Toxicologie et autres tests de sécurité
Etudes des effets toxiques de xénobiotiques chez le rongeur (rat, souris)
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 7600
Une partie des rats et des souris peut provenir d'autres procédures expérimentales, à condition d'y avoir subi une gravité réelle légère ou modérée, sans recevoir de substance en test, et après deux semaines de repos. 9 500 rongeurs, soit 7 600 rats et 1 900 souris, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour mesurer la toxicité de molécules avant leur mise sur le marché et tout essai chez l'humain. Aux prises de sang systématiques, sur rongeurs éveillés, s'ajoutent selon le produit l'administration répétée de la molécule, un isolement jusqu'à 16 heures pour recueillir l'urine, des prélèvements d'autres fluides jusqu'à une fois par semaine et des biopsies de peau sous anesthésie. Le porteur écrit que ce type de nuisances est "difficilement estimable", les effets toxiques pouvant être neurologiques, immunologiques, inflammatoires ou métaboliques, et indique que ces études "nécessitent généralement" une analyse pathologique et donc la mise à mort des rongeurs. Il affirme que le projet s'inscrit dans une "démarche d'amélioration continue du bien-être animal en appliquant les principes des 3R".
Objectifs
Ce projet vise à d’évaluer la sécurité et la toxicité de molécules avant leur utilisation, selon les recommandations internationales des instances médicales et pharmaceutiques, chez deux espèces de rongeurs : la souris et le rat. Leur évaluation est effectuée conformément aux exigences des autorités réglementaires et nécessaire pour leur mise sur le marché et avant tout utilisation chez l’humain. Pour chaque molécule, afin de caractériser ses potentiels effets toxiques, d’identifier ses organes cibles et de définir ses marges de sécurité, plusieurs études complémentaires et séquentielles sont nécessaires : - Des études préliminaires qui permettent d’identifier la dose appropriée pour les études réglementaires ultérieures. Elles aident également à déterminer les effets du xénobiotique afin de confirmer les études règlementaires et de garantir le succès du dépôt d'une demande d'autorisation de mise sur le marché. - Des études de toxicologie, qui ont pour objectif de déterminer le niveau sans effets toxiques ou le niveau sans effet indésirable observé, en fonction de la durée du traitement et de l’espèce animale. Elles permettent aussi de collecter des données de toxicité et de pharmacocinétique du xénobiotique avant que son utilisation soit autorisée. Le projet s’inscrit dans une démarche d’amélioration continue du bien-être animal en appliquant les principes des 3R. Les procédures sont optimisées pour limiter le nombre d’animaux requis, agir en étapes progressive pour raffiner le choix des doses et réduire la douleur et la contrainte, notamment par l’utilisation de techniques moins invasives et la validation d’approches alternatives.
Bénéfices attendus
Les études de toxicologie ont pour objectif de déterminer le niveau sans effets toxiques ou le niveau sans effet indésirable observé en fonction de la durée du traitement et de l’espèce animale, et de collecter des données de toxicité et de pharmacocinétique nécessaire à leur autorisation d’utilisation. Ces données sont des prérequis avant le passage aux essais cliniques chez l’humain ainsi que pour la constitution du dossier d’autorisation de mise sur le marché. Par ailleurs, le projet favorisera l’application des principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner), en optimisant les protocoles d’étude et en limitant l’impact sur le bien-être animal, ce qui renforcera la qualité scientifique des résultats et la conformité aux normes éthiques et réglementaires.
Procédures
Les animaux sont soumis dans ce projet : - des prélèvements de sang réguliers réalisés dans le cadre de recommandations vétérinaires, vigiles (sauf en cas d'anesthésie prévus pour d'autres prélèvements, cf ci-dessous). Chaque prélèvement dure quelques minutes, le nombre total est établi en fonction des caractéristiques du produit testé et limité en suivant les recommandations vétérinaires internationales. -des prélèvements d'urine, de manière passif (isolement jusqu’à recueil d'urine ou bien de 16h maximum), ou échoguidé sous sédations (quelques minutes). Généralement, un prélèvement au début et un prélèvement en fin d’étude sont suffisants. - prélèvement d’autres fluides biologiques (autres que le sang) : jusqu’à une fois par semaine, sous anesthésie d’une quinzaine de minutes environs - des biopsies de peau par ponction échoguidée (mini invasive), sous anesthésie (10 minutes environ) - des contention manuelle, notamment dans le cadre d'examen clinique pour détecter des effets toxiques, d’environ 10 minutes. Afin d’éviter la répétition d’actes anesthésiques, les prélèvements peuvent être réalisés au cours d’une même anesthésie, permettant, en 10 à 15 minutes, de recueillir plusieurs échantillons de tissus et liquides biologiques. A chaque étude, tous ces prélèvements ne sont pas effectués, à l’exception des prélèvements de sang qui sont systématiques. Ils sont choisis selon la nature du produit testé et les données préliminaires déjà connues (in vivo ou in vitro).
Impact sur les animaux
Trois catégories de nuisances peuvent être provoqués chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises de manière préventives pour réduire leur impact. - Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, ainsi que certaines voies d’administration, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des animaux. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaires mais cela peut néanmoins engendrer un stress. - Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de tissus biologiques (principalement de sang) et l’administration répétée de la molécule testée peut provoquer des lésions et un stress des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire pour certaines voies d’administration. De plus,, les animaux sont placés en cage individuelle pendant la phase d’évaluation de prélèvement d’urine. - Liées à une toxicité de la molécule testée : les études de toxicologie visent à évaluer la toxicité d’une molécule. Ce type de nuisances est difficilement estimable : selon le mécanisme d’action (anticorps, anticancéreux, neurologique, etc), la voie d’administration, ou encore la biodistribution, divers effets toxiques sont possibles (neurologique, immunologiques, inflammation, métabolique, etc).
Devenir
Les études de toxicologie nécessitent généralement une analyse pathologie et donc la mise à mort des animaux d'après les recommandations des instances pharmaceutiques et médicales internationales.
Remplacement
Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d'obtenir toutes les informations collectées grâce à ces études. Suivant les lignes directrices des instances médicales et pharmaceutiques internationales, il est nécessaire de recourir à des modèles in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est fixé au minimum permettant de garantir la fiabilité des données obtenues d’après les lignes directrices des instances médicales et pharmaceutiques internationales. Ce nombre est considéré comme le minimum acceptable permettant une interprétation pertinente des données et la caractérisation correcte des effets toxiques potentiels. Afin de le réduire, des animaux peuvent faire plusieurs études préliminaires (ou de pharmacocinétique) après une période de repos (wash-out, dépendant de la demi-vie du xénobiotique testé), dans le cadre d’une utilisation continue. Des études pilotes sont menées, lorsque cela est pertinent, afin d’optimiser les conditions expérimentales et d’affiner les protocoles, ce qui permet de réduire le besoin en animaux pour les études principales. De plus, les tissus et échantillons biologiques collectés au cours des études sont réutilisés pour des analyses complémentaires (histopathologie, biomarqueurs, etc.), ce qui évite de recourir à des animaux supplémentaires pour des tests additionnels. L’ensemble de ces mesures s’inscrit dans une démarche proactive de réduction du nombre d’animaux, en accord avec les principes des 3R et les exigences des bonnes pratiques de laboratoire. La réutilisation d’animaux issus d’autres procédures expérimentales de gravité réelle ‘’légère’’ ou ‘’modérée’’ est possible tant que ces animaux n’ont pas reçu de xénobiotique en cours de test et après une période de repos d'au moins 2 semaines. Cela permet de réduire le nombre global d’animaux utilisé au sein de l’établissement et d’utilisés des animaux bien habitués aux manipulations liées aux études. Cette réutilisation est validée par un vétérinaire et la structure en charge du bien-être animale.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 jours minimum pour les rongeurs est respectée à réception des animaux. Pendant cette période d’acclimatation, les animaux peuvent bénéficier d’un programme d’habituation adapté aux procédures qu’ils vont subir, afin de réduire leur stress et de favoriser leur coopération. Ce programme inclut des manipulations progressives et régulières, permettant aux animaux de s’habituer au contact humain et aux équipements utilisés. Un programme d’enrichissements validé par la structure en charge du bien-être animale. est appliqué quotidiennement pour garantir des conditions de vie optimales/minimiser les impacts des expérimentations.. Les animaux sont hébergés collectivement, sauf exceptions (bagarre, blessure), avec des enrichissements adaptés à leurs besoins. L’isolement est validé par un vétérinaire et fait l’objet d’un suivi structure en charge du bien-être animale.. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter tout signe clinique anormal et prendre rapidement les mesures nécessaires (réhydratation, isolement pour soin). Toute anomalie est rapportée au vétérinaire, qui prescrit un traitement si nécessaire. Un suivi clinique est en place, un fois par semaine pendant la phase d’administration du principe actif. L’examen clinique complet est effectué par un personnel formé pour évaluer les fonctions motrices, nerveuses, cardiaques, respiratoires, la température et l’état général des animaux. Un vétérinaire est présent aux heures ouvrées, et une astreinte vétérinaire est disponible 24h/24 et 7j/7. Une traçabilité des animaux/des actes est assurée pour permettre leur suivi et analyse. L’établissement développe des techniques les moins invasives possibles comme des gilets de télémétrie permettant d’analyser les fonctions cardiaques, respiratoires et l’activité sans contrainte physique ou pose d’implants par chirurgie. Les volumes prélevés/administrés respectent lesrecommandations vétérinaires.
Choix des espèces
D’un point de vue réglementaire, ces animaux sont des espèces reconnues pour leur aptitude à prédire les effets pharmacologiques, indésirables et/ou toxiques de xénobiotiques. Les lignes directrices instances médicales et pharmaceutiques internationales requièrent généralement deux espèces (rongeurs et non rongeurs) selon la nature du produit à tester (molécule chimique de synthèse, peptide, protéine, anticorps monoclonal ou produit de thérapie génique ou cellulaire). Des demandes d’autorisations de projet pour des espèces non rongeurs ont déjà été déposées par l’établissement. Selon ces lignes directrices, il convient d’utiliser de jeunes animaux sains après sevrage. Les rongeurs sont inclus en étude en général à partir de 6 semaines.
Évaluation des effets de différents produits sur la fonction cardio-vasculaire par télémétrie et sur le comportement chez le primate non humain
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Macaques rhésus : 12
Tester les effets cardiovasculaires de candidats médicaments pour le compte de leurs fabricants : 84 macaques, 72 à longue queue et 12 rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun peut subir une chirurgie de quatre heures et demie à cinq heures et demie pour l'implantation d'un émetteur de télémétrie, parfois d'un cathéter dans le ventricule gauche du cœur, puis six à huit jours seul en cage à métabolisme, des anesthésies de quatre heures et une contention pouvant durer une heure pendant les perfusions. Parmi les bénéfices attendus, le porteur inscrit un bénéfice pour l'animal lui-même, sous la forme de connaissances sur l'espèce et d'outils de raffinement. Aucun de ces macaques n'est tué à l'issue de ce projet, tous étant réutilisés dans un autre, après accord du vétérinaire.
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer les effets de différents candidats médicaments sur les paramètres cardio-vasculaires chez le primate non-humain vigile en utilisant la télémétrie, méthode d'enregistrement de différents paramètres permettant de laisser l'animal totalement libre de ses mouvements dans la volière pendant les mesures.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la vérification de l'absence d'effet ou la détermination du seuil d'effet de nouveaux médicaments sur le système cardiovasculaire, qui permettront par la suite une utilisation sécurisée du médicament en médecine humaine ou vétérinaire . Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (le primate non humain) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendu.
Procédures
Dans ce projet, les animaux pourront être soumis à une chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie avec ou sans cathéter de mesure de la pression ventriculaire gauche cardiaque (PVG), et avec ou sans implantation d'une chambre vasculaire. La durée de la chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie sera entre 4h30 et 5h30. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements de sang (durée environ 1min/prélèvement), des tests neurologiques et comportementaux (durée de 10 min max par observation). Les animaux seront maintenus pendant l’administration du candidat médicament (ou du placebo) par voie orale, sous-cutanée, transdermique, intranasale, intramusculaire ou intraveineuse (bolus ou perfusion) (durée 1 -2minutes, sauf pour la perfusion intraveineuse où les animaux sont maintenus en contention pendant la durée de la perfusion, maximum 1h). Dans le cas d'expérience sous anesthésie, les animaux seront soumis à plusieurs anesthésies d'une durée de 4h maximum chacune.
Impact sur les animaux
Les effets potentiellement indésirables du/des produits font l'objet d'échanges avec les fabricants des candidats médicaments testés pour adapter les outils d'observation des animaux afin d'anticiper au mieux de potentiels signes cliniques. Les animaux subiront une chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie pouvant induire des douleurs post-chirurgicales. Les animaux de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture avant administration du produit, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins, de l'administration et de l'anesthésie avant chirurgie ou avant expérience sous anesthésie, un stress lié à l'hébergement individuel en cage à métabolisme (6-8j) post-chirurgie. Lors de l'administration de candidats médicaments en perfusion intraveineuse de durée supérieure à 10 min, les animaux pourront subir un stress lié à la contention.
Devenir
Réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le primate non humain car il n'existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets cardiovasculaires. Or, avant toute utilisation chez l'homme, l'animal constitue un passage obligatoire pour l'évaluation de l'efficacité ou la sécurité d'un médicament. A ce jour, le primate non humain est une des espèces de non-rongeurs adaptée à ce type de modèle.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • l'utilisation de la technique de télémétrie permettant de recueillir des informations sans manipulations animaux, •la validation du système de télémétrie et validation pharmacologique du modèle, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le primate non humain est, pour certains candidats-médicaments, l’espèce animale la plus adaptée car la plus proche de l’homme en termes de métabolisme et d’exposition. Le système cardiovasculaire du primate non humain est également très proche de celui de l'homme, donc les effets observés sont plus facilement extrapolables. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Evaluation des effets chroniques de substances chimiques sur le poisson zèbre (Danio rerio)
- Protection de l’environnement
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Exposés en continu à une substance chimique depuis l'œuf jusqu'à trente jours après l'éclosion, 19 200 poissons zèbres vont être utilisés, 16 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 3 200 un niveau léger. Le porteur liste parmi les effets attendus des convulsions, une tétanie, une ventilation irrégulière, une exophtalmie, un œdème et une hémorragie. Aucune manipulation n'est pratiquée pendant l'essai, et tous les poissons sont tués à la fin pour être mesurés et pesés, ces données conditionnant la validité du test. Cet essai ne répond à aucune question de recherche, il est déclenché par le règlement REACH dès qu'une substance est produite ou importée à partir de 100 tonnes.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de répondre à une exigence gouvernementale dans le cadre de la réglementation REACH (règlement européen visant à sécuriser la fabrication et l’utilisation des substances chimiques dans l’industrie européenne). Depuis la mise en place de cette réglementation les industriels sont soumis à l’obligation, pour chaque substance produite ou importée, de faire réaliser des études physico-chimiques, toxicologiques et écotoxicologiques. L’essai de toxicité chronique sur le poisson d'eau douce intervient obligatoirement dans le cas où la substance détenue est fabriquée ou importée en quantité égale ou supérieure à 100 tonnes. Ce projet vise à déterminer les effets toxiques d’un produit chimique à l’essai, sur les stades de développement d’une espèce étudiée, ici le poisson zèbre.
Bénéfices attendus
Le projet, vise à fournir des données relatives à l’utilisation de la substance chimique. Les données de toxicité collectées à l’issu des essais réalisés permettront, par exemple, l’enrichissement de la fiche de données de sécurité propre à la substance, en avertissant des risques environnementaux associés à son utilisation.
Procédures
Au cours du projet de toxicité chronique, les poissons seront en contact constant avec une substance chimique à l'essai associée à leur milieu de vie, de l’œuf après la ponte jusqu'au stade juvénile (J30 post éclosion). Aucune manipulation ni prélèvement ne sera effectuée sur les poissons durant le test.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les poissons sont : - hypo ou hyperactivité, pendant 1 minute d’intensité modérée - nage en tire-bouchon, pendant 1 minute d’intensité modérée - répartition anormale à la surface ou dans le fond de l’aquarium, pendant 1 minute d’intensité modérée - sous ou sur réaction à un stimulus, pendant 15 secondes d’intensité modérée - diminution ou augmentation de la nage en groupe ou en banc, pendant 1 minute d’intensité modérée - agressivité, perte de contrôle de la flottabilité, pendant 1 minute d’intensité modérée - convulsions, pendant 15 secondes d’intensité sévère - tétanie, pendant 15 secondes d’intensité sévère - hypo ou hyperventilation, pendant 15 secondes d’intensité sévère - ventilation irrégulière, pendant 1 minute d’intensité sévère - exophtalmie, pendant 5 secondes d’intensité sévère - œdème, pendant 5 secondes d’intensité sévère - hémorragie, pendant 5 secondes d’intensité sévère.
Devenir
L'ensemble des poissons en fin d'essai réglementaire seront mis à mort. Des mesures de taille et poids humide de tous les poissons doivent être réalisées en fin d'essai, ces dernières faisant partie intégrante de l'exploitation des résultats ainsi que de la validité de l'essai.
Remplacement
Dans notre laboratoire nous réalisons des analyses d’écotoxicologie sur des modèles invertébrés (daphnies) ou encore des modèles de plantes aquatiques (algues). Le ratio actuel des organismes utilisés pour les essais d’écotoxicologie est le suivant : 49% sur daphnie, 35% sur algues, 16% sur poissons (dont 5% de tests sur œufs de poissons zèbres). L’essai de toxicité chronique sur poissons zèbre intervient uniquement lorsque les autorités compétentes réglementaires demandent la réalisation d’essais de toxicité chronique sur espèce aquatique.
Réduction
Le nombre minimal de poissons-zèbres utilisé pour les essais de toxicité chronique est imposé par un texte règlementaire. Ce nombre d’individus a été calculé afin d’assurer la fiabilité des analyses statistiques réalisées à l’issu de l’essai mais si deux essais chroniques sont lancés en parallèle sur deux substances différentes, les groupes témoins seront mutualisés pour les études afin de réduire le nombre d’individus utilisés.
Raffinement
Les conditions environnementales de l’essai chronique sont pensées et appliquées afin de limiter le stress chez les poissons zèbres sollicités pour l’essai. En raison d’interférences possibles avec la substance testée les cuves d’essai ne sont pas enrichies directement ; cependant le bac d’hébergement dans lequel elles reposent est tapissé avec des images apaisantes de fonds marins. À partir de l’étape de répartition des œufs dans les cuves d’essai, et jusqu’à la dernière observation des poissons avant mise à mort, les poissons font l’objet d’une surveillance journalière accrue par les opérateurs. Si un alevin présente des anomalies corporelles avérées telle que des malformations ou encore un état de souffrance, il est retiré de l’essai pour être aussitôt mis à mort. Il sera alors noté pour mort dans le registre de l’essai. Si, au cours d’une des observations quotidiennes, un alevin est noté mort, alors ce dernier est aussitôt retiré de la cuve d’essai. Aucun prélèvements biologiques, analyses ou autres ne sont réalisés sur cet individu.
Choix des espèces
Le poisson zèbre fait partie des poissons d’eau douce recommandé par un texte règlementaire. C’est une espèce très largement documentée : sa facilité de maintien en laboratoire et sa grande sensibilité aux polluants fait de cette espèce modèle un organisme d’intérêt dans le domaine de l’écotoxicologie. A l'issue du processus de ponte, les œufs fraîchement fécondés sont sélectionnés et triés à l’aide d’une loupe binoculaire. Ils sont ensuite répartis aléatoirement dans les cuves d’essais au stade de division 16 – 32 cellules. Les essais sont menés jusqu’à 31 jours post éclosion. L’utilisation de la procédure expérimentale à l’origine de cette demande d’autorisation de projet intervient dans l’unique cas ou la règlementation l’impose. En effet, le laboratoire privilégie autant que possible les essais d’écotoxicologie sur organismes invertébrés et sur algues d’eau douce. A ce jour, la règlementation ne donne pas la possibilité d’alternative au test chronique sur poisson d’eau douce, et cet essai reste, dans certains cas (production/importation supérieure à 1000 tonnes) l’unique procédure expérimentale de référence.
Etude de la toxicité aigüe et de la génotoxicité de substances chimiques, agrochimiques ou pharmaceutiques sur la santé humaine par l’utilisation d’un modèle de rat
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Tués en fin d'essai pour l'autopsie de leur estomac ou de leur peau, ou pour le prélèvement de leurs fémurs dont on extrait la moelle osseuse, 900 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une administration unique du produit à tester, par gavage, par application cutanée sous pansement pendant 24 heures ou par injection, les animaux traités par voie orale étant mis à jeun jusqu'à 19 heures avant le test et ceux traités par voie cutanée isolés pendant 24 heures. Les signes attendus vont des convulsions et des tremblements à l'érythème évoluant vers l'escarre et la destruction du derme, la toxicité pouvant aller jusqu'à la mort, et le porteur indique qu'il est impossible d'estimer la durée de ces atteintes puisqu'elles dépendent du produit testé. Ces essais servent à documenter des dossiers de mise sur le marché, et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro de toxicité systémique aiguë n'est aujourd'hui reconnu par les normes.
Objectifs
Le projet a pour but d’évaluer la toxicité des produits chimiques, agrochimiques et pharmaceutiques dans un contexte réglementaire ou de recherche et développement afin de définir les conditions sécurisées de leur manipulation sur leur lieu de fabrication, leur stockage, leur transport et leur manipulation par les utilisateurs. Parmi les paramètres permettant d’évaluer la toxicité d’un produit chimique, nous évaluons sa toxicité systémique aigüe, son potentiel mutagène. Pour répondre aux exigences des instances réglementaires européennes ou de recherche avant mise sur le marché de produits chimiques, agrochimiques et pharmaceutiques nous réaliserons des tests de toxicité systémique aigue ou de mutagénicité (TAO : toxicité systémique aigue par voie orale, TAD : toxicité systémique par voie cutanée, MIC : test micronoyau de mutagénicité). Pour cela, le produit à tester est administrée par la voie qui convient chez le rat afin de déterminer la toxicité du produit, par les différents signes cliniques observés et effets délétères observés.
Bénéfices attendus
Le projet permet d’évaluer la dangerosité potentielle sur la santé humaine liée à une substance chimique, agrochimique ou pharmaceutique. Ces études de toxicité et de mutagénicité permettront de définir les conditions de sécurité nécessaires pour leur manipulation lors de leur fabrication, leur stockage, leur transport et leur utilisation. Sur un plan plus large, ces évaluations, basées sur des normes très strictes, permettent d’évaluer la non dangerosité des médicaments ou des denrées alimentaires destinées à l'homme ou aux animaux.
Procédures
- Toxicité aiguë par voie oral: traitement unique par gavage (temps de contention + gavage maximum 1min). Pesée à J0, J2, J7 et J14 (1min). Observations cliniques répétées dans les premières heures puis quotidiennes (si l’animal ne présente aucun signe il est observé dans sa cage, sinon il est tenu par l’expérimentateur sans contention pendant un temps pouvant varier en fonction des signes (max 5min)). Procédure pour la mise à mort (30sec x2). - Toxicité aiguë par voie cutanée: rasage (1min), traitement unique local par patchage (30 sec) / dépatchage (30 sec) (mise d’un pansement pendant 24h puis retrait). Pesée à J0, J2, J7 et J14 (1min). Observations cliniques répétées dans les premières heures puis quotidiennes (si l’animal ne présente aucun signe il est observé dans sa cage, sinon il est tenu par l’expérimentateur sans contention pendant un temps pouvant varier en fonction des signes (max 5min)). Procédure pour la mise à mort (30 sec x2). - Test de mutagénicité: traitement unique qui se fait par la voie la plus propice (gavage, patchage, injection) (selon la voie 30 sec à 1min), pesée quotidienne (1 min), observations cliniques répétées dans les premières heures puis quotidiennes (si l’animal ne présente aucun signe il est observé dans sa cage, sinon il est tenu par l’expérimentateur sans contention pendant un temps pouvant varier en fonction des signes (max 5min)), procédure pour la mise à mort (30 sec x2).
Impact sur les animaux
Les réactions attendues sont des signes cliniques généraux relevant d’une toxicité aiguë : augmentation/diminution de l’activité spontanée des animaux ; diminution du mouvement involontaires des pavillons des oreilles déclenché par un son ; augmentation/diminution de la respiration, de la température corporelle, et du tonus musclaire ; limitation du réflexe de retournement ; aspect anormale de la ptose palpébrale, de l’aspect de la pupille, de l’aspect du poil ; observation de convulsions, tremblements, salivation, et larmoiement. La toxicité systémique peut également aboutir à la mort de l’animal. S’il y a atteinte des points limites alors l’animal sera mis à mort pour raison éthique avant la fin de l’étude. Concernant le test de toxicité aiguë dermique, en plus des effets systémiques, des réactions locales limitées à la zone de traitement peuvent être observées (sécheresse cutanée, perte de souplesse de la peau, érythème pouvant aller jusqu’à la formation d’escharre et/ou de croûte, desctruction de l’épidermes et du derme, œdème). Il est impossible d’estimer ou de prédire la durée de ces nuisances car elles seront dépendantes du produit testé. Cependant, une grille d'évaluation est mise en place en parallèle pour suivre le bien-être de l’animal, s’il y a atteinte des points limites alors l’animal sera mis à mort pour raison éthique avant la fin de l’étude. De plus les animaux traités par voie orale seront avant le test mis à jeûn pendant plusieurs heures (max 19h) et les animaux traités par voie dermique seront isolés pendant la durée de l’application (24 heures).
Devenir
- Toxicité aiguë par voie oral et cutanée: le but étant d’évaluer la toxicité systémique de la substance d’essai, une autopsie générale ainsi que celle du site de traitement (estomac ou peau) est réalisée en fin d’essai. Pour cela les animaux sont mis à mort en fin d’essai. - Test de mutagénicité : l’essai évalue la formation de micronoyaux dans les cellules sanguines prélevées dans la moelle osseuse des animaux. Pour ce faire, il est nécessaire de mettre à mort les animaux en fin d’essai afin de prélever leurs fémurs, os dans lesquels sera prélevé la moelle osseuse pour effectuer l'analyse.
Remplacement
L’ensemble de ces tests n’est mené qu’après analyse de la fiche de données sécurité par le directeur d’étude. Ces fiches rassemblent l’ensemble des données permettant de caractériser le produit : identité et structure chimique, propriétés physico-chimiques, résultats obtenus dans tous les autres essais de toxicité in vitro et in vivo, données toxicologiques de substances semblables et/ou ayant un usage similaire. L’analyse de ces fiches permettra de déterminer la dose de produit au démarrage de l’étude, et des études d’irritation et de corrosion in vitro (sur tissus de peau reconstitués) peuvent également être exigées si un doute persiste sur le produit avant le début de l’étude in vivo. Néanmoins à ce jour aucun modèle in vitro, permettant d’évaluer la toxicité systémique aiguë des produits chimiques, agrochimiques et pharmaceutiques, n’est décrit dans les normes communément accepté pour autoriser la mise sur le marché.
Réduction
L’ensemble de ces tests n’est réalisé que sur un seul sexe (généralement des femelles) afin de limiter le nombre d’animaux. De plus les témoins dit négatif, traités avec des substances connus pour ne causer aucune toxicité mais permettant de diluer le produit si nécessaire, ne sont réalisés que deux fois par an et non à chaque essai, excepté pour le test de mutagénicité où le test négatif sera inclu dans chaque essai. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étape est fixé par les normes spécifiques aux procédures. Et ne peut donc pas être réduit. Le nombre de test annuel est basé sur une estimation au vu du nombre de tests effectués les années précédentes. Aucun test statistique ne sera effectué dans ces projets.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par groupe de 2, 3 ou 5 animaux, par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles sont transparentes et contiennent de la litière constituée de copeaux de bois résineux déshydratée puis tamisée, ainsi que des frisottis, un tunnel en carton et des briquettes en bois comme enrichissement. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et la litière souillée est remplacée par de la litière propre 2 fois par semaine. Une liste de point limite et une grille pour évaluer l'importance de ces points limites a été établi. S’il y a atteinte des points limites alors l’animal sera mis à mort pour raison éthique avant la fin de l’étude. Les points limites sont définis pour ces tests afin d’éviter toute souffrance inutile aux animaux.
Choix des espèces
Le rat, reste le modèle de choix utilisé pour les tests de toxicité. Il est décrit dans les lignes directrices de l’OCDE (Organisation de coopération et de développement économiques) 402, 420, 423, 425 et 474 dont les versions originales ont été mises à jour en 2001 (OCDE 420 et 423), 2016 (OCDE 474), 2017 (OCDE 402) et 2022 (OCDE 425). L’espèce et le stade de développement des animaux à utiliser est imposé par les normes OCDE correspondantes. Nous utilisons des jeunes adultes de 8 à 12 semaines. Si des femelles sont utilisées, elles doivent être nullipares et non gravides.
Etudes des effets toxiques de xénobiotiques chez le chien
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Tués à l'issue pour l'analyse pathologique de leurs organes, sauf une centaine réutilisés ou confiés à des associations, 2 800 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 2 200 d'entre eux et sévère pour 600. Ils reçoivent de façon répétée des candidats médicaments ou des pesticides, subissent des prélèvements sanguins en état vigile, des prélèvements d'urine par sondage échoguidé sous sédation, des ponctions de liquide céphalorachidien et de liquide synovial ainsi que des biopsies d'organes sous anesthésie profonde. Les effets toxiques attendus vont des atteintes neurologiques aux atteintes métaboliques, et restent difficiles à estimer à l'avance. L'établissement mène ces études pour le compte des laboratoires qui développent ces produits, et présente le recours au chien comme "nécessaire" au regard des exigences réglementaires.
Objectifs
L’établissement utilisateur est spécialisé dans la conduite d’études de toxicologie/pharmacologie indispensables à l’évaluation clinique de xénobiotiques pour le compte de laboratoires les développant. Ce projet vise à d’évaluer la sécurité et la toxicité de xénobiotiques avant leurs utilisations, selon les recommandations des autorités règlementaires, chez le chien domestique Canis familiaris. Ces xénobiotiques sont des médicaments en cours de développement ou des composés chimiques comme les pesticides. Leur évaluation est effectuée conformément aux exigences des autorités réglementaires. Elle constitue la phase « pré-clinique » de leur développement, qui est un pré-requis aux essais cliniques de phase I, II et III et nécessaire pour l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché. Pour chaque xénobiotique, afin de caractériser ses potentiels effets toxiques, d’identifier ses organes cibles et de définir ses marges de sécurité, plusieurs études complémentaires et séquentielles sont nécessaires : - Des études préliminaires de détermination range de doses (DRF, dose range finding) ou de la dose maximale tolérée (MTD, maximal tolerable dose) qui constituent la première étape des évaluations toxicologiques et pharmacocinétiques. Elles permettent d’identifier la dose appropriée pour les études réglementaires ultérieures, notamment la toxicité à dose unique et à doses répétées. Elles aident également à déterminer les effets pharmacologiques et toxiques afin de confirmer les études règlementaires et de garantir le succès du dépôt d'une demande d'autorisation de mise sur le marché. - Des études de toxicologie réglementaires et de pharmacocinétique qui ont pour objectif de déterminer le niveau exempt d'effets toxiques ou le niveau sans effet indésirable observé en fonction de la durée du traitement et de l’espèce animale, de collecter des données de toxicité et de pharmacocinétique de candidats médicament avant administration chez l’humain ou chez l’animal. Le projet s’inscrit dans une démarche d’amélioration continue du bien-être animal en appliquant les principes des 3R. Les procédures sont optimisées pour limiter le nombre d’animaux requis, agir en étapes progressive pour raffiner le choix des doses et réduire la douleur et la contrainte, notamment par l’utilisation de techniques moins invasives et la validation d’approches alternatives.
Bénéfices attendus
Les études de toxicologie ont pour objectif de déterminer le niveau exempt d'effets toxiques ou le niveau sans effet indésirable observé en fonction de la durée du traitement et de l’espèce animale, de collecter des données sur la sécurité, l’efficacité et/ou la toxicité, de xénobiotiques (ex : candidats médicaments). Ces données sont des préquis avant le passage aux essais cliniques ainsi que pour la constitution du dossier d’autorisation de mise sur le marché. Le projet favorisera l’application des principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner), en optimisant les protocoles d’étude et en limitant l’impact sur le bien-être animal, ce qui renforcera la qualité scientifique des résultats et la conformité aux normes éthiques et réglementaires.
Procédures
Les animaux sont soumis dans ce projet : - des prélèvements de sang réguliers réalisés dans le cadre de recommandations vétérinaires, vigiles (sauf en cas d'anesthésie prévus pour d'autres prélèvements, cf ci-dessous). Chaque prélèvement dure quelques minutes, le nombre total est établi en fonction des caractéristiques du produit testé et limité en suivant les recommandations vétérinaires internationales. -des prélèvements d'urine, de manière passif (isolement jusqu’à diurèse ou bien de 4h maximum), ou échoguidé sous sédations (quelques minutes). Généralement, un prélèvement au début et un prélèvement en fin d’étude sont suffisants. - prélèvement d’autres fluides biologiques (liquide céphalorachidien, liquide synovial) : jusqu’à une fois par semaine, sous anesthésie profonde d’une quinzaine de minutes environs - des biopsies d’organes par ponction échoguidée (mini invasive), sous anesthésie profonde (10 minutes environ) - des contention manuelle, notamment dans le cadre d'examen clinique pour détecter des effets toxiques, d’environ 10 minutes. Afin d’éviter la répétition d’actes anesthésiques, les prélèvements peuvent être réalisés au cours d’une même anesthésie, permettant, en 10 à 15 minutes, de recueillir plusieurs échantillons de tissus et liquides biologiques. A chaque étude, tous ces prélèvements ne sont pas effectués, à l’exception des prélèvements de sang et d’urine qui sont systématiques. Ils sont choisis selon la nature du produit testé et les données préliminaires déjà connues (in vivo ou in vitro).
Impact sur les animaux
Trois catégories de nuisances peuvent être provoqués chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises de manière préventives pour réduire leur impact. - Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, ainsi que certaines voies d’administration, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des animaux. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaires mais cela peut néanmoins engendrer un stress. - Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de tissus biologiques (principalement de sang) et l’administration répétée du xénobiotique peut provoquer des lésions et un stress des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire pour certaines voies d’administration. De plus, les animaux sont placés en cage individuelle pendant la phase d’évaluation de la diurèse (prélèvement d’urine, durée limitée à 4 heures maximum). - Liées à une toxicité du xénobiotique testé : les études de toxicologie visent à évaluer la toxicité d’une molécule. Ce type de nuisances est difficilement estimable, mais selon le mécanisme d’action du xénobiotique (anticorps, anticancéreux, neurologique, etc), la voie d’administration, ou encore sa biodistribution, des effets toxiques sont possibles (neurologique, immunologiques, inflammation, métabolique, etc).
Devenir
Les études de toxicologie nécessitent généralement une analyse pathologie et donc la mise à mort des animaux d'après les recommandations des instances pharmaceutiques et médicales internationales. Néanmoins, pour chaque étude, 2 animaux peuvent être inclus dans la phase de préparation uniquement sans recevoir le produit testé et donc maintenus en vie en fin d'étude et inclus après validation vétérinaire dans d'autres études dans le cadre d'une même procédure (utilisation continue). Sans produits administrés, ou bien dans le cas où une mise à mort n'est pas utile d'un point de vu scientifique, ils peuvent être réutilisés dans d'autres procédures, ou bien placés. L'établissement travaille avec des associations pour les faire adopter.
Remplacement
Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d'obtenir toutes les informations collectées grâce à ces études. Suivant les recommandations des autorités règlementaires, il est nécessaire de recourir à des modèles in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est fixé au minimum permettant de garantir la fiabilité des données obtenues d’après les lignes directrices des instances médicales et pharmaceutiques.. Ce nombre est considéré comme le minimum acceptable permettant une interprétation pertinente des données et la caractérisation correcte des effets toxiques potentiels. Afin de le réduire, des animaux peuvent faire plusieurs études préliminaires après une période de repos (wash-out) dans le cadre d’une utilisation continue. Des études pilotes sont menées sur un nombre restreint d’animaux, lorsque cela est pertinent, afin d’optimiser les conditions expérimentales et d’affiner les protocoles, ce qui permet de réduire le besoin en animaux pour les études principales. De plus, les tissus et échantillons biologiques collectés au cours des études sont réutilisés pour des analyses complémentaires (histopathologie, biomarqueurs, etc.), ce qui évite de recourir à des animaux supplémentaires pour des tests additionnels. L’ensemble de ces mesures s’inscrit dans une démarche proactive de réduction du nombre d’animaux, en accord avec les principes des 3R et les exigences des bonnes pratiques de laboratoire. Enfin, la réutilisation d’animaux issus d’autres procédures expérimentales de gravité réelle ‘’légère’’ ou ‘’modérée’’ est possible tant que ces animaux n’ont pas reçu de xénobiotique en cours de test. Cela permet de réduire le nombre global d’animaux utilisé au sein de l’établissement et d’utilisés des animaux bien habitués aux manipulations liées aux études. Cette réutilisation est validée par un vétérinaire et la structure en charge du bien-être animal
Raffinement
Une période d’acclimatation 15 à 21 jours pour les chiens est respectée à réception des animaux. Pendant cette période d’acclimatation, les animaux bénéficient d’un programme d’habituation et de training adapté aux procédures qu’ils devront subir, afin de réduire leur stress et de favoriser leur coopération. Ce programme inclut des manipulations progressives et régulières, permettant aux animaux de s’habituer au contact humain et aux équipements utilisés. Pour les chiens, après la période d’acclimatation, des séances de jeu sont intégrées dans leur routine, favorisant leur stimulation cognitive et physique. Un programme d’enrichissements est appliqué quotidiennement. Il inclue un roulement régulier pour éviter l’habituation, est mis en place et validé par la Structure de Bien-Être Animal. Ce programme garantit des conditions de vie optimales et contribue à minimiser les impacts des expérimentations sur les animaux. Les animaux sont hébergés collectivement, sauf exceptions (bagarre, blessure), avec des enrichissements adaptés à leurs besoins. L’isolement est validé par un vétérinaire et fait l’objet d’un suivi par la structure en charge du bien-être animal. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter tout signe clinique anormal et prendre rapidement les mesures nécessaires (réhydratation, isolement pour soin). Toute anomalie est rapportée au vétérinaire, qui prescrit un traitement si nécessaire. Un suivi clinique et pondéral est en place, un fois par semaine pendant la phase d’administration du principe actif. L’examen clinique complet est effectué par un personnel formé pour évaluer les fonctions motrices, nerveuses, cardiaques, respiratoires, la température et l’état général des animaux. Un vétérinaire est présent aux heures ouvrées, et une astreinte vétérinaire est disponible 24h/24 et 7j/7. À leur inclusion dans le projet, tous les animaux font l’objet d’un examen clinique par un vétérinaire pour s’assurer de leur bon état de santé et exclure ceux jugés inaptes. Une traçabilité des animaux/des actes est assurée pour permettre leur suivi et analyse lors des bilans rétrospectifs. L’établissement développe des techniques les moins invasives possibles (ex: des gilets de télémétrie, permettant d’analyser les fonctions cardiaques, respiratoires et l’activité sans contrainte physique ou pose d’implant). Les volumes prélevés/administrés respectent les recommandations vétérinaires.
Choix des espèces
Ces animaux sont des espèces reconnues pour leur aptitude à prédire les effets pharmacologiques, indésirables et/ou toxiques de xénobiotiques destinés à devenir des médicaments humain. Les lignes directrices des instances médicales et pharmaceutiques requièrent généralement deux espèces (rongeurs et non rongeurs) selon la nature du produit à tester (molécule chimique de synthèse, peptide, protéine, anticorps monoclonal ou produit de thérapie génique ou cellulaire). Le chien est la principale espèce non rongeur utilisée. Selon ces lignes directrices, il convient d’utiliser de jeunes animaux sains : les chiens seront utilisés à partir de 6 mois.
CARC2025: Etudes de toxicité chronique et de cancérogénèse d’une nouvelle molécule avant sa mise sur le marché
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 480
960 rongeurs, 480 souris et 480 rats, vont être exposés pendant toute leur vie, jusqu'à 24 mois environ, à une nouvelle molécule chimique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'examen de leurs organes. Les prélèvements prévus à 3, 6, 12, 18 ou 24 mois comprennent trois prises de sang dans la même journée sans anesthésie, une autre sous anesthésie, et un isolement de 16 heures au plus pour recueillir les urines, à jeun pour les rats. Le résumé ne précise pas par quelle voie la molécule leur est administrée. Les souris et les rats porteurs de tumeurs sont gardés en vie tant que celles-ci n'entravent pas leurs déplacements ou leur capacité à boire et à manger et ne s'ulcèrent pas, et le porteur indique que la molécule peut provoquer chez le rat une opacité de la cornée et une cécité. Il présente ces études comme "une obligation avant la mise sur le marché", et précise que les groupes supplémentaires des lignes directrices chinoises ne seront pas constitués, la molécule n'étant pas destinée à ce marché.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer les risques pour la santé liés à l’exposition à un produit chimique spécifique tout au long de la vie de l’espèce considérée, avant sa mise sur le marché. Pour cela, nous réaliserons une étude combinée de toxicité chronique et de cancérogénicité. Ce projet permet de recueillir des informations sur les effets toxiques de la substance, y compris son potentiel cancérogène, tout en identifiant les potentiels organes cibles et la possibilité d’accumulation du produit dans ces derniers. De plus, il peut fournir une estimation de la dose sans effet nocif observé pour les effets toxiques, ainsi que, dans le cas de substances cancérogènes non génotoxiques, des réponses tumorales. Ces estimations sont cruciales pour établir des critères de sécurité concernant l'exposition humaine et donc le potentiel effet cancérogène pour l’homme. Pour caractériser et évaluer la cancérogénicité potentielle ainsi que la toxicité chronique de ce produit chimique, l’installation d’essai intègre toutes les informations disponibles sur la substance à tester.
Bénéfices attendus
Les études d’exposition chroniques et de cancérogenèse vont permettre : l’identification des propriétés cancérogènes d'un produit chimique susceptible d'augmenter les risques de tumeurs, la fréquence de survenue de tumeurs bénignes ou malignes ou la diminution du temps nécessaire à leur apparition, par rapport au groupe témoin non traité ; l’identification de la toxicité chronique d’un produit chimique ; l’identification d'un ou de plusieurs organes cibles de la toxicité chronique et de la cancérogenèse ; la caractérisation de la relation dose-effet ; l’identification d’un niveau de dose sans effet nocif observé ou du point de départ de l’effet pour l’établissement d'une dose de référence ; l’extrapolation des effets cancérogènes aux niveaux d’exposition humaine correspondant à de faibles doses ; la prévision des effets de toxicité chronique aux niveaux de doses représentatifs de l'exposition humaine ; l’obtention de données permettant de vérifier les hypothèses concernant le mode d’action de la molécule. Toutes ses données seront rapportées, soumises aux autorités internationales et serviront à l’analyse du risque pour l’homme.
Procédures
Aprés 3, 6, 12 et 18 et/ou 24 mois environ, 3 prélèvements sanguins sont réalisés au cours d'une même journée en moins de 2 minutes sur animaux vigiles. Aprés 3, 6, 12 et 18 et/ou 24 mois environ, 1 prélèvement sanguin est réalisé en moins de 2 minutes sur animaux anesthésiés. Aprés 3, 6, 12 et 18 ou 24 mois environ au cours de l’étude, les animaux peuvent être isolés pour une durée maximale de 16h (avec mise à jeun pour les rats) pour le recueil de leurs urines. La mise à mort précédée par une administration d'un analgésique et d'une anesthésie.
Impact sur les animaux
Les niveaux de doses sont fondés sur les résultats des études précédentes. Le choix de la forte dose doit permettre l’évaluation d’une dose bien tolérée par les animaux et induisant une toxicité légere à modérée. Les prelevements de sang peuvent induire une douleur légère et de légers hématomes au point de prelevement. Pour la mesure et le prelevement d’urines, les animaux sont isolés pendant 16h maximum (avec mise à jeun pour les rats). La veille des autopsies prévues, les rats n’ont plus accès à la nourriture pendant 16 h maximum ce qui peut induire un stress léger ainsi qu’une baisse de poids. Compte tenu de l’objectif de l’étude et de sa durée, des tumeurs bénignes ou non , spontanées ou induites par le produit peuvent apparaitre, les animaux seront gardés en vie tant que la taille des tumeurs ne remet pas en cause leur déplacement, et leur capacité à boire ou à s'alimenter(
Devenir
En raison du but de l’étude qui est d’évaluer l’atteinte au niveau des tissus, des organes de l’animal et l’apparition de tumeurs, tous les animaux seront mis à mort pour prelevement d'organes .
Remplacement
Malgré les nombreux tests in silico ( évaluation grace à des calculs/modéles complexes informatisés), in-vitro (essais réalisés sur micro-organismes, organes ou cellules) , et in-vivo conduits lors du developpement de cette molecule qui ont permis de mettre en évidence le mode d’action et les organes cibles de la molécule, ces études animales restent une obligation avant la mise sur le marché d’une nouvelle molécule chimique. Il n’existe pas aujourd’hui de tests substitutifs validés et acceptés par les autorités relatifs à l’évaluation de tumeurs après une exposition chronique.
Réduction
L'essai combiné dans l’étude rat ou l’ajout d’un sous-groupe pour mise à mort intermédiaire (phase chronique) dans l’étude souris permet une meilleure efficacité en temps et en coûts, et un moindre recours aux animaux, par rapport à la conduite de deux essais séparés, et ne compromet pas la qualité des données de la phase chronique ou de la phase de cancérogenèse. La taille des groupes est la taille minimale requise par la ligne directrice. La molecule n’étant pas destinée au marché chinois, les groupes supplémentaires requis par les guidelines chinoises (2 groupes de 10 animaux par doses et par sexes mis à mort après 6 et 18 mois d’exposition) ne seront pas nécessaires.
Raffinement
Compte tenu de la durée de l’étude, une observation quotidienne de l’état clinique des animaux sera assurée et une attention particulière sera portée à l’apparition de tumeurs spontanées ou induites par le produit. Ces tumeurs seront recherchées, observées et mesurées au moins 1 fois/semaine afin de suivre leur progression et/ou l’apparition de zone de nécrose. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. Lors des prises de sang en cours d’étude l’usage d’un tapis chauffant pourra être utilisé pour maintenir la température corporelle des animaux sous anesthésie. Des micro prélèvements seront utilisés pour l’évaluation des paramètres toxicocinétiques. Le jour précédent leur mise à mort les animaux sont déplacés dans une salle proche de la salle de nécropsie pour éviter le stress du transfert le jour même. Les prélèvements de sang sont réalisés dans une salle séparée et différente de celle utilisée pour la mise à mort. Afin d’éviter toute douleur, les animaux seront mis à mort après une analgésie à l’aide d’un opioïde de type méthadone suivi d’une anesthésie gazeuse à l’isoflurane.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les modèles expérimentaux choisis en raison de leur durée de vie relativement courte, de leur utilisation fréquente dans les études pharmacologiques et toxicologiques, de leur sensibilité à l'induction de tumeurs et de la disponibilité de souches suffisamment caractérisées. Les rongeurs sont recommandés par la communauté scientifique et les instances réglementaires. Des données historiques issues des études précdemment conduites sont disponibles dans le laboratoire avec les espèces et souches choisies (Rat Wistar et souris C57Bl6J). Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Les animaux utilisés sont de jeunes animaux sevrés à l’arrivée sur le lieu de l’expérimentation dont l’âge après la période d’acclimatation doit être inférieur à 8 semaines compte tenu de l'objectif et de la durée de l'étude (exposition pendant toute la vie de l'animal). Cet age est requis par les lignes directrices internationales.
Evaluation de la toxicité d’un candidat médicament après administration unique ou répétée chez le rongeur
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1800
Le protocole suit la voie d'administration retenue par la société qui développe le candidat médicament, orale par gavage, intramusculaire, sous-cutanée ou intrapéritonéale, jusqu'à deux fois par jour pendant un mois. 3 600 souris et 1 800 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, tous tués à l'issue. La mise à mort suit un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie profonde et permet de peser et d'examiner le cerveau, le cœur, le foie et les reins. Les effets attendus du produit vont de la prostration aux troubles digestifs et nerveux, et le porteur justifie ces essais par la nécessité de mesurer la toxicité sur un "organisme entier".
Objectifs
La société développe des médicaments pour l'homme avec différentes voies d'administration possibles et visant divers récepteurs, enzymes ou d'autres cibles. Il est important de connaître la toxicité et la distribution du candidat médicament dans le corps. Ainsi, l'objectif de ce projet est de déterminer la toxicité et l'exposition dans le temps d'un candidat médicament dans le sang et les organes dans différentes espèces animales rongeurs (rat ou souris), après un traitement unique ou répété (si répété :1 mois maximum, 2 administrations maximum par jour) par voie orale, ou par voie intramusculaire, sous-cutanée, ou intrapéritonéale. 1) L'observation clinique journalière des animaux permettra de détecter d'éventuels signes de toxicité. 2) Des analyses sanguines sur prélèvement sanguin terminal permettront de compléter le recueil d'informations. 3) L'autopsie terminale des animaux permettra un examen des organes (poids, aspects macroscopiques), leur recueil éventuel pour analyses histologiques. 4) Les mesures de taux de candidat médicament dans le sang et les organes nous donneront ainsi une bonne indication quant à l'exposition du candidat médicament dans le temps, nous aideront à relier les expositions aux effets toxicologiques. Ce projet d'utilisation des animaux s'intègre dans un projet de Recherche exploratoire plus global de ce candidat médicament au profit de la santé humaine et sera fait en complément des études in vitro.
Bénéfices attendus
L'implication des animaux dans ce projet va nous permettre d'avoir une meilleure connaissance du devenir du candidat médicament dans un organisme physiologiquement proche de l'homme sur une espèce (rat ou souris) qui sera utilisée dans toutes les études de toxicité réglementaires obligatoires avant le passage en clinique chez l'homme. Cette étude permettra 1) d'avoir une première approche de la gamme de doses sans effet toxique, de la comparer à la gamme de doses thérapeutiques efficaces et le cas échéant d'éviter d'engager un candidat médicament dans les études réglementaires de toxicité obligatoires qui sont lourdes et consommatrices d'animaux, 2) de déterminer d'éventuel(s) organe(s) cible(s) en termes de toxicité et 3) d'obtenir les expositions du candidat médicament dans le sang et les organes en fonction du temps. Ces expositions pourront être reliées aux effets pharmacologiques et toxicologiques du produit. Ce projet chez le rongeur aura un grand bénéfice dans le développement du candidat médicament car cette étude ne peut pas être substituée par des études cellulaires in vitro qui ne miment pas assez finement la complexité et la dynamique d'un modèle entier vivant et sa physiologie.
Procédures
Contention et administration du produit par voie orale (gavage) ou par injection intramusculaire, sous-cutanée, ou intrapéritonéale, l'ensemble durant moins de 30 secondes à chaque administration et ce pour l'administration aigue et pour l'administration répétée pendant 1 mois maximum (au maximum deux fois par jour). Anesthésie générale profonde pour prélèvement terminal sanguin suivi de la mise à mort de l'animal avant de réaliser des prélèvements d'organes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont celles liées à la contention de l'animal, l'administration du produit à tester (gavage, injection), à l’anesthésie avant les prélèvements sanguins terminaux pouvant conduire à un stress de l’animal ainsi que les effets indésirables éventuels du produit. Les effets indésirables liés au produit pourront être de l'ordre : prostration, hyperlocomotion, ou hypolocomotion, des comportements anormaux induits, des troubles digestifs ), des troubles du système nerveux central, des perturbations du métabolisme.
Devenir
Chaque animal sera anesthésié pour prélèvement terminal sanguin pour analyses, avant une mise à mort suivie de prélèvements terminaux d'organes (cerveaux, coeur, foie, reins...) pour analyses.
Remplacement
L'utilisation d'animaux pour des évaluations de toxicité et de toxicocinétique d'un candidat médicament est justifiée par la nécessité de pouvoir déterminer les effets de la molécule à tester sur un organisme entier, reflétant physiologiquement l'humain. La complexité et la dynamique de l'organisme et des interactions organes-médicament ne nous permettent pas de se limiter aux seuls modèles in vitro ou ex-vivo car ils ne représentent pas assez finement l'ensemble des mécanismes physiologiques. Toutefois, les candidats médicaments qui seront testés auront déjà passé une série de tests en phases précliniques précoces (in vitro) et qui permettent d'identifier les molécules les plus sélectives pour nos récepteurs d'intérêt et sans effets sur des cibles non désirées (cardiaque par exemple).
Réduction
Pour les prélèvements destinés aux analyses toxicocinétiques, le nombre d'animaux par temps selon nos données historiques est au maximum de 5 individus afin d'avoir une fiabilité de résultat en tenant compte de la variabilité inter-individus. Pour les prélèvements destinés aux analyses de biochimie et de numération-formule sanguine, le nombre d'animaux par temps selon nos données historiques est au maximum de 10 individus afin d'avoir une fiabilité de résultat en tenant compte de la variabilité inter-individus et permettre une analyse statistique. Chaque animal sera analysé sur l'ensemble des paramètres à son temps de sacrifice avec mesures des taux du candidat médicament dans le sang et dans d’autres organes (par exemple cerveau, coeur, foie, rein...), détermination de la numération-formule sanguine, mesures des paramètres de biochimie sanguine, observation macroscopique et pesée d'organes clefs en termes de toxicologie comme le coeur, le foie, les reins... et leur conservation le cas échéant pour analyse histologique.
Raffinement
Afin de réduire le stress, les animaux seront hébergés en animalerie et acclimatés au minimum 5 jours avant toute expérimentation pour s'habituer au nouvel environnement (contrôlé en continue). Pour le bien-être de l'animal et lui éviter un stress, chaque cage dispose d'un bloc de lanières de papier pour la nidation et d'un enrichissement (igloo ou tunnel), et ce, dès leur arrivée au laboratoire. Tout mal être identifié aboutira à une surveillance accrue de l'animal et à des soins si besoin (exemple : désinfection d'une plaie). Le personnel zootechnicien est sensibilisé pour remonter tout comportement suspect d'un animal anxieux soit durant le temps d'acclimatation, soit le jour même de l'expérimentation au moment de sa manipulation. Les groupes sociaux resteront ceux formés depuis l'arrivage jusqu'à la fin de l'étude. Les animaux disposeront de nourriture et eau de boisson à volonté sous surveillance quotidienne. Les traitements (oraux, injections...) se feront par du personnel formé avec du matériel adéquat pour chaque espèce rongeur. La méthode de mise à mort avec initialement un grand prélèvement terminal sanguin sera préalablement précédée d'une anesthésie gazeuse de l'animal. Le contrôle de l'anesthésie se fera par un contrôle du réflexe de retrait de la patte et en s'assurant d'une respiration abdominale. Les animaux feront l'objet d'une surveillance accrue pendant l'expérimentation. Si les points-limites préalablement établis sont atteints, l'animal sera euthanasié de façon anticipée afin de lui éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont des espèces relativement proches de l'homme, les données obtenues seront pertinentes afin d'extrapoler les résultats. Ces espèces sont utilisées dans les études de toxicité/toxicocinétique réglementaires obligatoires avant de passer un candidat médicament en phase clinique chez l’homme. Ces espèces sont 2 espèces de petite taille pour lesquelles il est possible d’avoir des effectifs assurant une robustesse dans les résultats et limitant les quantités nécessaires en produit administré. Le choix de l'espèce entre la souris et le rat va s'orienter selon : 1/le type de candidat médicament, 2/ les organes d'intérêt (exemple : le rat ne présente pas de vésicule biliaire par rapport à la souris) et 3/ du profil métabolique de l'espèce rongeur comparé au profil métabolique humain déterminé au préalable par des tests comparatifs in vitro. Les animaux seront utilisés au stade adulte : cela permettra de refléter un organisme mature et métaboliquement développé (en particulier au niveau du foie).
Evaluation de la tolérabilité d’un candidat médicament chez les chiens, porc et PNH
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Cochons : 225
Macaques à longue queue : 135
Réutilisés d'une étude à la suivante pendant quatre à cinq ans, 370 des 495 animaux impliqués repartent vers d'autres procédures, 30 chiens sont proposés à l'adoption et 95 animaux sont tués pour prélèvements terminaux. 225 cochons, 135 chiens et 135 macaques à longue queue vont ainsi être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun peut recevoir jusqu'à 40 administrations en dix semaines par minipompe, subir dix prélèvements sanguins en vingt-quatre heures, des biopsies de peau ou d'organes sous anesthésie de deux heures, et passer jusqu'à quarante-huit heures seul en cage à métabolisme. Les effets des produits testés sont déclarés non prévisibles au lancement du projet. Le porteur écrit qu'avant toute administration à l'homme l'animal constitue un "passage obligatoire", et présente ces données comme une "étape indispensable" à la mise sur le marché de nouvelles molécules.
Objectifs
L’objectif du projet est d’évaluer la tolérance locale et/ou systémique de futurs candidats médicaments après leur administration chez les non-rongeur. Dans le cadre de développement de nouveaux candidats médicaments, une modification de la formulation, de la voie d'administration ou un ajustement de la dose thérapeutique peut amener à étudier, dans ces nouvelles conditions, les effets sur l'état général de l'animal et/ou les effets en local, par exemple les effets sur la peau et l’étude de résidus du composé. Après administration du composé, une observation régulière des animaux sera réalisée grâce à une grille de surveillance adaptée à chaque étude et à chaque modèle animal. Également, une évaluation du comportement général pourra être effectuée. Des prélèvements répétés de sang ou des biopsies pourront être effectués au cours et/ou à la fin des études.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments ou des nouvelles formulations de médicaments déjà mis sur le marché, présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Suivant la cible thérapeutique, les composés testés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire.
Procédures
Afin d'administrer les candidats médicaments aux animaux, différentes voies d'administration pourront être utilisées (2 minutes ou moins, sauf pour les administrations par minipompe qui peuvent se faire sur plusieurs jours et avec un maximum de 40 administrations sur 10 semaines). Des prélèvements sanguins (durée 2min, maximum 10 prélèvements sur 24h) pourront être réalisés. Également, des biopsies de peau (2 minutes ou moins) ou d'organes (2h sous anesthésie) pourront être réalisés. Pour les recueils urinaires, les animaux seront placés en cage à métabolisme sur une durée de 24h en général qui peut être augmenté jusqu’au 48h au maximum. Les animaux pourront éventuellement être mis à jeun la veille de l’administration pour une durée qui est fonction du produit testé (24h maximum).
Impact sur les animaux
Les effets potentiellement indésirables du/des produits testés ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Une analyse sera engagée avant toute étude afin d'anticiper les effets indésirables potentiels qui pourraient émerger en fonction de la nature du produit à tester. Les effets potentiellement indésirables feront l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place les traitements de potentiels signes cliniques (diarrhée, vomissement). Les animaux de ce projet pourront subir une contrainte lié à la privation de nourriture avant administration du produit ou une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration et de l'anesthésie, une contrainte lié à l'hébergement individuel en cage à métabolisme pour la collecte d’urine, avec ou non une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins, une contrainte lié à l'anesthésie/sédation lors des poses d’intraflons, de cathéter veineux ou de minipompe.
Devenir
Lorsque les chiens ne peuvent pas être reutilisés (4 à 5 ans après leur arrivée), ils pourront être mis à l'adoption si leur état de santé le permet. Certains animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez les non-rongeur, car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer la tolérabilité ainsi que la pharmacocinétique d’une nouvelle molécule. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le chien, porc et le primate non humain sont des espèces non rongeur adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 3 à 6 animaux par groupe. Cependant, une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Le recours aux procédures d’anesthésie/analgésie adaptées dès que nécessaire • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales, • La mise en groupe des animaux, • La mise en place de jouets dans les cages de prélèvements (Chien, PNH), • Des séances d'exercice et de jeu pour les animaux.
Choix des espèces
Les espèces (chien, porc, primate non humain) qui seront utilisés dans ce projet, sontles espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour la réalisation d’études de tolérabilité et de pharmacocinétique permettant d’étudier le devenir (absorption, distribution, métabolisation, élimination), d’un produit testé, dans le sang et/ou les urines (lorsque ces espèces sont utilisées au cours du développement préclinique de ce produit). Ces espèces présentent des similarités physiologiques et cliniques avec l'homme et peuvent développer des pathologies analogues aux pathologies humaines. Animaux sevrés en croissance et animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Modèle d’implantation (et réimplantation) prépéritonéal pour l’évaluation d’un produit de santé avec ou sans implantation (et réimplantation) sous-cutanée
- Formation professionnelle
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Pour satisfaire aux exigences réglementaires précédant la mise sur le marché d'un produit de santé, 3 700 rats sont utilisés, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour autopsie. Chaque animal reçoit des implants placés entre la paroi de son ventre et la membrane qui entoure ses organes, jusqu'à quatre sites, plus six sites sous la peau, avec des réimplantations chirurgicales répétées, jusqu'à trois en prépéritonéal et cinq en sous-cutané sur un an. Le porteur décrit des cris à la manipulation et des morsures dues à la douleur, ainsi que des atteintes possibles à l'œil quand le sang est prélevé dans sa veine. L'étude est commandée par un client, qui garantit lui-même qu'elle ne double pas une étude déjà réalisée.
Objectifs
Le projet vise à respecter les exigences des autorités réglementaires et des normes en vigueur avant l’utilisation d’un produit de santé chez l’Homme. Il évalue la toxicité (i.e. les éventuels effets néfastes sur le corps) et/ou la tolérance locale (i.e. sécurité, toxicité/réaction locale) du produit de santé. L’évaluation de ces produits de santé doit mimer autant que possible l’utilisation clinique et ainsi considérer un mode d'administration similaire dans les modèles animaux (prépéritonéal et/ou sous-cutanée) et l’effet cumulatif (réimplantation(s)) lorsque cela est possible. Prépéritonéal signifie situé entre la membrane qui entoure les organes du ventre et la paroi du ventre. Sous-cutanée signifie situé sous la peau.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de s’assurer avant sa mise sur le marché que le produit de santé est sûr pour les patient afin de répondre aux exigences des autorités réglementaires et des normes en vigueur. Il permet d’évaluer les risques éventuels liés à l’utilisation de ce produit et de s'assurer que les éventuels risques sont acceptables par rapport aux bienfaits/bénéfices apportés aux patients. Les résultats des études aideront à décider si le produit peut être mis ou maintenu sur le marché, conformément aux règles en vigueur.
Procédures
Lors de la chirurgie réalisée sous analgésie/anesthésie, un ou des sites prépéritonéaux (situés entre la membrane qui entoure les organes du ventre et la paroi du ventre) (environ 15 minutes) seront réalisés. Un ou des site(s) sous la peau (environ 8 minutes supplémentaires) pourront également être ajoutés sur les même animaux. Il est possible d'ajouter à cela des tatouages des sites pendant la procédure (10 minutes additionnelles). Selon la durée de l'étude, une ou plusieurs autres réimplantations chirurgicales (espacées de 4 semaines minimum) pourront avoir lieu pour réimplantation (implanter de nouveau des dispositifs). La durée de ces interventions est similaire aux durées précédemment mentionnées. Le nombre et la fréquence des réimplantations dépendent de l'utilisation clinique du produit à tester, de sa taille, du nombre maximum de sites possible (4 sites maximum en prépéritonéal et 6 sites au maximum sous la peau), de la durée d'étude, de la nature et de la durée de l'ensemble des procédures cumulées, et de l'avis vétérinaire en fonction de l'état général des animaux. Pour une étude 14 à 28 jours: pas de réimplantation possible (car espacement considéré insuffisant). Pour une étude de 13 semaines: maximum 2 réimplantations prépéritonéales et 2 réimplantations sous-cutanées. Pour une étude de 26 semaines à 1 an, maximum 3 réimplantations prépéritonéales et 5 réimplantations sous-cutanées. Pendant l'étude, selon une fréquence et un volume n'affectant pas l'animal, des prélèvements sanguins (environ 5 minutes) pourront être réalisés. La durée des interventions en fin d'étude est d'environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant être observés sont principalement dus à l’implantation prépéritonéale et/ou sous la peau. Cela peut engendrer un stress et ou une douleur localisé au niveau du site chirurgical (entrainant par exemple des réactions inhabituelles, des cris lors de la manipulation, une agressivité, des morsures dues à la douleur), faible perte de poids, baisse d’appétit. Si le produit est toxique, il peut causer des pertes des poids significatives et une baisse d’activité plus importante, des gonflements/blessures au niveau des sites. En cas de prélèvements sanguins se faisant au niveau de la veine de l'oeil, des effets indésirables sur l'oeil peuvent se produire.
Devenir
Pour les besoins de l'étude, une autopsie est nécessaire. Ceci permet d'évaluer les effets potentiels de toxicité systémique et/ou locale du produit de santé à tester. Ces analyses expliquent l'impossibilité en fin d'étude de maintenir en vie les animaux utilisés. De plus, l’analyse des paramètres sanguins ainsi qu'une évaluation des tissus au microscope (analyse histopathologique) est nécessaire.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. Les méthodes alternatives existantes ne permettent pas d’évaluer les effets toxiques à court, moyen ou long terme des produits de santé en raison de la complexité des mécanismes de régulation d’un organisme vivant. Il n'existe pas de test in vitro validé ni de modèle simulé par ordinateur capable de reproduire la complexité d'une réaction tissulaire et/ou des effets systémiques. L’utilisation d’animaux est alors obligatoire pour y parvenir.
Réduction
A la constitution de l’étude, le nombre minimal d'animaux requis par les textes de références est considéré. Dans la mesure du possible, les animaux témoins sont mutualisés entre les différents essais (un même groupe d’animaux "témoin" pour plusieurs groupes d’animaux "test" recevant des produits à tester différents) et la tolérance locale est couplée à l’évaluation de la toxicité systémique. Pour chaque étude, le client pour lequel l'étude est conduite garantit que cette étude ne duplique pas une étude déjà réalisée. Les études dites "faisabilités/pilotes", sur un nombre restreint d’animaux, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur. De plus, dans le cadre d'essai de toxicité systémique subaiguë, subchronique et chronique, le nombre d'animaux doit être suffisant pour permettre une analyse statistique pertinente (i.e. nombre minimum d’animaux requis) et cela est défini dans la norme en vigueur Les analyses statistiques (exemple: Test de Mann & Whitney avec un risque de 5%) sont réalisées sur le poids des animaux, le poids des organes (absolus et relatifs) et les paramètres sanguins.
Raffinement
La stratégie de raffinement est établie afin de limiter le stress et la douleur des animaux. Elle repose sur la présence d’enrichissements du milieu en systématique, l’utilisation d’antalgiques, d’analgésiques et d’anesthésiques lorsque nécessaire, un suivi sanitaire et clinique renforcé pendant la/les phase(s) d’administration avec une visite vétérinaire en cas d’anomalie clinique, sanitaire ou comportementale, pour permettre une gestion adéquate de la douleur ou de l’anomalie constatée selon chaque cas. Un suivi des points limites spécifiques au projet sera mis en place.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans le(s) texte(s) de référence. De plus, il est largement utilisé, rendant disponibles de nombreuses données dans la littérature (données sur différents modèles - raffinement, données basales de pathologie…). Le choix du stade de développement est décrit dans les textes de référence qui recommandent généralement l'utilisation d'animaux adultes, âgés en général de 6 à 12 semaines. Lorsque la procédure le nécessite ou dans le cas des propriétés intrinsèques du produit à tester (ex : quantité et/ou taille du matériel à tester importante), des animaux d’un poids plus important (donc plus « âgés ») peuvent être utilisés.
Evaluation du système cardiovasculaire, respiratoire et système nerveux central chez le singe (Modification)
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Opérés une à deux heures pour l'implantation d'un émetteur télémétrique, maintenus en chaise de contention jusqu'à quatre heures pour les perfusions et hébergés seuls jusqu'à trente heures, 216 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les produits leur sont administrés par voie orale, intramusculaire, intraveineuse, intra-articulaire, vaginale, rectale, sous-rétinienne ou intravitréenne, à des doses supérieures ou égales aux doses thérapeutiques humaines. Le porteur écrit pourtant que les paramètres sont enregistrés "sans induire de stress aux animaux" et que les actes ajoutés par cette modification "n'induisent aucune nuisance ou effet indésirable supplémentaire". 120 de ces macaques sont déclarés réutilisés d'une étude à l'autre, et aucun ne peut être placé ni adopté du fait de l'émetteur implanté, le porteur indiquant qu'ils sont tués après avoir participé à plusieurs études.
Objectifs
Le but de ce projet est de décrire les études permettant d’identifier les propriétés pharmacodynamiques indésirables de candidats médicaments chez le primate non humain conscient. Ces études de pharmacologie de sécurité permettent d’enregistrer les paramètres cardio-respiratoires vitaux tels que l’électrocardiogramme, les paramètres respiratoires ainsi que la température et l’activité de l’animal par accéléromètre. Les animaux sont équipés d’émetteurs télémétriques implantés chirurgicalement (télémétrie interne) ou d’un gilet (télémétrie externe) permettant de transmettre en continu les signaux de respiration, de température et d’électrocardiogramme (ECG). En télémétrie interne ou externe, les paramètres sont enregistrés en continu sans induire de stress aux animaux. Les fonctions cardiaque, respiratoire et du système nerveux central sont ensuite évaluées après une ou plusieurs administrations d’un candidat médicament. Le présent projet comprend trois procédures de pharmacologie de sécurité chez le primate non humain (singe cynomolgus) conscient (procédures 1, 2 et 4) et une procédure de chirurgie (procédure 3). 1/ Evaluation du système cardio-respiratoire par télémétrie interne (avec implantation d’un émetteur de télémétrie), 2/ Evaluation du système cardio-respiratoire par télémétrie externe (avec ou sans implantation d’un émetteur de télémétrie pour la pression artérielle), 3/ Implantation chirurgicale des émetteurs de télémétrie : Implants de télémétrie pour utilisation en procédure 1 et implants de mesure de pression artérielle pour utilisation en procédure 2 ; l’utilisation du site de l'artère iliaque pour la pose du cathéter de pression artérielle nécessite une modification du projet initial sans d’ajout d’animaux. 4/ Evaluation du système nerveux central par batterie de tests fonctionnels.
Bénéfices attendus
Le projet, réalisé dans un cadre réglementaire, a comme objectif d’évaluer les effets pharmacodynamiques indésirables de candidats médicaments chez le primate non humain. Conformément aux lignes directrices éditées par l’International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH), l'évaluation du potentiel toxique d'un candidat médicament chez un non-rongeur est indispensable pour chaque nouveau candidat médicament avant de pouvoir démarrer les essais cliniques chez l'Homme, et avant toute autorisation de mise sur le marché.
Procédures
Les animaux sont soumis à une intervention chirurgicale d’une durée de 1 à 2 heures environ, pour implantation d’émetteurs de télémétrie servant à mesurer des paramètres cardiorespiratoires et/ou la pression artérielle. Dans un second temps, les paramètres cardiovasculaires sont mesurés par télémétrie (non invasif) sur les animaux, ce qui peut nécessiter un hébergement individuel qui ne dépasse pas 30 heures ou le port d’un gilet de télémétrie. Les animaux sont traités, par différentes voies (principalement orale et injection intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse, intra-articulaire, vaginale, rectale, sous-rétinienne ou intravitréenne), le plus souvent en dose unique, pour évaluer un potentiel effet pharmacodynamique indésirable d’un candidat médicament. Des prélèvements sanguins sont également possibles pour l’évaluation de l’exposition au produit et/ou bilan hémato-biochimique, et réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Une contention en chaise (maximum 4 heures pour des perfusions IV, avec habituation préalable) ou dans les bras (quelques minutes au maximum) est nécessaire pour les administrations et/ou les prélèvements. (Modification) Les actes ajoutés n’induisent aucune nuisance ou effet indésirable supplémentaire.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont rares et correspondent essentiellement aux effets pharmacologiques du produit administré [ex : action au niveau du système nerveux central, du système cardio-respiratoire (variation de fréquence cardiaque ou respiratoire ou du niveau de pression artérielle)] ou à des effets systémiques (ex : perte de poids, baisse de consommation alimentaire). Ces effets sont très rares en pratique compte tenu des faibles doses utilisées dans le cadre de ces études de pharmacologie de sécurité et qui sont le plus souvent déterminées en fonction des résultats des études de toxicologie réalisées auparavant. D’autres effets indésirables peuvent être associés aux procédures (contraintes liées au port du gilet de télémétrie, à l’implantation chirurgicale des émetteurs de télémétrie et à la contention lors des manipulations, prélèvements sanguins dans le but de vérifier l’exposition au candidat médicament, évaluation pharmacocinétique ou autres biomarqueurs sanguins). (Modification) Les actes ajoutés n’induisent aucune nuisance ou effet indésirable supplémentaire.
Devenir
Dans le cadre de ce projet, les animaux reçoivent des doses pharmacologiques supérieures ou égales aux doses thérapeutiques humaines et sont par conséquent, le plus souvent réutilisés. Ces animaux dont la majorité portent un émetteur de télémétrie ne peuvent pas être replacés ou adoptés. Après avoir participé à plusieurs études et en fonction des produits administrés et de leurs potentiel effet pharmacologique, les animaux sont sacrifiés suivant les procédures éthiques en vigueurs.
Remplacement
L'évaluation des effets pharmacodynamiques indésirables d'un candidat médicament ne peut pas être réalisée in vitro. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour ce type de procédure de traitement identique à celle utilisée chez l'Homme, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Les interactions entre les différentes fonctions physiologiques et composantes de l’organisme qui participent aux réponses pharmacodynamiques d’un candidat médicament, ne peuvent pas être identifiées aujourd’hui par des procédures in vitro de types cellules ou organes isolés. Le choix du primate non-humain par rapport aux autres espèces non-rongeurs est justifié par la nature du candidat médicament (biologiques) et de l’homologie des voies métaboliques et relations pharmacodynamiques/pharmacocinétiques chez l’homme par rapport au primate non-humain.
Réduction
Le nombre d’animaux est déterminé par la réglementation cadrant les études de pharmacologie de sécurité et est le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude. La méthode d’investigation en pharmacologie de sécurité implique le plus souvent un traitement croisé (cross-over design), permettant l’utilisation d’un nombre réduit d’animaux (de 4 à 8 animaux par étude – le plus souvent d’un seul sexe), sans impacter la fiabilité des données, les résultats et les objectifs de l’étude. Dans le cas d’un candidat médicament du type biologique nécessitant un protocole d’étude en groupes parallèles avec un groupe véhicule et deux doses de produit (n=4 animaux par dose ou groupe et n=12 au total), le nombre total d’animaux peut être réduit à 8 au lieu de 12, en ré-utilisant le groupe véhicule pour évaluer une des doses du candidat médicament. Par ailleurs, l’analyse continue des données de télémétrie améliore considérablement la qualité et la fiabilité des données enregistrées avec un nombre réduit d’animaux. Pour éviter d’inclure systématiquement l’évaluation d’un produit de référence positif dans chaque étude portant sur les effets de candidat médicament sur le système cardiovasculaire et en accord avec les nouvelles recommandations ICH, les résultats des effets d’un produit de référence positif, évalué en cross-over à trois doses et un véhicule, peuvent être utilisés pour plusieurs études, et réévalués séparément à un intervalle régulier de 3 et 6 années.
Raffinement
Les procédures, les conditions d’hébergement et matériel utilisés ainsi que les enrichissements fournis sont adaptés aux animaux utilisés dans ce projet. Des enrichissements variés (graines dans des copeaux, tablettes à différentes hauteurs, …) sont fournis aux animaux, leur permettant d’exprimer les comportements physiologiques et activités qu’ils auraient dans leur habitat naturel (ex. : recherche d’aliment, épouillage, temps d’isolement). Les animaux sont habitués aux contraintes expérimentales telles que le port du gilet et la contention en chaise. En cas d’administration par perfusion intraveineuse, des friandises peuvent être proposées pendant la perfusion. Après les chirurgies pour implantation des émetteurs, les animaux sont suivis quotidiennement en période post-opératoire (suivi de la fréquence cardiaque, de la température corporelle sur 10 jours, voire plus si l’état de l’animal l’exige) et des actions post-chirurgie sont mises en place pour permettre une bonne récupération rapide de la chirurgie (distribution de rations additionnelles de fruits et de légumes pour favoriser la prise alimentaire et éviter la perte de poids, regroupement des animaux dès leur réveil complet pour permettre les interactions physiques entre congénères et favoriser le retour au comportement physiologique, dont la consommation alimentaire). Afin de limiter la douleur et la souffrance des animaux, toutes les interventions chirurgicales sur les animaux se feront sous anesthésie générale, renforcée par des compléments analgésiques et antiinflammatoires appropriés, selon les procédures vétérinaires approuvées. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites, qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a un signe d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe social et un programme d'enrichissement adapté est mis en place tout au long de l'étude.
Choix des espèces
L’utilisation des non-rongeurs est une exigence réglementaire. Le choix du primate non humain est justifié par : - les homologies avec l'Homme, - la disponibilité d'études de toxicologie réglementaire dans cette espèce, - les données de pharmacocinétique/pharmacodynamie. Le primate non humain est la seule espèce pertinente pour les essais pré-cliniques de composés biologiques (ex : vaccins thérapeutiques anti-Alzheimer). Le choix de l’espèce de primate non humain (singe cynomolgus) est le plus souvent déterminé par des études in vitro permettant de comparer le métabolisme de ces espèces avec celui de l’Homme, ou de prouver que le candidat médicament a la même affinité pour sa cible chez le primate non humain et l’Homme. La pharmacocinétique du candidat médicament et les connaissances acquises avec des produits de même classe pharmacologique sont prises en compte. Les animaux intégrés dans ces études sont des animaux adultes ou jeunes adultes. L’âge minimal est d’au moins 24 mois. Pour les études de pharmacologie de sécurité, les animaux peuvent être utilisés dans le cadre de plusieurs études, par conséquent l’âge des animaux peut être plus important. Des individus matures ou jeunes adultes sont utilisés pour que l’état physiologique de l’animal permette une réponse non équivoque des systèmes analysés après traitement avec les composés et ainsi garantir une évaluation adéquate des paramètres ciblés.
Essai de toxicité aux premiers stades de la vie sur le poisson zèbre Danio rerio
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Nage en tire-bouchon, convulsion, tétanie, exophtalmie, œdème, hémorragie : ces signes déclenchent la mise à mort du poisson concerné. 8 640 poissons zèbres vont être utilisés, 4 320 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 2 880 un niveau modéré et 1 440 un niveau léger, tous tués à l'issue. Des œufs fraîchement fécondés sont exposés à cinq concentrations d'un produit chimique pendant environ trente jours après l'éclosion, la gamme étant calée pour que la plus faible concentration produise environ 10 % d'effet et la plus forte environ 90 %. Le test répond à l'obligation réglementaire REACH pesant sur des monomères que l'entreprise produit et qu'elle ne pourrait plus vendre en Europe sans lui.
Objectifs
Le test OCDE 210 est destiné à déterminer les effets létaux et sub-léthaux des produits chimiques sur les stades de développement de l'espèce étudiée (ici le poisson zèbre) et consiste à exposer des poissons aux premiers stades de leur vie à une série de 5 concentrations du produit chimique dissout dans l’eau, les effets étant comparés à un lot témoin non exposé. Ce test fait partie d’un ensemble de tests d’écotoxicité imposé par certaines réglementations (REACh notamment), il n’est réalisé qu’à la demande des autorités compétentes.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de réaliser les tests selon la ligne directrice OCDE 210 et de répondre ainsi à une exigence réglementaire qui consiste à caractériser les dangers et risques associés à la production et l’utilisation de nos produits. En absence de réponse à cette exigence, ces substances ne pourront plus être produites et/ou utilisées en Europe (les substances concernées sont des monomères produits par notre société et relevant notamment du règlement REACh qui s’applique aux produits chimiques hors biocides et produits phytosanitaires).
Procédures
Le test consiste à exposer des oeufs fraichement fécondés à une série de 5 concentrations du produit chimique testé dissout dans l’eau, pendant environ 30 jours après l’éclosion. Les points d’observation suivants, spécifiés dans la ligne directrice, seront relevés : - Éclosion et survie : dénombrement quotidien des éclosions et des survivants. Les oeufs moisis, embryons et larves morts seront retirés dès qu’ils sont repérés. - Apparence anormale : dénombrement (à minima 3 fois par semaine) des larves et juvéniles présentant une anomalie corporelle. En cas de malformations et apparence anormale telles que l’organisme est en état de souffrance considérable et irréversible, celui-ci sera retiré de l’essai et euthanasié. - Comportement anormal : hyperventilation, nage mal coordonnée, immobilité ou comportement alimentaire atypiques seront notées à minima 3 fois par semaine. - Poids & longueur totale : après euthanasie des poissons ayant survécu jusqu'à la fin de la période d'essai.- Paramètres physico-chimiques pH, oxygène dissous et température : mesure quotidienne. Les effets léthaux et subléthaux sont évalués et comparés aux valeurs témoin pour déterminer la concentration la plus basse pour laquelle on observe un effet, et la concentration sans effet observé.
Impact sur les animaux
Selon les substances et les concentrations testées, les nuisances attendues tout au long de la période d’essai peuvent être les suivantes : stress, douleur, comportement anormal, ralentissement anormal de la croissance (en termes de taille et de prise de poids). Parmi ces atteintes, seules celles définies comme étant des points limites auront pour conséquence une euthanasie des organismes concernés. Le protocole d'essai est clairement établi et ne peut être dérogé sous peine d'invalidité du test réalisé. La gamme d’essai étant choisie de sorte que la plus faible concentration testée ait environ 10% d’effet et la plus forte concentration environ 90%, nous considérons que les animaux exposés aux 2 plus faibles concentrations subiront un degré de gravité modéré et les animaux exposés aux 3 concentrations les plus élevées un degré sévère. Les organismes témoins subiront un degré de gravité légère.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés ne peut pas être réutilisés et doit être euthanasiés.
Remplacement
Ce test est une exigence réglementaire imposé par les autorités compétentes. Aucun test in vitro n’ayant été validé par les autorités, il ne sera procédé à aucun test in vitro en amont. Le test de toxicité selon la ligne directrice OCDE 210 est le seul test validé par les autorités compétentes, il n’est réalisé que sur leur autorisation, obtenue pour chacune des substances testées. De même, il n'existe pas de modélisation validée pour remplacer l'utilisation d'animaux.
Réduction
Pour chaque test, le nombre d'animaux utilisé est défini par le protocole d'essai et ne peut être diminué. Cependant, la ligne directrice autorise la possibilité de réaliser un pé-test permettant de définir les conditions exactes du test définitif, notamment la gamme de concentrations. Ce prétest est réalisé sur un nombre de concentration et de réplicat plus faibles. Afin de limiter le recours à ce test préliminaire, , nous définissions nos gammes de concentrations à partir de données de toxicité aiguë déjà disponibles sur chacune de nos substances et obtenues sur d’autres organismes (algues et daphnies notamment) mais également sur des poissons adultes de la même espèce. Ce processus permet également de réduire le risque d’invalidation d’un test dans le cas où la gamme de concentrations choisie ne permettrait pas d’atteindre les objectifs (par exemple dans le cas de concentrations trop élevées qui entraineraient une mortalité excessive ne permettant pas d’analyses statistique fiable. Dans cette situation nous serions obligé de recommencer le test et donc d’augmenter le nombre d’animaux utilisés).
Raffinement
Les organismes géniteurs sont commandés auprès de fournisseurs disposant de l’agrément européen. Dès réception, les poissons sont transférés dans un local indépendant où se situe le système d’hébergement. Ils sont d’abord versés dans un aquarium « tampon », puis l’eau de transport est progressivement diluée avec l’eau provenant du système d’hébergement (on remplace 1L tous les 1/4h environ). Les poissons sont maintenus dans un milieu à 50% de dilution pendant au moins 30 minutes puis sont transférés à l’aide d’une épuisette dans le système d’hébergement final (environ 6 individus par bac de 3.5L). Une période d’observation de 2 semaines minimum est respectée afin de valider le lot reçu. Le système d’hébergement est une armoire spécifiquement dédiée à l’hébergement des poissons, composée de racks d’aquariums de 3.5L sous lesquels un visuel de gravier a été ajouté pour améliorer le bien-être des animaux. Le système régule la température à 26°C et le renouvellement du milieu (composé d’eau osmosé et de sels minéraux); des sondes associées à un système d’alarme contrôlent en permanence la température, le pH et la conductivité. Les techniciens contrôlent à minima une fois par semaine les paramètres oxygène dissous, nitrates, nitrites, ammoniaque et dureté. Ils assurent également quotidiennement l’apport en nourriture (aliment en poudre, daphnies et artémias). Une photopériode de 16h de jour/8h de nuit est appliquée automatiquement. Les organismes soumis au test OCDE 210 (organismes témoins et organismes exposés à la substance testée) seront placés dans des aquariums nus (sans visuel de gravier) et maintenus dans les mêmes conditions environnementales que les géniteurs, de sorte que seule la concentration de la substance testée peut avoir un impact. Les comportements et anomalies suivants ont été définis comme des points limites nécessitant une euthanasie des individus concernés (dans le cadre de l’hébergement et des tests de toxicité) : nage « en tire-bouchon », convulsion, tétanie, exophtalmie, œdème et hémorragie. Dans le cadre de raffinement, la nourriture vivante (rotifère et artémies) est privilégiée.
Choix des espèces
Cette espèce est l'une de celles recommandées par la ligne directrice. Elle est employée par le laboratoire depuis plus de 20 ans pour d'autres projets (dont le test de toxicité aiguë sur adultes). La ligne directrice impose d'exposer les organsimes au produit chimique depuis le stade oeuf fécondé jusqu'au stade juvénile (soit environ 30 jours après l'éclosion).
Innocuité d’un vaccin contre l’influenza aviaire chez le canard
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Deux piqûres pour le vaccin et trois prises de sang, toutes réalisées sur animal vigile: 48 canetons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue pour autopsier les sites d'injection. Le porteur cherche à vérifier l'innocuité d'un vaccin expérimental contre l'influenza aviaire à différentes doses d'antigène, et annonce des réactions locales de type granulome inflammatoire dues aux adjuvants huileux. Il décrit un élevage au sol avec piscine, litière végétale et diffusion de musique pour habituer les canetons aux voix humaines. La monographie de la pharmacopée européenne qu'il cite prévoit dix animaux vaccinés pour ce contrôle, le projet en mobilise quarante-huit, et le texte présente ailleurs le produit comme un vaccin contre une bactérie alors que l'influenza aviaire est une maladie virale.
Objectifs
Etudier l'innocuité d'un vaccin experimental contre l'influenza aviaire chez le canard.
Bénéfices attendus
Il s'agit d'une preuve de concept, permettant de démontrer l'innocuité du vaccin experimental avec différentes doses d'antigène. Dans le cas de résultats favorables, cela permettra de confirmer la possibilité de la mise au point de vaccin contre cette bactérie
Procédures
les 2 piqûres pour les injections de vaccin (5 secondes par piqûre) _ les 3 piqûres pour les prises de sang (20 secondes par prise de sang) les interventions sont réalisées sur animal vigile.
Impact sur les animaux
les éventuelles réactions locales de type granulome inflammatoire de quelques millimètres dûes aux adjuvants (réactions classiques aux adjuvants huileux couramment utilisés en médecine vétérinaire).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de permettre une autopsie des sites d'injections et d'observer si des lésions ont été générées par l'administration du vaccin.
Remplacement
Il s'agit ici d'étudier l'innocuité du vaccin chez l'animal cible. Il n'y a pas de méthode alternative in vitro permettant de mimer ce type de réponse.
Réduction
Dans les monographies de la pharmacopée européenne pour les vaccins volaille, les tests de contrôle d'innocuité se font sur 10 animaux vaccinés pour les animaux de moins de 3 semaines.
Raffinement
Les canettons sont logés ensemble ce qui leur permet d'exprimer leur comportement grégaire. Mise à disposition d'une piscine permettant d'exprimer les comportements naturels de nage et nettoyage. Surveillance accrue en cas de détection de souffrance avant l'atteinte de points limites. De la musique est également diffusée (habituation aux voix humaines et aux bruits). Les animaux sont élevés au sol, sur une litière végétale permettant de s'y rouler pour nettoyer leur plumage.
Choix des espèces
Le canard est l'espèce cible du vaccin. Les animaux sont vaccinés à 1 et 21 jours d'âge, soit les âges de vaccination pour le produit cible.