessiter une transplantation du foie dans les plus brefs délais. Le paracétamol est un composé chimique utilisé comme antalgique (anti-douleur) et antipyrétique (anti-fièvre), qui figure parmi les médicaments les plus utilisés et prescrits au monde. En cas de surdose, le paracétamol provoque une sévère toxicité pour le foie par la production d’une molécule toxique pouvant entrainer la mort des cellules du foie et donc une insuffisance hépatique aïgue (IHA). Aucun traitement efficace n'est actuellement disponible. Le but de ce projet est de tester le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules sur l'intoxication au paracétamol. Ainsi, la capacité de candidats médicaments à stopper ou ralentir l'atteinte du foie et/ou à favoriser sa guérison sera évaluée. Pour cela, le modèle d’hépatite induite par une exposition aigue au paracétamol chez le rongeur (souris et rat) sera utilisé.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la mise au point de nouveaux médicaments pour traiter l'insuffisance hépatique aïgue due une intoxication au paracétamol pour laquelle il n’existe pas de réelles solutions thérapeutiques, hormis chirurgicales à ce jour.

Procédures

Les animaux de ce projet subiront : -Une administration d'acetaminophène (APAP) à dose contrôlée par voie intrapéritonéale, intraveineuse ou orale (1 fois/animal) -Une administration du candidat médicament en une ou plusieurs administrations (1 fois /animal) -Une série de prélèvement de sang (maximum 5 prélèvements /24h) en respectant les recommandations du NC3R’s pour les volumes. -La mise à mort avec ou sans anesthésie préalable en fonction des prélèvements terminaux à effectuer. Ces interventions auront toutes une durée maximum de 2 min.

Impact sur les animaux

L'administration d'APAP entraine des lésions du foie chez l'animal. Ces lésions du foie ne sont pas douloureuses (pas de signes de douleur chez l'animal et documenté chez l'Homme). Une hypoactivité associée à une hypothermie pourra être observée dans les 2h suivant l'administration d'APAP et se poursuivre pendant au moins 24h. Ces signes cliniques sont la conséquence des effets antipyrétique (anti-fièvre) et analgésique (anti-douleur) de l'APAP. Les candidats médicaments qui seront testés devraient théoriquement améliorer l'état de santé des animaux. Toutefois, les effets potentiellement indésirables du/des candidats médicament font l’objet d’échange avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin d'anticiper au mieux de potentiels signes cliniques.

Devenir

Mise à mort des animaux pour réaliser des prélèvements d’organes.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur l'hépatite aigüe due à une intoxication au paracétamol. Cette pathologie est un processus complexe faisant intervenir différents organes de l'organisme et n'est donc pas modélisable in vitro ou in silico. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris et le rat sont les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques adaptées. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 7-12 par groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi régulier de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.

Choix des espèces

Le rongeur (souris et rat) est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur l'insuffisance hépatique aigüe due à une intoxication au paracétamol. Cette espèce permet en effet de modéliser ce qui se passe dans une pathologie sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cette espèce. Elle permet d’étudier les phénomènes en cinétique de la physiopathologie et de tester l’effet de candidats médicaments sur la prévention et/ou la thérapie de la pathologie. Les études sont réalisées sur des animaux adultes car elles nécessitent des animaux avec une fonction hépatique normale (mature) et ont pour but de traiter une pathologie qui affecte surtout des adultes.

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du foie, par injection simple ou par chirurgie dans le foie, la rate ou la veine porte, puis des traitements testés et un suivi par imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que le développement de la tumeur peut entraîner des effets délétères encadrés par des points limites, les animaux étant tués pour prélever organes et fluides. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico n'évalue un médicament sur le cancer du foie et que l'animal reste un "passage obligatoire" avant l'humain.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments dans des modèles murins pertinents de cancer du foie. Ces modèles devant être représentatifs des tumeurs humaines et permettre d’évaluer au mieux l’effet bénéfique de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que les stratégies thérapeutiques testées sont actives dans un modèle expérimental et également d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques. Ainsi, à long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les cancers hépatiques, une pathologie humaine touchant plus de 10 000 personnes par an en France.

Procédures

Les animaux recevront 1 greffe de cellules tumorales soit par voie peu invasive (sc, ip, iv - durée max 1 min) soit par chirurgie (injection dans le foie, la veine prote ou encore la rate - durée de la chirurgie estimé à 5-10 min). Dès lors, des essais de traitements seront menés Le schéma thérapeutique sera adapté en fonction de la nature du traitement testé. En cas de prélèvement de sang ceux-ci seront réalisés sous anesthésie et limités à 1 par semaine et à un volume

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères. Dans ce contexte, la mise en place de points limites adaptés permettra de détecter ces signes au plus tôt et donc de garantir le bien-être animal. De même, l’utilisation de traitement novateur pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Encore une fois, la mise en place de points limites adaptés permettra de détecter les signes de mal être au plus tôt et donc de pouvoir agir rapidement et ainsi de garantir le bien-être animal. Les procédures chirurgicales d’implantation intrahépatique, intrasplénique et veine porte repose sur la mise en place de protocoles chirurgicaux incluant une analgésie maitrisée ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum. Après récupération, les animaux sont maintenus en groupe sociaux pour améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies. L'ensemble des mesures décrites ci-dessus permet donc de réduire les contraintes potentielles pour l’animal à leur minimum.

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués le développement de la tumeur ou encore par le produit / modèle chez les animaux

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le cancer du foie. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 6 à 10 / par groupe en fonction de l’effet thérapeutique attendu.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse,

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement .

39 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections d'un antibiotique, le méropénème, puis un prélèvement sanguin par ponction intracardiaque sous anesthésie, suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale, pour reconstituer la courbe pharmacocinétique du produit. Le porteur indique que la dose n'est pas toxique et qu'une souris montrant une douleur intense lors de la ponction serait tuée immédiatement. Il affirme que le recours à l'animal est une étape "obligatoire et réglementaire" du développement des médicaments.

Objectifs

L’objectif du projet est de caractériser la pharmacocinétique sanguine du méropénème sur une période de 5h post-injection, après deux administrations intra-péritonéales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de reconstruire la courbe pharmacocinétique du méropénème sur 24h chez la souris et ainsi d’adapter les fréquences d’administration dans un modèle de pneumonie à CRAb. En effet, la suite cette étude (qui fera l’objet d’un autre projet) sera d’évaluer l’efficacité du méropénème en association avec la rifampicine qui a déjà montré une diminution bactérienne dans les poumons de souris infectées à CRAb dans d’autres études.

Procédures

L’injection du méropénème se fera par voie intra péritonéale par du personnel expérimenté. La dose administrée est non toxique pour les animaux. Les souris seront ensuite soumises à un prélèvement intracardiaque sous anesthésie fixe (kétamine 50mg/kg + xylazine 10mg/kg). La profondeur de l’anesthésie est vérifiée par pression des voutes plantaires. Malgré tout, si l’animal présente un signe de douleur intense lors de la ponction cardiaque (ex : l’animal se recroqueville sur lui-même lors de l’injection), alors il sera mis à mort immédiatement par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Après l’injection du méropénème, les animaux seront observés sur la totalité de l’étude (jusqu’à 5h). Par ailleurs, il s’agit d’une inoculation sans infection et d’une dose non toxique. Les prélèvements sanguins par ponction intracardiaque auront lieu sous anesthésie fixe de kétamine (50 mg/kg) et xylazine (10mg/kg), administrée par voie IP. La méthode de mise à mort sera appliquée par dislocation cervicale après exsanguination par une ponction cardiaque.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort 5h après le début de l’expérience

Remplacement

Dernièrement, des études in vitro et in vivo ont démontré une activité intéressante de la rifampicine chez Acinetobacter baumannii multi résistants (en fonction des résistances). Or, cet antibiotique ne peut être administré en monothérapie à cause de la sélection de mutants qu’il génère. Une des dernières lignées thérapeutiques serait de l’associer à un carbapénème (ici le méropénème) pour lutter contre ces infections à CRAb. La mesure de l’efficacité de ces molécules ne peut se faire sans avoir recours au modèle animal ce d’autant que certains échecs de traitement ne peuvent être anticipés autrement. Pour l’heure, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux hypothèses et permettre une analyse statistique robuste a été réduit à 3 par groupe grâce à l’expérience acquise lors d’études précédentes.

Raffinement

Un gros travail bibliographique a été réalisé en amont de cette étude afin de s’assurer que la dose utilisée ne soit pas toxique pour les animaux. Il s’agira d’une étude sans infection où aucune toxicité n’est attendue. De plus un enrichissement du milieu (jouets en plastique, igloos en carton) sera utilisé et une surveillance accrue sera également réalisée pour cette étude. Des critères d’arrêts de l’étude ont été définis afin d’assurer le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Les souris Balb/c représentent classiquement un des modèles de choix pour l’évaluation de la pharmacocinétique. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée pour la mise au point du modèle d’infection pulmonaire à Acinetobacter baumannii dans d’autres projets. Souris de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel d’environ 20-22g (même poids que pour les précédentes études).

6 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur œil est exposé à un laser d'imagerie dont la puissance dépasse d'un facteur dix la norme au niveau de la cornée, le porteur indiquant que des ulcères, des lésions ou une cataracte peuvent apparaître, puis ils sont tués pour analyse histologique des tissus oculaires. L'objet est de vérifier l'innocuité d'un dispositif développé par une entreprise avant un éventuel passage chez l'humain. Le porteur affirme que ce test doit "obligatoirement" être mené in vivo, aucun modèle ex vivo ne pouvant reproduire l'œil.

Objectifs

Une startup française a développé une technologie de tomographie à cohérence optique (OCT) permettant d'effectuer des images proches de l'histologie classique ou des images du type confocale. Ces observations peuvent être compilées sous forme de stack permettant une reconstruction 3D du tissu en haute définition. Cette technologie est un excellent outil de diagnostic dermatologique et pourrait apporter les mêmes avantages en ophtalmologie, surtout dans le domaine des tissus de la surface oculaire. L'utilisation de cet OCT sur l'oeil pour des observations ne doit pas avoir d'effets indésirables sur les tissus de l'oeil. Des calculs de normes portent à penser que la rétine ne subira aucun dommage lors de l'imagerie de la cornée. La présente étude propose ainsi d'évaluer l'innocuité sur les tissus oculaires de cette nouvelle technologie d'OCT lors de l'imagerie de la cornée. Sera étudiée, à court terme, l'apparition d'œdème cornéen, de cataracte et de modifications rétiniennes.

Bénéfices attendus

Le projet permettrait de connaître la sécurité de cette nouvelle technologie d'OCT comme outil de diagnostic clinique des atteintes des tissus de la surface oculaire proche d'une étude histologique. Avec les résultats de ce projet, l'entreprise développant ce dispositif pourra alors se tourner vers une étude clinique (si les résultats ne montrent pas d'effets délétères) et in fine la rédaction de dossiers pour autorisation par les instances de santé. Si des atteintes rétiniennes venaient à être observées, des atteintes de la vision sont possibles et par conséquent un éventuel stress pouvant se traduire par une perte de poids (supérieure ou égale à 10% en 3 jours) ; des perturbations comportementales graves et persistantes comme la piloérection, dos voûté, prostration, isolement, agressivité à l'ouverture de la cage et des perturbations graves et persistantes liées au système digestif (marqueur de stress chez le lapin)comme la constipation (absence de fèces), selles liquides.

Procédures

Les animaux seront soumis à de l'imagerie ophtalmologique contact et sans contact avec l'œil sous sédation. Ces imageries de suivi seront faites 4 fois : à J0 (x2 + imagerie avec la nouvelle technique d'OCT), J2 et J7 pour le groupe 1 ou J0 préop post, J2 et J21 pour le groupe 2. La durée de chaque observation de suivi dure environ 45 minutes. L'imagerie avec la nouvelle technologie OCT (docking + imagerie) durera 10 minutes.

Impact sur les animaux

L'éclairement du laser du LC OCT est de 0.82 mW/cm² au niveau de la cornée, 0.02 W/cm² au niveau de la rétine. En prenant en compte la norme ISO 15004-2, il a été déterminé que cela dépassait d'un facteur 10 la limitation en éclairement au niveau de la cornée, mais pour l'éclairement de la rétine la puissance est très inférieure à la limitation (inférieur à la limite d'éclairement d'un facteur 35).Au vu de ces données il est attendu aucun problème sur la rétine de l'animal, mais il est possible qu'une atteinte des tissus cornéens soit à prévoir (ulcères épithéliaux, lésions de la couche endothéliale). De plus, le système de mesure se fait en contact avec la cornée via une lame de verre. Il est donc possible, là aussi, que nous ayons des atteintes du tissu cornéen. Cette étude est justement faite pour se rendre compte de la présence de ces atteintes avec des paramètres de laser au-dessus de la norme. Le cristallin pourrait aussi être atteint par effet thermique (cataracte).

Devenir

En fin de procédure les animaux seront mis à mort pour étude histologique des tissus oculaires.

Remplacement

Ce nombre doit OBLIGATOIREMENT ÊTRE MIS EN ŒUVRE IN VIVO avant de pouvoir utiliser pour la première fois cet LC-OCT chez l’Humain. Aucun dispositif ex vivo ou in silico ne peut remplacer la complexité de l'organisation de l'oeil et de ses composants, ainsi que la réponse à un passage d'un laser potentiellement néfaste pour les tissus oculaire. L'effet cataractogène peut se déclarer 1 à 2 semaines après le passage du laser.

Réduction

Il a été jugé que le nombre minimum, mais suffisant d’animaux était de 3 lapins par groupe pour prendre en compte les différences interindividuelles pour ce type d'imagerie indolore.

Raffinement

Les animaux arriveront au moins une semaine (7 jours) avant toute manipulation. Tout est mis en œuvre pour LIMITER AU MAXIMUM LE STRESS ET LA DOULEUR DE L’ANIMAL (séfdation pendant les observations). Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérer grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie). Par ailleurs, les lapins sont hébergés en cage règlementaire pouvant communiquer entre elles ; dans un environnement enrichi (jouet kong et autres jeux). Enfin, l'eau et la nourriture (granules et foin) sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux. Toutes les techniques d'imagerie de suivi in vivo se font sans contact avec l'oeil et sans docking. Seul l'observation avec l'OCT en contact avec l'oeil. Toutes les observations se feront sous anesthésie générale et l'OCT sera effectué sous AG + anesthésie locale. La mise à mort de l'animal est faite sous anesthésie générale

Choix des espèces

D'un point de vue éthique et pratique, les lapins sont les seuls animaux communément utilisés en expérimentation animale et présentant une anatomie oculaire proche de l'homme. Pour que l'observation soit représentative de ce qu’il puisse être chez l’homme dans le futur, la chambre antérieure de l’œil de l’animal ne doit pas être trop petite. C’est pour cela que nous optons pour des lapins âgés d’environ 3 mois (12 semaines).