Toxicologie et autres tests de sécurité
MODIFICATION Chirurgies d’implantations de dispositifs d’administration ou de mesures pour les études de toxicologie et pharmacologie règlementaire.
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Chiens : 250
Ouistitis et tamarins : 320
Macaques à longue queue : 225
Opérés puis intégrés à des études de toxicologie et de pharmacologie réglementaires, 2 400 rats, 320 ouistitis et tamarins, 250 chiens et 225 macaques à longue queue subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit par chirurgie un dispositif d'enregistrement de ses constantes ou un cathéter veineux, une opération de trente minutes à deux heures selon l'espèce, suivie d'un isolement pouvant aller jusqu'à vingt-quatre heures. Le porteur reconnaît des risques d'inflammation, d'infection et de douleurs opératoires et post-opératoires, et présente ces implants comme un moyen de réduire le stress des manipulations invasives qui viendront ensuite. Il indique que les lignes directrices ICH/EMA imposent deux espèces, un rongeur et un non-rongeur, et prévoit de recourir à des animaux juvéniles quand le produit vise des indications pédiatriques.
Objectifs
L’objectif du projet est de réaliser des chirurgies d’implantation de système de mesure, d’administration ou de prélèvements de différents paramètres physiologiques, produits d’études ou fluides biologiques. Ces systèmes sont nécessaires à la réalisation d’études de toxicologie et pharmacologie réglementaire suivant les lignes directrice ICH/EMA afin d’évaluer la sécurité, l’efficacité et la toxicité de candidats médicaments ou substances chimiques chez différentes espèces animales avant leur utilisation chez l’humain ou l’animal.
Bénéfices attendus
Ces chirurgies permettent de : - Faciliter et sécuriser le traitement des animaux et donc diminuer leur stress induit par des manipulations invasives répétées. - Faciliter les prélèvements de sang et limiter le nombre de site de prélèvement - Evaluer de manière fiable certains paramètres physiologiques comme la fréquence cardiaque, des bio-potentiels comme l’électroencéphalogramme, des températures comme la température corporelle ou l’activité motrice. - Collecter des données sur la sécurité, l’efficacité et/ou la toxicité, de candidats médicament avant administration chez l’Homme ou chez l’animal.
Procédures
Les animaux se verront implantés par chirurgie un système d'enregistrement des paramètres physiologies et/ou un système de cathétérisation veineuse afin de pouvoir administrer des molécules testés dans le cadre d'essais pré-cliniques de développement de médicaments. La pose de ces implants prends de 30 minutes à 2h, selon l'espèce. Si un prélèvement sanguin est nécessaire, il est fait vigile, en quelques minutes.
Impact sur les animaux
La chirurgie représente un risque de nuisance modérée pour les animaux. Les risques sont une inflammation ou un gonflement des zones de chirurgie, d’infection, de douleurs opératoires et post opératoire. L’isolement post opératoire, bien que limité à 24h maximum, représente aussi une source de stress pour les animaux.
Devenir
Les procédures décrites dans ce projet permettront d'intégrer les animaux dans des projets de toxicologie et pharmacologie pré-cliniques dans le cadre du développement de médicaments. Cette intégration se fait dans le cadre d'une utilisation continue des animaux sur des projets liés à la même question scientifique.
Remplacement
Les chirurgies préparatoires menées dans le cadre de ce projet permettent la réalisation d’études règlementaires évaluant l’efficacité, la sécurité et la toxicité de candidats médicament ou de substances chimiques en vue de leur mise sur le marché. Ces études réglementaires sont des prérequis aux essais cliniques de phase I, II et III et sont réalisées en suivant des guidelines nationales et internationales (ICH/EMA). Selon ces guidelines, ces études doivent être effectuées sur des modèles animaux, il n’est donc pas possible actuellement de remplacer les modèles in vivo par des modèles in vitro ou in silico.
Réduction
Une fois les animaux implantés ils participent à plusieurs études, ce qui permet d’en réduire le nombre nécessaire. De plus, pour les études réglementaires le nombre d’animaux est réduit au minimum pour permettre la détection d’effet indésirables/toxicologique/pharmacologique en accord avec les lignes directrices ICH/EMA.
Raffinement
Afin de réduire les nuisances liées à la chirurgie, un protocole anesthésie/analgésie est avec une prémédication (qui permet de rendre plus rapide et plus stable l’anesthésie et d’apporter une analgésie), une application d’anesthésique locale avant l’incision et générale en fin de chirurgie et une anesthésie générale gazeuse avec inhalation d’isoflurane sont mis en place pour permettre une chirurgie et un réveil rapide et sans douleur. Le suivi post-opératoire sera quotidien, et inclus l’administration d’analgésie injectable et/ou par voie orale systématiquement durant 2 à 3 jours. Des points limites ont été définies afin de mettre en place des actions correctives afin d'éviter tout souffrance.
Choix des espèces
Toutes les espèces retenues pour ce projet sont des espèces reconnues pour leur aptitude à prédire les effets pharmacologiques, indésirables et/ou toxiques de candidats médicament ou substances chimiques. Les lignes directrices requièrent deux espèces (rongeurs et non rongeurs) selon la nature du produit à tester (molécule chimique de synthèse, peptide, protéine, anticorps monoclonal ou produit de thérapie génique ou cellulaire). Ce projet utilise des rongeurs à partir de 6 semaines, des chiens à partir de 6 mois, des macaques à partir de 2 ans et des marmousets à partir d’un an. Exceptionnellement, ce projet pourra être menées sur des animaux juvéniles pour des produits à visée pédiatrique afin de révéler des effets toxiques dépendant de l’âge (retard de croissance, effet sur la maturation sexuelle, effet toxique lié à l’immaturité de certaines fonctions physiologiques). La ligne directrice suivie est : “guideline on the need for non-clinical testing in juvenile animals of pharmaceuticals for paediatric indications - EMEA/CHMP/SWP/169215/2005”.
Étude de l’efficacité d’une molécule améliorant la fonction vasculaire dans des modèles de sepsis chez la souris
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
2 216 souris vont être utilisées dans des procédures classées en niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever les organes vitaux. Un sepsis leur est provoqué, avec pour effets annoncés une baisse d'activité, un stress, une chute de température et la mort d'une partie des animaux. Chacune reçoit jusqu'à quatre injections et un prélèvement sanguin à la veine de la queue sur animal vigile, certaines une ponction cardiaque sous sédation profonde. Le porteur attend de cette molécule une preuve de concept sur la protection des vaisseaux sanguins, et ramène le nombre de 2 216 souris à des expériences préliminaires et des tests statistiques adaptés, sans autre précision.
Objectifs
Le sepsis est une complication grave d’origine infectieuse, qui peut être mortelle malgré des traitements souvent coûteux. Il provoque une réaction inflammatoire excessive qui détériore les vaisseaux sanguins et perturbe fortement la circulation. Aujourd’hui, protéger les vaisseaux est devenu une priorité pour mieux soigner cette maladie. Des chercheurs ont identifié une nouvelle molécule capable de renforcer les vaisseaux sanguins. Cette étude vise à évaluer l'efficacité de cette molécule à améliorer la prise en charge du sepsis, et à déterminer dans quelles conditions elle serait la plus bénéfique, seule ou en association avec des antibiotiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’établir la preuve de concept de l’efficacité de cette molécule à protéger les vaisseaux sanguins lors d’une infection grave. À terme, il pourrait ouvrir la voie à de meilleurs traitements contre différentes infections du sang, en précisant comment et quand utiliser cette molécule. Il pourrait aussi permettre d’identifier un marqueur biologique associé, utile pour suivre son efficacité. Cette étape est essentielle pour envisager l’utilisation future de cette molécule dans la prise en charge du sepsis.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections (maximum 4, durée 1 min), à 1 prélèvement sanguin à la veine de la queue (maximum 1, durée 1 min). Ces interventions seront réalisées à l’état vigile. Des animaux seront soumis à des ponctions cardiaques réalisées sous sédation profonde.
Impact sur les animaux
Les injections et prélèvement sanguin réalisé peuvent occasionner un stress et une douleur de courte durée aux animaux. Le sepsis provoqué peut entraîner une diminution d’activité, un stress, une baisse de température et la mortalité des animaux.
Devenir
Une fois les animaux mis à mort, nous prélevons les organes vitaux pour analyse.
Remplacement
Toutes les études préliminaires ont été conduites sur des modèles in vitro, cela nous a permis de sélectionner la molécule la plus pertinente à tester. Cependant le sepsis est une situation complexe impliquant plusieurs organes et systèmes physiologiques à l’échelle de l’organisme c’est pourquoi notre étude nécessite le recours à un modèle animal.
Réduction
Le nombre minimal d’animaux à utiliser a été calculé en se basant sur des expériences préliminaires et des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Une surveillance stricte et rapprochée sera assurée. Les cages seront enrichies (coton, maison en carton) pour limiter hypothermie et stress. La réhydratation intrapéritonéale systématique visera à prévenir la déshydratation. Des points limites adaptés permettront l’euthanasie anticipée si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle adapté pour mimer une infection sévère (sepsis) chez l’Homme. Elle permet de reproduire l’ensemble des complications associés à cette maladie, notamment le dysfonctionnement des vaisseaux et d’organes. Nous utilisons des souris femelles et mâles adultes âgés de 10 à 12 semaines. À 10–12 semaines, les souris ont un système immunitaire pleinement développé et stable. Les jeunes souris (moins de 8 semaines) ont des réponses immunitaires encore immatures, tandis que les souris âgées peuvent avoir des altérations immunitaires ou des comorbidités. L'âge de 10–12 semaines représente un compromis idéal pour limiter ces biais. De plus, cet intervalle d’âge est couramment utilisé dans les modèles animaux, ce qui facilite la comparaison des résultats avec ceux d'autres études publiées. Inclure des souris mâles et femelles permet de détecter d’éventuelles différences de susceptibilité, de réponse au traitement ou de physiopathologie entre les sexes — ce qui est important, car le sepsis affecte différemment les hommes et les femmes chez l'humain. Cela répond aussi aux exigences croissantes en matière de rigueur et d’équité biologique.
Etude de toxicité systémique après administration(s) orale(s) d’un produit de santé
- Formation professionnelle
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
3 280 rats vont être utilisés, 2 980 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour autopsie. Ils reçoivent par sonde orale un produit de santé, sur des durées allant de trois jours à un an, avec des prélèvements sanguins en cours d'étude. Le porteur décrit une irritation liée au passage répété de la sonde, des vocalises lors de la manipulation, de l'agressivité, des douleurs abdominales et une possible détresse respiratoire. L'étude est conduite pour un client qui s'engage par contrat à ne pas dupliquer les essais, et le porteur indique que l'utilisation d'animaux est "requise" par la réglementation et donc "obligatoire".
Objectifs
Le projet vise à respecter les exigences des autorités réglementaires et des normes en vigueur avant l’utilisation d’un produit de santé chez l’Homme. Il évalue la toxicité (i.e. les éventuels effets néfastes sur le corps) du produit de santé ou de ses composants après administration orale (une seule ou plusieurs administration(s)) chez le rat, sur une durée de 3 jours à un an, tout en reproduisant au mieux l'utilisation clinique. Les risques éventuels liés à l’utilisation de ce produit doivent être acceptables et garantir une haute protection de la santé et de la sécurité des patients et des utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de s’assurer avant sa mise sur le marché que l’utilisation du produit de santé est sûr pour les patients afin de répondre aux exigences des autorités réglementaires et des normes en vigueur. Il permet d’évaluer les risques éventuels liés à l’utilisation de ce produit et de s’assurer que les éventuels risques sont acceptables par rapport aux bienfaits/bénéfices apportés aux patients. Les résultats des études aideront à décider si le produit peut être mis ou maintenu sur le marché pour utilisation chez l'Homme, conformément aux règles en vigueur.
Procédures
La fréquence et la dose d’administration orale sont définies en fonction des textes auxquels on se réfère. L’administration sera réalisée de sorte à minimiser autant que possible les nuisances à l’animal (maximum 4 minutes par administration par animal). Pendant l'étude (si besoin), selon une fréquence et un volume n'affectant pas l'animal, des prélèvements sanguins (environ 5 minutes par animal) pourront être réalisés. La durée des interventions en fin d'étude est d'environ 10 minutes chez le rat.
Impact sur les animaux
L’administration par voie orale peut engendrer chez les animaux un stress lié à la contention, un stress ou une gêne légère lié au passage de la sonde, une légère irritation liée au passage répété de la sonde avec gêne légère à la déglutition. Ceci pouvant entraîner de petites pertes de poids, une baisse d'appétit, des comportements atypiques pour l’espèce, vocalises lors de la manipulation et/ou agressivité. Les effets liés au produit (si une toxicité systémique est constatée) et/ou à une mauvaise administration sont des pertes de poids, une baisse d’activité, des douleurs abdominales, voire une détresse respiratoire.
Devenir
Pour les besoins de l'étude, une autopsie est nécessaire. Ceci permet d'évaluer les effets potentiels de toxicité systémique du produit de santé à tester. Ces analyses expliquent l'impossibilité en fin d'étude de maintenir en vie les animaux utilisés. De plus, l’analyse des paramètres sanguins ainsi qu'une évaluation des tissus au microscope (analyse histopathologique) pourra s’avérer nécessaire.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. Les méthodes alternatives existantes ne permettent pas d’évaluer les effets toxiques à court, moyen ou long terme des produits de santé en raison de la complexité des mécanismes de régulation d’un organisme vivant. Il n'existe pas de test in vitro validé ni de modèle simulé par ordinateur capable de reproduire la complexité d'une réaction tissulaire et/ou des effets systémiques. L’utilisation d’animaux est alors obligatoire pour y parvenir.
Réduction
A la constitution de l’étude, le nombre minimal d'animaux requis par les textes de références est considéré. Dans la mesure du possible, les animaux témoins sont mutualisés entre les différents essais (un même groupe d’animaux "témoin" pour plusieurs groupes d’animaux "test" recevant des produits à tester différents). Pour chaque étude, le client pour lequel l'étude est conduite s’engage à ne pas dupliquer les essais via la signature du protocole d’essai. Les études dites "de faisabilité", sur un nombre restreint d’animaux, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur. Le cas échéant, le nombre d'animaux doit être suffisant pour permettre une analyse statistique pertinente (i.e. nombre minimum d’animaux requis) et cela est défini dans la norme. Les analyses statistiques sont réalisées sur le poids des animaux, le poids des organes (absolus et relatifs) et les paramètres sanguins.
Raffinement
La stratégie de raffinement est établie afin de limiter le stress et la douleur des animaux. Elle repose sur la présence d’enrichissements du milieu en systématique, un suivi sanitaire et clinique renforcé pendant la/les phase(s) d’administration avec une visite vétérinaire en cas d’anomalie clinique, sanitaire ou comportementale, pour permettre une gestion adéquate de la douleur ou de l’anomalie constatée selon chaque cas. Un suivi des points limites spécifiques au projet sera mis en place et tracé en temps réel au moment des observations.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans le(s) texte(s) de référence. De plus, il est largement utilisé, rendant disponibles de nombreuses données dans la littérature (données sur différents modèles - raffinement, données basales de pathologie…). Le choix du stade de développement est décrit dans le(s) texte(s) de référence qui recommande(nt) l'utilisation d'animaux adultes, âgés d’environ 6 à 12 semaines.
Évaluation de la toxicité et de la pharmacocinétique de composés anti-infectieux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 210
Chercher la dose la plus forte qu'un animal peut recevoir avant que la toxicité devienne sévère : 760 souris et 210 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue pour prélever organes et fluides. 45 études sont prévues sur cinq ans. Les animaux subissent des injections, un cathétérisme urétral qui peut enflammer la vessie, des administrations intranasales et des prélèvements sanguins répétés, avec pour effets annoncés une posture voûtée, un poil hérissé, des diarrhées, une gêne respiratoire et des hématomes. Le porteur présente le projet comme un moyen d'accélérer le développement de traitements contre des infections graves ou résistantes, tout en optimisant les coûts et les délais des programmes de recherche et développement.
Objectifs
Ce projet vise à déterminer la concentration maximale tolérée et à caractériser les profils pharmacocinétiques de nouvelles molécules anti-infectieuses chez la souris et le rat. L’objectif principal de l’étude est de déterminer la dose la plus élevée d’un composé pouvant être administré sans provoquer d’effets toxiques sévères chez les animaux, et ce, selon une voie d’administration donnée. Cette étape est essentielle pour évaluer la tolérance aiguë ou subaiguë d’un composé chez l’animal. Les traitements évalués incluent des antibiotiques, des antifongiques, des antiviraux, ainsi que des biothérapies innovantes comme les anticorps. Des observations cliniques et des analyses biologiques permettront d’évaluer les éventuels signes de toxicité ou d’effets secondaires. Les études de pharmacocinétique visent à déterminer comment un composé anti-infectieux est absorbé, distribué, métabolisé et éliminé dans l’organisme. Elle permet de mesurer l’exposition systémique après administration, notamment dans les tissus ciblés. Ces données servent à optimiser la posologie et à établir la relation entre la concentration et l’efficacité. Elle est essentielle pour prédire les conditions dans lesquelles le traitement sera le plus efficace. 45 études sont prévues pour la totalité du projet de 5 ans
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet permettra de sélectionner les doses maximales tolérées et les schémas d’administration optimaux des candidats thérapeutiques, afin de sécuriser leur usage dans les modèles infectieux. La concentration maximale tolérée constitue une étape fondatrice de la caractérisation préclinique ; elle assure à la fois la sécurité des animaux, la pertinence des doses testées, et la robustesse des données biologiques qui en découleront. Ce projet génèrera également des données de pharmacocinétiques robustes permettant de modéliser précisément la relation dose-exposition-efficacité. Ces informations orienteront le choix des molécules à prioriser et réduiront le recours inutile à des expérimentations ultérieures inefficaces. À moyen terme, les résultats obtenus renforceront la prédictibilité des études précliniques et amélioreront la transposabilité des données vers l’Homme ou l’animal. Cela contribuera à accélérer le développement de traitements innovants contre des infections graves ou résistantes, tout en optimisant les coûts et délais des programmes de recherche et développement.
Procédures
Les nuisances principales concernent la douleur et l'inconfort induits par les injections et les douleurs liés au traitement. Des efforts sont faits pour limiter ces impacts en suivant des protocoles de réduction de la douleur et du stress. L'anesthésie avec l'isoflurane induit un stress de courte durée (15 secondes). Les piqûres d’aiguille pour traiter les animaux entraînent une douleur légère de courte durée (2 secondes). L'administration par voie urétrale nécessite l'installation d’un cathéter et peut induire une inflammation locale de la vessie, causant un léger inconfort temporaire (1 minute). L'administration par voie intranasale de molécules peut entraîner une inflammation : douleur modérée (10 secondes).
Impact sur les animaux
Dans le cadre des études de dose maximale tolérée et de pharmacocinétique, les composés anti-infectieux testés peuvent induire certains effets indésirables transitoires chez la souris et le rat. Des réactions légères sont attendues, telles qu'une diminution temporaire de l’activité, une perte de poids modérée ou une légère réaction inflammatoire au point d’injection. En fonction des doses et de la voie d’administration, des signes de toxicité plus marqués peuvent apparaître, comme un poil hérissé, une posture voûtée, une réduction de la mobilité, ou une altération de la respiration. Des troubles digestifs (comme une diarrhée), une irritation locale ou des complications liées aux prélèvements sanguins (hématome, saignement) peuvent également survenir. Tous les animaux seront suivis au moins quotidiennement, et en cas de signes cliniques sévères, des soins adaptés seront appliqués par le responsable du projet (sur avis du vétérinaire).
Devenir
A la fin de chaque procédure tous les animaux sont mis à mort, afin d’en prélever les organes et fluides biologiques afin de quantifier des biomarqueurs divers.
Remplacement
Plusieurs approches alternatives sont utilisées en amont pour limiter le recours à l’expérimentation animale pour l'évaluation des effets secondaires ou de la biodistribution. Les tests ex vivo, comme les coupes de poumon ou les explants intestinaux, permettent de tester localement des anticorps monoclonaux ou des peptides antimicrobiens, mais ne reflètent pas les effets systémiques, ni la diffusion du traitement. Les organoïdes intestinaux ou pulmonaires humains, ou les organes sur puce permettent d’étudier les effets localisés d’un traitement, mais ne modélisent pas la pharmacocinétique, la biodistribution ou l’immunité adaptative. Les modélisations informatiques, comme les simulations de liaison médicament-récepteur, ou les réseaux d’interactions immunitaires, sont utilisées pour affiner les posologies ou prédire des toxicités, mais nécessitent toujours une validation expérimentale. Seule l’expérimentation animale permet d’intégrer la complexité de la réponse immunitaire, de la clairance, de la toxicité systémique et de l’efficacité dans un organisme complet. Ces approches non animales sont néanmoins systématiquement mobilisées en phase précoce pour sélectionner les meilleurs candidats et optimiser les doses.
Réduction
Nous utilisons systématiquement des tests alternatifs comme le test de viabilité cellulaire, l’essai de cytotoxicité, l’analyse de paramètres inflammatoires, ou encore des modèles d’organoïdes humains pour sélectionner les composés les plus prometteurs avant toute phase expérimentale chez l'animal. Des modèles d'explant de poumon et de peau humaine reconstituée sont également utilisés pour évaluer la diffusion et l’irritation locale des produits candidats. Grâce à cette combinaison d’approches, nous réduisons significativement le nombre d’animaux utilisés tout en sécurisant la progression des thérapies testées.
Raffinement
Dans les études pharmacocinétiques, le raffinement repose sur des prélèvements sanguins peu invasifs (comme le micro-échantillonnage) et la réduction du stress par contention douce et habituation des animaux. L'utilisation de plans expérimentaux optimisés et de modèles bio-informatique permettent de raffiner nos protocoles. Le choix judicieux des temps de prélèvement et l'exploration de matrices alternatives (urine, salive) réduisent les interventions tout en assurant la qualité des données. Pour la détermination de la dose maximale tolérée, des protocoles adaptatifs avec escalade progressive des doses permettent de mieux contrôler l’apparition de toxicités. Des grilles d’évaluation clinique précises assurent l’arrêt rapide du traitement en cas de signes de souffrance. L’inclusion de biomarqueurs précoces permet d’anticiper les effets délétères avant qu’ils ne deviennent irréversibles. Des critères d'arrêt stricts sont définis pour éviter la souffrance excessive des animaux. Par exemple, l’apparition de signes cliniques graves tels qu'une respiration difficile, ou une perte de réponse à un stimulus conduiront à l’interruption immédiate de l’expérience. L’objectif est de garantir que l’état de l’animal est constamment suivi et que des soins vétérinaires sont fournis dès que nécessaire. La prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse (isoflurane) et administration d'analgésique au préalable des gestes douloureux (injection par piqûre...).
Choix des espèces
L’utilisation de la souris et du rat pour les procédures de détermination de la dose maximale tolérée et d’études pharmacocinétiques repose sur des considérations scientifiques, réglementaires et techniques. D’une part, la souris est l’espèce de référence en infectiologie préclinique, en raison de sa petite taille, de sa sensibilité bien documentée à de nombreux agents infectieux, et de la disponibilité de lignées standardisées. Elle permet une évaluation rapide de la tolérance aiguë d’un composé et de ses premiers paramètres pharmacocinétiques dans un modèle robuste, avec un nombre limité d’animaux et un faible volume de substance requis. D’autre part, le rat est utilisé en complément ou en seconde intention, car il permet des prélèvements sanguins en série plus volumineux, offrant une meilleure résolution temporelle dans l’analyse pharmacocinétique, et il est plus adapté à certaines voies d’administration. La complémentarité entre ces deux espèces permet donc d’obtenir des données fiables et conformes aux exigences des agences réglementaires. Dans le cadre des procédures de dose maximale tolérée et de pharmacocinétique, seuls des animaux adultes sexuellement matures ou jeunes adultes seront utilisés. Il s’agit d’un choix visant à garantir une réponse pharmacologique homogène, une tolérance physiologique suffisante, et une réduction des variables liées au développement ou au vieillissement. Chez la souris, les animaux seront âgés de 6 à 10 semaines, un stade où la croissance est stabilisée, la physiologie métabolique est mature, et le volume des fluides corporels est adapté aux manipulations et aux prélèvements sans risque excessif. Chez le rat, les animaux seront âgés de 8 à 12 semaines, âge auquel les volumes sanguins autorisent des prélèvements sériels et où les capacités d’absorption, de métabolisme et d’élimination sont représentatives de l’âge adulte.
Evaluation de la neurovirulence de candidats vaccins virus vivants atténués issus de souches virales neurotropiques
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Pour vérifier qu'un procédé de fabrication n'a pas rendu un vaccin contre la fièvre jaune plus virulent, 4 000 souris de quatre semaines reçoivent une injection directement dans le cerveau, sous anesthésie gazeuse de cinq minutes, puis sont observées trois semaines. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour un examen histologique de leurs organes. Le porteur attend comme effets des signes de neurovirulence, paralysie et incapacité à se déplacer et à se nourrir, et écarte l'analgésie au motif qu'elle ajouterait une piqûre ou fausserait l'inflammation observée. Il cite une méthode in vitro publiée, "BBB-Minibrain", qu'il juge trop variable, et conclut que le test sur des animaux non-humains reste exigé par les lignes directrices de l'OMS pour libérer les lots.
Objectifs
Afin de répondre aux exigences de la réglementation, la neurovirulence de nouveaux vaccins en développement qui ont un tropisme pour le système nerveux central doit être comparée avec un vaccin de référence pour assurer et documenter le maintien de l’atténuation au cours de la multiplication virale lors du processus de fabrication. Le vaccin contre la fièvre jaune est un vaccin vivant atténué ayant un tropisme pour le système nerveux. Le caractère vivant atténué de ce vaccin implique un risque potentiel, lors du processus de fabrication, de réversion vers un phénotype plus virulent. Administré chez l’homme, un vaccin avec une virulence excessive pourrait entrainer des signes adverses graves tels qu’une encéphalite et une paralysie des nerfs crâniens. La réglementation demande donc que la stabilité du vaccin au cours du processus de fabrication soit évaluée en amont afin de garantir la sécurité des personnes qui recevront une injection vaccinale. Le projet vise donc à administrer des dilutions de vaccin contre la fièvre jaune à des souris, hébergées pendant une durée adaptée pour observer l’apparition éventuelle de symptômes cliniques neurologiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont : Valider le processus de fabrication de vaccins contre la fièvre jaune Contribuer in fine au développement de vaccins sûrs pour l’Homme et conformes aux spécifications et aux textes de référence en vigueur
Procédures
Administration unique de moins d’une minute sous anesthésie gazeuse d’environ 5 minutes, pour tous les animaux.
Impact sur les animaux
Signes cliniques caractéristiques de la neurovirulence du virus étudié (paralysie, incapacité à se déplacer et à se nourrir…). Effets secondaires transitoires liés à l’anesthésie (étourdissement et perte d'équilibre brefs suite à l’anesthésie).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de collecter les organes et faire une évaluation histologique.
Remplacement
A ce jour, Il existe une méthode in vitro « BBB-Minibrain », décrite mais cette approche repose sur l’utilisation de cellules primaires nécessitant plusieurs jours de différenciation. À l’issue de ce processus, il a été observé une forte variabilité, ce qui limite considérablement la fiabilité de la méthode. Ainsi, même si un développement a été réalisé et publié, cette méthode ne permet pas une comparaison robuste et reproductible des vaccins à tester selon les exigences règlementaires des lignes directrices. Dans ce projet, l’évaluation de la neurovirulence se fait en évaluant les signes cliniques et les points limites, dans l’engagement à respecter les exigences réglementaires et à garantir la qualité et la sécurité du vaccin requis par les lignes directrices en vigueur (WHO TRS872 annexe 2, Appendix 3). Il est donc nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, pour évaluer l’ensemble des paramètres demandés par la ligne directrice. Il n'existe pas des méthodes in vitro validés et acceptés par les autorités pour évaluer la sécurité de lots de vaccin de la fièvre jaune obtenus par culture sur œuf.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés au total est calculé au plus juste de façon à répondre aux exigences réglementaires afin d’obtenir des résultats robustes et exploitables.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages sur fond plastique et sur de la litière avec un enrichissement adapté (par exemple : papier kraft, bâtonnet et matériel de nidification) et dans des conditions environnementales appropriées pour cette espèce. L’injection intracérébrale par voie transcutanée consiste en une simple injection avec une aiguille de 27G très rapide (30 secondes), sans résistance, sans chirurgie (pas d’incision) ni utilisation de cadre stéréotaxique, sur un animal sous anesthésie (moins de 5 minutes) à des concentrations d'Isoflurane assurant l’inconscience de l’animal et donc l’absence de douleur ressentie pendant l’injection. La voie d’injection utilisée n’induit pas plus de douleur qu’une injection intrapéritonéale et moins qu’une injection intraveineuse ou intramusculaire et l’administration d’un analgésique (par exemple la lidocaïne pour éviter tout biais sur l’inflammation attendue) n’est pas pertinente car cela nécessiterait la réalisation d’une deuxième injection avant l’anesthésie donc une douleur et un stress pour l’animal (analgésique systémique) ou alors allongerait la durée de la procédure (analgésique local). L’administration d’un anti-inflammatoire n’est pas nécessaire et interfèrerait avec l’objectif de l’étude (évaluation de la neurovirulence). L’observation clinique des animaux témoins immédiatement après l’injection et lors du retour dans la cage après le réveil dans des études réalisées précédemment n’a pas montré de signes de douleur visible (absence de piloérection, prostration, abattement, posture voutée...). De plus le protocole d’étude doit être 100% comparable aux études antérieures pour ne pas apporter de biais dans les comparaisons de résultats. Les animaux sont observés au moins 1 fois par jour (incluant le week-end) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile. Des points limites stricts et spécifiques au projet sont appliqués : En cas de signes cliniques ayant des répercussions importantes sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire y compris l'euthanasie. En cas de de signes cliniques entrainant des difficultés pour accéder à la nourriture, des gels hydratants avec ou sans aliments pourront être rajoutés dans les cages des animaux afin qu'ils puissent se nourrir plus facilement, ainsi que des croquettes à même la litière.
Choix des espèces
L'espèce murine est largement décrite dans la littérature pour l'évaluation de la neurovirulence de virus neurotropiques. Les souris seront âgées de 4 semaines au moment de l’injection et seront observées pendant 3 semaines, tel que préconisé dans les lignes directrices.
Analyse de la réponse immunitaire, de la protection contre l’infection et de la stabilité d’un candidat vaccin universel antigrippal dans un modèle préclinique murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
992 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Toutes reçoivent deux vaccinations intramusculaires dans les pattes sous anesthésie, à vingt et un jours d'intervalle, et 37,5 % d'entre elles sont infectées par le virus de la grippe par inhalation sous anesthésie profonde, puis pesées chaque jour pendant quatorze jours. Le porteur indique que la dose élevée de virus peut provoquer une perte de poids marquée et des signes cliniques, et que les animaux sont mis à mort soit à l'atteinte d'un point limite, soit en fin d'étude pour les prélèvements. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la physiologie d'un "organisme entier" et que le recours à la souris est "nécessaire" pour satisfaire les exigences réglementaires.
Objectifs
La grippe est une maladie virale aigue, fréquente et très contagieuse causée par des virus grippaux circulant dans le monde. Elle provoque chaque année environ 1 milliard de cas, 3 à 5 millions de cas graves (infections respiratoires entraînant des hospitalisations), et entre 300 000 et 650 000 décès particulièrement chez les individus vulnérables (personnes âgées, les enfants et immunodéprimés). Les souches responsables de la grippe, principalement de type A ou de type B, peuvent coexister sur une saison, ce qui rend le taux d’incidence annuel imprévisible. La vaccination reste à ce jour la stratégie la plus efficace pour protéger les populations. Elle agit en induisant des réponses immunitaires contre la souche virale circulante, ciblant les protéines de surface du virus. Cependant ces vaccins présentent une efficacité limitée : ~32 % pour les personnes âgées et ~43% pour les personnes adultes. Cette efficacité réduite s’explique en partie par les mutations très fréquentes, diminuant la correspondance entre le vaccin en cours et la souche circulante. D’autre part, le virus de la grippe renferme une protéine interne, hautement conservée entre les différentes souches virales. Cette caractéristique fait d’elle une cible pertinente pour de nouveaux vaccins universels capables d’induire des protections plus durables et plus efficace, notamment en cas de pandémies. L’objectif est de renforcer l’efficacité en testant de nouveaux candidats, ciblant la protéine interne, chez la souris. Cela se fait via deux axes principaux : élargir la couverture vaccinale en ciblant simultanément les souches A et B, et renforcer la réponse immunitaire grâce à l’ajout d’un adjuvant. Le second axe vise à étudier si une réponse immunitaire préexistante, induite par des expositions antérieures aux virus grippaux, peut améliorer ou modifier la réponse à une vaccination contre la grippe. Ce projet vise ainsi à contribuer à la mise au point d’un vaccin plus performant et mieux adapté aux défis épidémiologiques posés par la grippe.
Bénéfices attendus
Contrairement aux protéines de surface du virus de la grippe qui mutent souvent, la protéine interne, située à l'intérieur du virus, est beaucoup plus conservée entre les différentes souches de grippe. Cette faible variabilité fait d’elle une cible intéressante pour le développement de vaccins à large spectre, pouvant offrir une protection universelle contre diverses souches grippales contre la grippe saisonnière humaine, mais aussi contre d'autres sous types de la maladie actuellement présents chez les espèces aviaires, ayant le potentiel de provoquer une nouvelle pandémie. Le bénéfice attendu du projet est donc d’accroître l’efficacité des vaccins antigrippaux saisonniers et de garantir une préparation optimale en cas de future pandémie grippale. À l’issue de ces recherches, le candidat-vaccin entrera en phase clinique chez l’humain, avec pour objectif de diminuer la mortalité et l’incidence des formes graves de la grippe, apportant un bénéfice majeur à la santé publique.
Procédures
Tous les animaux du projet vont recevoir 2 vaccinations, réalisées par voie intra musculaire dans les pattes sous anesthésie générale légère. Ces injections sont espacées de 21 jours et chaque injection dure quelques secondes. Au moment de la mise à mort, un prélèvement sanguin est réalisé sous anesthésie générale légère dans 3 procédures sur 4 (81% des animaux). Les infections virales (représentant 37,5% des animaux) sont réalisées par inhalation et sous anesthésie profonde par injection. Cette injection est réalisée en quelques secondes, 1 seule fois par souris. L’infection est réalisée en quelques minutes pour chaque souris, afin de garantir la réussite du geste et la sécurité de l’animal. Les souris infectées seront pesées tous les jours sur une période de 14 jours.
Impact sur les animaux
Le geste de l'immunisation intramusculaire peut entrainer une douleur locale mais temporaire suite à l’injection. Les formulations utilisées sont à base de solution saline et les volumes injectés limitent fortement les risques de souffrance. L’infection virale par inhalation peut provoquer un stress léger et transitoire. 2 doses de virus seront utilisées en fonction des expériences : - une dose faible à laquelle une légère perte de poids peut être observée dans les quelques jours suivant l’infection, paramètre qui sera surveillé. - une dose élevée pouvant entrainer une perte de poids plus importante avec des signes cliniques (modification du comportement et altération de l’aspect physique. Une surveillance quotidienne rigoureuse sera mise en place pour minimiser la souffrance animale
Devenir
L'ensemble des animaux du projet sont mis à mort soit après atteinte d'un point limite défini dans le protocole, soit en fin d'étude pour les prélèvements post mortem nécessaires. Cette approche garantit le respect du bien-être animal tout en se conformant aux exigences réglementaires post-exposition.
Remplacement
La vaccination repose sur la mise en place d’une réponse immunitaire dans différents organes de la souris. Aucun modèle in vitro n’est actuellement capable de reproduire une telle dynamique. Des études de remplacement sont en cours de développement, mais cela ne permet pas mimer la physiologie d’un organisme entier. L’utilisation de la souris s’avère donc pertinent et est même nécessaire afin de satisfaire les exigences réglementaires.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est basé sur nos études antérieures et des approches statistiques, afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables et robustes, permettant de détecter des différences significatives entre les groupes. Au sein d’une même procédure, plusieurs candidats vaccins seront testés en parallèle afin de réduire le nombre d’animaux du groupe contrôle. Le nombre d’animaux estimé correspond au nombre maximum d’animaux pouvant être utilisé dans ce projet. Cependant, durant tout le long du projet, en fonction des résultats obtenus à chaque procédure ou chaque temps points, les nombre d’animaux pourront être réduits et certains temps points supprimés.
Raffinement
Les souris seront acclimatées au minimum durant une semaine avant le début d’une procédure. Dans l’ensemble de nos groupes expérimentaux, un enrichissement de l’environnement est systématiquement mis en place dans les cages des souris afin d’améliorer leur bien-être. Cet enrichissement comprend, par exemple, l'ajout de maisonnettes en carton, de morceaux de bois, ainsi que d'autres éléments favorisant l'expression des comportements naturels des animaux. Ces mesures visent à diminuer le stress et à promouvoir un état émotionnel positif tout au long de l’étude. La vaccination est réalisée dans les pattes de la souris sous anesthésie légère, afin de limiter le stress lié à la préhension et la piqure. Les infections virales par inhalation seront réalisées sous anesthésie profonde. Des surveillances régulières sont assurées après les différentes études de pré-infection ou d’infection. Suivant l’infection, des croquettes et de l’eau pourront être mises à disposition dans la cage pour faciliter leur accessibilité. Une eau gélifié contenant l’équivalent nutritifs des croquettes pourra être utilisé comme substitut et déposé directement dans la cage. Enfin, au moment de l’euthanasie, un prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie locale (Collyre anesthésique local) et sous anesthésie gazeuse pour minimiser toute sensation de douleur.
Choix des espèces
Parmi les différentes espèces animales utilisées en expérimentation, la souris est l’animal le mieux adapté pour le développement de modèles immunologiques d’autant plus que notre équipe maîtrise les outils et méthodes associés. Le modèle murin est par ailleurs largement documenté dans la littérature, ce qui nous permet de situer et de comparer nos résultats aux données existantes. Cette espèce offre donc tous les critères requis pour atteindre nos objectifs et mettre au point de nouvelles formulations vaccinales contre les infections grippales. Les animaux âgés de 5 semaines seront réceptionnés par l’animalerie et utilisés seulement après une période d’acclimatation d’une semaine. Nous allons donc utiliser des animaux sevrés de 6 semaines (jusqu’à 12 semaines si besoin). Le système immunitaire est décrit comme mature à partir de cet âge-là et non vieillissant.
Performances et sécurité de nouveaux agents d’embolisation artérielle
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles urogénitaux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Plusieurs embolisations de chaque côté, sur les deux reins, en gardant une fonction rénale de 50 % : 34 jeunes porcs charcutiers de 3 à 5 mois vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil ou impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'analyse microscopique de leurs organes. Sous anesthésie générale, chaque porc subit une prise de sang et l'occlusion, guidée par imagerie, de branches de l'artère rénale. Un groupe est tué sans reprendre conscience. L'autre est réveillé et suivi d'une semaine à trois mois, avec des douleurs et une perte d'appétit possibles dues à l'ischémie des reins, un hématome ou une boiterie, avant une seconde anesthésie, sans réveil, pour une angiographie et une dernière prise de sang. Le porteur choisit le porc pour sa taille et ses vaisseaux proches de ceux des humains, et indique que la performance et "l'innocuité" de ces dispositifs implantables "doivent être évalués chez l'animal", avec des résultats versés aux dossiers de demande d'autorisation de mise sur le marché.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité et la sécurité de nouveaux agents d’embolisation utilisés en radiologie interventionnelle (RI), avant leur application chez les patients. La RI est une spécialité médicale qui associe une technique d’imagerie (rayons X, ultrasons, résonnance magnétique) à un geste mini- invasif pour diagnostiquer et/ou traiter un large éventail de maladies, dont les cancers. L’embolisation est une procédure de radiologie qui consiste à injecter à l’intérieur d’un vaisseau un produit pour l’occlure. Le but visé est, soit d’arrêter un saignement (traumatisme, hémorragie du post-partum, hémoptysie…), soit de dévasculariser un tissu pathologique irrigué par ce vaisseau en le privant d’apport sanguin (fibrome utérin, adénome de la prostate, tumeur hépatique, malformation vasculaire…). De nouveaux matériaux sont actuellement à l’étude pour améliorer les traitements par embolisation. On peut notamment citer les matériaux dégradables, la fonctionnalisation des matériaux ou l’introduction d’adjuvants pour rendre les dispositifs visibles en imagerie ou encore chargeables avec des principes actifs. Tous ces agents d’embolisation sont des dispositifs médicaux implantables pour lesquels la performance et l’innocuité doivent être évalués chez l’animal avant de les utiliser en clinique. Les résultats obtenus seront versés aux dossiers réglementaires pour les demandes d’autorisation de mise sur le marché.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont d’ordre technologique et médical. Il s’agit de tester de futurs produits de santé destinés à une utilisation chez l’homme. La radiologie interventionnelle a révolutionné la pratique de la médecine moderne grâce à l'introduction, au développement et à la validation de thérapies peu invasives, dont beaucoup ont non seulement remplacé des procédures invasives, mais ont également offert de nouvelles solutions diagnostiques et thérapeutiques là où il n'en existait pas auparavant. La radiologie interventionnelle s’inscrit de plus en plus dans les perspectives curatives de maladies cancéreuses, que ce soit par l’efficacité propre de ses méthodes ou dans le cadre de traitements combinés avec d’autres techniques. Ce projet bénéficiera donc directement aux patients, les nouveaux agents d’embolisation testés pourront être appliqués en clinique dès leur sécurité d’utilisation établie selon les bonnes pratiques de laboratoire.
Procédures
Chaque animal sera soumis à une anesthésie générale pendant laquelle une prise de sang et une intervention chirurgicale mini-invasive guidée par l’imagerie (embolisations 30-40 minutes) sera réalisée. Un groupe d'animaux sera mis à mort à l'issue de cette procédure sans réveil de l'anesthésie, un autre groupe sera réveillé et observé quotidiennement, de 1 semaine à 3 mois selon les lots, avant une deuxieme anesthésie générale sans réveil pour un contrôle angiographique et un prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les animaux sans réveil sont liées à l’induction de l’anesthésie : stress à la contention, injection intramusculaire. Pour les animaux suivis en post opératoire, le réveil de l’anesthésie peut s’accompagner de nausées, désorientation, hypothermie, irritation trachéale. L’intervention chirurgicale par voie endovasculaire est mini invasive, l’embolisation de branches de l’artère rénale induit une ischémie qui peut amener des douleurs et occasionner une perte d’appétit passagère. Les effets indésirables consécutifs à l’accès vasculaire sont un hématome et éventuellement une boiterie.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour prélever des organes à but d'analyses microscopiques.
Remplacement
Plusieurs mesures alternatives ont été mises en œuvre en amont des tests in vivo: Lors de l’étape de design du dispositif, les fabricants cherchent les données de biocompatibilité disponibles pour les matériaux utilisés. Ceux dont les effets et les doses toxiques sont connus sont éliminés de la composition de l’implant, afin de réduire le risque d’effets pathologiques locaux. Des tests in vitro de performances ou de cytotoxicité permettent également d’exclure certaines compositions qui ne répondent pas aux spécifications du dispositif, et de diminuer le nombre de prototypes à tester in vivo. Après ces tests préalables sur modèles non-vivants, nous arrivons à un stade de développement des dispositifs où un certain nombre de conditions du vivant ne peuvent être modélisées dans des systèmes in vitro : contact avec le sang, déformation des vaisseaux, réaction tissulaire et dégradation des produits, ré-ouverture des vaisseaux ; cicatrisation, persistance de la fonction rénale… Le recours à l’animal vivant devient alors indispensable, les modèles in vitro sont insuffisants du point de vue réglementaire pour envisager des essais cliniques chez l’Homme: des essais sur animaux vivants sont exigés par les agences sanitaires pour apporter des données supplémentaires fiables sur le comportement des dispositifs implantables dans les tissus vivants.
Réduction
Tous les moyens ont été mis en œuvre pour réduire le nombre d’animaux, à savoir premiers essais initiés sur modèles alternatifs, progression par étapes avec amélioration et raffinement des dispositifs, détermination des effectifs sur la base des attentes réglementaires, progression par étapes avec amélioration et raffinement des dispositifs. Le nombre total d’animaux est aussi optimisé en traitant les deux reins et en réalisant plusieurs embolisations par coté (tout en maintenant une fonction rénale de 50%).
Raffinement
Toutes les interventions (prise de sang, angiographie, embolisations) se font sous anesthésie générale avec traitement de la douleur. Les animaux sont hébergés en groupe social dans un environnement contrôlé en température et hygrométrie. Ils reçoivent une alimentation adaptée à leurs besoins, de l’eau à volonté, des jouets et dispositifs favorisant leurs comportements naturels comme le fouissage et mâchouillement. Un temps d'habituation avec douche tiède, promenade et distribution de récompenses permet leur familiarisation et la réalisation des examens cliniques sans contrainte (prise de température, palpation, auscultation...). Une équipe compétente de zootechniciens, vétérinaire et médecins assure au quotidien l’entretien, la surveillance et les soins. Une vidéosurveillance 24h/24 permet d'observer les comportements en animalerie et d'intervention rapidement en cas d’anomalie. Une grille d’évaluation de la douleur est établie avec la conduite à tenir en cas de complications. Des points limites sont définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance. La Structure en charge du bien-être animal accompagne le suivi des animaux. Avec le vétérinaire désigné, elle conseille les responsables dans l’amélioration de leurs pratiques en faveur du bien-être des animaux et de l’application des 3R.
Choix des espèces
Parmi les différentes espèces animales, le porc est l’espèce de choix pour les études impliquant de la chirurgie en raison de sa grande taille et de ses ressemblances anatomiques avec l'homme. Les similitudes vasculaires (arborescence générale, calibres des vaisseaux, flux sanguins) permettent de reproduire fidèlement chez le porc les scénarios d’administration vasculaire des agents d’embolisation en radiologie interventionnelle, avec des imageurs et matériels identiques à ceux utilisés pour les patients. De jeunes porcs charcutiers, âgés de 3 à 5 mois, seront utilisés. A cet âge les animaux ont atteint une taille suffisante pour réaliser les procédures de cathétérisme et embolisation avec le même matériel que chez l’homme.
Modélisation préclinique de l’infection par le virus de la fièvre jaune et évaluation de composés de recherche à visée prophylactique ou thérapeutique
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Injectées de plasmides par voie hydrodynamique, soumises à des prélèvements sanguins répétés puis infectées par le virus de la fièvre jaune, 1 000 souris, dont des lignées immunodéficientes et des lignées humanisées, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que l'injection de plasmides provoque des hématomes, des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l'état général, et que l'infection peut entraîner perte de poids, hypothermie, paralysie des membres postérieurs et mort. L'effectif ne repose sur aucun calcul statistique : il est estimé à partir du nombre d'études des années précédentes et d'une croissance anticipée, "en accord avec le plan commercial". Deux cents souris pourront être transférées vers un protocole de formation interne aux gestes techniques, à condition de n'avoir pas été infectées, les autres étant tuées en atteignant les points limites ou sur décision du vétérinaire.
Objectifs
La fièvre jaune est une maladie virale transmise par les moustiques, principalement dans les régions tropicales. Elle peut causer de la fièvre, des douleurs musculaires et des nausées. Dans 15% des cas, la maladie évolue vers une forme grave, caractérisée par une jaunisse et des hémorragies pouvant entraîner le décès du patient. Il n’existe pas de traitement antiviral pour soigner cette maladie, mais la vaccination est efficace pour la prévenir. Le vaccin est préparé à partir d’un virus vivant atténué. Les objectifs de ce projet sont multiples : - Modéliser et caractériser l’infection par le virus de la fièvre jaune dans des souris - Evaluer l’innocuité de composés de recherche à visée prophylactique ou thérapeutique (traitements ou vaccins) - Caractériser les réponses immunitaires induites par ces composés de recherche - Evaluer l’efficacité antivirale de ces composés de recherche chez des souris infectées par le virus de la fièvre jaune Pour répondre à ces objectifs, nous utiliserons des souris conventionnelles non-humanisées (immunocompétentes ou immunodéficientes), ou des souris dites humanisées (système immunitaire ou foie), ou doublement humanisées (système immunitaire + foie).
Bénéfices attendus
Grâce à ce projet, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle préclinique prédictif permettant d'étudier le virus de la fièvre jaune ainsi que l’efficacité de composés de recherche innovants.
Procédures
Des administrations de composés à visées thérapeutiques seront réalisées avec une fréquence définie par le protocole d’étude. Leurs durées seront de 10 à 15 secondes chacune. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. À l’issue des études, les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.
Impact sur les animaux
-Injection de plasmides : les nuisances attendues sont des hématomes et des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Administration de traitements ou de virus : il n’y a pas de nuisances attendues, mais il existe un risque d’observer des effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées). L’infection par le virus de la fièvre jaune peut entraîner une perte de poids, une hypo-activité, une diminution de la température corporelle, une paralysie des membres postérieurs traduisant une atteinte neurologique, et la mort. - Prélèvements sanguins : il n’y a pas de nuisance attendue mais un risque d’hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés soit parce qu’ils atteignent les points limites, soit par décision du vétérinaire. Certains animaux pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve que les souris n’aient pas subit de geste plus sévère qu'une injection hydrodynamique et qu’elles n’aient pas été infectées avec le virus. Cette réutilisation permet de ne pas commander des souris spécifiquement pour la Formation mais d’utiliser nos souris déjà présentes.
Remplacement
Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un modèle étudiant les interactions complexes qui peuvent exister entre le système immunitaire et le virus de la fièvre jaune, permettant de reproduire l’infection du virus tout en objectivant les effets thérapeutiques et toxicologiques de composés de recherche destinés à son traitement ou sa prévention. Les modèles murins constituent donc une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 1000 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser environ 20 études précliniques de 50 souris. Aucune approche statistique n'a été réalisée pour le nombre total d’études, ou pour le nombre total d’animaux dans le projet, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial.
Raffinement
En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables de 5 individus maximum. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (ex : Diet Gel). La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Des mesures pour éviter tout stress au moment de l’euthanasie sont prévues. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction des scores cliniques et de la perte de poids.
Choix des espèces
90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente permet la création de lignées humanisées. Le modèle murin a été choisi en raison de sa capacité à reproduire des aspects clés de la pathogénie de l’infection par le virus de la fièvre jaune, notamment en conditions d’immunodéficience ou après adaptation virale. Certaines souches ou lignées modifiées permettent de mimer la susceptibilité humaine (atteinte hépatique, réponse inflammatoire), ce qui en fait un modèle pertinent pour l’évaluation de composés antiviraux ou prophylactiques. Pour les souris non humanisées et humanisées avec des cellules sanguines provenant du sang périphérique, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 4 semaines, ces souris pouvant être utilisées dès leur sevrage. Pour les souris humanisées avec des cellules souches issues de cordons ombilicaux humains, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules humaines dans le sang. Pour les souris humanisées au niveau du foie ou double-humanisées (foie + système immunitaire), les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 13 semaines, première apparition des hépatocytes dans le foie.
Etudes de pharmacologie de sécurité sur rongeurs sur les fonctions, neurologique et cardiovasculaire
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 7200
9 000 rongeurs, soit 7 200 rats et 1 800 souris, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour mesurer les effets indésirables de molécules sur la respiration, le système nerveux et le cœur. Outre les administrations de la molécule et les prises de sang, ils sont isolés jusqu'à 12 heures dans un pléthysmographe, contenus éveillés pour des tests neurologiques non détaillés, et une partie des rats reçoit par chirurgie un émetteur de télémétrie. L'établissement, spécialisé dans les études réglementaires, produit pour chaque composé un rapport d'effets adverses, étape d'un dossier qui débouchera "potentiellement sur la commercialisation d'un nouveau médicament". Les rongeurs sont tués en fin de procédure, et une partie, en général des rats porteurs d'un émetteur, peut être réutilisée dans des procédures sans réveil, comme un prélèvement d'organes, 3 000 étant déclarés réutilisés. Le porteur affirme que "Seule l'expérimentation animale permet de définir leur innocuité".
Objectifs
L’établissement utilisateur est spécialisé dans la conduite d’études de toxicologie/pharmacologie réglementaires, lesquelles sont indispensables pour initier l’évaluation clinique d’un xénobiotique. La pharmacologie de sécurité est un élément réglementaire indispensable dans le développement préclinique d’un futur médicament. Préalablement aux études cliniques, les effets d’une molécule sur les fonctions vitales (respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires) doivent être caractérisés chez l’animal en respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire. Du fait de la complexité des organismes vivants, il n’existe actuellement aucun modèle de remplacement pour prédire les effets pharmacologiques d’une molécule. Seule l’expérimentation animale permet de définir leur innocuité afin de sécuriser les premiers essais chez l’humain. Pour atteindre cet objectif, et en accord avec les recommandations internationales, la présente autorisation de projet permettra de caractériser les effets adverses de molécules sur les systèmes respiratoire, nerveux central et cardiovasculaire chez le rongeur. L’évaluation de la fonction respiratoire (rat/souris) se fera par pléthysmographie corporelle. Cette méthode permettra de déterminer les fréquences et volumes respiratoires.L'évaluation de la fonction neurologique (rat/souris) se fera par évaluation neurocomportementale. L'évaluation cardiologique (rat uniquement) se fera par électrocardiographie implantée ou externe (non invasive). La conduite de ces études de pharmacologie de sécurité conduira à la production d’un rapport décrivant les effets adverses du composé testé.
Bénéfices attendus
Actuellement dans le monde, les maladies cardiovasculaires font 17,9 millions (M) de morts par an, les cancers 10 M/an, les maladies neurologiques 9 M/an, les maladies infectieuses 7,7 M/an, les maladies respiratoires chroniques 3,9 M/an, le diabète 1,5 M/an. Pour un grand nombre de ces pathologies, il n’existe aucune solution thérapeutique satisfaisante. Cette demande d’autorisation de projet permettra de couvrir une étape importante, et indispensable sur le plan réglementaire, du développement de composés innovants. La pharmacologie de sécurité est un élément réglementaire indispensable dans le développement préclinique d’une molécule. Préalablement aux études cliniques, les effets d’un composé thérapeutique sur les fonctions vitales (respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires) doivent être caractérisés chez l’animal en respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire. La conduite d’études de pharmacologie de sécurité permettra : 1. d’améliorer la qualité de vie des patients, en permettant à de nouvelles molécules d’entrer en clinique 2. d’améliorer la sécurité des patients, en identifiant et caractérisant les effets indésirables d’une molécule 3. d’optimiser les doses thérapeutiques en identifiant précocement les doses efficaces optimales et les effets secondaires 4. de contribuer à la recherche scientifique. Les résultats de ces projets enrichiront les connaissances scientifiques sur les mécanismes d'action et les profils de sécurité de nouvelles familles de molécules 5. de réduire les coûts de santé en améliorant la sécurité et l'efficacité des traitements 6. de répondre aux exigences réglementaires en matière de sécurité afin d’obtenir l’autorisation d’essais cliniques Donc, à court terme, le bénéfice premier de la mise en œuvre de ce projet sera l’établissement du profil toxicologique/pharmacologique d’une molécule. A plus long terme, les données obtenues au travers des études de pharmacologie de sécurité feront partie intégrante des dossiers règlementaires qui permettront de motiver une demande d’essai clinique qui débouchera potentiellement sur la commercialisation d’un nouveau médicament.
Procédures
Les animaux seront soumis à l'administration d'un composé thérapeutique par différentes voies selon les caractéristiques du composé testé ainsi que des prélèvements saugins. Les volumes et fréquences d'administration et de prélèvements sont établies en fonction des caractéristiques de chaque composé testé, dans le respect des recommandations des instances pharmacologiques et médicales internationales. Les animaux sont généralement anesthésiés pour ces prélèvements, mais peuvent être vigiable pour les administrations. Chaque geste dure généralement quelques minutes. Pour évaluer la fonction respiratoire, les animaux sont isolés dans un plesthymographe après une période d'habituation, au moins 30 minutes, et jusqu'à 12h maximum. Pour évaluer la fonction neurologique, des contentions et tests neurologiques sont effectués vigiles, pendant 10 environ. Pour évaluer la fonction cardiovasculaire, les animaux utilisés auront un émétteur télémétrique implanté par chirurgie avec la procédure décrite dans cette autorisation, ou bien auront un gilet (système non invasif) pouvant être porté en continue pusieurs jours d'affilée.
Impact sur les animaux
Trois catégories de nuisances peuvent être provoqués chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises de manière préventives pour réduire leur impact. 1) Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, ainsi que certaines voies d’administration, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des animaux. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaires mais cela peut néanmoins engendrer un stress modéré. 2) Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de sang et l’administration de la molécule testée peut provoquer des lésions locales et un stress des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire pour certaines voies d’administration. . 3) Liées à une toxicité de la molécule testée : ce projet vise à évaluer les effets pharmacologiques, y compris délétères, d’une molécule. Cependant, les recommandations internationnales des agences de santé qui sont appliqué par l'établissement sont de choisir une dose ne produisant que des effets indésirables au maximum modérés, il n’est donc pas attendu d’effets toxiques majeurs dans les études de pharmacologie.
Devenir
Afin d'éviter tout risque pour l'animal ou la santé publique, les animaux sont en 1er intention euthanasiés en fin de procédure. Une partie des animaux, généralement les rats disposant d'un émétteur télémétrique, peuvent être réutilisé dans des procédures sans réveil (ex : prélèvement d'organes). Dans certains cas, les animaux des groupes témoins peuvent être adopté, après avis vétérinaire et validation de la SBEA. La décision est prise au cas par cas, en fonction du protocole expérimentale de l'étude et du composé utilisé dans le groupe témoin.
Remplacement
La pharmacologie de sécurité étudie les interactions entre une molécule extérieur au corps et une ou plusieurs cibles en lien avec les systèmes respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires. Ces interactions recouvrent les effets potentiels de la molécules, ou de ses produits de dégradation sur les fonctions étudiées. Une bonne compréhension des mécanismes de toxicité est donc indissociable d’une bonne connaissance des mécanismes physiologiques, développementaux, cellulaires et moléculaires. Actuellement, l’ensemble des cibles potentielles et les mécanismes conduisant à une toxicité ne sont pas complètement élucidés et ne peuvent donc pas être modélisés. Il n’existe donc pas de modèle de remplacement. C’est pour cela que la règlementation impose d’évaluer la toxicité potentielle d’un composé thérapeutique avant tout essais chez l’humain.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux dans les études de pharmacologie de sécurité : • nous nous assurerons de la validité et de la prédictivité des données acquises avant de démarrer toute expérimentation, pour ne pas évaluer des composés non pertinents • si nécessaire, des études pilotes seront réalisées. Elles auront pour objectif d’évaluer graduellement la toxicité des composés et de rechercher les doses les plus prometteuses sur un nombre limité d’animaux Concernant les études de pharmacologie de sécurité : le nombre d’animaux est fixé au minimum permettant de détecter statistiquement des effets adverses.
Raffinement
Le raffinement de nos procédures inclue : • la gestion du stress et de l’angoisse : les animaux seront acclimatés (animalerie, nouveaux congénères, environnements de test) pendant 5 à 15 jours selon le protocole, et habitués à la manipulation et à la contention. Ils seront également hébergés à 3 par cage au minimum, pour augmenter les interactions sociales, dans un environnement enrichi • la prise en charge précoce de la douleur : un même opérateur observera matin et soir chaque animal. La douleur sera objectivée en fonction de modifications de l'apparence, de la posture et du comportement . En parallèle, une échelle de douleur sera employée et un analgésique sera mis en place si nécessaire, après validation par un vétérinaire. • des soins vétérinaires adaptés seront mis en place si nécessaires : compléments alimentaires, sérum physiologique, antibiotique, analgésique • l’intégration de points limites stricts : une grille précise d’évaluation sera utilisée afin d’anticiper la mise à mort si nécessaire. Dans tous les cas, l’ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation, exception faite des animaux implantés avec un boitier de télémétrie. Spécifiquement pour les études de cardiologie, la méthode validée nécessite l'implantation chirurgicale d'un module de télémétrie. Afin de rendre cette technique moins invasive, l'utilisation d'un module externe avec des électrodes de surface placé dans un gilet est en cours d'évaluation.
Choix des espèces
Les études de pharmacologie réglementaire in vivo sont régies par la ligne directrice ICH S7A. Ces études peuvent être réalisées sur des espèces rongeur et non rongeur. Le rat et la souris sont 2 espèces retenues pour ces études du fait de leur prédictivité et font l’objet de cette DAP. Les animaux sont utilisés à partir de 6 semaines. Les données récuillies sur les études de la fonction neurologique et la fonction respiratoire sont plus robuste sur des animaux de 6-8 semaines et 8-12 semaines respectivement.
VaccinoLIV : Étude de l’immunogénicité et de l’efficacité chez la souris de candidats vaccins recombinants
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Certaines souris sont infectées par des virus humains pathogènes ou par le parasite du paludisme murin, une infection qui peut provoquer fièvre, prostration, perte de poids et paralysie. 4 622 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 312 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. D'autres sont greffées de cellules tumorales, avec des tumeurs qui peuvent s'infecter ou s'ulcérer, et reçoivent des injections de virus de la rougeole modifiés une à deux fois par semaine pendant dix semaines. Le porteur écrit que la souffrance liée à l'infection "précédera la mort de l'animal" et, quelques lignes plus loin, que la mort comme point limite est strictement évitée.
Objectifs
L’objectif du projet est l’évaluation préclinique chez la souris de l’immunogénicité et de l’efficacité des différents candidats vaccins développés au laboratoire. Les capacités anticancéreuses de virus de la rougeole modifiés seront aussi évaluées dans des modèles de greffes de tumeurs syngéniques. Ces objectifs sont justifiés du point de vue scientifique car ils permettent de démontrer la fonctionnalité des candidats vaccins ou thérapeutiques. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs contre plusieurs pathologies infectieuses graves, ainsi qu’un possible traitement contre certains cancers, deux domaines d’impact majeur en santé publique.
Bénéfices attendus
Les candidats vaccins développés dans le laboratoire sont destinés à être évalués par la suite dans des essais cliniques. Leur évaluation préalable dans un modèle murin permet de démontrer leur efficacité et leur sûreté préclinique et de définir les doses et schémas vaccinaux. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs contre plusieurs pathologies infectieuses graves pour lesquelles le besoin médical est immense, ainsi qu’un traitement viro-thérapeutique contre certains cancers pour lesquels le besoin médical et le marché sont également immenses.
Procédures
Les animaux sont immunisés par voie intrapéritonéale, intramusculaire, intradermique, intraveineuse ou orale selon l'agent pathogène ciblé (quelques secondes par animal). Les prélèvements sanguins à la veine rétro-mandibulaire sont effectués à J0 - J7 - J28 - J60 après la vaccination (quelques secondes par animal). Pour évaluer l'efficacité des vaccins, certaines souris seront confrontées à des épreuves infectieuses (quelques secondes par animal) par des virus humains pathogènes ou non-pathogènes chez les souris contrôles ou par le parasite du paludisme Plasmodium berghei, pathogène. Le suivi du challenge est effectué sur une goutte de sang récupérée à la queue de chaque animal à J1, J2, J3, J5, J7, J10 (quelques secondes par animal). Pour évaluer les propriétés immuno-oncolytiques des vaccins, les souris seront greffées avec des cellules tumorales (quelques minutes par animal). Le traitement des tumeurs est effectué par des injections intratumorales, intrapéritonéales, intramusculaires, intradermiques ou intraveineuses de vaccins recombinants contre la rougeole (quelques secondes par animal). Les vaccins candidats sont inoculés (quelques secondes par animal) une ou deux fois par semaine pendant un maximum de 10 semaines.
Impact sur les animaux
Pour évaluer l'efficacité des vaccins recombinants, certaines souris seront confrontées à des épreuves infectieuses par des virus humains pathogènes ou non chez les souris contrôles, ainsi que par le parasite du paludisme murin Plasmodium berghei, également pathogène. Selon l'agent testé, l'infection peut entraîner une souffrance (fièvre, prostration, perte de poids, paralysie) qui précédera la mort de l'animal. Pour évaluer les propriétés anticancéreuses des candidats vaccins, les souris seront greffées avec des cellules tumorales syngéniques qui peuvent entrainer des effets indésirables. En effet, la croissance des tumeurs chez la souris peut provoquer une gêne ou affecter le comportement ou la locomotion. La tumeur peut s'infecter ou s'ulcérer.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Il n'existe pas d'alternatives non-animales dans le domaine de la recherche préclinique sur les vaccins recombinants. En absence de telles alternatives, l'utilisation d'animaux vivants dans les procédures expérimentales est prévue pour atteindre les objectifs du projet. L'étude des réponses immunitaires des candidats vaccins nécessite l'utilisation d'un organisme vivant entier avec un système immunitaire développé. Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte que les primates, dont l’homme. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris IFNAR ou hCD46/IFNAR permissif pour la rougeole est utilisé pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins.
Réduction
Pour appliquer le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés, nous composons les groupes d’animaux « contrôles » de 4 souris et les groupes « test » de 6 souris. Ainsi deux souris sont épargnées à chaque test. Par la suite nous pourrons diminuer le nombre d’animaux à 4 dans les groupes « contrôle négatif » car, d’une expérience à l’autre, ces animaux contrôles reçoivent systématiquement le vaccin rougeole standard Schwarz et que la réponse des souris à l’immunisation est relativement homogène d’un animal à l’autre. Les groupes « test » sont composés de 6 souris, le nombre minimal d’animaux pour que les résultats soient statistiquement significatifs, comme validés par un bioinformaticien en interne. Le nombre de souris utilisées par groupe représente la moitié des normes utilisées dans l’industrie du vaccin. Nous pouvons appliquer cette réduction car nous observons des effets forts : réponses immunitaires présentes ou absentes ; protection d’épreuves infectieuses efficace ou non. Ces observations sont basées sur notre longue expérience (67 publications dans ce domaine).
Raffinement
Les animaux soumis à des procédures qui produisent une douleur ou une détresse minimale/transitoire seront suivis par une observation quotidienne. Lorsque les animaux subiront des épreuves infectieuses, ils seront également contrôlés quotidiennement. En effet, selon le pathogène utilisé, l’infection pourra entraîner une souffrance (fièvre, prostration, perte de poids, paralysie) qui précèdera la mort de l’animal. La mort des animaux comme point limite est strictement évitée. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une grille évaluation douleur stress inconfort sera utilisée pour noter la douleur et la détresse qui peuvent survenir chez les animaux exposés à des agents pathogènes connus pour provoquer des effets graves. Nous suivrons : 1) L'apparence générale (poil luisant/terne, hérissé, état d'embonpoint, perte de poids, rétrécissement des orbites oculaires, renflement du nez, changement de position des vibrisses. 2) Signes cliniques : respiration, posture, activité, fèces, pli cutané. 3) Comportement : comportement normal/agitation, mobilité, mâchonnement des barres, déplacement en cercle, saut arrière. Pour éviter au maximum la douleur et la détresse nous suivrons les recommandations suivantes : mise à mort en cas de score 2 et observation quotidienne si score >0. Un aliment enrichi sera ajouté et l'enrichissement de l’environnement sera amélioré dès le début des procédures des épreuves infectieuses.
Choix des espèces
Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte que les primates, dont l’homme. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris permissif pour la rougeole est utilisé pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins. Nous utilisons ces souris depuis de nombreuses années et avons publié un grand nombre d’articles décrivant leurs propriétés et leurs qualités dans ce contexte. Pour étudier les propriétés immuno-oncolytiques du virus de la rougeole, des modèles de greffe de tumeurs sont utilisés. Age moyen des animaux : 11 semaines +/- 4 semaines. Les animaux doivent être matures au plan immunologique. Par ailleurs les jeunes individus répondent mieux que les plus vieux. Enfin, il est inutile de laisser vieillir les animaux avant utilisation.
CARC2025: Etudes de toxicité chronique et de cancérogénèse d’une nouvelle molécule avant sa mise sur le marché
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 600
600 rats et 480 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun suivi jusqu'à vingt-quatre mois, tous tués pour prélever leurs organes. À 3, 6, 12, 18 puis 24 mois, ils subissent trois prises de sang dans une même journée sur animal vigile, une quatrième sous anesthésie, et jusqu'à seize heures d'isolement pour recueillir leurs urines, les rats étant privés de nourriture. Des tumeurs apparaissent, spontanées ou provoquées par le produit testé, et le porteur indique que les animaux sont gardés en vie tant qu'elles ne remettent pas en cause leur déplacement, leur capacité à boire ou à manger, et qu'aucune ulcération n'apparaît. Le produit peut aussi provoquer chez le rat une opacité de la cornée et une cécité. Cette étude sert à faire entrer une molécule chimique sur le marché, et le porteur précise que les deux groupes supplémentaires exigés par les lignes directrices chinoises ne seront pas utilisés puisque la molécule n'y est pas destinée.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer les risques pour la santé liés à l’exposition à un produit chimique spécifique tout au long de la vie de l’espèce considérée, avant sa mise sur le marché. Pour cela, nous réaliserons une étude combinée de toxicité chronique et de cancérogénicité. Ce projet permet de recueillir des informations sur les effets toxiques de la substance, y compris son potentiel cancérogène, tout en identifiant les potentiels organes cibles et la possibilité d’accumulation du produit dans ces derniers. De plus, il peut fournir une estimation de la dose sans effet nocif observé pour les effets toxiques, ainsi que, dans le cas de substances cancérogènes non génotoxiques, des réponses tumorales. Ces estimations sont cruciales pour établir des critères de sécurité concernant l'exposition humaine et donc le potentiel effet cancérogène pour l’homme. Pour caractériser et évaluer la cancérogénicité potentielle ainsi que la toxicité chronique de ce produit chimique, l’installation d’essai intègre toutes les informations disponibles sur la substance à tester.
Bénéfices attendus
Les études d’exposition chroniques et de cancérogenèse vont permettre : l’identification des propriétés cancérogènes d'un produit chimique susceptible d'augmenter les risques de tumeurs, la fréquence de survenue de tumeurs bénignes ou malignes ou la diminution du temps nécessaire à leur apparition, par rapport au groupe témoin non traité ; l’identification de la toxicité chronique d’un produit chimique ; l’identification d'un ou de plusieurs organes cibles de la toxicité chronique et de la cancérogenèse ; la caractérisation de la relation dose-effet ; l’identification d’un niveau de dose sans effet nocif observé ou du point de départ de l’effet pour l’établissement d'une dose de référence ; l’extrapolation des effets cancérogènes aux niveaux d’exposition humaine correspondant à de faibles doses ; la prévision des effets de toxicité chronique aux niveaux de doses représentatifs de l'exposition humaine ; l’obtention de données permettant de vérifier les hypothèses concernant le mode d’action de la molécule. Toutes ses données seront rapportées, soumises aux autorités internationales et serviront à l’analyse du risque pour l’homme.
Procédures
Aprés 3, 6, 12 et 18 et/ou 24 mois environ, 3 prélèvements sanguins sont réalisés au cours d'une même journée en moins de 2 minutes sur animaux vigiles. Aprés 3, 6, 12 et 18 et/ou 24 mois environ, 1 prélèvement sanguin est réalisé en moins de 2 minutes sur animaux anesthésiés. Aprés 3, 6, 12 et 18 ou 24 mois environ au cours de l’étude, les animaux peuvent être isolés pour une durée maximale de 16h (avec mise à jeun pour les rats) pour le recueil de leurs urines. La mise à mort précédée par une administration d'un analgésique et d'une anesthésie.
Impact sur les animaux
Les niveaux de doses sont fondés sur les résultats des études précédentes. Le choix de la forte dose doit permettre l’évaluation d’une dose bien tolérée par les animaux et induisant une toxicité légere à modérée. Les prelevements de sang peuvent induire une douleur légère et de légers hématomes au point de prelevement. Pour la mesure et le prelevement d’urines, les animaux sont isolés pendant 16h maximum (avec mise à jeun pour les rats). La veille des autopsies prévues, les rats n’ont plus accès à la nourriture pendant 16 h maximum ce qui peut induire un stress léger ainsi qu’une baisse de poids. Compte tenu de l’objectif de l’étude et de sa durée, des tumeurs bénignes ou non , spontanées ou induites par le produit peuvent apparaitre, les animaux seront gardés en vie tant que la taille des tumeurs ne remet pas en cause leur déplacement, et leur capacité à boire ou à s'alimenter(
Devenir
En raison du but de l’étude qui est d’évaluer l’atteinte au niveau des tissus, des organes de l’animal et l’apparition de tumeurs, tous les animaux seront mis à mort pour prelevement d'organes .
Remplacement
Malgré les nombreux tests in silico ( évaluation grace à des calculs/modéles complexes informatisés), in-vitro (essais réalisés sur micro-organismes, organes ou cellules) , et in-vivo conduits lors du developpement de cette molecule qui ont permis de mettre en évidence le mode d’action et les organes cibles de la molécule, ces études animales restent une obligation avant la mise sur le marché d’une nouvelle molécule chimique. Il n’existe pas aujourd’hui de tests substitutifs validés et acceptés par les autorités relatifs à l’évaluation de tumeurs après une exposition chronique.
Réduction
L'essai combiné dans l’étude rat ou l’ajout d’un sous-groupe pour mise à mort intermédiaire (phase chronique) dans l’étude souris permet une meilleure efficacité en temps et en coûts, et un moindre recours aux animaux, par rapport à la conduite de deux essais séparés, et ne compromet pas la qualité des données de la phase chronique ou de la phase de cancérogenèse. La taille des groupes est la taille minimale requise par la ligne directrice. La molecule n’étant pas destinée au marché chinois, les groupes supplémentaires requis par les guidelines chinoises (2 groupes de 10 animaux par doses et par sexes mis à mort après 6 et 18 mois d’exposition) ne seront pas nécessaires.
Raffinement
Compte tenu de la durée de l’étude, une observation quotidienne de l’état clinique des animaux sera assurée et une attention particulière sera portée à l’apparition de tumeurs spontanées ou induites par le produit. Ces tumeurs seront recherchées, observées et mesurées au moins 1 fois/semaine afin de suivre leur progression et/ou l’apparition de zone de nécrose. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. Lors des prises de sang en cours d’étude l’usage d’un tapis chauffant pourra être utilisé pour maintenir la température corporelle des animaux sous anesthésie. Des micro prélèvements seront utilisés pour l’évaluation des paramètres toxicocinétiques. Le jour précédent leur mise à mort les animaux sont déplacés dans une salle proche de la salle de nécropsie pour éviter le stress du transfert le jour même. Les prélèvements de sang sont réalisés dans une salle séparée et différente de celle utilisée pour la mise à mort. Afin d’éviter toute douleur, les animaux seront mis à mort après une analgésie à l’aide d’un opioïde de type méthadone suivi d’une anesthésie gazeuse à l’isoflurane.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les modèles expérimentaux choisis en raison de leur durée de vie relativement courte, de leur utilisation fréquente dans les études pharmacologiques et toxicologiques, de leur sensibilité à l'induction de tumeurs et de la disponibilité de souches suffisamment caractérisées. Les rongeurs sont recommandés par la communauté scientifique et les instances réglementaires. Des données historiques issues des études précdemment conduites sont disponibles dans le laboratoire avec les espèces et souches choisies (Rat Wistar et souris C57Bl6J). Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Les animaux utilisés sont de jeunes animaux sevrés à l’arrivée sur le lieu de l’expérimentation dont l’âge après la période d’acclimatation doit être inférieur à 8 semaines compte tenu de l'objectif et de la durée de l'étude (exposition pendant toute la vie de l'animal). Cet age est requis par les lignes directrices internationales.
Evaluation préclinique de la pharmacocinétique de composés de recherche
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Incluses dans les études dès le sevrage, à partir de quatre semaines, 2 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles est immunodéficiente ou porte un système immunitaire et un foie humanisés, obtenus par greffe de cellules humaines. Elles reçoivent des injections de plasmides que le porteur reconnaît pouvoir provoquer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l'état général, subissent des prélèvements de sang répétés avec risque d'anémie et d'hématome, et pour certaines un prélèvement terminal sous anesthésie suivi de leur mise à mort. Sur la réduction, le porteur écrit qu'aucune approche statistique n'a été réalisée et que l'effectif découle du nombre d'études des années précédentes, ajusté selon "le plan commercial". Deux cent cinquante de ces souris pourront ensuite être transférées vers un projet de formation interne aux gestes techniques.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’analyser la pharmacocinétique de composés de recherche après administration à des souris. En particulier, nous nous intéresserons à leurs absorptions, biodistribution, métabolisme et élimination. Ces analyses sont cruciales pour déterminer les doses efficaces et la posologie d’un médicament. Pour ce faire, nous utiliserons des souris immunodéficientes, immunocompétentes ou avec un système immunitaire et/ou un foie humanisé.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’obtenir des données essentielles sur la biodistribution et la durée de vie de composés de recherche dans l’organisme. Grâce à ces données, nous pourrons définir les doses et posologies à tester dans des études d’efficacité.
Procédures
Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement sans réveil suivi d’une euthanasie sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Des prélèvements d’urines et de fèces pourront être pratiqués par contention et massage du ventre à la main. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. Les administrations de traitements dureront quelques secondes et seront effectuées avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Leur nombre dépendra du protocole ‘étude et sera validé par le vétérinaire. À l’issue des études, les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.
Impact sur les animaux
- Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmidess (pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt) : peut engendrer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. Peut engendrer un hématome. - Administration de traitements ou de composés : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées) - Prélèvements sanguins : hématome, anémie, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux ayant atteints les point limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris » sur décision vétérinaire.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible d’étudier l’absorption, la biodistribution, le métabolisme et l’élimination de composés de recherche sans les injecter in vivo. La souris constitue un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 2200 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser 50 études précliniques de 44 souris. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques.
Raffinement
En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables de 5 individus maximum. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (ex : Diet Gel). La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire, administrée avant toute procédure potentiellement douloureuse. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction des scores cliniques et de la perte de poids.
Choix des espèces
90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente permet la création de lignées humanisées. De plus, le métabolisme des souris présente des similarités avec celui des humains, ce qui permet de prédire la distribution, biotransformation et élimination d’un médicament. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 4 semaines, ces souris pouvant être utilisées dès leur sevrage. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules humaines dans le sang.