Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 03/05/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-477127)
112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues d’un élevage de souris modifiées pour la maladie d’Alzheimer, elles reçoivent un peptide par voie intranasale tous les deux jours pendant six mois, puis passent trois tests de mémoire, un test de mémoire de travail spatiale, un test associant un contexte à une émotion et un test de reconnaissance d’objet, avant mise à mort et prélèvement du cerveau. Le porteur indique que l’administration intranasale peut provoquer un stress et une détresse respiratoire. Il affirme que l’usage de ces animaux est « indispensable », les effets sur la mémoire ne pouvant s’étudier qu’in vivo.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La maladie d’Alzheimer est la forme la plus courante de démence chez les personnes âgées. Elle se caractérise par un déclin progressif de la mémoire et des capacités cognitives, qui est initié par l’accumulation de protéines anormales dans le cerveau. Ces protéines anormales provoquent une altération des cellules nerveuses qui est responsable du déficit de mémoire. Le défi est donc d’augmenter la résistance des cellules nerveuses à cette toxicité. Cependant, les traitements actuels de la maladie d’Alzheimer améliorent les symptômes comportementaux sans modifier l’évolution de la maladie. Une approche prometteuse consiste à contrer l’accumulation de ces protéines anormales à un stade précoce de la maladie et nous avons concu pour cela de nouveaux composés moléculaires. Nous avons caractérisé l’efficacité de ces composés à bloquer la formation, l’accumulation et la toxicité de ces protéines anormales dans des modèles in vitro de la maladie. L’ensemble de ces résultats ouvrent la voie à l’utilisation de ces composés pour lutter contre les altérations cognitives précoces dans la maladie d’Alzheimer. Dans ce projet, ces composés seront utilisés in vivo dans un modèle murin préclinique de la maladie d’Alzheimer, afin d’étudier leur impact sur différents types de mémoire et sur les cellules nerveuses. Les conséquences de cette stratégie expérimentale seront également analysées sur la charge du cerveau en protéines anormales.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’ensemble de ces expériences a pour but de déterminer si cette stratégie peut limiter la toxicité due aux protéines anormales et améliorer de manière durable les capacités de mémorisation chez des souris, modèle de la maladie d’Alzheimer. L’objectif est d’étudier l’impact de ces composés sur les déficits de mémoire, les altérations des cellules nerveuses et la charge en protéines anormales dans le modèle murin de la maladie d’Alzheimer. L’utilisation de ces animaux est donc indispensable à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques de la maladie d’Alzheimer et à l’estimation d’un effet bénéfique potentiel du traitement sur les déficits cognitifs. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la maladie pour envisager dans le futur de nouvelles pistes thérapeutiques.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les 3 procédures envisagées s’appuient sur la production de souris, puis l’administration non invasive de composés d’intérêt par voie intranasale chez la souris vigile pour faciliter leur transport jusqu’au cerveau. Ces traitements d’infusion d’une durée de 10 minutes seront initiés à la 8ème semaine et répétés tous les 2 jours sur une période de 6 mois. Dans la procédure 1 d’élevage, 112 souris transgéniques mâles et femelles APP/PS1 seront obtenues par croisement de souris hétérozygotes à phénotype non-dommageables. Dans la procédure n°2, l’effet de ces traitements sera étudié sur 64 souris (16 souris par groupe) par des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités à fixer une information en mémoire. Pour chaque animal, 3 tests comportementaux seront réalisés au 8ème mois. Tout d’abord, un test destiné à évaluer la mémoire de travail spatiale sera réalisé 1 fois sur 5 jours, sur une durée de 8 minutes chaque jour. Après une semaine de délai, un test évaluant la capacité d’associer un contexte à une émotion sera effectué 1 fois sur 2 jours sur une durée de 4 minutes chaque jour. Enfin, après une autre semaine de délai, un test de reconnaissance d’objet sera entrepris sur 3 jours, sur une durée de 20 minutes le premier jour et 10 minutes les 2 jours suivants. Après cette étude comportementale, les souris seront anesthésiées profondément puis mises à mort pour prélever leur cerveau et réaliser une étude biochimique complémentaire. Cette étude permettra d’analyser l’impact des traitements sur la charge en protéines anormales dans ces souris modèle de la maladie d’Alzheimer. Dans la procédure n°3, 48 souris (12 souris par groupe) seront anesthésiées profondément et analgésiées après la fin des traitements, puis perfusées en intracardiaque en état de mort cérébrale pour fixer leur cerveau et réaliser une étude immunohistochimique. L’effet de ces traitements sur les cellules nerveuses sera étudié par un marquage spécifique sur coupes de cerveau.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’application intranasale de composés peut induire un certain stress chez la souris. Pour limiter ce stress au maximum, les souris auront une période d’habiuation au protocole de 2 semaines avec un renforcement positif appliqué à chaque étape clé. Des aléas expérimentaux peuvent se produire après l’administration intranasale de composés comme l’induction d’une détresse respiratoire. Pour réduire ce risque, le protocole respecte une attente de 2 minutes entre chaque administration intranasale. Enfin, la possibilité qu’une hypersensibilité aux composés administrés apparaissent chez de rares souris sera envisagée. Dans ce cas, l’animal sera sorti immédiatement de l’étude et mis à mort après induction d’une anesthésie profonde.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de la procédure 1, les 112 souris seront utilisées dans la procédure expérimentale 2, pour 64 d’entre elles, et dans la procédure 3 pour les 48 souris restantes. A l’issue de la procédure n°2, les 64 souris seront anesthésiées profondément et mises à mort pour prélever leur cerveau et réaliser une étude biochimique en complément de l’étude comportementale. A l’issue de la procédure n°3, les 48 souris seront analgésiées puis anesthésiées profondément et perfusées en état de mort cérébrale pour fixer leur cerveau et réaliser une étude immunohistochimique. Ces 3 procédures permettront de déterminer si l’administration des composés d’intérêt permet de limiter la toxicité due aux protéines anormales, chez la souris modèle de la maladie, et d’améliorer de manière durable les capacités de mémorisation de ces souris, en conservant l’intégrité de leurs cellules nerveuses.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Des études sur ces composés ont été réalisées sur des modèles cellulaires et en éprouvette pour limiter l’utilisation d’animaux au strict nécessaire, c’est à dire à l’évaluation des performances cognitives. Les effets du traitement sur la mémoire ne peuvent en effet s’étudier que dans les conditions in vivo chez l’animal.
2. Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au maximum sans compromettre les objectifs du projet et avoir des résultats statistiquement exploitables. Le nombre de souris a été réduit à n=112 en référence aux études comparables de la littérature. Ce nombre d’animaux est nécessaire car plusieurs traitements seront délivrés par voie intranasale en administrant les composés actifs ou les molécules contrôles chez des souris de génotypes différents. Les performances cognitives de ces souris seront évaluées après traitement grâce à trois apprentissages comportementaux. Comme ces apprentissages successifs peuvent réorganiser les circuits nerveux, il sera nécessaire d’utiliser d’autres souris (procédure 3) pour étudier l’impact des traitements sur la densité et la morphologie des cellules nerveuses. Dans la procédure 2, un même cerveau sera utilisé pour 2 approches différentes (i.e. approche comportementale sur l’animal vivant, puis approche moléculaire avec l’analyse biochimique de la charge en protéines anormales du cerveau). Une compilation d’études de la littérature indique qu’il est nécessaire d’avoir 15 animaux par groupe (4 groupes) pour atteindre la significativité statistique avec un test statistique adapté. Cette limite justifie le nombre de souris fixé à 16 souris par groupe, soit 1 animal supplémentaire à la limite de la significativité, afin de prévoir les possibles aléas (problème survenant lors des 6 mois de l’étude et/ou mort de l’animal).
3. Raffinement
Avant d’initier le protocole d’administration intranasale, les souris de 6 semaines seront habituées à la manipulation pendant une période de deux semaines. Elles seront habituées à être soulevées, placées en position inclinées vers l’arrière, et à recevoir une microgoutte (2,5 ul) de saline en contact avec la narine pour qu’elle soit aspirée au moment de l’inspiration. Cette habituation sera réalisée de manière à limiter le stress de l’animal lors de l’administration intranasale des composés, et se base sur une technique de renforcement positif avec une récompense sous forme de lait concentré sucré. Les souris seront suivies quotidiennement suite à l’infusion intranasale des traitements. Leur état sera noté selon des critères établis qui prennent en compte divers facteurs (poids, état du pelage, comportement dans la cage et lors de la manipulation de l’animal, fabrication d’un nid). Ceci nous permettra de nous assurer du bien-être des animaux. Tout animal présentant des signes de douleur ou de mal être avec atteinte de point limite sera aussitôt sorti du protocole, anesthésié profondement et mis à mort.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les souris génétiquement modifiées sont couramment utilisées en neurosciences pour l’étude de traitements visant à améliorer les performances de mémoire dans la maladie d’Alzheimer ou pour mieux connaître les mécanismes moléculaires mis en jeu. Ces souris génétiquement modifiées présentent l’avantage unique de mimer les formes dites familiales de la maladie qui sont observées chez certains patients. Des souris âgées de 6 semaines à 8 mois seront utilisées dans ce projet car l’accumulation de protéines anormales dans leur cerveau débute à 8 semaines, et les déficits de mémoire se produisent au 8ème mois chez les mâles ou les femelles.