Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 03/06/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-577966)
Opérées de l’oreille interne à l’âge de deux semaines, 70 souris reçoivent une thérapie génique déposée au laser sur la fenêtre ronde, puis passent quatre mesures d’audition sous anesthésie étalées sur huit semaines. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées après la dernière mesure, pour prélèvement des tissus de l’oreille interne. Une partie des animaux appartient à une lignée sourde par mutation, ce qui doit permettre de vérifier que la thérapie restaure l’audition avant un passage chez l’être humain. Le porteur affirme que le dépôt au laser et les mesures d’audition n’engendrent aucune douleur, et annonce des points limites définis sans dire lesquels.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’oreille interne, où se situe la cochlée, l’organe permettant d’entendre, est difficile d’accès pour l’administration de médicaments. En effet, la cochlée est un organe de quelques millimètres situé derrière le tympan. La présence d’une barrière physiologique entre la circulation sanguine et les liquides de l’oreille interne limite l’accès par les voies conventionnelles telles que la voie orale ou intraveineuse. Une des extrémités de la cochlée, la membrane de la fenêtre ronde, fine et perméable, est une voie d’accès à la cochlée. En effet, il est possible de venir déposer le médicament sur la membrane de la fenêtre ronde, cette approche étant considérée conservative et peu invasive. La bioimpression assistée par laser permet le dépôt contrôlé et très précis de bioencre contenant des cellules. En adaptant la technique de bioimpression assistée par laser, il est possible de faire de l’administration de médicaments assistée par laser. Cette méthode a déjà été utilisée pour l’administration d’anti-inflammatoires sur la membrane de la fenêtre ronde chez la souris. Les résultats montrent que le médicament diffuse jusqu’aux cellules au sein de la cochlée sans effet délétère. Dans la continuité de ce projet, l’objectif est d’améliorer le procédé de dépôt ciblé pour l’administration de thérapie génique permettant la correction de surdité d’origine génétique. Nous souhaitons valider un nouveau dispositif laser conduit à l’aide d’une fibre optique et permettant le dépôt ciblé de thérapie génique sur la fenêtre ronde humaine. Des méthodes pour augmenter la diffusion à travers la membrane doivent également être validées pour améliorer le transfert de la thérapie génique. Finalement, la correction du défaut génétique et la récupération de l’audition seront validées chez un modèle animal présentant une modification génétique similaire à l’homme, touchant la production d’une protéine indispensable pour entendre.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet permettra d’améliorer le dispositif d’injection et de diffusion de médicaments, et plus particulièrement de thérapie génique, dans la cochlée, avec une grande précision et sans risque de lésions, contrairement aux injections invasives développées à ce jour. L’utilisation d’une fibre et de médicaments plus volumineux nécessite une nouvelle validation du procédé de dépôt ciblé assisté par laser sur la fenêtre ronde et une diffusion dans l’oreille interne. De plus, cette étude pré-clinique est nécessaire pour ensuite passer aux essais cliniques chez l’homme. D’un point de vue technique, ce projet est une étape-clé pour optimiser la technologie de dépôt ciblé de médicaments assisté par laser conduit par fibre. Plus largement, ce projet permettra de valider l’utilisation du laser pour l’administration de médicaments.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis à des mesures pré-opératoires et post-opératoires de l’audition, n’excèdant pas 10 minutes. Les mesures post-opératoires seront effectuées 48h, une semaine, deux semaines et huit semaines après l’opération. Cette mesure est similaire aux mesures réalisées sur l’homme éveillé. Les animaux seront soumis à une chirurgie (durée de 15 minutes) et à une administration de médicaments dans l’oreille (durée de 10 à 12 minutes au total pour installer la souris, paramétrer le laser puis administrer le médicament). Un anti-douleur est également administré en pré-opératoire, et 24h après la chirurgie, pour limiter la douleur occasionnée par la chirurgie. L’administration de médicaments assistée par laser ne génèrent aucune douleur ou traumatisme chez l’animal, et sont réalisés sous anesthésie générale car cela nécessite une immobilisation complète de l’animal. Dans leur globalité, les procédure pré-opératoire et opératoire n’excèdent pas 40 minutes maximum afin de limiter la durée de l’anesthésie. Toutes ces interventions seront faites sous anesthésie.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les animaux pourront subir du stress avant et lors des anesthésie (entre 2 et 5 minutes). Un délai de 48h minimum sera respecté entre les anesthésies pour le limiter. Des douleurs pourront être ressenties après la chirurgie durant les 2 jours post-opératoires. Les protocoles de dépôt ciblé et de mesure de l’audition n’engendreront aucune douleur. Chez les souris avec surdité d’origine génétique, la thérapie génique doit entraîner la récupération de l’audition dans les semaines suivant le traitement.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort selon la procédure prévue à la fin de la dernière mesure de l’audition (huit semaines post-opératoire). Les tissus de l’oreille interne seront prélevés pour analyse quantitative et qualitative (histologie, fluorescence).
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’application de thérapie génique sur la membrane de la fenêtre ronde assistée par laser s’insérant dans un projet d’application clinique future, il est nécessaire de valider son efficacité (diffusion et transfert) et son innocuité (sans impact auditif) sur un modèle animal. Seules les conditions in vivo chez l’animal permettent d’évaluer l’effet de la procédure sur l’audition. Ces mesures doivent être effectuées sur des animaux mammifères qui possèdent un système auditif suffisamment proche de l’homme, et un défaut auditif génétique similaire. Aucun environnement multifactoriel ne permet de reproduire ce modèle in vitro. Néanmoins, des études in vitro et ex vivo seront réalisées pour sélectionner les paramètres laser du dépôt ciblé, de la perméabilisation, et du gel contenant la thérapie génique.
2. Réduction
Des tests préliminaires seront effectués sur des lames receveuses et du matériel inerte afin de fixer l’entièreté des paramètres de bioimpression (paramètres laser et composition de l’hydrogel) avant de procéder aux expérimentations animales. La méthode de perméabilisation sera décrite précisément et validée in vitro et ex vivo, avant de procéder aux études in vivo. Chaque souris sera utilisée pour l’entièreté de la procédure : mesure pré-opératoire de l’audition, chirurgie, perméabilisation et dépôt ciblé assistés par laser, et les quatre mesures post-opératoires de l’audition, afin d’en limiter le nombre. Nous utiliserons le plus petit nombre possible de souris par conditions (contrôles, validation du dépôt ciblé, délivrance de médicaments actifs). Le nombre total de 70 souris utilisées sur l’ensemble du projet permet un traitement statistique significatif des données obtenues compte tenu du degré de variabilité inter-individuelle.
3. Raffinement
Une analgésie adaptée sera appliquée en pré- et post-opératoire ainsi que des conditions de stabulation appropriées. Pour soulager l’inconfort et le stress des souris, nous hébergerons les souris dans une cage en groupe (5 par cage) à milieu enrichi (tunnel carton, aspen bois, fibres de papier et abri) dans un local à ventilation, température et éclairage contrôlés. Pendant les différentes procédures, l’animal sera profondément anesthésié avec une surveillance des points vitaux (fréquence cardiaque et respiration, couleur des muqueuses, température corporelle). Le stress sera réduit en manipulant régulièrement les animaux dans la semaine précédant l’anesthésie pour qu’ils s’habituent aux expérimentateurs. Le réveil s’effectuera sur couverture chauffante, uniquement avec la mère puis regroupées par 5 en respectant la composition du groupe per-opératoire. La douleur engendrée par la chirurgie sera réduite au maximum par utilisation d’analgésique et anesthésique local. L’estimation de la souffrance sera réalisée dans les 5 premiers jours par l’expérimentateur, en même temps que par le personnel de l’animalerie. Cette estimation est ensuite réalisée quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Les animaux seront surveillés concernant leurs activités et leurs comportements. Des points limites sont définis afin de respecter le bien-être animal et pourront entraîner l’arrêt immédiat des manipulations. Tous les expérimentateurs satisferont les obligations de formation en chirurgie sur rongeurs et en expérimentation animale.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
L’évaluation de l’impact de la procédure sur la fonction auditive et de la diffusion et du transfert de thérapie génique dans l’oreille interne nécessite de réaliser des expérimentations sur l’animal. Les mesures de l’audition ne peuvent se faire sur des animaux non-mammifères car leur système auditif est trop éloigné de celui de l’homme. Chez la souris, l’anatomie cochléaire est également similaire, et la fenêtre ronde est bien accessible par voie chirurgicale. Des études présentent les voies d’accès à la membrane de la fenêtre ronde chez la souris, afin d’avoir une chirurgie reproductible et le moins traumatique possible. Par ailleurs, une lignée de souris présentant un défaut auditif génétique similaire à l’homme existe au sein de l’animalerie et nous permettrait de valider la diffusion, le transfert génique et la récupération de l’audition. Les souris utilisées auront deux semaines lors de la procédure opératoire, car les souris plus âgées présentent une structure anatomique limitant l’accès à la fenêtre ronde.