Toxicologie et autres tests de sécurité

17 955 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'effectif de loin le plus élevé du lot. Ils reçoivent des injections dans la peau et des applications cutanées répétées de dispositifs médicaux, dont des applications sur le pénis, pour tester leur pouvoir irritant et sensibilisant avant mise sur le marché. Le porteur indique que ces tests peuvent provoquer des rougeurs allant jusqu'à la nécrose de la peau, des escarres et une destruction de l'épiderme et du derme. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'est reconnu pour ces dispositifs et que ces essais sont imposés par la réglementation européenne.

Objectifs

Les professionnels de santé utilisent aujourd’hui des dispositifs médicaux (implants, prothèses, instruments…) que nous appelons « DM ». Le but du projet est d’évaluer la biocompatibilité de ces dispositifs. Autrement dit nous devons déterminer si les dispositifs, qui vont avoir un contact direct avec les tissus et fluides interne, sont compatibles avec le corps humain. Pour cela il existe des tests règlementaires de toxicité qui peuvent évaluer les potentiels risques de réactions allergiques et/ou d’irritation cutanée de ces DM. Cette évaluation est imposée par les instances règlementaire européennes.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’évaluer les risques biologiques potentiels de l’utilisation des DM sur la santé humaine. Ceci dans un but de commercialisation des DM sans risque pour la santé de l’homme.

Procédures

- SMKiso : sur 15 (ou 30 dans le cas d’extraits) animaux vigiles, 6 injections intradermiques, une application locales occlusive pendant 48h et une application locale pendant 24h. 3 pesées, observations locales. Injection IP pour la mise à mort - SMBiso : sur 30 animaux vigiles, 3 à 9 applications occlusives locales de 24 heures, 3 pesées, observations cliniques quotidiennes. Injection IP pour la mise à mort. - MP : au moins 4 applications locales sur le pénis sur au moins 6 animaux, pesées, observations cliniques quotidiennes. Injection IP pour la mise à mort.

Impact sur les animaux

Un phénomène de sensibilisation peut apparaître . Les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Les effets locaux peuvent rester jusqu’à la fin de l’étude, soit 35 jours. Selon l’intensité des effets observés, s’il y a atteinte des points limites alors l’animal peut être euthanasié pour raison éthique avant la fin de l’étude. Il peut y avoir, assez rarement, des effets de toxicité systémique. - test SMKiso : À la suite des injections intradermiques, il peut y avoir de l’érythème allant jusqu’à la nécrose du derme. À la suite des applications locales, peuvent apparaître des érythèmes pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte, une destruction de l’épiderme et du derme, de l’œdème, de la sécheresse cutanée. - test SMBiso : peuvent apparaître des érythèmes pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte, une destruction de l’épiderme et du derme, de l’œdème, de la sécheresse cutanée. Un phénomène d’irritation peut apparaître . Les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. -test MP : peuvent apparaître des érythèmes, de l’œdème, de la sécheresse cutanée.

Devenir

- SMKiso et SMBiso : Les animaux ayant reçu des traitements sur différentes parties de leur corps ceux-ci ne peuvent donc pas être réutilisés pour une procédure différente utlérieurement. Ils sont donc euthanasiés en fin d’essai. - MP : les animaux sont euthanasiés en fin d’étude pour prélèvement des pénis et analyse histologique.

Remplacement

Les relations quantitatives structure-activité et les modèles in vitro ne sont pas encore suffisamment élaborés à l’heure actuelle pour un rôle significatif dans l’évaluation du potentiel de sensibilisation cutanée des substances ; on doit donc continuer à déterminer ce potentiel sur des modèles in-vivo. Les tests in vitro permettant d’évaluer la sensibilisation du produit à tester ne sont pas reconnus pour les DM. Tout matériau irritant pour la peau, les yeux ou les muqueuses ou ayant un pH ≤ 2 ou ≥12.5 ne doit pas être testé et doit être étiqueté comme irritant potentiel. Par ailleurs les tests d’irritation ne doivent être envisagés que si les données de sécurité ne peuvent petre obtenues par d’autres moyens. Il n’existe pas de modèle in-vitro validé pour l’irritation pénienne. L’évaluation du potentiel sensibilisant et irritant des DM est imposée par la règlementation européenne pour leur mise sur le marché et les industriels ne peuvent se passer de réaliser ces tests.

Réduction

Des essais préliminaires sont réalisés afin de déterminer pour l’essai principal les doses non irritantes par application topique, non nécrosantes par injection intradermique et ne présentant pas de toxicité systémique et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les normes demandent de réaliser des groupes témoins positifs à chaques tests. Pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ces tests, nous réalisons un test témoin positif tous les six mois et non à chaque essai. Lorsque plusieurs DM sont testés dans un même temps, le lot contrôle sera communs aux différentes études dans la mesure du possible (3 DM maximum par lot commun pour les SMKiso et SMBiso et autant de DM que nécessaire par lot commun pour les MP).

Raffinement

A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, dans des cages communes par 2 ou 3, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles contiennent de la litière constituée de particules de bois résineux déshydratée puis tamisée et un tunnel en carton comme enrichissement. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et la litière souillée est remplacée par de la litière propre 2 fois par semaine. En cous d’étude (pendant une phase de repos) les animaux sont passés en cages plus grandes, par 5, toujours dans un souci de respect des règles de bien être animal (surface au sol). Des essais préliminaires sont réalisés afin de déterminer pour l’essai principal les doses non irritantes par application topique, non nécrosantes par injection intradermique et ne présentant pas de toxicité systémique et donc de limiter toute souffrance animale inutile. Des points limites (basés sur l’état général de l’animal) sont définis pour chacun des tests afin d’éviter toutes souffrance inutile aux animaux.

Choix des espèces

Le cobaye, reste le modèle de choix utilisé pour les tests de sensibilisation cutanée et d’irritation des tissus péniens. De plus la capacité de sensibilisation du cobaye est assez voisine de celle de I'homme. L’espèce et le stade de développement des animaux est imposé par les normes correspondantes. Cobayes jeunes adultes de 3 à 6 semaines pesant au moins 300g au début d’étude et arrivant à environ 800g à 1kg en fin d’étude. Si des femelles sont utilisées elles doivent être nullipares et non gravides.

3 260 souris vont être utilisé·es, dont 2 960 réutilisées dans d'autres procédures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent des cellules souches humaines après irradiation, puis des injections, gavages et prélèvements sanguins répétés jusqu'à huit fois, avec un suivi par imagerie. Il s'agit d'une plateforme produisant à la demande des souris "humanisées" pour le système immunitaire, fournies à des laboratoires pour tester vaccins et traitements. Le porteur présente ce modèle comme une alternative au primate non-humain et affirme qu'il est le "seul modèle d'hématopoïèse humaine expérimentale".

Objectifs

L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite soit utilisées par des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements. Dans ce projet, nous testerons l’activité de nouvelles immuno-modulateurs thérapeutiques ou de nouveaux vaccins afin de tester leur activité et/ou leur impact sur le système immunitaire humain.

Bénéfices attendus

Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).

Procédures

irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes) - injection intra-péritonéale (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1jour à 1 mois) ) - injection intra-veineuse (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - injection intra-musculaire (1 à 3 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1semaine à 1 mois) - injection sous-cutanée (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) -administration dans eau de boisson (1 à 8 par animal, durée 24h à 1 mois, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration par gavage (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - imagerie IVIS (2 à 10 par animal, durée 5min, intervalle entre 3 jours et 1 mois)

Impact sur les animaux

Immunodéficience : du fait de leur degré d’immunodéficience, ces animaux sont très sensibles aux infections. TSLP : Après irradiation les souris transgéniques pour TSLP peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. Irradiation : de potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Injection Hydrodynamique : un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort.

Devenir

Les animaux portant un système immunitaire humain générés dans une procédure pourront être inclus d'autres procédures du même projet (par exemple pour booster certaines cellules humaines, augmenter le nombre de cellules myeloides humaines, valider l’activité d’immuno-modulateurs) ou d'autres projets à la demande des utilisateurs de la plateforme). Les autres souris utilisées pour valider l’activité d’immuno-modulateurs seront mises à mort pour analyse des différents organes post-mortem.

Remplacement

Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.

Réduction

Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 380 souris la première année, 570 la deuxième année, 770 chaque année pour les 3 années suivantes, soit un total de 3260 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme (facteur limitant la production la première année et qui passera de 2 à 4 FTE entre les années 1 et 3), 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé à 4 la première année, 6 la deuxième année et devrait se stabiliser à 8 par an à partir de la 3ème année. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an).

Raffinement

La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.

Choix des espèces

La souris humanisée présentant un système immunitaire humain (HIS) est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches isolées dans des souriceaux nouveau-nés de moins de 9 jours car les nouveaux nés sont plus permissifs à la greffe dans les premiers jours de vie. Le contrôle qualité par vérification du niveau d’humanisation dans le sang sera réalisé à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines. Ce nombre de semaines correspond au temps minimum nécessaire au développement du système immunitaire humain dans une souris à partir de cellules souches hématopoïétiques. Les souris HIS seront ensuite utilisées entre 12 et 25 semaines de vie. Cet intervalle d’âge correspond à la période pendant laquelle le système immunitaire humain est le plus stable chez la souris.

28 poulets vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont gavés pendant dix jours de nitrofurazone, un antibactérien interdit et cancérogène, ou de son métabolite, subissent jusqu'à huit prélèvements sanguins, puis sont tués par groupes à quatre échéances pour prélever plasma, foie et muscle. L'objectif est réglementaire, mesurer la cinétique d'un traceur permettant de repérer l'usage illégal de cette molécule dans les élevages avicoles, en particulier à l'importation. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet cette étude cinétique et la juge "indispensable" sur "l'espèce cible".

Objectifs

La nitrofurazone est un principe actif antibactériens, interdit depuis 1995 sur tout le territoire Européen. Cette molécule présente une toxicité avérée (cancérogène, mutagène) et représente donc un risque pour le consommateur. Cependant, de la nitrofurazone peut être trouvée dans les denrées alimentaires d’origine animale et qui sont destinées à la consommation humaine. Sur le plan cinétique la nitrofurazone est rapidement métabolisées et ce dès les premières heures après son administration. De ce fait la surveillance des résidus de nitrofurazone dans les denrées d’origine animale est basée uniquement sur la surveillance d’un métabolite, le semicarbazide (SEM). Ce métabolite est plus persistant au niveau des muscles et du foie avec des demi-vies d’élimination respectivement de 4,5 jours et de 2,2 jours. Cependant, le SEM n’est pas spécifique de la nitrofurazone et il peut être détecté dans certains produits alimentaires d’origine animale, notamment lorsque ces denrées ont subi un procédé agroalimentaire (transformation industrielle par exemple) alors qu’il n’y a pas eu usage d’un traitement vétérinaire chez l’animal producteur de la denrée. Ce manque de spécificité implique que le contrôle basé uniquement sur le SEM peut engendrer des résultats d’analyse faussement positif. Un autre métabolite a été identifié et il pourrait être utiliser pour détecter l’utilisation de nitrofurazone en élevage. Ce métabolite est le 5-nitrofuraldéhyde. Cependant aucune information n'a été publiée sur sa cinétique et en particulier sur- ses caractéristiques cinétiques telle que sa vitesse d’élimination de l’organisme et sur sa persistance dans les tissus d’animaux. Ce projet permettra de générer des connaissances sur le devenir et la persistance de la nitrofurazone et de son métabolite le 5-nitrofuraldéhyde dans les matrices animales (muscle, foie), chez le poulet, et d’établir si ce métabolite peut devenir le traceur pour suivre l’utilisation de la nitrofurazone dans les élevages aviaires, en particulier lors d’importation.

Bénéfices attendus

L’usage de la nitrofurazone a été interdite sur tout le territoire de l’Union Européenne. Le dépistage dans les denrées alimentaires d’origine animale est basée sur la détection du métabolite marqueur persistant, le SEM qui se lient aux protéines des tissus animaux. L’analyse de ce métabolite traceur peut engendrer des résultats d’analyse faussement positifs car il peut provenir d’autres sources. On ne peut donc pas distinguer si l’occurrence du SEM dans les aliments d’origine animale provient d’un traitement thérapeutique illégal en élevage par nitrofurazone ou bien d’une contamination par exemple lors du processus de transformation agro-alimentaire. Notre projet s’intéresse donc sur l’analyse du 5-nitrofuraldéhyde qui est un autre métabolite potentiel à tous les nitrofuranes. L’étude pharmacocinétique réalisée in vivo documentera le devenir du 5-nitrofuraldéhyde et de la nitrofurazone afin de caractériser le métabolisme, la persistance, et la demi-vie dans différents organes du poulet.

Procédures

Des prélèvements sanguins sont prévues sur les poulets avant et lors de l’exposition avec la nitrofurazone et le 5- nitrofuraldehyde (sur la durée de l’étude, 8 prélèvements maximum de 0.5 ml de sang par animal traités). La durée des prélèvements sera environ de 30 secondes. Les poulets témoins seront mis à mort avant l’exposition au nitrofurazone et le 5-nitrofuraldehyde. Les animaux seront traités pendant 10 jours par voie orale (durée du gavage 1à 2 minutes). Il a été prévu quatre échéances (4 dates différentes) de mise à mort. A chaque échéance trois poulets exposés au nitrofurazone et trois poulets exposés 5-nitrofuraldéhyde seront mis à mort pour prélever différent tissus et organes. Ces opérations seront effectuées par des opérateurs habilités et expérimentés

Impact sur les animaux

Le gavage ainsi que les prélèvements sanguins seront effectuées sur des poulets vigiles par des opérateurs formés ce qui limitera le stress de l’animal.

Devenir

Les poulets seront mis à mort pour obtenir différents tissus et organes (plasma, foie et muscle) afin d’en évaluer la teneur en nitrofurazone et en nitrofuraldéhyde.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle in vitro permettant de réaliser une étude de cinétique. En conséquence l’étude pharmacocinétique simultanée de la nitrofurazone et de son métabolite le 5-nitrofuraldéhyde est indispensable après que des animaux reçoivent de la nitrofurazone. Cela permettra d’étudier la cinétique des molécules dans le plasma et dans le foie et le muscle. La comparaison avec l’administration du métabolite seul permettra d’évaluer si sa cinétique est influencée par la présence de nitrofurazone. Il est également important que cette étude soit réalisée chez l’espèce cible.

Réduction

Le nombre de poulet nécessaire à la modélisation de la cinétique des résidus est de 28 poulets (1 parquet de 4 Témoins, 2 parquets de 6 pour le traitement avec la nitrofurazone et 2 parquets de 6 pour le traitement avec le 5- nitrofuraldéhyde). Les prélèvements de sang seront réalisés sur 3 poulets par échéance de temps. La quantité de sang prélevé par animal n’excédera pas 10% du volume total sanguin de l’animal. Il est prévu quatre échéances de mise à mort ou le muscle et le foie seront prélevés afin d’établir la présence et la quantité de nitrofurazone et de son métabolite. La modélisation cinétique basée sur les répétitions des animaux aux échéances permettra de caractériser la variabilité interindividuelle des paramètres cinétiques et d’établir un modèle cinétique qui a terme permettra de réduire le nombre d’animaux. Il ne sera pas réalisée d’analyse statistique comparative, la modélisation permettant de réaliser une description quantitative et qualitative de l’évolution des concentrations chez le poulet.

Raffinement

Dans un premier temps, avant de commencer les procédures expérimentales, une phase d'acclimatation des poulets de 7 jours sera effectuée pour habituation au nouvel environnement : 5 parquets au sol seront à disposition et permettra la répartition de 6 animaux traités par parquet et 4 pour le lot témoin. Ces espaces permettront de favoriser la mobilité grâce à une répartition de zone d’enrichissement pour les animaux soit par l’espace paillé sollicitant le fouissage, zone perchoir qui constituera la zone de repos et une zone alimentation avec un accès illimité à l’eau et à la nourriture. La manipulation des animaux sera effectuée par des opérateurs formés afin de minimiser le stress des animaux. Une contention régulière sera effectuée pour habituation à l’immobilisation notamment lors des pesées. Une température d’ambiance sera appliquée allant de 23 degrés à leur arrivée et diminuant en fonction du développement de leur plumage. Le respect des rythmes de luminosité sera respecté par un passage de 8h d’obscurité durant les nuits. Une surveillance quotidienne du comportement et de l’état général des animaux sera effectuée au regard de leur consommation d’eau, de leur alimentation, et en effectuant des mesures du poids. Ces points clefs vont déterminer les points limites qui seront appliqués dès l'apparition de signes précoces de la douleur. Il ne sera pas possible d’utiliser une co-médication pour éviter d’éventuelles interactions. Néanmoins, une mise à mort compassionnelle pourra être effectuée si les points limites sont atteints.

Choix des espèces

Le poulet de chair est l’espèce la plus importante en élevage avicole et c’est également la viande la plus importés en ce qui concerne les volailles. C’est donc l’espèce cible qu’il faut étudier pour établir la cinétique de la nitrofurazone et de son métabolite. Au début de l’expérimentation, les poulets seront âgés de 3 semaines (soit une moyenne d’1kg à l'arrivée des animaux). Ce stade correspond à l'âge standard des animaux traitées sur élevage conventionnel.

Des candidats médicaments sont administrés à des macaques pour satisfaire une exigence réglementaire : un essai sur une espèce non-rongeur avant tout essai chez l'humain. 216 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, la plupart porteurs d'un émetteur de télémétrie implanté par chirurgie, d'autres d'un gilet. Les produits passent par voie orale ou intraveineuse, mais aussi intra-articulaire, vaginale, rectale, sous-rétinienne ou intravitréenne, et les singes sont habitués à la contention en chaise. Le porteur affirme que la télémétrie enregistre leurs paramètres "sans induire de stress aux animaux", puis cite les contraintes du gilet, de la chirurgie et de la contention. Le champ structuré déclare 120 macaques réutilisés sur 216, et le porteur précise que ces singes sont mis à mort après plusieurs études, leurs émetteurs empêchant de les replacer ou de les faire adopter.

Objectifs

Le but de ce projet est de décrire les études permettant d’identifier les propriétés pharmacodynamiques indésirables de candidats médicaments chez le primate non humain conscient. Ces études de pharmacologie de sécurité permettent d’enregistrer les paramètres cardio-respiratoires vitaux tels que l’électrocardiogramme, les paramètres respiratoires ainsi que la température ou l’activité de l’animal par accéléromètre. Les animaux sont équipés d’émetteurs télémétriques implantés chirurgicalement (télémétrie interne) ou d’un gilet (télémétrie externe) permettant de transmettre en continu les signaux de respiration, de température et d’électrocardiogramme (ECG). En télémétrie interne ou externe, les paramètres sont enregistrés en continu sans induire de stress aux animaux. Les fonctions cardiaque, respiratoire et du système nerveux central sont ensuite évaluées après une ou plusieurs administrations d’un candidat médicament. Le présent projet comprend trois procédures de pharmacologie de sécurité chez le primate non humain (singe cynomolgus) conscient (procédures 1, 2 et 4) et une procédure de chirurgie (procédure 3). 1/ Evaluation du système cardio-respiratoire par télémétrie interne (avec implantation d’un émetteur de télémétrie), 2/ Evaluation du système cardio-respiratoire par télémétrie externe (avec ou sans implantation d’un émetteur de télémétrie pour la pression artérielle), 3/ Implantation chirurgicale des émetteurs de télémétrie : Implants de télémétrie pour utilisation en procédure 1 et implants de mesure de pression artérielle pour utilisation en procédure 2, 4/ Evaluation du système nerveux central par batterie de tests fonctionnels.

Bénéfices attendus

Le projet, réalisé dans un cadre réglementaire, a comme objectif d’évaluer les effets pharmacodynamiques indésirables de candidats médicaments chez le primate non humain. Conformément aux lignes directrices éditées par l’International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH), l'évaluation du potentiel toxique d'un candidat médicament chez un non-rongeur est indispensable pour chaque nouveau candidat médicament avant de pouvoir démarrer les essais cliniques chez l'Homme, et avant toute autorisation de mise sur le marché.

Procédures

Les animaux sont traités, par différentes voies (principalement orale et injection intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse, intra-articulaire, vaginale, rectale, sous-rétinienne ou intravitréenne), le plus souvent en dose unique, pour évaluer un potentiel effet pharmacodynamique indésirable d’un candidat médicament. Des prélèvements sanguins sont également possibles pour l’évaluation de l’exposition au produit et/ou bilan hémato-biochimique. Ces prélèvements sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont rares et correspondent essentiellement aux effets pharmacologiques du produit administré [ex : action au niveau du système nerveux central, du système cardio-respiratoire (variation de fréquence cardiaque ou respiratoire ou du niveau de pression artérielle)] ou à des effets systémiques (ex : perte de poids, baisse de consommation alimentaire). Ces effets sont très rares en pratique compte tenu des faibles doses utilisées dans le cadre de ces études de pharmacologie de sécurité et qui sont le plus souvent déterminées en fonction des résultats des études de toxicologie réalisées auparavant. D’autres effets indésirables peuvent être associés aux procédures (contraintes liées au port du gilet de télémétrie, à l’implantation chirurgicale des émetteurs de télémétrie et à la contention lors des manipulations, prélèvements sanguins dans le but de vérifier l’exposition au candidat médicament, évaluation pharmacocinétique ou autres biomarqueurs sanguins).

Devenir

Dans le cadre de ce projet, les animaux reçoivent des doses pharmacologiques supérieures ou égales aux doses thérapeutiques humaines et sont par conséquent, le plus souvent réutilisés. Ces animaux dont la majorité portent un émetteur de télémétrie ne peuvent pas être replacés ou adoptés. Après avoir participé à plusieurs études et en fonction des produits administrés et de leurs potentiel effet pharmacologique, les animaux sont sacrifiés suivant les procédures éthiques en vigueurs.

Remplacement

L'évaluation des effets pharmacodynamiques indésirables d'un candidat médicament ne peut pas être réalisée in vitro. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour ce type de procédure de traitement identique à celle utilisée chez l'Homme, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Les interactions entre les différentes fonctions physiologiques et composantes de l’organisme qui participent aux réponses pharmacodynamiques d’un candidat médicament, ne peuvent pas être identifiées aujourd’hui par des procédures in vitro de types cellules ou organes isolés. Le choix du primate non-humain par rapport aux autres espèces non-rongeurs est justifié par la nature du candidat médicament (biologiques) et de l’homologie des voies métaboliques et relations pharmacodynamiques/pharmacocinétiques chez l’homme par rapport au primate non-humain.

Réduction

Le nombre d’animaux est déterminé par la réglementation cadrant les études de pharmacologie de sécurité et est le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude. La méthode d’investigation en pharmacologie de sécurité implique le plus souvent un traitement croisé (cross-over design), permettant l’utilisation d’un nombre réduit d’animaux (de 4 à 8 animaux par étude – le plus souvent d’un seul sexe), sans impacter la fiabilité des données, les résultats et les objectifs de l’étude. Dans le cas d’un candidat médicament du type biologique nécessitant un protocole d’étude en groupes parallèles avec un groupe véhicule et deux doses de produit (n=4 animaux par dose ou groupe et n=12 au total), le nombre total d’animaux peut être réduit à 8 au lieu de 12, en ré-utilisant le groupe véhicule pour évaluer une des doses du candidat médicament. Par ailleurs, l’analyse continue des données de télémétrie améliore considérablement la qualité et la fiabilité des données enregistrées avec un nombre réduit d’animaux. Pour éviter d’inclure systématiquement l’évaluation d’un produit de référence positif dans chaque étude portant sur les effets de candidat médicament sur le système cardiovasculaire et en accord avec les nouvelles recommandations ICH, les résultats des effets d’un produit de référence positif, évalué en cross-over à trois doses et un véhicule, peuvent être intégrés en annexe de chaque rapport évaluant les effets d’un nouveau candidat médicament. Si nécessaire et en fonction des changements de conditions expérimentales, les effets du produit de référence peuvent être réévalués séparément à un intervalle régulier de 3 et 6 années.

Raffinement

Les procédures, les conditions d’hébergement et matériel utilisés ainsi que les enrichissements fournis sont adaptés aux animaux utilisés dans ce projet. Des enrichissements variés (graines dans des copeaux, tablettes à différentes hauteurs, …) sont fournis aux animaux, leur permettant d’exprimer les comportements physiologiques et activités qu’ils auraient dans leur habitat naturel (ex. : recherche d’aliment, épouillage, temps d’isolement). Les animaux sont habitués aux contraintes expérimentales telles que le port du gilet et la contention en chaise. En cas d’administration par perfusion intraveineuse, des friandises peuvent être proposées pendant la perfusion. Après les chirurgies pour implantation des émetteurs, les animaux sont suivis quotidiennement en période post-opératoire (suivi de la fréquence cardiaque, de la température corporelle sur 10 jours, voire plus si l’état de l’animal l’exige) et des actions post-chirurgie sont mises en place pour permettre une bonne récupération rapide de la chirurgie (distribution de rations additionnelles de fruits et de légumes pour favoriser la prise alimentaire et éviter la perte de poids, regroupement des animaux dès leur réveil complet pour permettre les interactions physiques entre congénères et favoriser le retour au comportement physiologique, dont la consommation alimentaire). Afin de limiter la douleur et la souffrance des animaux, toutes les interventions chirurgicales sur les animaux se feront sous anesthésie générale, renforcée par des compléments analgésiques et antiinflammatoires appropriés, selon les procédures vétérinaires approuvées. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites, qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a un signe d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe social et un programme d'enrichissement adapté est mis en place tout au long de l'étude.

Choix des espèces

L’utilisation des non-rongeurs est une exigence réglementaire. Le choix du primate non humain est justifié par : - les homologies avec l'Homme, - la disponibilité d'études de toxicologie réglementaire dans cette espèce, - les données de pharmacocinétique/pharmacodynamie. Le primate non humain est la seule espèce pertinente pour les essais pré-cliniques de composés biologiques (ex : vaccins thérapeutiques anti-Alzheimer). Le choix de l’espèce de primate non humain (singe cynomolgus) est le plus souvent déterminé par des études in vitro permettant de comparer le métabolisme de ces espèces avec celui de l’Homme, ou de prouver que le candidat médicament a la même affinité pour sa cible chez le primate non humain et l’Homme. La pharmacocinétique du candidat médicament et les connaissances acquises avec des produits de même classe pharmacologique sont prises en compte. Les animaux intégrés dans ces études sont des animaux adultes ou jeunes adultes. L’âge minimal est d’au moins 24 mois. Pour les études de pharmacologie de sécurité, les animaux peuvent être utilisés dans le cadre de plusieurs études, par conséquent l’âge des animaux peut être plus important. Des individus matures ou jeunes adultes sont utilisés pour que l’état physiologique de l’animal permette une réponse non équivoque des systèmes analysés après traitement avec les composés et ainsi garantir une évaluation adéquate des paramètres ciblés.

300 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent l'implantation chirurgicale d'un produit de santé sous la peau ou dans l'os, avec prélèvements sanguins et injections, sur une période pouvant aller jusqu'à vingt-quatre mois, puis sont mis à mort pour analyse des organes et des tissus. Le porteur décrit comme nuisances attendues une perte de poids, des douleurs ostéo-articulaires, des complications de la plaie chirurgicale et l'hébergement individuel d'une espèce sociale. Il présente ces essais réglementaires comme "obligatoires" faute de test in vitro validé, et choisit le lapin pour la taille du dispositif à implanter.

Objectifs

Le projet s’inscrit dans les démarches réglementaires recommandées avant utilisation d’un produit de santé chez l’homme. En effet, tout fabricant doit s’assurer que l’utilisation de son produit ne compromette ni l’état clinique et la sécurité des patients, ni la sécurité et la santé des utilisateurs. Dans ce projet, il s’agit plus précisément d’évaluer la toxicité systémique (c’est-à-dire la toxicité non limitée aux effets défavorables au niveau du contact entre le corps et le dispositif) et éventuellement locale d’un produit fini ou de ses différents constituants, après implantation/injection chez le lapin sur une période allant de 14 jours à 24 mois. Le lapin est privilégié du fait de la taille du dispositif à implanter. Toute étude de toxicité systémique peut, par ailleurs, être couplée à une évaluation des effets locaux (= toxicité locale). Dans ce cas, les réactions locales à étudier dépendent directement des caractéristiques du produit à tester (ex : étude de la tolérance locale après implantation/injection dont la localisation est proche de l'utilisation clinique chez l'homme).

Bénéfices attendus

S’assurer avant sa mise sur le marché que l’utilisation du produit de santé ne compromet ni l’état clinique et la sécurité des patients, ni la sécurité et la santé des utilisateurs. Evaluer les risques éventuels liés à l’utilisation de ce produit et s’assurer le cas échéant qu’ils constituent des risques acceptables au regard des bienfaits/bénéfices apportés aux patients et sont compatibles avec un niveau élevé de protection de la santé et de la sécurité des patients comme des utilisateurs. Les résultats seront disponibles à l’issue des études et leur incorporation dans les dossiers de soumissions aux autorités de santé compétentes avant leur mise (ou leur maintien) sur le marché pourront en découler à court terme.

Procédures

Implantation chirurgicale sous-cutanée sous anesthésie : 1 environ 40 minutes maximum en fonction du nombre de sites et de l'implant Implantation chirurgicale intraosseuse sous anesthésie : 1 environ 60 minutes maximum Prélèvement sanguin sur animaux vigiles : 2 (1 en début et 1 en fin d’étude) environ 5 minutes chacun (total de maximum 10 minutes) Injection intramusculaire : 1 environ 1 minute Injection intraartérielle : 1 environ 1 minute par molécule (total de maximum 4 minutes) Anesthésie volatile : 1 environ 10 minutes

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues suivant nos procédures expérimentales sont les suivantes : perte de poids, baisse d’activité, baisse d’appétit, comportements atypiques pour l’espèce, vocalises, hébergement individuel pour les espèces sociales, douleurs myo-arthro-squelettiques, complications post-chirurgie (inflammation de la plaie chirurgicale).

Devenir

Pour les besoins de l'étude, une analyse des paramètres sanguins ainsi qu'une évaluation des tissus au microscope (analyse histopathologique) est nécessaire. Ceci permet d'évaluer les effets potentiels de toxicité systémique et/ou la tolérance locale au niveau de la zone d'implantation du produit de santé à tester. Ces analyses expliquent l'impossibilité en fin d'étude de maintenir en vie les animaux utilisés.

Remplacement

Les méthodes alternatives existantes ne permettent pas d’évaluer les effets toxiques à moyen ou long terme des produits de santé en raison de la complexité des mécanismes de régulation d’un organisme vivant. Il n'existe pas de test in vitro validé ni de modèle simulé par ordinateur capable de reproduire la complexité d'une réaction tissulaire post-chirurgicale et/ou des effets systémiques. L’utilisation d’animaux est alors obligatoire pour y parvenir.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux* (nombre minimal d'animaux/sites requis par les textes de références, lots témoins communs entre différents essais si possible, engagement du donneur d'orde de non duplication des essais, évaluation de la toxicité systémique couplée à une évaluation de la tolérance locale si possible), l'espèce et la durée de l'essai sont alors définis. * Dans le cadre d'essai de toxicité systémique, le nombre d'animaux doit être suffisant pour permettre une analyse statistique pertinente (e.g. toxicité subaiguë: minimum 4/sexe/groupe; toxicité subchronique: minimum 5/sexe/groupe; toxicité chronique: minimum 7/sexe/groupe. Dans le cadre de l'évaluation des effets locaux, minimum 10 sites sur minimum 3 animaux différent sont nécessaires)

Raffinement

La stratégie de raffinement est établie afin de limiter le stress et la douleur des animaux et repose sur l’acclimatation des animaux pendant laquelle les animaux ne subissent aucune manipulation non indispensable ; la présence d’enrichissements du milieu systématique ; l’utilisation d’anesthésiques et d’antalgiques ; un suivi sanitaire et clinique quotidien et renforcé en phase post-opératoire avec une visite vétérinaire en cas d’anomalie clinique, sanitaire ou comportementale, pour permettre une gestion adéquate de la douleur ou de l’anomalie constatée selon chaque cas. Un suivi des points limites spécifiques au projet sera mis en place (suivi de l'alimentation, du comportement et de la lomotion)

Choix des espèces

Espèce animale définie dans le (ou les) texte(s) de référence. En général, les animaux sont utilisés au stade jeune adulte (lapins de minimum 2,5 kg) ; lorsque la procédure le nécessite (ex : quantité et/ou taille du matériel à tester importante, implantation intra-osseuse), des animaux plus "âgés" (donc d’un poids plus important) peuvent être utilisés. L'implantation intra-osseuse nécessite des animaux plus gros d'au moins 26 semaines.

1 530 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 050 réutilisés ensuite dans d'autres projets et 480 tués pour prélèvement d'organes. Une partie subit la pose d'une mini-pompe ou d'un cathéter sous anesthésie, puis reçoit le produit à tester avant l'évaluation neurologique par le test d'Irwin, avec un isolement social pouvant durer jusqu'à trois semaines et une mise à jeun jusqu'à seize heures. L'objectif est d'évaluer les effets secondaires de candidats médicaments sur le système nerveux central avant leur passage chez l'humain. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution suffisante et que l'animal constitue un "passage obligatoire", le rat étant selon lui l'espèce la plus adaptée.

Objectifs

La développement de nouveaux médicaments s'accompagne d'une évaluation de leurs potentiels effets secondaires chez l'animal avant toute administration chez l'homme. Cette évaluation pré-clinique de la sécurité du candidat médicament au niveau du système nerveux central peut être effectuée par le test d'Irwin chez le rat. Le test consiste à effectuer une batterie d'observations fonctionnelles incluant des paramètres neurologiques après administration d'un candidat médicament afin d'évaluer les effets secondaires de ce dernier sur le système nerveux central du rat.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments avec peu d'effets secondaires pour le patient et de traiter diverses maladies dans de nombreuses indications thérapeutiques (par exemple, les cancers, les maladies du système nerveux central). Ces composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont d'évaluer les éventuels effets secondaires du composé testé avant son passage en phases cliniques. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (rat) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive.

Procédures

Avant de réaliser le test d'Irwin et afin de permettre une administration chronique ou sous perfusion sanguine du produit à tester, les animaux pourront être sujets à l'implantation d’une minipompe ou d'un cathéter veineux (environ 35 mins) ou également d'un cathéter artériel (35 mins) pour réaliser des prélèvements sanguins. Cela est fait sous anesthésie générale avec une analgésie morphinique. Ils receveront également un suivi post-opératoire selon les bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux peuvent également recevoir le produit à tester par différentes voies d'administration (-2 minutes) à un volume respectant les recommandations éthiques. Les animaux seront ensuite évalués d'un point de vue neurologique par le test d'Irwin, un test durant 6 minutes et qui consiste en l'évaluation de différents paramètres à différents temps de mesure post-administration. Leur activité locomotrice pourra également être évaluée dans un actimètre (environ 60 minutes). Une observation peut être réalisée avant l'administration et la période d'observation post-administration sera de 24h à 72h. Celle-ci pourra être allongée en fonction de la durée de demi-vie du candidat-médicament. Des prélèvements de sang (environ 1 min) pourront également être effectués en cours d'étude en respectant les recommandations éthiques pour les volumes et la récupération entre les séries de prélèvements.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis a une chirurgie réalisée sous anesthésie qui peut induire un stress à l'endormissement. Les cicatrices de la chirurgie peuvent indurie un inconfort. Les animaux peuvent également être mis en isolement social après la chirurgie et jusqu'à 3 semaines post-chirurgie ce qui peut induire du stress. Le test d'Irwin en lui-même ne provoque pas plus de nuisance pour l'animal qu'un éventuel stress lié à la préhension et au déplacement de ce dernier. L'administration de molécules dont les effets sont connus peuvent induire des effets secondaires modérés et limités par les doses utilisées dans cette procédure. Les animaux peuvent également être mis à jeun pour une période de 16h maximum avec complémentation en glucose ou non ce qui peut induire une sensation de faim chez l'animal.

Devenir

A la fin de l'étude, les animaux pourront être euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’organes/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal. Un certain nombre d'animaux pourra également être réutilisé dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les symptômes comportementaux ou neurologiques. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de la toxicité et de la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé (n=10/groupe) afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuels signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Le rat est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les potentiels effets secondaires d'un produit sur le système nerveux central car il s'agit de l'espèce la plus pratique et la plus utilisée et donc charactérisée pour évaluer les effets de médicaments en développement sur le système nerveux central. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement afin de s'affranchir de divers effets liés au développement et à l'âge (par exemple les changements hormonaux).

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections sous-cutanées de deux antibiotiques, puis sont tuées par prélèvement intracardiaque sous anesthésie pour doser ces composés dans le sang. L'objet est de décrire la pharmacocinétique du céfépime et de l'enmétazobactam avant d'en tester l'efficacité, dans un projet ultérieur, sur un modèle de pneumonie à Klebsiella pneumoniae résistante. Le porteur indique que les doses ne sont pas toxiques et affirme que le recours à l'animal reste une étape "obligatoire et règlementaire".

Objectifs

L’objectif du projet est de caractériser la pharmacocinétique sanguine du céfépime (antibiotique) et de l’enmétazobactam sur une période de 8h post-injection, après deux administrations sous-cutanées. Cette caractérisation permettra d’évaluer le devenir de ces deux composés, depuis leur entrée jusqu'à leur élimination en fonction du temps et ainsi d’avoir les bonnes concentrations et fréquence d’administration pour en évaluer leur efficacité dans des modèles d’infection ultérieurement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de reconstruire les courbes pharmacocinétiques des deux composés (céfépime et enmétazobactam) sur 24h chez la souris et ainsi d’adapter les fréquences d’administration dans un modèle de pneumonie à Klebsiella pneumoniae résistant aux carbapénèmes afin d’y évaluer leur efficacité sur la diminution de la charge bactérienne pulmonaire.

Procédures

L’injection des composés se fera par voie sous cutanée. Les doses administrées sont non toxiques pour les animaux. Les souris seront ensuite soumises à un prélèvement intracardiaque (d’une minute) sous anesthésie fixe. La profondeur de l’anesthésie est vérifiée par pression des voutes plantaires.

Impact sur les animaux

L’effet indésirable principal ici est lié à la douleur légère et de courte durée générée par deux injections (l’une pour l’administration des composés puis la seconde pour l’administration de l’anesthésie fixe)..

Devenir

Tous les animaux seront mis afin de doser les différents composés étudiés.

Remplacement

Le céfépime est un antibiotique de la famille des bêta-lactamines. Cependant, le céfépime peut être hydrolysé par des β-lactamases à spectre étendu (BLSE) telle que l’OXA-48. La principale stratégie pour restaurer l'efficacité des β-lactamines est l'utilisation d'inhibiteurs de β-lactamase. Le but est de trouver la meilleure combinaison capable d’avoir une activité antibactérienne efficace contre ces BLSE. Dernièrement, des études in vitro et in vivo ont démontré une activité intéressante chez des Entérobactéries multi résistantes. La mesure de l’efficacité de cette combinaison (céfépime + enmétazobactam) ne peut se faire sans avoir recours au modèle animal ce d’autant que certains échecs de traitement ne peuvent être anticipés autrement et que les aspects liés à la pharmacocinétique de ces nouvelles molécules ne peuvent être évalués autrement. Pour l’heure, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux hypothèses a été réduit à 3 par groupe grâce à l’expérience acquise lors d’études précédentes. Compte tenu de la variabilité attendue sur les dosages chez la souris, trois souris par point sont nécessaires pour mener à bien cette étude – Aucun test statistique sera appliquée sur les résultats de dosage.

Raffinement

Un gros travail bibliographique a été réalisé en amont de cette étude afin de s’assurer que la dose utilisée ne soit pas toxique pour les animaux. Il s’agira d’une étude sans infection où aucune toxicité n’est attendue. De plus un enrichissement du milieu (jouets en plastique, igloos en carton) sera utilisé et une surveillance accrue sera également réalisée pour cette étude. Des critères d’arrêts de l’étude ont été définis afin d’assurer le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Les souris représentent classiquement un des modèles de choix pour l’évaluation de la pharmacocinétique. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée pour la mise au point du modèle d’infection pulmonaire à Klebsiella pneumoniae dans d’autres projets. Souris de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel d’environ 20-22g (même poids que pour les précédentes études).