Toxicologie et autres tests de sécurité

Pour tester une molécule anti-inflammatoire à longue action destinée à de futurs médicaments vétérinaires pour chats, 32 chats adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis tous gardés en vie et déclarés réutilisés. Sous anesthésie générale d'environ une heure, une solution de kaolin leur est injectée en huit points sous la peau de la plante d'une patte arrière, ce qui provoque une inflammation et une boiterie d'environ cinq jours, que le porteur qualifie de "modèle totalement réversible". S'y ajoutent jusqu'à trois injections du produit espacées de trois semaines, des prises de sang à la jugulaire, un hébergement individuel pendant la boiterie et des passages en laisse et harnais sur une plateforme de force. Le porteur affirme qu'il est "indispensable de recourir à l'animal" et précise que le traitement d'une douleur détectée se décide "en accord avec le Donneur d'Ordre".

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité d'un produit testé en le comparant avec un contrôle positif (la référence) et un contrôle négatif (le véhicule du produit test à administrer ou du sérum physiologique). Les propriétés recherchées du produit testé sont des propriétés anti-inflammatoire et analgésique évaluées via un modèle boiterie chez le chat.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir démontrer l'efficacité du produit testé en le comparant aux contrôles positif et négatif. De démontrer les propriétés anti inflammatoires et analgésiques du produit test . Ce projet est nécessaire pour trouver de nouveaux principes actifs pour de futurs médicaments vétérinaires destinés à la médecine féline.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations sous-cutanées quelques soit le groupe, pour le produit test, le contrôle négatif et le contrôle positif. Durée, par administration, inférieure à la minute. Au total un maximum de 3 administrations par produit espacées de 3 semaines de récupération entre les administrations pourront être réalisées. La réalisation de la boiterie sera induite par administration d'une solution de kaolin en 8 points d'injections par voie sous-cutanée en face plantaire d'un membre postérieur sous anesthésie générale. La durée d'administration est inférieure à 5 minutes. La durée de l'anesthésie générale est d'environ 1h. Durée de la boiterie induite : environ 5 jours, il s'agit d'un modèle totalement réversible. Les prélèvements sanguins seront réalisés avant chaque administration du produit test, contrôle négatif ou positif puis toutes les 3 semaines jusqu'à la fin de l'étude. Tout prélèvement de sang sera fait selon les bonnes pratiques vétérinaires et conformément à la réglementation en vigueur. La durée d'un prélèvement sanguin est inférieur à la minute. Enfin les animaux seront tenus en laisse et harnais et passeront à la marche sur un système de balance (force plate). Les animaux auront eu un entrainement au préalable de l'étude. Cela a pour but d'évaluer la force du membre présentant la boiterie pour pouvoir évaluer l'efficacité du médicament testé. Durée d'un passage : inférieur à 1 minute. Plusieurs passages ( maximum 5) sont réalisés par temps afin d'obtenir une moyenne fiable d'interprétation.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont ceux liés à l'induction d'une boiterie et d'une inflammation du membre postérieur administré avec la solution de kaolin, à la contention lors des prélèvements sanguins, le risque d'hématome lors des prélèvements au niveau des veines jugulaires et au risque anesthésique de toute intervention sous anesthésie générale. Des réactions inflammatoires (gonflement, rougeurs par exemple) peuvent également être observées au niveau des sites d'injections des éléments tests.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux, il est indispensable de recourir à l’animal. Aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'efficacité d'un produit test sur le modèle boiterie chez le chat. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés.

Réduction

32 animaux seront inclus dans ce projet. Ils seront répartis en 4 groupes de 8 animaux. 2 groupes auront les éléments contrôle positif et contrôle négatif puis deux groupes auront l' élément test à deux doses différentes. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats représentatifs et interprétables et en tenant compte de la variabilité inter individuelle. Une justification du nombre d'animaux est demandée pour éviter tout double emploi. Des phases préliminaires, comme des études pilotes, ont été réalisées dans le but de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour cette étude. Pas de test statistique réalisé en amont.

Raffinement

Pendant la période d'acclimatation, les animaux continueront une phase d'entraînement à la marche en ligne dans le corridor de Force Plate. Cette phase sert à familiariser les animaux avec le dispositif experimental. Les animaux seront hébergés par groupe de 2 à 4. Puis ils seront hébergés en condition individuelle tout au long de la présence de la boiterie. Cet hébergement en individuel est nécessaire pour mettre l'animal dans de bonnes conditions pour la phase de réveil et pour faciliter l'observation des animaux ainsi que de garantir leur tranquilité tout au long de la phase active du modèle boiterie. En effet, pour les chats, le calme et le repos est plus apprécié lors d'évènements pouvant occasionner une gêne ou une diminution de la capacité motrice que les nombreuses intéractions sociales avec des congénères. Ils garderont un contact visuel, auditif et olfactif pendant la période d'hébergement individuel. De l'enrichissement (exemple: plateformes à différentes hauteurs, tunnels, balle, corde et griffoirs) sera présent autant que possible dans les boxes. Les tablettes dans les hébergements seront remontées aussi longtemps que la présence de boiterie pour l'animal au niveau du membre induit. En cas de détection d'une souffrance ou de douleur , le vétérinaire sera immédiatement prévenu et procèdera à un examen clinique de l'animal concerné afin d'établir un diagnostic et mettre en place un traitement adapté en accord avec le Donneur d'Ordre. Des anesthésiques ou analgésiques pourront être utilisés si necessaire. Toute intervention sur l'animal sera effectuée par une personne habilitée et expérimentée afin de réduire au minimum le stress.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce cible pour ce projet. Chats adultes entre 1 à 9 ans. Ce stade de développement permettra de viser la majorité du stade cible de ce médicament.

Deux heures et demie d'anesthésie générale pour une injection unique dans le cerveau : 150 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue après un prélèvement de liquide céphalo-rachidien et de sang. Vingt d'entre eux sont utilisés dans une étude pilote destinée à valider la technique d'injection et à former les chirurgiens, les 130 autres dans une étude réglementaire de toxicologie d'un produit de thérapie tissulaire visant la maladie de Parkinson. Des symptômes neurologiques, tremblements ou convulsions, peuvent suivre l'administration. Des tests neurocomportementaux sont réalisés quatre puis vingt-quatre heures après, sans que leur nature soit précisée, et la souche retenue est le rat Nude RNU, dont l'immunodéficience est jugée "nécessaire" pour éviter le rejet d'un produit d'origine humaine.

Objectifs

MODIFICATION Le premier objectif de ce projet est la validation du modèle d’administration intracérébrale chez le rat immunodéprimés (étude pilote), incluant la formation des chirurgiens. Une fois le modèle validé, le second objectif de ce projet est la réalisation d’une étude réglementaire de toxicologie générale (étude principale) chez le rat immunodéprimés. Cette étude consiste en l’administration unique du produit à tester (futur médicament) suivie d’observations régulières des animaux, pesées corporelle, évaluation des effets sur les paramètres sanguins et analyse macroscopique ou histopathologique, évaluation de la toxicocinétique et pharmacodynamique du produit. Cette étude permettra d’accéder aux essais cliniques afin de confirmer la sécurité et l’efficacité du produit chez l’Homme avant sa mise sur le marché ou d’obtenir l’autorisation de mise sur le marché Suite au décalage du début de l’étude, une modification du projet initialement autorisé est nécessaire afin d’étendre la durée du projet de 1 à 2 ans.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : - la détermination de la tolérance d'un produit de thérapie tissulaire chez l'animal - l'obtention de l'autorisation d'essai clinique et la réalisation d'essai clinique chez l'homme avec le maximum de sécurité pour les personnes incluses - à long terme la mise sur le marché d'une thérapie innovante permettant de traiter les patients atteints de Parkinson

Procédures

Chaque animal aura une procédure d’injection intracérébrale unique, réalisée sous anesthésie générale volatile avec surveillance anesthésique et une antalgie suffisante (durée environ 2h30). Des tests neurocomportementaux sont réalisés (durant le prétest et +4h et 24h postadministration ; durée approximative : 5 à 7 min). Un prélèvement de liquide céphalo-rachidien (LCR) et de sang seront réalisés en fin de procédure (avant mise à mort), sur animaux anesthésiés (sans réveil) (durée quelques minutes).

Impact sur les animaux

Les procédures d’administration intracérébrale sont réalisés sous anesthésie, après mise à jeun la veille. Lors du réveil anesthésique, une désorientation/perte d’équilibre, perte de certains reflexes neurologiques ainsi qu’une hypothermie, une douleur post-injection et baisse d’activité (en raison de la durée de la chirurgie) peuvent être observées temporairement. Des évènements anesthésiques liés à l’anesthésie volatile peuvent survenir. Des signes locaux (oedème, ...) au niveau des sites d’administrations peuvent être observés. Des symptômes neurologiques (tremblement, convulsion,…) peuvent être observés à la suite de la procédure d’administration intracérébrale. Les nuisances pour les animaux peuvent être les suivantes (tous les animaux n’ont pas toutes les nuisances) : - Stress, inconfort ou douleur brève, n’excédant pas quelques minutes, lors de prélèvement de sang. - Anesthésie de quelques minutes et réveil d’anesthésie (incoordination) lors des prélèvements de sang réalisés sous anesthésie - Stress lors de changement d’environnement lors d’évaluation neurocomportementale : durée du test en lui-même généralement quelques minutes. - Effets toxicologiques ou pharmacologiques légers à modérés dus à l’administration du candidat médicament à tester (perte de poids, léthargie, excitation, baisse en consommation de nourriture, tremblements, irritation ou inflammation locale au site d’administration…). Des points limites précoces adaptés sont mis en place afin d’éviter une prolongation inutile des effets observés. En cas d’atteinte de ces points limites, des mesures sont rapidement prises pour limiter la souffrance (mise en place d’un traitement analgésique, diminution de la dose testée, suspension de la procédure ou euthanasie).

Devenir

Les animaux de l'étude pilote seront mis à mort en fin d’expérimentation afin de valider la procédure d’administration. Les animaux de l'étude principale seront euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examens et de prélèvements d’organes ou tissus (examens macroscopiques et microscopiques) tels que requis par la réglementation pour la détermination des organes cibles.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas d’alternative non animale permettant d’évaluer la sécurité et la toxicité, notamment systémique et neurocomportementale des futurs candidats médicaments dans le cadre du développement de thérapies innovantes, telles que la thérapie tissulaire. Il n’existe pas non plus d’alternative non animale pour valider que la technique d’administration intracérébrale aboutit à une exposition de l’animal au candidat médicament et que celle-ci est bien tolérée (analyse histopathologique). Dans ces études, un relevé des signes cliniques et des paramètres sanguins des animaux est requis, ainsi qu’une évaluation macroscopique et microscopique des organes il est donc nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, pour évaluer l’ensemble des paramètres demandés par les guidelines.

Réduction

Le nombre d’animaux dans ce projet a été défini sur la base du nombre minimum d’animaux requis pour pouvoir conclure à la validation de la technique. Afin de réduire ce nombre au minimum, les techniciens ont été préalablement formés en ex-vivo. Le nombre d’animaux dans ce projet est basé sur les guidelines et est le minimum pour pouvoir interpréter et conclure sur l’évaluation histopathologique et l’analyse de biodistribution. Au total, 150 animaux seront utilisés dans ce projet : 20 animaux pour l’étude pilote, 130 animaux pour l’étude principale. L’étude pilote, sur un nombre limité d’animaux, va permettre de mettre au point et valider la technique d’administration intracérébrale et avant le démarrage de l’étude principale, qui a pour but de déterminer la toxicité d’un candidat médicament sur un nombre plus important d’animaux

Raffinement

Les animaux auront une période d’acclimatation aux conditions environnementales avant le début des procédures. Les rats seront hébergés en groupes sociaux sauf incompatibilité comportementale, dans des portoirs ventilés avec filtration de l'air, dans des cages sur fond plastique et sur de la litière de cellulose avec un enrichissement adapté (papier kraft, tunnel, …). La procédure d’administration intracérébrale sera réalisée sous anesthésie générale volatile avec surveillance anesthésique. Une analgésie préventive sera mise en place avant et après administration du produit de l’élément d’essai afin d’anticiper toute douleur ou détresse chez les animaux. Des mesures de prévention de l’hypothermie seront appliquées pendant l’anesthésie et au réveil. En raison du potentiel impact de l’administration intracérébrale, une évaluation neurocomportementale sera réalisée durant le pretest et après adminisration. De plus, les animaux ont accès a une eau de boisson filtrées et le matériel qui rentre dans l'animalerie est désinfecté. Les animaux sont observés au moins 1 fois par jour (incluant le week end) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile et sont évalués par le vétérinaire en cas d'anomalies. Des anti-inflammatoires / antibioiques seront prescrits en cas de signes d'infection locale et/ ou d'hyperthermie sans atteinte neurologique. L'euthanasie sera réalisée si les signes cliniques suivants sont observés : • convulsions ne rétrocédant pas spontanément ou à l'administration d'anti-convulsivants ou convulsions répétées dans la même journée • incapacité prolongée de l'animal à se déplacer ou pertes d'équilibres durables impactant la qualité de vie de l'animal • atteinte importante du niveau de conscience et vigilance de l’animal • stéréotypie • hyperthermie supérieure à 40°C ne répondant pas au traitement• signes de détresse et/ou douleur

Choix des espèces

Le rat répond aux exigences réglementaires pour la réalisation d'études précliniques. Dans le cadre de ce projet des rats immunodéprimés (rat Nude RNU) seront utilisés afin de permettre l’évaluation toxicologique d’un produit de thérapie tissulaire. Une immunodéficience partielle des animaux est nécessaire afin de réduire le risque de rejet en raison de l’origine humaine du produit de thérapie tissulaire. L’ensemble du projet se fera sur jeunes adultes/adultes afin de mimer les futures conditions d’utilisation clinique.

Évaluer la toxicité de candidats médicaments avant les premiers essais chez l'humain conduit à utiliser 2 550 macaques, 2 508 crabiers et 42 rhésus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 2 473 d'entre eux sont tués à la fin pour l'analyse histopathologique de leurs organes, exigée par la réglementation, et 77 sont gardés en vie pour être réutilisés. Ils reçoivent le composé chaque jour ou chaque semaine, restent attachés en chaise de contention jusqu'à quatre heures, sont mis à jeun seize heures avant sédation, et pour certains opérés sous anesthésie générale afin de recevoir un émetteur de télémétrie. L'hébergement seul dure de un jour à trois mois quand le protocole l'impose. Le porteur affirme que l'évaluation chez une espèce non-rongeur est "indispensable" pour chaque nouveau candidat médicament, et que le macaque est parfois "l'unique espèce pertinente".

Objectifs

Le projet réalisé dans un cadre réglementaire a comme objectif de permettre l'évaluation du potentiel toxique d'un candidat médicament dans le cadre de son développement préclinique (tests réalisés chez l’animal). Conformément aux lignes directrices, l’évaluation chez une espèce non-rongeur est indispensable pour chaque nouveau candidat médicament avant de démarrer les essais cliniques chez l’homme et avant toute autorisation de mise sur le marché. L'espèce primate non humain est parfois l’unique espèce pertinente pour le développement préclinique de composés biologiques (protéines thérapeutiques, anticorps monoclonaux, vaccins anti-cancer). Ces études permettent d’évaluer le schéma thérapeutique envisagé et de réduire le risque potentiel encouru par le volontaire sain à la suite de l’administration du candidat médicament au cours des premiers essais cliniques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont le développement et la mise sur le marché de nouveaux médicaments pour des pathologies invalidantes, des maladies graves, en caractérisant les effets et les doses toxiques des médicaments en développement, selon la règlementation, pour assurer la sécurité des nouveaux médicaments.

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (ex : orale, injection intramusculaire) de façon journalière ou hebdomadaire avec le composé d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 4h maximum dans le cas de perfusion intraveineuse. Les prélèvements réalisés chez l’animal vigile (ex : sang, par les voies veineuses périphériques) nécessitent une contention de courte durée (jusque 4h maximum pour des perfusions intraveineuses). Les prélèvements nécessitant une sédation et/ou une anesthésie (ex. biopsie) ont une durée estimée à une heure maximum, Pour certaines études (rares), un hébergement individuel peut être requis pour collecter des données individuelles ou éviter les contaminations d'un animal à l'autre. Par exemple, des examens urinaires ou de selles peuvent nécessiter un hébergement individuel en cage à métabolisme (4 heures en général, 18 heures maximum). Si la procédure expérimentale ne permet pas de regrouper les animaux (ex : traitement dans l'alimentation ou l'eau de boisson avec nécessité de déterminer précisément la dose administrée à chaque animal et/ou cinétiques de collecte de fécès ou d’urine), ou en cas d’agressivité et d’incompatibilité sociale entre les animaux (ex : animaux sexuellement matures), les animaux doivent être hébergés individuellement (volières habituelles) pendant toute la durée de l’étude (de un jour à 3 mois). Pour les évaluations cardiovasculaires par télémétrie, soit les animaux portent un gilet (après habituation), soit sont implantés chirurgicalement sous anesthésie générale (durée de 2h maximum, avec analgésie et suivi péri-opératoire adaptés, sur au moins 10 jours).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables ou nuisances attendus correspondent essentiellement : - aux effets du produit administré (exemple : variation de la fréquence respiratoire) - aux effets systémiques (exemple : perte de poids, baisse de consommation alimentaire) - à l’inconfort généré par les procédures : de contention (exemple : contention en chaise sur une durée maximale de 4 heures, port du gilet de télémétre), d’administration (exemple : cas des administrations répétées), et/ou de prélèvement sur animal vigile (exemple : prélèvement de sang, de sperme) - à la sédation/anesthésie générale requises pour certaines procédures (prélèvements de biopsie, implantations chirurgicales d’émetteurs de télémétrie) et nécessitant une mise à jeun (environ 16 heures) - à la chirurgie (par exemple pour implanter un emetteur de télémétrie pour l’enregistrement des paramètres cardiovasculaires) et aux effets indésirables post-opératoires éventuels. - hébergement individuel (contacts olfactifs, visuels, sonores préservés), le cas échéant

Devenir

Les études de toxicologie règlementaires incluent une évaluation obligatoire des effets sur les organes et tissus (analyse histopathologique), et nécessitent par conséquent une mise à mort des animaux en fin d’étude. Pour les études où une analyse des tissus et organes en fin d’étude n'est pas nécessaire, et si les animaux ont subi uniquement des effets légers ou modérés et réversibles, les animaux peuvent être gardés en vie, et être réutilisés dans un autre projet après une période de récupération et autorisation du vétérinaire. Il est estimé qu’environ 77 animaux seront gardés en vie.

Remplacement

L'évaluation de la toxicité d'un candidat médicament et/ou d’un dispositif médical ne peut pas être réalisée in vitro. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour ce type de procédure de traitement identique à celle utilisée chez l'homme, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Dans certains cas, l'espèce primate non humain est la seule espèce pertinente pour les essais pré-cliniques (similarités physiologiques ou métaboliques Homme-primate non humain), par exemple dans le cas de composés biologiques (protéines thérapeutiques, anticorps monoclonaux, vaccins thérapeutiques anti-cancer...).

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est celui recommandé dans les lignes directrices ICH (International Council for Harmonisation) ou OCDE (Organisation de coopération et de développement économiques), et correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude. Le besoin de groupe contrôle, le nombre de doses nécessaires, ainsi que les techniques de prélèvements sanguins sont évalués systématiquement pour assurer une réduction du nombre d’animaux. En incluant dans une même étude (i.e. sur les mêmes animaux), l’évaluation toxicologique et l’évaluation des paramètres de pharmacologie de sécurité, le nombre d’animaux utilisés est très nettement réduit.

Raffinement

Les procédures, les conditions d’hébergement et matériel utilisés ainsi que les enrichissements fournis sont adaptés aux animaux utilisés dans ce projet. Des enrichissements variés (ex : graines dans des copeaux, tablettes à différentes hauteur) sont fournis aux animaux leur permettant d’exprimer les comportements physiologiques et activités qu’ils auraient dans leur habitat naturel (ex : recherche d’aliment, épouillage, temps d’isolement). Les actes pouvant engendrer du stress, de l’inconfort ou des douleurs importantes seront réduits au minimum nécessaire et seront réalisés sous sédation ou anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté dans le cas échéant. Dans le cas où l’anesthésie est jugée plus traumatisante pour l’animal et/ou si l’anesthésie est incompatible avec les prélèvements prévus, les prélèvements seront réalisés sur l’animal vigile, notamment les prélèvements sanguins et le recueil d’urine, par exemple. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a un signe d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux. Les mesures sont prises dès que possible pour réduire la souffrance des animaux. D’autres traitements peuvent être mis en place suivant les recommandations des vétérinaires, selon les observations, conditions d’expérimentation. L’évaluation des paramètres de pharmacologie de sécurité est effectuée par télémétrie, permettant l’obtention de données fiables, sur des périodes de temps prolongées, et avec des contraintes sur l’animal minimisées.

Choix des espèces

Le choix du primate non humain est justifié notamment par : - les homologies avec l'homme - la disponibilité d'études préliminaires dans cette espèce, - les données de pharmacocinétique, pharmacodynamie Certains composés biologiques ciblant le système immunitaire [anticorps monoclonaux, protéines et vaccins thérapeutiques (tels que les composés pour des traitements anti-cancer, anti-Alzheimer)] ne peuvent être testés que chez le primate non-humain (espèce non-rongeur avec le système immunitaire le plus proche de l'Homme). Le choix de l’espèce de primate non humain est le plus souvent déterminé par des études in vitro permettant de comparer le métabolisme de ces espèces avec celui de l’homme, ou de prouver que le candidat médicament a la même affinité pour sa cible chez le primate non humain et l’homme. La pharmacocinétique du candidat médicament est également prise en compte, ainsi que les connaissances acquises avec des produits de même classe pharmacologique. Les macaques (crabiers ou rhésus) sont les seules espèces de primates non humain utilisées dans les études de toxicologie réglementaire. Les animaux seront âgés de 2 à 4 ans en standard. Pour certains composés, des animaux mâtures (d'un point de vue maturité sexuelle ou maturité du système immunitaire) doivent être utilisés (ex : nouveau produit contraceptif, anticancéreux, immunomodulateurs). Dans ce cas les femelles ont en général au-moins 4 ans, et les mâles au minimum 4 à 5 ans. Pour certaines indications, il sera indispensable de tester le candidat chez un animal un peu plus jeune (20 mois minimum).

10 macaques à longue queue, des primates âgés de 2 à 5 ans, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour analyser la distribution des vecteurs viraux dans leur organisme. Au cours d'une même chirurgie d'environ quatre heures, chacun reçoit une injection dans l'œil, une dans l'oreille interne et une dans une veine, puis subit éveillé, dans un système de contention, jusqu'à une prise de sang par jour pendant sept jours. Il s'agit de choisir, avant des études de toxicologie réglementaire, les vecteurs AAV qui portent le mieux une protéine sensible à la lumière jusqu'à la rétine, l'oreille interne, le cerveau ou l'estomac, en vue de thérapies optogénétiques. Le porteur cite parmi les risques rares de l'injection dans l'œil une hémorragie du vitré, des déchirures et un décollement de la rétine, et pour l'injection dans la cochlée des troubles de l'audition et de l'équilibre. Il écrit que réunir les trois voies sur les mêmes macaques divise leur nombre par 3 à 4 "sans introduire de charge supplémentaire pour l'animal individuel".

Objectifs

Le projet est une étude préliminaire visant sélectionner des vecteurs viraux AAV permettant d’apporter à un type de cellule une molécule thérapeutique sensible à la lumière. Cette sélection sera faite d’après l’affinité de ces vecteurs pour les organes cibles (oreille interne, rétine, estomac, cerveau), ainsi que leur distribution dans l’organisme. L’étude sera effectuée comme une étude de toxicologie pour évaluer tout effet potentiellement toxique. La sélection sera faite après leur administration intraoculaire, dans l'oreille interne et intraveineuse au cours d’une même anesthésie chez le macaque fascicularis. Les vecteurs viraux AAV sont dérivés d'un virus non pathogène et sont couramment utilisés dans la recherche biomédicale afin de développer des thérapies chez l’humain. Ils permettent une transduction efficace de nombreux types de cellules de mammifères et une expression génétique stable après un seul traitement d’un ou plusieurs gènes, ce qui permet de compenser un déficit génétique. Les protéines sensibles à la lumière sont utilisées pour développer la thérapie optogénétique, une méthode prometteuse pour compenser la perte des cellules de la rétine ou de restaurer l’audition via des implants intra-auriculaire chez des patients atteints de surdité. Les résultats obtenus permettront de sélectionner les vecteurs viraux les plus prometteurs dans le développement de thérapies optogénétiques chez l’humain.

Bénéfices attendus

Il permet de sélectionner les vecteurs viraux capbles de transduire efficacement dans les différents cellules et tissus cibles pour la réalisation d’études de toxicologie règlementaire prérequis aux essais cliniques de phase I, II et III chez l’humain

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale d'environ 4h et pendant laquelle une injection dans l'oeil, une injection dans l'oreille interne et une injection intraveineuse du produit testé seront effectués successivements. Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang effectués vigiles, dans un système de contention adapté, à raison d'un par jour au maximum sur 7 jours. Le prélèvement de sang dure quelques minutes. Un prétraitement sous forme d'une perfusion pourra être effectué selon des résutlats préliminaires, d'une durée maximal de 2h.

Impact sur les animaux

Quatre catégories de nuisances peuvent être provoquées chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises en compte de manière préventives pour réduire leur impact. 1)Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des primates. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaire mais cela peut néanmoins engendrer un stress chez ces espèces non domestiques 2) Liées à la chirurgie : un risque de nuisance modérée pour les animaux (inflammations, douleurs opératoires et post opératoire, etc) est possible 3) Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de sang, peut provoquer des lésions locales (hématomes) et un stress modéré des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire. De plus, même si ces effets délétères sont rares lorsque le geste est réalisé par un opérateur expérimenté, il existe un risque d’infection lors d’administration dans la cochlée ou l’œil. Enfin, dans de rares cas, l’injection intravitréenne peut entrainer une augmentation de la pression intraoculaire, hémorragie du vitré, déchirures et décollement de la rétine, inflammation intraoculaire et endophtalmie et l’administration intra cochléaire peut provoquer des troubles auditifs et de l’équilibre se traduisant par exemple par des maux de tête ou des nausées. 4) Liées à une toxicité du mélange de vecteurs testés : ce type de nuisances est difficilement estimable, mais semblent faibles selon les données scientifiques des études chez d’autres espèces. Si des effets toxiques apparaissent, ils seront liés à la biodistribution des vecteurs dont l’évaluation est le but de cette étude.

Devenir

Les animaux utilisés seront euthansiés pour procéder à une analyse de la distribution des vecteurs dans l'organisme.

Remplacement

Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d'obtenir toutes les informations collectées grâce à ce type étude, qui visent à sélectionner des variants de vecteurs viraux les plus efficaces pour poursuivre le développement de thérapies optogénétiques. Il faudra pour cela pouvoir modéliser un organisme entier, ce qui n'est pas réalisable pour le moment avec les méthodes alternatives existantes.

Réduction

L’utilisation d’un male et d’une femelle par lot est considéré comme le minimum acceptable permettant une interprétation pertinente des données. L’administration successive des variants AAV chez les mêmes animaux a pour but de réduire le nombre d’animaux d’un facteur 3 à 4 (par rapport à un criblage séparé pour chaque voie d’administration), sans introduire de charge supplémentaire pour l’animal individuel. Les 3 voies d'administrations n'interfèrent pas ensemble car chaque vecteur est identifié par un code spécifique. Les principaux organes cibles sont les cellules cilliées auditives, la rétine, le cerveau et l'estomac, d’où les 3 vois d'administration.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 15-21 jours est respectée à réception des animaux, suivie de 1- 2 semaines de training. Les animaux bénéficient d’un programme de training par renforcement positif pour réduire le stress/favoriser la coopération (habituation aux systèmes de contention -boîtes taxi, chaises, gilets- et manipulations progressives reproduisant les gestes techniques de l’étude). Un programme d’enrichissements validé par la structure en charge du bien-être animal est appliqué quotidiennement pour garantir des conditions de vie optimales/minimiser les impacts des expérimentations. Les animaux sont hébergés collectivement, sauf exceptions (bagarre, blessure), avec des enrichissements adaptés à leurs besoins. L’isolement est validé par un vétérinaire et fait l’objet d’un suivi SBEA. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux compatibles pour réduire le stress/le risque de blessures liés à un réallotement. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter tout signe clinique anormal et prendre rapidement les mesures nécessaires (réhydratation, isolement pour soin). Toute anomalie est rapportée au vétérinaire, qui prescrit un traitement si nécessaire. Un suivi clinique et pondéral est en place, un fois par semaine pendant la phase de suivi après l’administration. Un vétérinaire est présent aux heures ouvrées, et une astreinte vétérinaire est disponible 24h/24 et 7j/7. À leur inclusion dans le projet, tous les animaux font l’objet d’un examen clinique par un vétérinaire pour s’assurer de leur bon état de santé et exclure ceux jugés inaptes. Une traçabilité des animaux/des actes est assurée pour permettre leur suivi et analyse lors des bilans rétrospectifs. Des systèmes de contention adaptés sont développés pour limiter les manipulations directes et la contention manuelle des primates vigiles (boîte taxi, chaise à contention). Les volumes prélevés/administrés respectent les guidelines vétérinaires. Concernant les administrations : ce sont des voies standard en médecine humaine. Elles seront effectuées sous anesthésie et analgésie par des chirurgiens expérimentés ayant pratiqués ces chirurgies chez l’humain et différents modèles animaux. La réalisation de l’ensemble des administration en une seule anesthésie limite l’accumulation des anesthésies et permet d’évaluer à modérée le degré de sévérité.

Choix des espèces

Le macaque fascicularis est une espèce reconnue pour son aptitude à prédire les effets pharmacologiques, indésirables et/ou toxiques de produits à visée thérapeutiques humains pour des produits thérapeutiques dont la cible est la plus proche de l’humain, ce qui est le cas pour les structures oculaires et auditives. De plus, les variants AAV sélectionnés sur des modèles murins pour ce type de thérapies se révèlent souvent peu efficace chez le primate humain et non humain, ce qui explique la nécessité de passer par un primate non humain pour les sélectionner plus finement. Il convient d’utiliser de jeunes animaux sains ; les macaques sont utilisés à partir de 2 ans, et jusqu'à 5 ans.

150 chats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modérée, chacun pouvant subir jusqu'à seize prélèvements sanguins en sept jours, dont douze sur une seule journée. Les administrations et les prises de sang se font sur animal vigile, tenu à la main, et l'urine est recueillie soit après 24 heures d'isolement en cage, soit par ponction directe de la vessie, le chat couché sur le dos. L'objet est commercial, produire pour un donneur d'ordre les données pharmacocinétiques de futurs médicaments vétérinaires. Aucun chat n'est tué à l'issue du projet, tous restent disponibles pour être réutilisés dans d'autres protocoles.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de pouvoir tester différents principes actifs et véhicules chez le chat et d'obtenir des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. La pharmacocinétique et la pharmacodynamie sont des disciplines qui étudient le devenir de la molécule dans l’organisme. Le devenir du médicament selon les doses utilisées, sa voie d'administration et sa concentration sont étudiés chez l'animal: son absorption, sa distribution dans l'organisme, son métabolisme, son élimination. Les chats sont régulièrement utilisés pour la recherche biomédicale dans les domaines de santé animale (espèce pour laquelle le médicament est prévu). L'objectif est de pouvoir générer de nouveaux médicaments pour la médecine vétérinaire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir déterminer les paramètres pharmacocinétiques des l'éléments tests et de montrer que cela n'a pas eu d'impact au niveau clinique, en suivant certains paramètres hématologiques, biochimiques, sur la pharmacodynamie. Ce projet est nécessaire pour trouver de nouveaux principes actifs pour de futurs médicaments vétérinaires destinés à la médecine féline.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations uniques ou répétées de molécules tests selon les études (1 administration à 5 administrations espacées d'au moins 1 semaine). Pour cela les animaux seront vigiles et auront une contention manuelle. Cette contention est facilitée par les entrainements réguliers des animaux à tenir ces positions (par exemple: assis sur la table, ouverture de la cavité buccale, tête légèrement orientée vers le haut, allongés sur le dos pour des prélèvements de cystocentèse). La durée d'une administration est inférieure à la minute. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur les animaux vigiles. Pour une période de 7 jours, le nombre de prélèvements sanguins sera limité à 16 maximum (volume environ égale à 1 mL par temps) et engendrera une période de récupération de 7 jours minimum, la durée du prélèvement est inférieure à la minute. Sur cette période de 7 jours, un total de 12 prélèvements sanguins maximum peuvent être réalisés sur 24h. Certains animaux peuvent être soumis à un recueil d'urine. Dans ce cas, cela se fera soit par miction spontanée ne nécessitant pas de manipulation de l'animal. Les animaux sont pour cela mis en hébergement individuel comprenant des bacs à litière spécifique pour le recueil d'urine. La durée de la mise en individuel peut être de 24h, soit le prélèvement urinaire peut se faire par cystocentèse sur un animal vigile avec une contention manuelle. La durée du prélèvement est de l'ordre de la minute pour la cystocentèse, l'animal est alors allongé sur le dos. Un maximum de deux cystocentèses sur 24h est accepté, espacées d'au moins 6h.

Impact sur les animaux

Toutes administrations des différents éléments tests vont engendrer une contention de l'animal. Malgré un entraînement régulier, toute contention peut engendrer un stress ou un inconfort. Les prélèvements de sang ou prélèvements d'urine peuvent également entraîner un stress, un inconfort mais également de la douleur.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à la fin du projet et de chaque protocole en accord avec le vétérinaire responsable. Les animaux pourront être réutilisés dans le cadre d'autres projets.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés. La possibilité de mettre en place ces techniques de remplacement seront évaluées avant la mise en place de chaque projet.

Réduction

150 animaux pourront être inclus dans ce projet qui a une durée de 2 ans. Cela représente en moyenne 75 animaux par an soit en moyenne 7 études par an comprenant une moyenne de 10 à 12 individus par protocole. Afin d'obtenir des résultats fiables, interprétables et reproductibles, pour chaque molécule testée, un minimum de 3 chats sera nécessaire. Ce nombre peut être augmenté pour obtenir une meilleure fiabilité des résultats, palier à une grande variabilité inter-individuelle ou être homogène dans le sex-ratio des animaux. Dans le cas d'un principe actif qui n'a jamais été administré chez le chat, les administrations se feront de manière échelonnée ou différées, un animal à la fois en respectant un délai d'observation d'au moins 24h.

Raffinement

Les chats seront hébergés par groupe de 2 à 4 animaux par groupe, par sexe et par affinité dans le respect du plan d'hébergement et de la règlementation en vigueur. De l'enrichissement du milieu (exemple: griffoir, coussin, plateformes à différentes hauteurs, balles ou cordelettes) est présent dans chaque box. Un suivi quotidien est mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, observation des sites de prélèvement, observation du comportement de l'animal...). En cas de détection d'une souffrance ou de douleur sur l'un des animaux du protocole, le vétérinaire sera immédiatement prévenu et procèdera à un examen clinique de l'animal concerné afin d'établir un diagnostic et mettre en place un traitement adapté en accord avec le Donneur d'Ordre et le protocole. En cas d'urgence vitale, nécessitant une prise en charge immédiate, l'animal sera exclu du protocole sur l'avis seul du vétérinaire et pris en charge dans les plus brefs délais. Toute intervention sur l'animal sera effectuée par une personne habilitée et expérimentée afin de réduire au minimum le stress. Une visite hebdomadaire par le vétérinaire désigné ou son suppléant est réalisée pour évaluer la stabilité et l'équilibre social de tous les groupes de chats.

Choix des espèces

Espèce cible pour les médicaments vétérinaires. Jeunes adultes stérilisés ayant atteint leur taille adulte et un système immunitaire et métabolique mature.

37 440 cobayes vont être utilisés sur trois ans dans des procédures d'un niveau de souffrance modérée, 264 réutilisés d'une étude à l'autre et tous les autres tués. Chaque animal reçoit des injections d'adjuvant, porte un pansement occlusif pendant 48 heures puis un patch pendant 24 heures, avant que ses deux flancs soient examinés à la recherche d'érythèmes et d'œdèmes. Il s'agit de vérifier, avant leur mise sur le marché, si des matériaux de dispositifs médicaux déclenchent une allergie cutanée, à raison de 1 248 études pour un même protocole normalisé. Le porteur justifie la mise à mort par le fait que les animaux "ne sont donc plus utilisables", l'adjuvant employé étant "conçu pour engendrer des escarres".

Objectifs

Le projet s’inscrit dans les démarches réglementaires recommandées avant utilisation de ces produits chez l’Homme. En effet, tout fabricant doit s’assurer que l’utilisation de son produit ne compromette ni l’état clinique et la sécurité des patients, ni la sécurité et la santé des utilisateurs. L’évaluation des risques menée prend en compte le fait que les risques éventuels liés à l’utilisation du produit constituent des risques acceptables au regard du bienfait apporté au patient et sont compatibles avec un niveau élevé de protection de la santé et de la sécurité des patients comme des utilisateurs. Dans ce projet, le paramètre évalué est le potentiel sensibilisant cutané (manifestations allergiques cutanées) par contact chez le cobaye. Comme indiqué dans la norme, certains matériaux entrant dans la composition des dispositifs médicaux ont été testés (en particulier pour les matériaux dentaires). D'autres matériaux et leurs composants chimiques n'ont pas été testés et peuvent induire des effets indésirables lorsqu'ils entrent en contact direct et indirecte avec des tissus humains. Le fabricant est donc tenu d'évaluer les effets indésirables potentiels de chaque dispositif avant sa mise sur le marché.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de s’assurer avant sa mise sur le marché que l’utilisation du produit de santé ne compromet ni l’état clinique et la sécurité des patients, ni la sécurité et la santé des utilisateurs (manifestations allergiques cutanées). Evaluer les risques éventuels liés à l’utilisation de ce produit et s’assurer le cas échéant qu’ils constituent des risques acceptables au regard des bienfaits/bénéfices apportés aux patients et sont compatibles avec un niveau élevé de protection de la santé et de la sécurité des patients comme des utilisateurs. Les résultats seront disponibles à l’issue des études et leur incorporation dans les dossiers de soumissions aux autorités de santé compétentes avant leur mise (ou leur maintien) sur le marché pourront en découler à court terme.

Procédures

Dans ce projet, le paramètre évalué est la capacité de l’élément testé à induire une manifestation allergique cutanée par contact chez le cobaye. Le test se déroule en trois phases principales. Les deux premières phases consistent à exposer un groupe d'animaux à deux reprises au produit testé. Lors de la première phase, les animaux sont injectés avec le produit et restent en contact avec le produit pendant 7 jours (environ 1 minute). Lors de la deuxième phase, les animaux sont mis en contact avec unun produit nécessaire à la réaction de sensibilisation pendant 48 heures une période de repos d’environ 14 jours, lors de la troisième phase, les animaux les animaux sont mis en contact via un patch dermique avec l’élément d’essai à tester pendant 24 heures Enfin, les sites d’application (sur les 2 flancs de l’animal) sont observés et une évaluation visuelle d’une éventuelle réaction locale est réalisée (érythèmes et/ou œdèmes). Le cas échant, en fonction de la nature de l’élément à tester, afin de ne pas biaiser la lecture du potentiel allergique cutané dans le test principal, une étape préalable permet de déterminer une concentration du produit n’interférant pas avec les modalités de l’étude principale. L’étape préalable nommé test préliminaire se compose comme suit : les animaux sont mis en contact avec le produit pendant 2 minutes puis observé de la même façon que décrit précédemment 24 heures après.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont les suivantes : - Inconfort léger lors des injections réalisées (inconfort transitoire (acte inférieur à 1 minute) ; récupération rapide) -Stress léger lié aux contentions lors des différents actes et à la mise en place de pansements (inconfort transitoire (acte inférieur à 1 minute), actes espacés dans le temps ; temps totale de 9 à 10 min sur une durée total d'étude de 26 jours) -Inconfort modéré ponctuel lié au retrait des pansements (présence d’une compresse protégeant et limitant le contact de l’adhésif avec la peau, acte transitoire inférieur à 1 minute) -Inconfort modérée liée à la présence de pansement (tension du pansement adaptée, vérification de l’absence de gène dans les mouvements de l’animal, durée limitée, uniquement deux sessions de respectivement 48h et 24h (sur les 26 jours de l'étude), chacune séparée de 13 jours - Mise en place d'éléments compensatoires sur toute la durée de l'étude) - Inconfort modéré ponctuel lié à la présence d’érythème intense à la suite d’une réaction de sensibilisation (Durée limitée, maximum 48h sur les 26 jours de l’étude). - Douleur modérée en cas d’apparition de lésions cutanées suite aux injections réalisées (mise en place d'un traitement analgésique approprié).

Devenir

Etant donné que : - il s'agit du seul test sur cobaye réalisé, - les animaux ont déjà eu une sensibilisation, - l'ACF utilisé dans le cadre de ces études est conu pour engendrer des escarres, les animaux ne sont donc plus utilisables et sont donc mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives existantes ne permettent pas d’évaluer les effets sensibilisants des produits de santé, en raison de la complexité des mécanismes de régulation d’un organisme vivant (système immunitaire en particulier). De plus, il n'existe pas de test in vitro validé ni de modèle simulé par ordinateur capable de reproduire la complexité d'une réaction tissulaire. De ce fait, l’utilisation d’animaux est toujours requise par la réglementation (exemple : suivi des exigences de la norme ISO 10993).

Réduction

Le nombre minimum d’animaux est défini dans les textes normatifs de référence (10 animaux test et 5 animaux témoins dans 2 conditions différentes). Pour les tests sur certains produits (pur ou extrait) un test préliminaire sur un minimum de 4 animaux est réalisé pour déterminer les concentrations à appliquer. En effet, la réaction cutanée locale liée à cette irritation pourrait biaiser l’obtention des résultats du test de sensibilisation Ce test préliminaire sur minimum 4 animaux permet donc de réduire le risque d’échec du test réglementaire, évitant ainsi l’usage inutile de ce plus grand nombre d’animaux. Au vue de ces données, le nombre d'animaux utilisés sur 3 ans est estimé à 37440 soit un nombre d'études de 1248.

Raffinement

Chaque animal fait l’objet d’un suivi quotidien pour permettre de détecter des signes de souffrance ou angoisse. Si une telle détection avait lieu, un suivi spécifique est mis en place par l’équipe vétérinaire. En cas de détection de signes de douleur ou de détection d’une anomalie clinique pouvant laisser penser que l’animal présente une souffrance, un traitement analgésique sera mis en place au moins une fois par jour. En particulier, une évaluation renforcée a lieu dans les phases critiques de l’étude, pour s’assurer que la prise en charge est adaptée aux observations cliniques réalisées. Si ça n’était pas le cas, et qu’aucune autre prise en charge n’est scientifiquement possible, l’animal sera rapidement euthanasié. L’enrichissement du lieu d’hébergement et les éléments compensatoires sont fournis : des objets en bois, un tunnel et un galet de foin, afin de favoriser l’activité d’exploration et de mastication. Enfin, de la musique est diffusée dans les salles d’hébergement.

Choix des espèces

Espèce animale définie dans le (ou les) texte(s) de référence(s). Stade jeune adulte et/ou poids correspondant précisés dans le(s) texte(s) de référence (poids compris entre 300 et 500 g en début d’étude).