Toxicologie et autres tests de sécurité

1500 souris et 450 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des administrations répétées de composés chimiques ou biologiques par diverses voies, avec des prélèvements sanguins pouvant atteindre 20 % du volume circulant et jusqu'à une vingtaine d'interventions par semaine, pour évaluer la toxicité de candidats médicaments sur des rongeurs génétiquement modifiés au niveau du système immunitaire. Le porteur indique que les effets attendus vont de la perte de poids aux atteintes rénales, hépatiques ou immunitaires liées à la souche et au produit testé. Il affirme que ces études réglementaires "nécessitent encore" l'animal et ne peuvent pas être réalisées in vitro.

Objectifs

Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier, en recherchant/vérifiant les homologies avec l'homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce). Ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, de bien choisir les doses dans les premières études règlementaires, et peuvent également être des études règlementaires. Elles peuvent permettre de comprendre grâce à des investigations perfectionnées les mécanismes de toxicité (toxicité rénale, hépatique, testiculaire...) ou les profils d’immunotoxicité, afin d'établir la pertinence de ces effets observés chez le rongeur en comparaison avec l'humain, avec pour objectif d'assurer la santé des patients humains. Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans une espèce rongeur. L'efficacité d'un composé peut également être testée sur un modèle pathologique ou un animal transgénique, ici des animaux génétiquement altérés au niveau du système immunitaire. Il est attendu d'utiliser en moyenne 30 rats ou 50 souris par étude et de réaliser jusqu'à 15 études rat et 30 études souris sur la durée du projet (soit environ 3 études rat/an et 6 études souris/an).

Bénéfices attendus

Le développement de composés pharmaceutiques ou chimiques requiert des explorations in vivo chez le rongeur ainsi que des études réglementaires à proprement parler. Ces études peuvent être demandées par les autorités réglementaires, pour affiner ou mettre en place des conditions expérimentales, ou pour répondre à des questions de sécurité, ou pour explorer les mécanismes d’action. Ces études peuvent donc servir à affiner les expériences en amont des études réglementaires qui devront être réalisées par la suite, en permettant de limiter le nombre global d'animaux utilisés dans le développement d'un produit. Elles peuvent aussi directement contribuer à assurer la sécurité non-clinique des médicaments en comprenant mieux leurs mécanismes.

Procédures

Les animaux sont traités, par différentes voies (principalement orale et injection intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse) de façon journalière ou hebdomadaire (ex : composés biologiques), avec le produit d’intérêt. La durée des administrations est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 30 minutes maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses chez le rat. La durée des études peut être courte (un jour) ou longue [en général de 1, 3 ou 6 mois pour les études règlementaires].. Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur : -Prélèvements multiples: -jusqu’ à 7,5% du sang total circulant peut être prélevé en 24h sans récupération - jusqu’ à 10% du sang total circulant peut être prélevé en 24h avec 7 jours de récupération - jusqu’ à 15% du sang total circulant peut être prélevé en 24h avec 2 semaines de récupération - jusqu’ à 20% du sang total circulant peut être prélevé en 24h avec 3 semaines de récupération -Prélèvement unique: maximum 15% du volume sanguin circulant Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min).. Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse, n’excédant pas 18h est aussi possible.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent : - au phénotype dommageable de la souche utilisée (ex : sensibilité aux infections opportunistes...) ; - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), à l’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée) ; - aux effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) qui peuvent être observés.

Devenir

Les études de toxicologie incluent souvent une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus. De plus, les animaux ayant un phénotype dommageable pendant les études ou bien se développant avec l’âge, aucun animal ne sera gardé à l’issue de ces études.

Remplacement

L’évaluation de la toxicité de candidats médicaments selon les règlementations en vigueur nécessite encore l’utilisation d’animaux, et ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro. Il n’existe pas encore de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité des organismes vivants, et en particulier des réponses immunitaires. De plus, certaines études ne peuvent pas être réalisées dans des souches sauvages ou transgéniques à phénotype non- dommageable qui ne sont pas adaptées à la recherche de mécanismes d’action ou d’un effet toxique spécifique (ex : immunotoxicité…). Un animal transgénique ou exprimant certaines caractéristiques ou déficiences dans le système immunitaire représente parfois un meilleur modèle pour l’évaluation d’un produit.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude: un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses de toxico-/pharmacocinétique ou pharmacodynamie, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, nombre de doses testées, criblage de plusieurs produits, etc. Pour les études à objectif règlementaire, le nombre d’animaux est précisé dans les lignes directrices correspondantes. En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés...) et que la douleur ne peut pas être suffisamment limitée à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Prélèvements sanguins : Des techniques de prélèvement (ex : veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire...) sont utilisées quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements peuvent être réalisés sous anesthésie pour éviter stress, douleur ou inconfort, comme par exemple les administrations intramusculaire, intra-articulaire ou intra-vésicale Les animaux sont hébergés conformément à la Directive 2010/63 avec enrichissements. En général l’hébergement est groupé mais peut être individuel si un protocole expérimental particulier le requiert ou si des problèmes de comportements antisociaux sont anticipés chez certains animaux (notamment les souris mâles âgées de plus de 6 semaines); dans ce cas, ce choix devra être dûment argumenté. Des portoirs ventilés pourront être utilisés selon le phénotype dommageable, le cas échéant après avis du vétérinaire sanitaire.

Choix des espèces

Le choix du rongeur est justifié par : - les objectifs de l’étude : disponibilité d’un modèle de maladie, rongeurs utilisés pour d’autres études précliniques, présence du récepteur pour le composé, données de pharmacocinétique, pharmacodynamie, modèle de déficience dans un gène ou d’un mécanisme d’intérêt, - la comparaison possible avec d’autres études dans ces espèces, - la quantité de données disponibles sur la souche, - des aspects pratiques de manipulation, - sa place dans la phylogénie (l'utilisation de rongeurs sera privilégiée, en première intention, plutôt que celle du chien, du porc ou du primate). Les animaux ont en général 6 à 8 semaines d’âge en début de traitement, correspondant à un âge de croissance, selon les recommandations générales de la règlementation. L’âge peut varier en fonction des objectifs de l’étude (par exemple animaux juvéniles de moins de 6 semaines, matures de plus de 8 semaines, âgés...).

150 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés dans d'autres projets puis proposés à l'adoption. Ils reçoivent un candidat médicament par des voies variées, parfois par endoscopie sous anesthésie d'une heure, avec jusqu'à neuf prélèvements sanguins et des séjours de 24 à 48 heures en cage à métabolisme pour recueillir leurs urines. Le porteur indique un stress lié au jeûne et à l'isolement et une douleur équivalente à une piqûre. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'évaluer la pharmacocinétique et décrit le chien comme l'espèce la plus adaptée.

Objectifs

Le projet consiste à évaluer le profil pharmacocinétique d'un candidat médicament chez le chien grâce à des prélèvements, répétés dans le temps, d'échantillons sanguins et/ou d'urine après administration du produit à tester. Le but est de mesurer la concentration plasmatique et/ou urinaire du produit et/ou de ses métabolites, et d'éventuels marqueurs biologiques après administration.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Du fait de la cible thérapeutique, ces composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques sur l’espèce utilisée (Chien) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les animaux seront administrés avec les composés à tester par différentes voies (orale, intrapéritonéale, sous-cutanée, transdermique, intramusculaire ou intraveineuse) avec -2 min par administration. Les produits pourront également être administrés par endoscopie, dans ce cas les animaux seront soumis à une anesthésie d'environ 1h. Des prélèvements de sang seront réalisés sur l’animal vigile au niveau de la veine céphalique, veine saphène ou veine jugulaire (2 minutes par prélèvement). Ces prélèvements seront en général de 1 à 2 mL, avec un maximum de 9 prélèvements et/ou dans la limite de 20% du volume sanguin total sur 24h. Les animaux pourront éventuellement être mis à jeun la veille de l’administration pour une durée qui est fonction du produit testé. Pour les recueils urinaires, les animaux seront placés en cage à métabolisme sur une durée de 24h en général qui peut être augmenté jusqu’au 48h au maximum.

Impact sur les animaux

Les chiens de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture avant administration du produit, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration et de l'anesthésie, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme (24h à 48h) pour la collecte d’urine et une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins. Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Ils font donc l’objet d’échange avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observation des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques.

Devenir

Réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire. Lorsque les animaux ne peuvent pas être reutilisés (4 à 5 ans après leur arrivée), ils pourront être mis à l'adoption ( généralement via le GRAAL) si leur état de santé le permet.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le chien car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer la pharmacocinétique d’une nouvelle molécule. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le chien est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’etudier le devenir des médicaments dans l'organisme (analyses pharmacocinétiques). Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse pharmacocinétique : 3 à 6 animaux par groupe. Pour des études exploratoires, un nombre inférieur d’animaux pourra être utilisé. Cependant, une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Le chien est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour la réalisation d’études de pharmacocinétique permettant d’étudier le devenir (absorption, distribution, métabolisation, élimination), d’un produit testé, dans le sang et/ou les urines (lorsque le chien est utilisé au cours du développement préclinique de ce produit). Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

72 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de l'oreille interne d'une à deux heures sous anesthésie, une injection de vecteur viral, des prises de sang et des prélèvements de liquide cérébrospinal, pour tester une thérapie génique de la surdité avant un passage chez l'Homme. Le porteur indique des effets possibles comme une perte d'équilibre et un nystagmus transitoires, et décrit ce projet comme "indispensable" au dossier réglementaire de première administration humaine. Il affirme que la souris ne permet pas cette translation et conclut à la "nécessité" du primate.

Objectifs

Le projet est réalisé pour vérifier et optimiser la transduction du vecteur viral (soit le composé d’intérêt de la thérapie génique développée), d’en évaluer l’impact sur la fonction auditive ainsi que sa sécurité chez le PNH afin de préparer, chez l’Homme, la restauration de la fonction auditive, en cas de surdité profonde héréditaire, à l’aide du vecteur précédemment sélectionné. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme et fait partie des dossiers présentés aux autorités.

Bénéfices attendus

Suite à ce projet, le traitement pourra être testé en clinique, avec l’objectif ultime de palier la surdité tout en préservant la structure de l’oreille interne, laissant ainsi la possibilité pour le patient d’avoir ultérieurement un autre traitement tel que la pose d’un impant cochléaire par exemple.

Procédures

Chirurgie : sur animaux sous anesthésie générale, tous les animaux de l’étude, selon les protocoles d’usage vétérinaire. Considérant que la procédure chirurgicale commence avec l’anesthésie de l’animal et se termine au réveil de l’animal, la durée de chirurgie est estimée entre 1 heure (traitement unilatéral) et 2 heures (traitement bi-latéral). Prises de sang : sur animal vigile, tous les animaux de l’étude, contention manuelle, nombre de prélèvements selon les études mais toujours 1) dans le respect du volume maximal prélevable et 2) avec un temps de récupération des animaux entre 2 prises de sang. Les prises de sang, incluant la durée de contention de l’animal, sont de courte durée (environ 1 à 2 minutes) Liquide de l’oreille, liquide cerebrospinal : sur animal sous anesthésie générale ou à la nécropsie, tous les animaux de l’étude, 1 prélèvement par occasion, au maximum 2 occasions par animal (à la chirurgie et à la nécropsie)

Impact sur les animaux

Les nuisances correspondent essentiellement à la chirurgie et aux conséquences de la chirurgie. Suite à la chirurgie, et selon sa durée (si traitement uni- ou bi-latéral, durée entre 1h et 2h), les animaux peuvent présenter une phase de réveil plus ou moins longue (variabilité inter individuelle), toujours sous surveillance étroite des techniciens et l’appui des vétérinaires. Il est possible qu’après la chirurgie, les animaux présentent une baisse légère et ponctuelle de leur prise alimentaire et de leur poids. Les effets indésirables potentiels sont une perte d’équilibre et/ou un nystagmus (mouvement d'oscillation involontaire et saccadé du globe oculaire) transitoire(s). Dans tous les cas, une analgésie et une surveillance péri-opératoire sont mis en place (ex : les animaux sont suivis quotidiennement avec plusieurs examens quotidiens sur au moins 10 jours post-chirurgie avec contrôle vétérinaire).

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés pour permettre la collecte de tissus, fluides pour évaluer la toxicité du test item, la biodistribution du test item.

Remplacement

Il n'existe pas de système in vitro à l'heure actuelle pour la validation de l’efficacité et de la sécurité de la transduction des différents sérotypes de vecteurs viraux présélectionnés dans le modèle murin. Nécessité d’optimiser la chirurgie, la dose et le sérotype viral chez le PNH afin de pouvoir ensuite transférer cette stratégie à l’humain.

Réduction

Le nombre d'animaux est estimé en fonction de la variation attendue concernant les différents paramètres explorés : transduction du vecteur dans les cellules ciliées, modification des seuils en PEA. Cette estimation du nombre a été déterminée pour permettre la détection d'une différence de 10% minimum de transduction virale entre les cellules ciliées des cochlées et pouvoir détecter une éventuelle variation de 10 dB à deux fréquences sur les PEA des oreilles injectées et non injectées afin de vérifier l'absence d'effets indésirables de la technique et/ou du virus pouvant causer une perte de l'audition. Les tests statistiques seront choisis en fonction des paramètres comparés. Cette procédure permet d'optimiser le nombre d'animaux utilisés dans chaque série, soit en utilisant les deux oreilles avec une condition différente pour chacune, soit en utilisant à chaque fois l'oreille controlatérale comme témoin expérimental.

Raffinement

Pendant la phase pré-opératoire et de réveil et ensuite pendant au moins 10 jours après la chirurgie, sont surveillés étroitement : l’activité et la mobilité dans les volières des animaux, les interactions sociales et les expressions faciales, l’apparence physique (aspect de la fourrure traduisant les phases de toilettage entre congénères, poils drus), les éventuels écoulements nasaux et/ou oculaires, les postures inhabituelles, la réponse aux stimuli, la consommation alimentaire, le poids, le clignement des yeux/mobilité des paupières (signes cliniques de paralysie faciale, en raison de la chirurgie intracochléaire), par les techniciens avec l’appui des vétérinaires. A chaque paramètre évalué est associé un score de sévérité. La somme permet de définir un score total. Selon le résultat, le vétérinaire est consulté pour mise en place des soins pour soulager l’animal (ex. traitement anti-inflammatoire). Par exemple, en cas de dessèchement de l’oeil, une pommade (Ocrygel ou équivalent) sera utilisée. Egalement, suite à la chirurgie, des rations additionnelles de fruits et de légumes peuvent être proposées aux animaux pour favoriser la prise alimentaire dès 24 heures après la chirurgie afin d’éviter la perte de poids, et les animaux peuvent être regroupés dès leur réveil complet après chirurgie pour permettre les interactions physiques entre congénères et favoriser le retour au comportement physiologique, dont la consommation de fruits/légumes. S’ajoute également le suivi quotidien de la fréquence cardiaque et de la température corporelle sur ces 10 jours (et plus si l’état de l’animal l’exige). Afin de limiter la douleur et la souffrance des animaux, toutes les interventions chirurgicales sur les animaux se feront sous anesthésie générale, renforcée par des compléments analgésiques et antiinflammatoires appropriés, selon les procédures vétérinaires approuvées. Leur état de santé sera surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites, qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a signe d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux.Les animaux seront hébergés au minimum par deux et un programme d'enrichissement adapté est mis en place tout au long de l'étude.

Choix des espèces

Les études préalables menées chez la souris ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’Homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une organisation de l’oreille comparable à celle de l’Homme. Le choix de macaca fascicularis est justifié par le fait que l’on trouve dans cette espèce une organisation du système auditif, une dimension et une structure de l’oreille moyenne et interne comparable à celles de l’Homme. Des études préalables ont également mis en évidence une différence morphologique critique entre l’oreille moyenne de souris et celle de macaque. Seuls ces derniers présentent une structure de la fenêtre ovale similaire à ce que l’on retrouve chez l’Homme (absence d’artère stapédienne qui existe chez la souris) et permet de rendre possible la translation de la technique d’injection locale dans l’oreille interne à l'Homme. Animaux (2 à 6 ans). La nécessité de travailler avec des animaux de cet âge est de pouvoir avoir un système auditif bien développé au moment de l’étude.

30 bovins, veaux et génisses, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent deux vaccinations intramusculaires, sept prises de sang et trois prélèvements par poche, puis des écouvillonnages nasaux, pour tester un candidat vaccin contre le virus respiratoire syncytial bovin. À la fin, tous sont tués pour prélever des tissus lymphoïdes et du sang. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro pour évaluer la réponse vaccinale et relie l'intérêt du projet à la réduction des antibiotiques en élevage.

Objectifs

La vaccination contre le virus respiratoire syncycial (VRS) bovin a été identifiée comme une priorité en élevage en raison de la prévalence de cette infection virale (qui touche les veaux dans leur première année) et de la morbidité et mortalité qu’elle occasionne. De plus, le VRS bovin peut favoriser la survenue de surinfections bactériennes et pour prévenir ce risque, les éleveurs traitent fréquemment avec des antibiotiques dès l’apparition de troubles respiratoires dans leur troupeau. Un vaccin efficace dès le plus jeune âge en élevage aura un impact fort sur la santé et le bien-être des veaux. Un enjeu majeur de la vaccination contre le VRS chez le veau est d’induire une immunité protectrice dans les premières semaines de vie, en présence des anticorps d’origine maternelle (acquis par la buvée du colostrum). Notre candidat vaccin est une protéine virale, la protéine de fusion F, produite in vitro sous une forme stabilisée dite préfusion (preF). Un candidat vaccin similaire est également en cours de développement pour protéger contre le virus respiratoire syncytial humain responsable des bronchiolites infantiles. Or il a été montré chez l’homme que les déterminants antigéniques portés par cette protéine preF qui sont reconnus par les anticorps neutralisant l’infection virale, diffèrent entre les nouveau-nés (0-2 mois) et les enfants plus âgés (6 mois et au-delà). Pour les bovins, nous avons déjà fait la preuve de l’efficacité du vaccin preF pour protéger contre l’infection virale après une seule administration par voie intramusculaire avec un adjuvant vétérinaire classique. Le projet actuel a pour premier objectif d’identifier les déterminants antigéniques qui sont dominants en réponse au vaccin preF chez les veaux de 2-3 semaines et qui sont mineurs chez les veaux plus âgés (6-9 mois). Notre deuxième objectif est de concevoir un nouveau candidat vaccin ne comportant que ces déterminants antigéniques dominants en période néonatale puis de l’évaluer chez des veaux de 1 mois pour son efficacité meilleure par comparaison avec preF en présence des anticorps d’origine maternelle.

Bénéfices attendus

- Un vaccin efficace contre le VRS dès le plus jeune âge en élevage aura un impact fort sur la santé et le bien-être des veaux qui sont fortement affectés par des infections respiratoires. Un vaccin efficace réduira l’utilisation des traitements antibiotiques par les éleveurs lorsque des troubles respiratoires apparaissent dans leur troupeau et que les éleveurs veulent prévenir le risque de sur-infections bactériennes. - Comprendre comment élaborer des vaccins efficaces dans la période néonatale en présence des anticorps d’origine maternelle est une avancée majeure en vaccination pour les animaux d’élevage, de compagnie et aussi pour le nourrisson.

Procédures

Les 30 animaux du projet seront soumis aux 3 gestes techniques suivants : 1) Vaccination 2 fois en intramusculaire J0 et J30 post-vaccination et moins de 5 minutes par animal. 2) Prise de sang/poche : 7 prises de sang une fois par semaine en moyenne et 3 poches de sang à 20 jours d'intervalle entre 5 à 10 minutes par animal. 3) Ecouvillonage nasal non invasif et moins de 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les vaccins évalués dans ce projet sont de type protéique sous-unitaire (inerte, non réplicatif) et adjuvés avec un adjuvant vétérinaire classiquement utilisé pour les bovins. De ce fait les réactions locale et systémique attendues sont faibles (évenutellement douleur locale et fièvre), et la durée de la phase inflammatoire sera limitée à quelques heures. Il est possible que cette zone soit douloureuse localement dans les 24 à 48 heures. Une réaction cliniquement détectable de plus de 24 h entrainerait la mise en place d’un traitement anti-inflammatoire. La contention de l’animal pour les prises de sang engendre du stress et que la prise de sang peut également engendrer un hématome.

Devenir

Tous les animaux (n = 30) seront mis à mort à la fin de l’étude. Des tissus lymphoides seront prélevés et des poches de sang pour collecter pour récupérer les cellules immunitares.

Remplacement

Il n'a pas de modèles in vitro alternatifs pour évaluer la réponse vaccinale.

Réduction

Des effectifs de 5 génisses de 6-9 mois et 5 veaux mâles ou/et femelles de 3-4 semaines seront suffisants pour isoler des lymphocytes B du sang ou des ganglions en réponse à la vaccination. Des expériences antérieures nous ont en effet permis de valider la quantité d’antigène preF, l’adjuvant et la voie de vaccination pour générer des réponses anticorps robustes. Trois individus dans chaque groupe avec les réponses les plus fortes seront sélectionnées pour l’analyse des répertoires. Ce sont également nos données antérieures qui nous ont permis de déterminer le n=5 par groupe de veaux de 2-3 semaines pour avoir des comparaisons statistiquement significatives. Ce nombre d’animaux permettra de réaliser des tests statistiques non paramétriques. Les bovins pourront recevoir un traitement si nécessaire lors de la vaccination car il y a un risque de réponse inflammatoire locale modérée avec une légère fièvre pendant 24h.

Raffinement

Les bovins sont hébergés en groupe dans une animalerie conventionnelle fermée, avec un environnement enrichi (pierre de sel, brosse, paille, aire d’exercice). Cependant les animaux sont suivis plusieurs fois par jour (enrichissement social) pour détecter les signes cliniques précoces et afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites. Les bovins pourront être traités avec des anti-inflammatoires ou des antalgiques en cas de réaction à la vaccination. Une réaction cliniquement détectable de plus de 24 h entrainerait la mise en place d’un traitement anti-inflammatoire à base de méloxicam (voie sous-cutanée), éventuellement répétée après 48h. Il sera mis en place une récompense positive, type céréales ou boucons de paille, après chaque prise de sang.

Choix des espèces

Le bovin est l'hôte naturel du virus respiratoire syncytial bovin et le veau doit être protégé par la vaccination. Veaux de 2-4 semaines : période néonatale avec présence d’anticorps circulants spécifiques du virus respiratoire syncytial bovin et d’origine maternelle. Génisses de 6-9 mois : stabilisation d’un répertoire B de type adulte

2 000 souris, 1 500 rats et 100 cochons d'Inde vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un composé à tester puis subit jusqu'à neuf prélèvements de sang en vingt-quatre heures et des séjours en cage à métabolisme en isolement, certains portant un dispositif chirurgical pour recueillir la bile, pour mesurer le devenir de molécules candidates. Le porteur reconnaît un stress lié à la contention et à l'isolement ainsi que des douleurs et des lésions internes possibles aux sites de prélèvement. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la diffusion d'un produit dans l'organisme entier, ce qui rendrait le recours à l'animal "indispensable".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de pouvoir conduire différents protocoles dans lesquels différents éléments d'essai seront testés (classe thérapeutique anti inflammatoire, anti cancéreux, antibiotique, neurologie principalement) ainsi que l'évaluation des excipients et des produits exploratoires. Suite à ces différentes études, l'objectif est de pouvoir identifier de nouveaux éléments qui pourront pas la suite peut être donner lieu à de nouveaux médicaments. Il peut s'agir de conduire des études de PK simple: suivre les paramètres de l'élément testé dans les matrices plasma/serum principalement. Il peut s'agir de conduire des études PK/PD: suivre les paramètres de l'éléments testés dans les matrices plasma/serum principalement mais également de suivre les effets de ces éléments test en suivant certains paramètres biologiques. Il peut s'agir de conduire des études pour mettre en avant les phases Administration, Distribution, Métabolisme et Elimination. Dans ce cas les éléments test peuvent être suivis dans les urines, fécès, bile ...

Bénéfices attendus

L'intéret de ce projet est de pouvoir mener différentes études en testants différents éléments d'essai sur des rongeurs. Cela permettra d'identifier les composés intéressants qui pourront peut être déboucher sur de nouveaux médicaments humain ou vétérinaires. Les différents protocoles entrant dans le scope de ce projet (études PK, études PK/PD, études ADME) seront primordiaux pour avoir des données sur les paramètres phamacocinétiques et pharmacodynamiques des éléments testés pour pouvoir déterminer les relations dose/effet.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents types d'intervention - Premièrement l'administration de l'élément test. Cela sera fait sur animal vigile par un personnel formé pour éviter tout stress à l'animal -Puis des prélèvements de sang seront réalisés. En fonction de l'espèce animale les volumes et le nombre pourront varier. Pour les rats et les cobayes, 9 prélèvements maximum sur 24h, volume prélevé environ 60 μL Pour les souris, 9 prélèvements maximum sur 24h , volume prélevé environ 30 μL. La durée d'un prélèvement est inférieur à la minute. Les animaux pourront être placés en cage à métabolisme pour des recueils d'excrétas si demandés. La durée de l'hébergement dans ces cages à métabolisme sera réduite au maximum. Jusqu'à 7 jours maximum pour le recueil d'urine ou de fecès et jusqu'a 72h maximum pour le recueil de bile. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux.

Impact sur les animaux

Suite aux différentes administrations et durant les prélèvements sanguins, les animaux peuvent ressentir du stress, de la peur à la contention. Les prélèvements sanguins seront réalisés à différents sites de prélèvements, mais il peut y avoir de la douleur, des lésions internes. Lors des recueils de bile, de fécès ou d'urine, les animaux seront hébergés en cage à métabolisme. Cela signifie un hébergement individuel. Cela peut également occasionner du stress pour l'animal. Si l'animal a subit une chirurgie pour un recueil de bile, ou une administration duodénale cela necessite que l'animal porte un dispositif particulier qui peut influer sur sa liberté de mouvements. Tous ces gestes seront réalisés par un personnel expérimenté pour éviter au maximum toutes ces nuisances

Devenir

A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort. Cela sera pratiqué par un personnel expérimenté conformément à la réglementation en vigueur.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux ni d'évaluer les effets d'une molécule sur un ou plusieurs paramètres pharmacodynamiques au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier.

Réduction

Pour ce projet, il est envisagé d'utiliser environ 1500 rats, 2000 souris, 100 cobayes sur 5 ans. Ce sont des chiffres approximatifs pour une durée de 5 ans. Le nombre d'animaux inclus dans chaque étude entrant dans le scope de ce projet sera réduit au minimum pour avoir des résultats interprétables. Par exemple en utilisant la technique du micro sampling ( prélèvement de 30 µL de sang par animal) ou en utilisant des animaux cathétérisés cela permettra de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés car 9 points de pK pourront être réalisés sur le même animal.

Raffinement

Une attention particulière sera portée à l'enrichissement du milieu. Animaux hébergés en groupe autant que possible avec présence d'enrichissement au maximum au niveau des hébergements ( présence de buchettes, cachettes, tunnels ...) Les animaux seront observés quotidiennement pour une prise en charge rapide. Pour préserver les sites de prélèvement au maximum, un point de compression sera réalisé aprés chaque prélèvement avec la possibilité d'appliquer de la glace afin d'éviter la formation d'hématome. Les sites seront alterner autant que possible et le nombre de prélèvement de sang par site sera réduit au minimum.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont les espèces majoritairement utilisées dans ces études. Ces espèces sont bien décrites et caractérisées dans la littérature et leur utilisation est conseillée (OCDE) pour les essais de produits pharmaceutiques. Le cobaye est minoritairement utilisé mais peut permettre d'identifier des métabolites absents chez les deux précédentes espèces, par exemple. Nouveau nés, jeunes, adultes. Le stade de développement sera justifié pour chaque étude. Cela dépendra de la cible concernée pour le produit testé.

120 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés, après accord du vétérinaire, dans une autre étude du même projet ou dans un autre projet. Chacun subit une chirurgie d'environ trois heures sous anesthésie générale pour l'implantation définitive d'un émetteur de télémétrie, parfois suivie d'une heure de plus pour poser une chambre vasculaire, et peut être réopéré pour repositionner un cathéter. Les candidats médicaments sont ensuite administrés sous contention, par voie orale, intraveineuse ou quatre autres voies, avec des mises à jeun pouvant durer 30 heures, et leurs effets sur le cœur et les vaisseaux sont enregistrés sur des porcs éveillés. Après chaque chirurgie, les porcs restent isolés six à huit jours, isolement dont le porteur écrit qu'il engendrera "un stress de durée moyenne et d'intensité modérée", avant d'ajouter qu'il "permettra aussi d'accélérer la récupération post-chirurgicale".

Objectifs

Chaque étude de ce projet consiste à évaluer les effets cardio-vasculaires de différents candidats médicaments chez le mini-porc éveillé, en utilisant un dispositif électronique permettant la mesure et l’enregistrement automatique des paramètres cardio-vasculaires (télémétrie). Pour cela, une chirurgie initiale est prévue afin d'implanter de manière définitive ce dispositif électronique. Les enregistrements se font dans les pièces d'hébergement, sur des animaux libres de leurs mouvements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Dans ce projet les animaux pourront être soumis à deux types de chirurgie sous anesthésie générale : une chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie (dispositif permettant la mesure des paramètres cardiovasculaires), et parfois une chirurgie d'implantation de chambre vasculaire (dispositif permettant l'administration intraveineuse de produit, ou la réalisation de prélèvements sanguins). La durée de ces interventions sera d'environ 3h pour l'implantation de l'émetteur, plus 1h supplémentaire en cas d'implantation de chambre vasculaire. En cas de besoin, l'animal pourra être soumis à une nouvelle chirurgie pour repositionner le cathéter de l'implant ou de la chambre vasculaire, voir pour changer la chambre (durée 1h environ). Les animaux seront maintenus pendant l’administration du candidat médicament (ou du placebo) par voie orale, intrapéritonéale, sous-cutanée, transdermique, intramusculaire ou intraveineuse (bolus ou perfusion) (durée 1 -2minutes). Et si l’administration se fait par une perfusion de longue durée (supérieure à 1h), les animaux porteront des gilets (avec une minipompe embarquée) pendant maximum 24h. Ainsi, les effets sur les paramètres cardiovasculaires seront évalués. Cette évaluation se fera chez un animal éveillé et libre de ses mouvements dans sa pièce d'hébergement pendant plusieurs heures ou jours. Dès que possible, les animaux seront hébergés avec un animal congénère afin de ne pas être isolé. Des prélèvements sanguins, sans anesthésie, pourront être effectués durant les phases expérimentales (moins de 2min par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les contentions des animaux pour induire l'anesthésie ou administrer le produit peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. Dans ce projet, les animaux seront anesthésiés à une ou plusieurs reprises, pour l'implantation de l'émetteur de télémétrie, et dans certains cas, de la chambre vasculaire. Ces chirurgies peuvent induire des douleurs post-chirurgicales qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, une analgésie et un protocole de soins post-opératoire. Les animaux seront isolés pendant la période de récupération post-opératoire (6 à 8 jours après chaque chirurgie). Cet isolement engendrera un stress de durée moyenne et d'intensité modérée (désocialisation). Cependant en contrepartie, l'isolement permettra aussi d'accélérer la récupération post-chirurgicale. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements de sang (moins de 2min/prélèvement, et 2mL max par prélèvement). Par ailleurs, les animaux seront mis à jeun avant les chirurgies, et parfois avant l'administration du produit à tester. Cette période de jeun durera au maximum 30h. La mise à jeun engendre un stress physiologique et psychologique d'intensité modérée mais de courtes durées. Enfin, les effets potentiellement indésirables provoqués par le candidat médicament à tester font l'objet d'échanges avec les fabricants du candidat médicament afin d'adapter les outils d'observation des animaux, pour anticiper au mieux de potentiels signes cliniques.

Devenir

Réutilisation des animaux dans une étude du même projet ou dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré, après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le mini-porc car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets cardiovasculaires de ces candidats médicaments. Or, avant toute utilisation chez l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité ou la sécurité d'un médicament. A ce jour, le mini-porc est l’une des espèces les plus adaptées à ce type de modèle car il présente un système cardiovasculaire proche de celui de l'homme.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe (n=4 à 8 par groupe) est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences, et d’effectuer des analyses statistiques robustes. Une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, •l'utilisation de la télémétrie sans fil (animal libre de ses mouvements pendant les phases d'enregistrement), • la validation du système de télémétrie et la validation pharmacologique du modèle, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • l'utilisation d'une chambre vasculaire permettant des prélèvements sanguins sans une restriction physique importante • Le suivi d’éventuels signes cliniques, • La détermination des points limites, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire.

Choix des espèces

Le mini-porc est une espèce animale adaptée et couramment utilisée pour évaluer les effets cardio-vasculaire d'un candidat médicament car son système cardiovasculaire est physiologiquement et anatomiquement proche de celui de l'homme. Animaux sevrés en croissance et animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

970 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés ensuite dans d'autres projets après avis vétérinaire. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie de 1h30 à 2h, parfois une seconde chirurgie pour une mini-pompe, puis reçoivent des candidats médicaments par diverses voies pendant plusieurs jours, avec des périodes d'isolement et de mise à jeun jusqu'à 20 heures. Le porteur décrit ces atteintes comme un stress modéré et transitoire. Il affirme qu'avant toute administration à l'homme l'animal constitue un "passage obligatoire" et qu'il n'existe pas de méthode de substitution pour évaluer les effets cardiovasculaires.

Objectifs

Chaque étude de ce projet consiste à évaluer les effets cardio-vasculaires de différents candidats médicaments chez le rat éveillé en utilisant un enregistrement automatique des paramètres cardio-vasculaires (télémétrie). Pour cela, des chirurgies sont prévues afin d'implanter de manière définitive un dispositif d'enregistrement. Les enregistrements se feront en cage de vie et sur des animaux libres de leur mouvements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Les procédures de ce projet nécessitent différents types d'interventions. Dans un premier temps, une chirurgie sous anesthésie générale sera pratiquée afin d'implanter un dispositif (émetteur de télémétrie) permettant l'enregistrement automatique des paramètres cardio-vasculaires (durée: 1h30-2h). Les animaux seront tenus afin de pouvoir leur administrer des produits anesthésiques et analgésiques (durée: environ 1-2minutes). Après la chirurgie d’implantation de l’émetteur de télémétrie, 10 à 15 jours de récupération, au minimum, sont prévus avec isolement des animaux pour optimiser la cicatrisation. Pour certains protocoles, une seconde chirurgie pourra être pratiquée après récupération de la première chirurgie (durée: 30-45min). Le but de cette seconde chirurgie est d’implanter une mini-pompe sous la peau pour perfuser le produit à tester de façon continue. Dans ce cas, les soins post-opératoires ne pourront pas être suspendus et leurs durées seront fonction du type de mini-pompe implantée (durée maximale: 1 semaine). Le candidat médicament ou du placebo seront administrés aux animaux par voie orale, intrapéritonéale, sous-cutanée (continue ou non), transdermique, intramusculaire ou intraveineuse (bolus ou perfusion ou continue) (durée 1-2minutes et non applicable pour les administrations continues via une mini-pompe). Ainsi, leur potentiel effet sur les paramètres cardiovasculaires pourra être évalué. Cette évaluation se fera chez un animal éveillé et libre de ses mouvements dans sa cage d'hébergement pendant plusieurs heures ou jours. Dès que possible, les animaux seront hébergés avec un animal compagnon afin de ne pas être isolé. Des prélèvements sanguins pourront être effectués durant les phases expérimentales sur animal vigile ou anesthésié (durée des prélèvements: moins de 3min). Pour certains protocoles, des animaux pourront être mis à jeun (durée maximale: 20 heures). En cas de mise à jeun, une période minimale d’une semaine sera respectée entre chaque expérience de télémétrie (à l'inverse de 24h sans mise à jeun).

Impact sur les animaux

Les contentions des animaux vigiles pour induire l'anesthésie et administrer le produit peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. La chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie et la potentielle chirurgie d'implantation d'une mini-pompe peuvent induire des douleurs post-chirurgicales qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, analgésie et un protocole de soins post-opératoire. Post-chirurgie.s, les animaux pourront être isolés: 10/15 jours maximum post chirurgie d'implantation de l'émetteur de télémétrie et éventuellement, 1 semaine supplémentaire maximum post chirurgie d'implantation d'une mini-pompe. Cet isolement engendra un stress de durée moyenne et d'intensité modérée (désocialisation). Cependant en contrepartie, l'isolement permettra aussi d'accélérer la récupération post-chirurgicale. Finalement, les animaux pourront être mis à jeun avant l'administration du produit (et de façon exceptionnelle, avant les chirurgies). Cette période de jeun durera maximum 20h. La mise à jeun engendre un stress physiologique et psychologique d'intensité modérée mais de courtes durées.

Devenir

Réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire (sauf en cas de prélèvements d’organes / fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal).

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur la fonction cardiovasculaire. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’une des espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe (6 à 12) est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. L'utilisation de la télémétrie permet de faire des suivis sur de longues périodes. De plus, en général, les mêmes animaux sont utilisés pour les administrations des placebos et des produits (avec un temps de récupération entre les 2). Ainsi, la technique de télémétrie permet de diminuer le nombre d'animaux en ne multipliant pas les animaux pour l'étude de divers temps et groupes expérimentaux. Enfin, une réutilisation des animaux pour plusieurs études, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra aussi de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement est obtenu par : l'utilisation d'animaux libres de leurs mouvements pendant les enregistrements, la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, la validation du système de télémétrie et validation pharmacologique du modèle, le suivi des signes cliniques et des points limites, le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, des protocoles chirurgicaux avec une anesthésie et une analgésie adaptées et maitrisées, le suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux. L'ensemble des mesures décrites ci-dessus permet de réduire les contraintes potentielles pour l'animal à leur minimum.

Choix des espèces

Le rat est l'une des espèces de rongeurs les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur le système cardiovasculaire car il s'agit d'une espèce bien connue et décrite dans les premières étapes de l'évaluation des effets cardiovasculaires des candidats-médicaments. Des animaux adultes seront utilisés. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.