Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 13/02/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-245962)
1026 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. La moitié subit une électrocautérisation des cinq sixièmes d’un rein et l’autre l’ablation du rein gauche sous anesthésie, induisant de façon certaine une insuffisance rénale chronique, complétée par un régime riche en phosphate, des prélèvements sanguins et des échocardiographies. Le porteur cherche à mettre au point un modèle de calcification de la valve aortique et à évaluer une cible pharmacologique, un traitement chez l’humain étant présenté comme un espoir conditionnel. Sur le remplacement, il affirme qu’aucun modèle in vitro fiable ne reproduit cette pathologie.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif central de ce projet est de comprendre le rôle d’Ezh2 (Enhancer Zeste Homologue 2), enzyme épigénétique responsable de la triméthylation de la lysine 27 sur l’histone 3 (H3K27me3), dans le développement du rétrécissement aortique calcifié (RAC). De plus, pour répondre à cet objectif principal nous avons un sous objectif qui est de développer un modèle de calcifications valvulaires suite à l’induction d’une insuffisance rénale chronique supplémentée avec un régime alimentaire riche en phosphate chez la souris. Ce même modèle a précédemment été mis au point chez le rat au sein du laboratoire. La mise au point de ce modèle nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de cette pathologie et l’implication d’Ezh2.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet nous permettra, d’une part, de mettre au point un modèle de calcifications valvulaires aortiques chez la souris, permettant par la suite d’être utilisé pour mieux comprendre les mécanismes associés au développement du RAC in vivo. D’autre part, d’étudier l’implication de notre cible thérapeutique, Ezh2 dans le développement du RAC induit par différents types cellulaires (cellules endothéliales valvulaire, cellules inflammatoires etc…) grâce à l’utilisation de modèle de souris génétiquement modifiées. Nous espérons ainsi, si les résultats obtenus sont encourageants, créer une nouvelle stratégie de ciblage pharmacologique de Ezh2 spécifique aux cellules inflammatoires, pouvant faire l’objet d’un traitement innovant de la progression du RAC chez l’Homme.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
1. Electrocautérisation des 5/6ème du rein droit sous anesthésie gazeuse et sous couverture analgésique pour la moitié des souris soit n=478. La chirurgie dure environ 20 minutes. 2. Néphrectomie, c’est-à-dire exérèse, du rein gauche sous anesthésie gazeuse et sous couverture analgésique pour la moitié des souris soit n=478. La chirurgie dure environ 20 minutes. 3. Pour s’assurer de l’induction de l’IRC, un prélèvement sanguin sera réalisé au niveau du sinus sous mandibulaire au niveau de la veine mandibulaire d’une durée de 1 à 2 minutes, la 4ème semaine post-chirurgie afin de mesurer les paramètres plasmatiques de la dysfonction rénale (créatinine, urée) pour toutes les souris n=956. De plus, pour toutes les souris un prélèvement sanguin comme décrit ci-dessus sera effectué avant toute chirurgie et lors de la mise à mort. 4. Echocardiographie, d’une durée maximum de 20 minutes par souris, (imagerie in vivo) menée sous anesthésie gazeuse et sous couverture analgésique pour toutes les souris. 5. Au total chaque souris (n=956) subira 2 prélèvements sanguins au niveau du sinus sous-mandibulaire, d’une durée de 1 à 2 minutes et un prélèvement sanguin via l’aorte abdominale lors de la mise à mort. La couverture analgésique totale pour la procédure durera 6 heures.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les prélèvements sanguins, les administrations d’analgésique et le traitement avec l’inhibiteur pharmacologique de Ezh2, ainsi que l’exérèse du rein gauche pourront occasionner des effets secondaires. De manière certaine, les animaux, après néphrectomie des 5/6ème (procédure classée sévère) développeront une insuffisance rénale chronique (IRC). Nous nous attendons, si notre modèle fonctionne, à voir des signes de dysfonction cardiaque et plus particulièrement de la valve aortique évalués par échocardiographie.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Afin de vérifier si notre modèle d’IRC a induit des calcifications valvulaires, différents types de prélèvements seront effectués : – Prélèvements sanguins 4 semaines après chirurgie et lors de la mise à mort. – Prélèvements de tissus (cœur, rein, poumon, foie) afin de réaliser des analyses histologiques et biochimiques. Ces prélèvements seront réalisés sur les animaux précédemment anesthésiés de manière gazeuse lors de l’échocardiographie correspondant aux analyses fonctionnelles.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les expériences in vivo ne peuvent pas être remplacées par des études in vitro car nous avons pour but dans cette étude de mettre au point un modèle d’insuffisance rénale chronique (IRC) associée à un régime riche en phosphate induisant de la calcification valvulaire chez la souris afin d’évaluer l’efficacité de traitements pharmacologiques inhibant l’activité de Ezh2. Cependant l’utilisation des animaux est rendue nécessaire car il n’existe pas à ce jour de modèle in vitro fiable récapitulant la physiopathologie du RAC.
2. Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque (échocardiographie). Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo durant la procédure et au moment de la mise à mort. Le choix des inhibiteurs pharmacologiques de Ezh2 est issu d’expériences préalablement réalisées dans des modèles de RAC in vitro. Suite à la procédure de mise au point du modèle animal nous ajusterons le nombre d’animaux nécessaires aux procédures suivantes à l’aide du logiciel G*power version 3.1.9.7 qui s’appuie sur la variabilité statistique des résultats obtenus pour réduire le nombre d’animaux nécessaire. Des animaux des deux sexes seront utilisés dans nos procédures afin de s’affranchir d’un effet du genre et d’utiliser l’intégralité des animaux OGM produits dans notre animalerie. Une stratégie de reproduction par backcross complémentée par une analyse du génotype de chaque animal nous permettra de nous limiter à l’unique production d’animaux pour les procédures expérimentales. Afin d’éviter la production d’animaux servant au maintien de la lignée OGM dans notre animalerie, une stratégie de cryopréservation de sperme sera mise en place.
3. Raffinement
Pour raffiner, les animaux seront hébergés en groupes de 5 individus maximum aux normes requises incluant un enrichissement des cages (des plaques de cellulose vierge et des maisons en carton) dans des portoirs ventilés. Des points limites adaptés grâce à notre grille de score (poil ébouriffé, perte de poids ≥ 20%, hypoactivité, prostration, paralysie, dyspnée) associés à une stratégie de réhydratation des animaux par injection sous cutanée de sérum physiologique à 37°C pour une diffusion plus lente et une meilleure hydratation et en cas de besoin, une injection de glucose 5% par voie intrapéritonéale. Un traitement analgésique en pré et post-opératoire, soit immédiatement après la chirurgie, ou une fois par jour sur les 48h qui suivent l’opération, est prévu. Si un des points limites est atteint ou si la somme des paramètres de suivi atteint un score de 3, l’animal sera mis à mort. Un suivi quotidien du bien-être animal sera mis en place. Dans le but de réduire la douleur tous les animaux inclus dans cette étude (sauvages et OGM) seront identifiés par puçage.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des outils biologiques, l’utilisation d’animaux pour lesquels un gène est invalidé de manière spécifique dans différents types cellulaires comme cela est le cas dans cette demande concernant la délétion de Ezh2 dans les cellules myéloïdes, qui ne sont parfois pas accessibles pour le rat (modèle développé au sein de notre laboratoire). Ces modèles sont particulièrement intéressants pour mieux comprendre les mécanismes de la pathologie. Dans notre laboratoire nous avons, depuis de nombreuses années, une excellente expérience des évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. La souche de souris (C57Bl/6j) sera utilisée dans cette étude. Nous allons inclure des animaux adultes de 16 semaines et pesant 20-24g pour cette étude. La taille des souris à cet âge permet une réalisation facilitée de la chirurgie.