Procédures légères

1595 souris pour une question sur le microbiote intestinal, dont 280 portées entières retirées à leur mère dès la naissance et confiées à des femelles rendues hypothyroïdiennes par un régime pauvre en iode. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger à modéré, et toutes les souris seront tuées pour un prélèvement de sang et d'organes. Cinq cent vingt d'entre elles sont anesthésiées au gaz chaque semaine pour être mesurées, et pesées trois fois par semaine, quarante subissant en plus un prélèvement de fèces à l'anus. Le porteur écrit qu'une mère de substitution qui ne prend pas la portée en charge expose les souriceaux à la dénutrition et à l'hypothermie, et que ceux dont l'estomac apparaît vide de lait par transparence sont mis à mort.

Objectifs

Chez l'homme 10% des grossesses s'accompagnent d'hypothyro?die. Si cette derni?re n'est pas corrig?e chez le nouveau n?, elle s'accompagne de d?fauts d?veloppementaux irr?versibles. Comme chez la souris, la p?riode postnatale constitue une fen?tre critique du d?veloppement au cours de laquelle les organes acqui?rent leur maturit? fonctionnelle et s?ajustent aux signaux environnementaux. Dans le m?me temps, le microbiote intestinal se d?veloppe et est n?cessaire ? une croissance optimale. Cette p?riode est donc d?terminante pour l??tablissement des interactions h?te-microbiote. Chez la souris aussi les HT sont cruciales dans cette fen?tre d?veloppementale: en absence d?HT, les souriceaux n?atteignent pas le sevrage. Bien que la signalisation thyro?dienne et la maturation du microbiote soient toutes deux n?cessaires au bon d?roulement de cette p?riode critique, le r?le des HT dans le recrutement du microbiote n'a pas ?t? ?tudi?. Pourtant des donn?es laissent ? penser que cela pourrait ?tre le cas. Chez l'adulte les HT r?gulent la synth?se h?patique des acides biliaires . L?augmentation h?patique d?HT, observ?e d?s trois jours apr?s la naissance, pourrait initier la production d?acides biliaires, acteurs majeurs de la maturation du microbiote intestinal, sugg?rant un r?le des HT sur la maturation du microbiote au cours du d?veloppement. Le but de ce projet est d?explorer si les HT participent ? la maturation du microbiote intestinal pendant la p?riode postnatale chez la souris et si oui comment. La mise en ?vidence d?un dialogue inter-organes (foie-intestin) et inter-r?gnes (microbiote-h?te), pendant la p?riode postnatale permettrait de mieux comprendre les m?canismes impliqu?s dans l?adaptation pr?coce de l?organisme ? son environnement, d?terminante pour permettre le sevrage et la sant? ? l??ge adulte. Vues les similitudes qu'il existe entre les effets d?veloppementaux des HT et le recrutement du microbiote entre homme et souris , les r?sultats obtenus nous ?claireraient sur le r?le des HT dans la maturation du microbiote chez l'homme.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de d?terminer si et comment les hormones thyro?diennes, un signal hormonal crucial pour le d?veloppement postnatal de l'h?te participent ? la prolif?ration et ? la diversification du microbiote. En effet hormones thyro?diennes et microbiote sont tous deux n?cessaires ? une croissance normale et une maturation de nombreux organes de l?h?te, cependant aucune ?tude n?a pour l?instant interrog? une potentielle interaction entre les deux. S?il existe un effet, nous ?valuerons s?il peut ?tre corrig? en restaurant des concentrations d?hormones thyro?diennes normales. Ces connaissances contribueront ? am?liorer notre compr?hension de la mise en place des communications h?te-microbiote, qui sont n?cessaires non seulement ? la bonne sant? de l?h?te adulte, mais aussi ? son bon d?veloppement postnatal . Si nos hypoth?ses sont confirm?es chez la souris, nos r?sultats permettraient d'envisager l'utilisation de probiotiques en cas d'hypothyro?die chez l'homme ? la naissance, en attendant de stabiliser les niveaux d'hormones thyro?diennes, pour limiter les d?fauts de d?veloppement postnatal pr?coce.

Procédures

1595 animaux seront utilis?s dans le projet, ils seront vigiles sauf indication contraire. 35 femelles gestantes seront nourries pendant les deux derniers tiers de leur gestation avec de la nourriture pauvre en iode et avec un traitement bloquant la production d?hormone thyro?dienne entra?nant une ? hypothyro?die ?. D?autres recevront un r?gime contr?le. A la naissance, des port?es (280) de m?res contr?les seront donn?es ? adopter ? des m?res hypothyro?diennes. Les m?res hypothyro?diennes et leurs petits adopt?s sont maintenus sous leur r?gime sp?cial au maximum un mois apr?s la naissance. Toutes les souris (520) seront mesur?es chaque semaine sous anesth?sie g?n?rale gazeuse (3 minutes) puis pes?es (< 1 min) 3 fois par semaine pendant toute la dur?e du protocole. Certaine de ces souris (40) seront aussi contentionn?es (< 1 min) pour pr?l?vement de f?ces ? l?anus, 1 fois par semaine. En parall?me des souris portant des modifications g?n?tiques (960) sont n?es et ?lev?es par des m?res nourris avec un r?gime contr?le et seront seulement pes?es (< 1 min) 3 fois par semaine pendant toute la dur?e du protocole. Pour l?ensemble des animaux n?s (1480) au cours de ces exp?riences un pr?l?vement sanguin est effectu? au moment de la mise ? mort. Pour les animaux ?g?s de plus de 21 jours, ces pr?l?vements se font apr?s l'injection sous cutan?e d'un produit analg?siant (30 secondes) suivie 30 minutes apr?s d'une injection d'anesth?siques dans l'abdomen ( 30 secondes), pour r?aliser ce pr?l?vement sans douleur.

Impact sur les animaux

En cas d??chec d?adoption les petits risquent d??tre d?nutris et en hypothermie . L?g?res douleurs li?es ? diff?rents types d?injection en sous cutan?es et dans l?abdomen (analg?sique) anesth?sique) L?gers inconforts li?s ? la manipulation/contention lors des pes?es et du pr?l?vement de f?ces. L?hypothyro?die chez le nouveau-n? entraine une absence de prise de poids Aucun ph?notype dommageable n?est pr?visible pour les deux nouveaux g?notypes . En tout ?tat de cause, les petits portants ces mutations sont observ?s tous les jours du lundi au vendredi et pes?s trois fois par semaine d?s leur naissance comme il est pr?conis? de le faire pour une nouvelle mutation. Toute souffrance pourra ?tre mise en ?vidence, et les animaux mis ? mort si n?cessaires.

Devenir

L'ensemble des animaux mis en proc?dure seront mis ? mort en vue du pr?l?vement de sang et des organes d'int?r?t.

Remplacement

Cette ?tude implique des interactions r?ciproques entre un organisme et les microbes pr?sents dans son intestin. Elle s?int?resse aussi ? la perturbation de la communication entre plusieurs organes induite par des changements hormonaux. Aucun mod?le in vitro ne permet de reproduire cette complexit?. C'est pourquoi cette ?tude n?cessite l'exp?rimentation animale.

Réduction

Le nombre d?animaux a ?t? r?duit au maximum tout en garantissant la robustesse statistique des r?sultats. Trois types d?exp?riences sont pr?vus et seront r?alis?s de fa?on s?quentielle. Si le premier type r?alis? ne montrent pas un effet des hormones thyro?diennes sur le recrutement et la maturation du microbiote ou sur la production d?acide biliaire, les autres exp?riences n?auront pas lieu d??tre. Si ces exp?riences sont r?alis?es nous r?duirons le nombre de conditions au minimum en n?incluant que les temps pour lesquels un effet a ?t? observ?. Afin de limiter le nombre d?animaux ? utiliser dans de futures exp?riences, tous les organes d?int?r?t potentiels (muscle, tissu adipeux, etc.) seront pr?lev?s ? la fin des protocoles et conserv?s au cong?lateur pour d??ventuelles analyses ult?rieures.

Raffinement

Apr?s l?adoption les animaux sont surveill?s quotidiennement, si les petits ne sont pas pris en charge (absence de lait dans l?estomac, visible par transparence) ils seront mis ? mort. La croissance en taille sera mesur?e individuellement chaque semaine, le poids trois fois par semaine et les animaux seront suivis quotidiennement du lundi au vendredi. Ces fr?quences permettront de d?tecter tout effet dommageable des nouvelles mutations. Des points limites pr?dictifs seront d?finis ? l?avance, et leur atteinte entra?nera la mise ? mort imm?diate des individus concern?s afin de pr?venir toute souffrance prolong?e. Aucune exp?rience autre que la manipulation des souris lors des exp?riences de pes?e, de mesure de la taille, et de la collection de f?ces n?est pr?vue. Pour la mesure de la taille, une anesth?sie gazeuse l?g?re de courte dur?e permettra d??viter la contention et de diminuer le temps n?cessaire ? la mesure. Pour le pr?l?vement terminal de sang des les animaux ?g?s de plus de 21 jours, ces pr?l?vements se font apr?s l'injection sous cutan?e d'un produit analg?siant (30 secondes) suivie 30 minutes apr?s d'une injection d'anesth?siques dans l'abdomen ( 30 secondes), pour qu'il soit sans sans douleur. La profondeur d?anesth?sie sera v?rifi?e. Toutes les mesures visent ? limiter le stress et la douleur tout en assurant la robustesse scientifique des donn?es.

Choix des espèces

La souris sera utilis?e car il s'agit d'un bon mod?le pour ?tudier l?effet des hormones thyro?diennes sur la croissance, les effets sont similaires chez l?homme, seule la temporalit? diff?re. La souris a aussi ?t? largement utilis?e pour ?tudier le microbiote. Enfin il existe des lign?es g?n?tiquement modifi?es permettant d?intervenir de fa?on cibl?e dans un contexte physiologique, en particulier sur la signalisation thyro?dienne, pour avoir acc?s ? des donn?es m?canistiques. Les animaux utilis?s seront des animaux ?g?s de 7 ? 28 jours. L'objectif du projet est d'?tudier les effets de la signalisation thyro?dienne, ? partir du moment o? elle se met en place et temps qu?elle reste tr?s ?lev?e (21 ? 28 jours) sur le recrutement et la diversification du microbiote qui s?effectue dans le m?me temps. Microbiote et signalisation thyro?dienne sont critiques pendant cette p?riode postnatale pour permettre les transformations n?cessaires au sevrage.

Jusqu'à seize anesthésies générales pour une même souris : 300 souris fortement immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Un fragment de poumon humain leur est greffé au cours d'une opération de vingt à soixante minutes, puis un cytomégalovirus humain est injecté directement dans le greffon, et l'infection est suivie par imagerie jusqu'à huit fois, avec neuf prélèvements sanguins au maximum par animal. Certaines restent dans le protocole plusieurs mois, jusqu'à l'âge de neuf mois. Le porteur écrit que leur déficit immunitaire, qui les rend fragiles aux infections et impose un hébergement particulier, est aussi ce qui permet la greffe de tissus humains, et interdit ensuite toute réutilisation comme toute adoption.

Objectifs

Les personnes ayant re?u une greffe d?organe doivent prendre des traitements diminuant l?activit? du syst?me immunitaire afin d??viter le rejet du greffon. Cette diminution des d?fenses immunitaires augmente cependant le risque d?infections. Parmi elles, le cytom?galovirus humain est l?une des plus fr?quentes et peut provoquer des complications importantes ainsi qu?alt?rer la survie du greffon. L??tude de cette infection est difficile car ce virus infecte uniquement les cellules humaines. Les mod?les animaux classiques ne permettent donc pas de reproduire correctement les interactions entre le virus, les tissus humains et le syst?me immunitaire. L?objectif de ce projet est de d?velopper et caract?riser deux mod?les de souris portant des tissus humains afin d??tudier l?infection par le cytom?galovirus humain dans un contexte proche de la transplantation d?organe. Le premier mod?le permettra d??tudier l?infection du virus dans un greffon pulmonaire humain et de suivre son ?volution au cours du temps gr?ce ? des m?thodes d?imagerie non invasives. Le second mod?le permettra, en plus du greffon pulmonaire, de reconstituer un syst?me immunitaire humain chez la souris. Il servira ? ?tudier les interactions entre le virus, le greffon et les cellules immunitaires humaines, ainsi que la capacit? du syst?me immunitaire ? contr?ler l?infection. Ces mod?les seront ?valu?s en termes de stabilit?, de reproductibilit? et de qualit? de l?infection observ?e. Ce projet a pour objectif d??tablir des mod?les exp?rimentaux robustes pour mieux comprendre les interactions entre le virus, les tissus humains et le syst?me immunitaire dans un contexte de transplantation. Il ne vise pas directement ? tester un traitement, mais ? pr?parer de futures ?tudes th?rapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de d?velopper et caract?riser des mod?les exp?rimentaux reproduisant certaines caract?ristiques de l?infection par le cytom?galovirus humain dans un contexte proche de la transplantation d?organe. ? court terme, il permettra de mieux comprendre la mani?re dont ce virus infecte et persiste dans des tissus humains greff?s, ainsi que les interactions entre le virus et le syst?me immunitaire humain. Il permettra ?galement de valider des m?thodes de suivi de l?infection au cours du temps chez les m?mes animaux, afin de limiter le nombre d?animaux n?cessaires aux exp?riences. ? moyen terme, ces travaux fourniront des mod?les exp?rimentaux robustes et reproductibles pour l??tude des infections virales humaines chez les patients immunod?prim?s, notamment apr?s une transplantation d?organe. Ils contribueront ? am?liorer les connaissances sur les m?canismes impliqu?s dans le contr?le ou la persistance de l?infection. ? plus long terme, ces mod?les pourront servir de base au d?veloppement et ? l??valuation de nouvelles approches th?rapeutiques contre les infections opportunistes chez les patients greff?s ou immunod?prim?s. Ils pourront ?galement ?tre adapt?s ? l??tude d?autres infections humaines n?cessitant la pr?sence de tissus et de cellules immunitaires humaines. Les b?n?fices attendus concernent principalement l?am?lioration des connaissances en sant? humaine et le d?veloppement futur d?outils de recherche pr?clinique.

Procédures

Les animaux utilis?s dans ce projet subiront diff?rentes interventions r?alis?es sous anesth?sie g?n?rale. Dix souris recevront une anesth?sie g?n?rale dans le cadre d?une ?tude pilote de validation chirurgicale. Trente souris recevront jusqu?? 10 anesth?sies g?n?rales au cours de la mise en place et du suivi d?un mod?le comportant l?implantation de tissus pulmonaires humains. Soixante-quinze souris recevront jusqu?? 16 anesth?sies g?n?rales dans le cadre du d?veloppement d?un mod?le associant des tissus humains et un syst?me immunitaire humain reconstitu?. Les interventions chirurgicales seront r?alis?es une seule fois et dureront environ 20 ? 30 minutes pour le mod?le d?implant pulmonaire et 45 ? 60 minutes pour le mod?le de reconstitution immunitaire. Apr?s une p?riode de r?cup?ration, certains animaux recevront une injection locale de virus dans les tissus implant?s. Des suivis r?guliers seront r?alis?s tout au long du projet. Ils comprendront des s?ances d?imagerie sous anesth?sie g?n?rale afin de suivre l??volution de l?infection au cours du temps. Chaque s?ance durera moins de 15 minutes et pourra ?tre r?p?t?e jusqu?? 8 fois selon les groupes exp?rimentaux. Certains animaux feront ?galement l?objet de pr?l?vements sanguins sous anesth?sie afin d??valuer la reconstitution du syst?me immunitaire humain et le suivi de l?infection. Ces pr?l?vements seront r?alis?s ? intervalles espac?s, avec un maximum de 9 pr?l?vements de faible volume par animal sur l?ensemble de la proc?dure. Les animaux issus de l??levage feront ?galement l?objet d?un g?notypage, et les animaux inclus dans les proc?dures exp?rimentales seront identifi?s individuellement avant leur inclusion dans l??tude. La dur?e totale de participation des animaux au projet pourra atteindre plusieurs mois selon les proc?dures exp?rimentales.

Impact sur les animaux

Les souris utilis?es dans ce projet pr?sentent un d?ficit important du syst?me immunitaire, ce qui les rend plus sensibles aux infections et n?cessite des conditions d?h?bergement et de surveillance adapt?es. Les principales nuisances attendues sont li?es aux interventions chirurgicales n?cessaires ? l?implantation des tissus humains. Ces interventions peuvent entra?ner une douleur et un inconfort transitoires, principalement dans les jours suivant la chirurgie. Une prise en charge adapt?e de la douleur sera mise en place. Les manipulations r?p?t?es, les s?ances d?imagerie et les pr?l?vements sanguins peuvent ?galement provoquer un stress l?ger et temporaire. L?infection exp?rimentale pourra entra?ner des modifications localis?es des tissus implant?s, telles qu?une inflammation ou des l?sions du greffon pulmonaire humain. Une alt?ration mod?r?e de l??tat g?n?ral des animaux reste ?galement possible en raison de leur fragilit? immunitaire. Les animaux feront l?objet d?une surveillance r?guli?re tout au long du projet afin de d?tecter rapidement tout signe de souffrance ou d?alt?ration de l??tat g?n?ral. Des crit?res d?arr?t anticip? seront appliqu?s si n?cessaire afin de limiter la douleur et les nuisances.

Devenir

? l?issue des proc?dures exp?rimentales, tous les animaux seront mis ? mort afin de permettre le pr?l?vement des tissus et organes n?cessaires aux analyses finales. Ces analyses sont indispensables pour ?valuer la pr?sence du virus, l??tat des tissus humains greff?s et la reconstitution du syst?me immunitaire humain. Les animaux ne pourront pas ?tre r?utilis?s ou propos?s ? l?adoption en raison de leur immunod?ficience, des interventions chirurgicales subies et de la n?cessit? de r?aliser des analyses terminales incompatibles avec leur maintien en vie.

Remplacement

Le cytom?galovirus humain infecte uniquement les cellules humaines et ne peut pas ?tre ?tudi? de mani?re satisfaisante dans des mod?les animaux classiques. Des m?thodes alternatives, comme les cultures cellulaires, les organo?des ou les mod?les de tissus humains en laboratoire, sont utilis?es lorsque cela est possible pour ?tudier certains m?canismes de l?infection. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire l?ensemble des interactions entre le virus, les tissus humains et le syst?me immunitaire dans un organisme vivant. Elles ne permettent pas non plus de suivre l??volution de l?infection au cours du temps dans des tissus humains vascularis?s et int?gr?s ? un organisme. Les mod?les de souris humanis?es utilis?s dans ce projet constituent actuellement la seule approche permettant d??tudier ces interactions dans des conditions proches de celles observ?es chez les patients greff?s et immunod?prim?s.

Réduction

Le nombre d?animaux utilis? dans ce projet a ?t? d?fini ? partir des donn?es de la litt?rature et des caract?ristiques des mod?les ?tudi?s, notamment les taux attendus de prise des greffons et de reconstitution du syst?me immunitaire humain. Ces param?tres ont ?t? pris en compte afin d??viter de r?p?ter les exp?riences et de limiter l?utilisation d?animaux suppl?mentaires. Le nombre d?animaux par groupe a ?t? limit? au strict n?cessaire pour obtenir des r?sultats scientifiquement exploitables tout en tenant compte de la variabilit? li?e aux tissus humains utilis?s. Le suivi de l?infection sera r?alis? de mani?re r?p?t?e chez les m?mes animaux gr?ce ? des techniques d?imagerie non invasives. Cette approche permet de limiter le nombre total d?animaux n?cessaires en r?duisant les comparaisons entre individus diff?rents. Le protocole exp?rimental a ?galement ?t? con?u afin de limiter le nombre de groupes exp?rimentaux et de r?duire autant que possible le recours ? des groupes t?moins suppl?mentaires.

Raffinement

Plusieurs mesures seront mises en place afin de limiter la douleur, le stress et les nuisances subies par les animaux tout au long du projet. Les souris seront h?berg?es dans des conditions adapt?es ? leur fragilit? immunitaire afin de limiter le risque d?infections. Elles seront maintenues en groupes sociaux autant que possible et b?n?ficieront d?un environnement enrichi pour r?duire le stress. Une p?riode d?acclimatation sera respect?e avant le d?but des proc?dures exp?rimentales. Les interventions chirurgicales seront r?alis?es sous anesth?sie g?n?rale avec administration syst?matique de traitements contre la douleur avant et apr?s la chirurgie. Les animaux seront surveill?s jusqu?? leur r?veil complet puis feront l?objet d?un suivi r?gulier portant notamment sur leur ?tat g?n?ral, leur comportement, leur poids et la cicatrisation. Les techniques utilis?es ont ?t? choisies afin de limiter la dur?e des interventions et les complications. Les s?ances d?imagerie seront r?alis?es sous anesth?sie br?ve afin de limiter le stress li? aux manipulations. Des crit?res d?arr?t anticip? seront appliqu?s en cas de signes de souffrance ou d?alt?ration de l??tat g?n?ral afin de permettre une prise en charge adapt?e ou une euthanasie si n?cessaire.

Choix des espèces

La souris est un mod?le largement utilis? en recherche biom?dicale, notamment pour l??tude du syst?me immunitaire et des maladies infectieuses. Elle permet de r?aliser des ?tudes reproductibles dans un organisme vivant tout en limitant le nombre d?animaux n?cessaires. Les souris utilis?es dans ce projet pr?sentent un d?ficit important du syst?me immunitaire, ce qui permet l?implantation de tissus humains et, dans certains cas, la reconstitution d?un syst?me immunitaire humain. Ce mod?le est particuli?rement adapt? ? l??tude du cytom?galovirus humain, un virus qui infecte uniquement les cellules humaines et ne peut donc pas ?tre ?tudi? correctement dans des souris classiques. Cette souche permet ?galement l?implantation de cellules humaines sans recourir ? certaines proc?dures plus invasives habituellement n?cessaires dans d?autres mod?les, ce qui contribue ? limiter les nuisances pour les animaux. Les animaux seront inclus dans les proc?dures exp?rimentales ? l??ge de 8 ? 10 semaines, ?ge auquel leur d?veloppement et leur ?tat physiologique permettent de supporter les interventions chirurgicales dans de bonnes conditions. Selon les proc?dures exp?rimentales, les animaux pourront ?tre suivis pendant plusieurs mois afin de permettre la stabilisation des tissus humains implant?s, la reconstitution du syst?me immunitaire humain et le suivi de l?infection. Au maximum, les souris seront ag?es de 9 mois en fin de proc?dure.

Une partie des souris reçoit dans le cerveau des molécules destinées à y produire un stress oxydant, après une opération de vingt minutes sous anesthésie, puis passe jusqu'à deux heures sous les appareils d'imagerie. 472 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue, du sang étant prélevé sous anesthésie juste avant. Il s'agit de mettre au point des molécules qui deviennent visibles en imagerie quand un stress oxydant est présent, et d'évaluer leur toxicité en prélevant les tissus après la mort. Le résumé ne nomme ni les molécules injectées, ni la région du cerveau visée, ni la nature de l'opération de vingt minutes, et ne dit pas combien de souris passent dans chacun des deux groupes.

Objectifs

Le stress oxydant correspond ? un d?s?quilibre dans l?organisme qui peut endommager les cellules et les tissus. Il joue un r?le important dans de nombreuses maladies fr?quentes comme les maladies cardiaques, certaines maladies c?r?brales ou encore les cancers. Aujourd?hui, il est difficile de d?tecter ce ph?nom?ne ? un stade pr?coce de ces maladies chez un ?tre vivant sans faire de pr?l?vements. Ce projet a pour objectif de d?velopper une nouvelle m?thode permettant de d?tecter ce stress oxydant de mani?re non invasive, c?est-?-dire sans avoir besoin d?effectuer un pr?l?vement ou une biopsie. Pour cela, nous utilisons des mol?cules sp?cialement con?ues pour devenir visibles en imagerie uniquement lorsqu?un stress oxydant est pr?sent. L??tude men?e chez la souris vise ? v?rifier si ces nouvelles mol?cules permettent de localiser et de mesurer ce ph?nom?ne dans le cerveau. Elle permettra ?galement d??valuer leur s?curit? d?utilisation. ? terme, ces travaux pourraient contribuer ? am?liorer le diagnostic pr?coce de certaines maladies et ? faciliter le d?veloppement de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de d?velopper de nouvelles mol?cules permettant de d?tecter le stress oxydant de mani?re non invasive, c?est-?-dire sans avoir besoin d?effectuer un pr?l?vement ou une biopsie. A court terme cette m?thode pourrait permettre de suivre un m?me individu dans le temps sans avoir recours ? des analyses n?cessitant de multiples pr?l?vements, ainsi qu?une m?thode plus fiable d??valuation du stress oxydant. Cela pourrait contribuer ? r?duire le nombre d?animaux utilis?s en recherche. ? plus long terme, cette approche pourrait am?liorer la compr?hension de nombreuses maladies fr?quentes, notamment celles qui touchent le cerveau, les maladies cardiovasculaires ou encore certains cancers. Elle pourrait aussi contribuer au d?veloppement de nouveaux traitements en permettant de mieux ?valuer leur efficacit?.

Procédures

Un groupe d'animaux subira seulement une injection de moins de 2 minutes. L'autre groupe sera soumis ? une proc?dure chirurgicale sous anesth?sie et analg?sie d'une dur?e de 20 minutes puis ? une injection et ? diff?rents examens d'imagerie non invasifs sous anesth?sie qui dureront au maximum deux heures. Pour l'ensemble des animaux, du sang sera pr?lev? sous anesth?sie g?n?rale et analg?sie (moins d'une minute) avant la mise ? mort.

Impact sur les animaux

L?injection dans le cerveau de mol?cules g?n?rant un stress oxydant cause un stress et une douleur l?g?re de courte dur?e. L?injection des mol?cules d?imagerie et l?administration d?analg?siques peuvent provoquer un stress et une douleur l?g?re de courte dur?e.

Devenir

L?ensemble des souris seront mises ? mort afin de pr?lever certains tissus pour des analyses permettant d??valuer l??ventuelle toxicit? des mol?cules utilis?es pour l?imagerie, ainsi que la r?partition de ces mol?cules dans diff?rents organes et tissus (en plus du cerveau).

Remplacement

Des ?tudes ont d?abord ?t? r?alis?es en laboratoire sur des cellules afin de v?rifier que les mol?cules utilis?es ne sont pas toxiques et pour s?lectionner les plus prometteuses. Cependant, ces mod?les ne permettent pas de reproduire le fonctionnement complet d?un organisme vivant. Ils ne permettent pas non plus de savoir comment ces mol?cules se distribuent dans le corps ni d??valuer leur comportement dans le cerveau. M?me si leur capacit? ? d?tecter le stress oxydant a d?j? ?t? d?montr?e sur des cellules, il est n?cessaire de confirmer ces r?sultats dans un organisme vivant, o? ce ph?nom?ne peut ?tre reproduit de mani?re contr?l?e. ? l?heure actuelle, il n?existe pas de m?thode alternative permettant de r?pondre ? ces questions sans avoir recours ? l?animal.

Réduction

Les effectifs ont ?t? ramen?s au minimum permettant toutefois d?avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilis? un outil informatique pour calculer le nombre minimum d'animaux n?cessaire en utilisant les donn?es pr?liminaires.

Raffinement

Toutes les mesures sont mises en place pour limiter au maximum la douleur, le stress et l?inconfort des animaux. Les animaux re?oivent syst?matiquement des m?dicaments contre la douleur avant, pendant et apr?s les interventions. Les proc?dures chirurgicales et d?imagerie sont r?alis?es sous anesth?sie g?n?rale afin qu?ils ne ressentent pas de douleur ou de stress, et une anesth?sie locale est ?galement mise en place avant la chirurgie. Apr?s les interventions, les animaux sont surveill?s r?guli?rement jusqu?? leur r?veil, puis tout au long de l??tude afin de d?tecter rapidement tout signe de souffrance. Une grille de score est mise en place et des points limites adapt?s aux interventions ont ?t? d?finis afin de prendre en charge de mani?re pr?coce et adapt?e la douleur qui pourrait ?tre ressentie par les animaux inclus dans l??tude. En cas d?atteinte de points limites, une administration d?analg?sique sera mise en ?uvre. Enfin, des crit?res d?arr?t de souffrance ont ?galement ?t? d?termin?s et aboutiront ? la mise ? mort des animaux.

Choix des espèces

La souris est l'animal classiquement d?crit dans litt?rature pour ce type d?exp?rimentation. Dans ce projet, son utilisation est notamment li?e au fait que les ?quipements disponibles sont sp?cialement con?us pour des animaux de petite taille comme la souris ou le rat, et ne permettent pas d??tudier des esp?ces plus grandes. Une lign?e de souris ? pelage clair est utilis?e afin de faciliter les injections, qui sont ainsi plus facilement r?alis?es et moins stressantes pour les animaux. Enfin, des souris adultes pesant de 17 ? 22 g sont utilis?es car leur taille est adapt?e aux appareils d?imagerie employ?s, permettant de r?aliser les examens dans des conditions ad hoc.

Des femelles gestantes subissent une chirurgie abdominale sous anesthésie générale pour atteindre les embryons et y introduire du matériel génétique par électroporation, d'autres reçoivent des injections quotidiennes pendant six jours sur souris vigile. 3 388 souris sont utilisées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les souriceaux et les fœtus sont placés sous anesthésie générale sans réveil pour le prélèvement du cerveau, une mise à mort que le porteur qualifie d'"indispensable" faute d'imagerie atteignant la résolution cellulaire voulue. La chirurgie des mères est donnée pour "environ 45 minutes" dans la description des procédures, et "limitée à 30 minutes maximum" dans celle des mesures de raffinement.

Objectifs

Comment se construit notre c?blage c?r?bral ? Vous ?tes-vous d?j? demand? comment les milliards de cellules de notre cerveau parviennent ? se ranger exactement au bon endroit pour nous permettre de penser, de bouger ou de ressentir ? Tout se joue avant la naissance. Au stade embryonnaire, de jeunes cellules (les futurs neurones) naissent et entreprennent un v?ritable voyage pour rejoindre leur destination finale dans le syst?me nerveux. Pour se guider dans ce labyrinthe, ces cellules utilisent des signaux chimiques appel?s morphog?nes. Imaginez ces signaux comme des phares dont l'intensit? diminue avec la distance : selon qu'une cellule per?oit un signal fort ou faible, elle sait o? elle se trouve et ce qu'elle doit faire. Cependant, nous ignorons encore comment ces cellules apprennent ? interpr?ter ces messages qui changent tout au long de leur croissance. L'objectif de notre projet est de comprendre comment les cellules nerveuses modifient leur mani?re de r?pondre ? ces signaux pour construire une architecture c?r?brale parfaite. Pour cela, nous utilisons des outils biologiques pour introduire avec une pr?cision chirurgicale des instructions g?n?tiques dans certaines cellules. Cela nous permet d'activer ou d'?teindre certains g?nes interrupteurs. Les ciseaux g?n?tiques (CRISPR) : Nous modifions l'ADN pour observer comment une petite modification change le comportement de la cellule et son d?placement. Pourquoi est-ce important ? Comprendre ces m?canismes, qui restent encore aujourd'hui un myst?re pour la science, est essentiel. De nombreuses maladies, comme les troubles du spectre autistique, les malformations du cerveau ou certaines d?ficiences intellectuelles, trouvent leur origine dans un bug lors de ce voyage des cellules. En d?couvrant comment le syst?me nerveux se construit normalement, nous posons les bases de futurs traitements capables de r?parer ou de pr?venir ces anomalies pr?coces.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche explore les myst?res de la fabrication du syst?me nerveux. Gr?ce ? des technologies de pointe, nous voulons comprendre comment les cellules s'organisent pour cr?er un cerveau fonctionnel. 1. Une meilleure connaissance de nos origines (Court terme) Le cerveau se construit gr?ce ? des signaux complexes que les cellules doivent apprendre ? lire. En utilisant des outils de pr?cision, nous pouvons modifier localement certains g?nes. Cela nous permet d'identifier les moments cl?s o? une cellule d?cide de se d?placer ou de se transformer. L'objectif est de passer d'une simple observation ? une compr?hension r?elle du mode d'emploi du cerveau. 2. Des pistes pour soigner les maladies (Long terme) M?me si les retomb?es m?dicales prendront du temps, elles sont porteuses d'espoir : a) Comprendre les causes : Beaucoup de maladies (autisme, ?pilepsie, malformations) naissent d'un probl?me durant le d?veloppement de l'embryon. Nos travaux permettront de comprendre l'origine de ces troubles. b) R?parer avant la naissance : En testant ces outils g?n?tiques, nous pr?parons les traitements du futur. ? terme, il pourrait devenir possible de corriger des d?fauts de d?veloppement tr?s t?t. c) Nouvelles cibles : Nous identifierons des prot?ines cl?s qui serviront de cibles pour de futurs m?dicaments ou des outils de diagnostic.

Procédures

Des femelles gestantes peuvent ?tre soumises ? une chirurgie abdominale sous anesth?sie g?n?rale d'une dur?e d'environ 45 minutes. Une injection d'analg?sique est administr?e avant l'intervention, et un traitement analg?sique est poursuivi 24 ? 48 heures. Par ailleurs, d?autres femelles re?oivent ?galement des injections de substances sur animal vigile, d'une dur?e d'environ 30 secondes, en une fois ou quotidiennement pendant six jours. En fin de protocole, les souriceaux ou f?tus sont places sous anesth?sie g?n?rale sans r?veil avec et un traitement analg?sique, par une proc?dure d'environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de la chirurgie, des douleurs sont possibles en p?riode post-op?ratoire, correspondant ? la cicatrisation. L?anesth?sie utilis?e peut induire dans de rare cas une hypothermie, une d?tresse respiratoire, voire un arr?t cardiorespiratoire. L?injection d?agents pharmacologiques peut induire une p?ritonite au niveau du site d?injection. Enfin, la manipulation r?p?t?e des animaux peut provoquer un stress.

Devenir

L'ensemble des animaux utilis?s dans ce projet seront euthanasi?s ? l'issue des proc?dures. Cette euthanasie est indispensable car les objectifs scientifiques reposent sur l'analyse des tissus c?r?braux embryonnaires et postnataux, qui ne peuvent ?tre pr?lev?s que post mortem. Aucune technique d'imagerie non invasive ne permet aujourd'hui d'atteindre la r?solution cellulaire n?cessaire pour ?tudier le d?veloppement cortical chez la souris. Les analyses r?alis?es comprennent des coupes histologiques, des marquages par immunofluorescence, des dosages de lipides c?r?braux, des analyses d'expression g?nique et du s?quen?age ? l'?chelle cellulaire. Toutes ces approches requi?rent l'acc?s direct au tissu c?r?bral.

Remplacement

Pourquoi ne peut-on pas se passer d'animaux ? Avant d'utiliser des animaux, nous avons examin? toutes les alternatives possibles. Malheureusement, aucune ne permet de r?pondre ? nos questions. Notre projet cherche ? comprendre comment les cellules s'organisent pour construire un cerveau fonctionnel. Ce processus repose sur des signaux chimiques qui se diffusent dans les tissus, sur des interactions complexes entre diff?rents types de cellules (neurones, cellules de soutien, vaisseaux sanguins), et sur une architecture en trois dimensions qui se met en place progressivement au cours de la grossesse. Or, les cultures de cellules en laboratoire, bien qu'utiles pour ?tudier des m?canismes isol?s, ne reproduisent ni cette organisation spatiale, ni ces interactions entre cellules. Les organo?des c?r?braux cultiv?s en laboratoire, repr?sentent une avanc?e prometteuse, mais ils ne poss?dent ni vaisseaux sanguins fonctionnels, ni l'organisation rigoureuse du cerveau r?el selon ses diff?rents axes. Ils ne permettent pas non plus d'?tudier les ?changes entre la m?re et l'embryon, notamment le passage de substances ? travers le placenta, qui est au c?ur de notre second volet de recherche. La mod?lisation informatique nous aide ? formuler des hypoth?ses, mais elle doit imp?rativement ?tre confront?e ? la r?alit? biologique pour ?tre valid?e. Le recours ? la souris est donc indispensable. C'est le mod?le de r?f?rence pour l'?tude du d?veloppement c?r?bral : sa grossesse est courte, son cerveau se d?veloppe de mani?re tr?s similaire ? celui de l'homme, et il existe des outils de manipulation g?n?tique ?prouv?s et sp?cifiquement adapt?s ? cette esp?ce. C'est le seul mod?le qui nous permet d'observer la construction du cerveau dans un organisme vivant complet, tout en restant au plus proche de la physiologie humaine.

Réduction

Comment avons-nous r?duit le nombre d'animaux au strict minimum ? Le nombre d'animaux a ?t? calcul? avec soin pour chaque exp?rience, en s'appuyant sur notre exp?rience pass?e et sur des m?thodes statistiques adapt?es. Pour la premi?re partie du projet, qui consiste ? modifier l'activit? de certains g?nes dans le cerveau d'embryons, la technique utilis?e ne fonctionne correctement que dans environ un tiers des cas. Nous avons tenu compte de ce taux de r?ussite pour calculer le nombre d'embryons n?cessaires, en veillant ? disposer de suffisamment d'animaux pour obtenir des r?sultats fiables sans en utiliser plus que n?cessaire. Par ailleurs, cette technique permet de tester le r?le d'un g?ne directement chez l'embryon, ce qui ?vite de cr?er des lign?es de souris g?n?tiquement modifi?es (une approche qui n?cessiterait beaucoup plus d'animaux sur plusieurs g?n?rations). Pour la seconde partie du projet, o? nous ?tudions l'effet d'un traitement sur la fabrication du cholest?rol dans le cerveau embryonnaire, nous avons adopt? une m?thode statistique avanc?e qui permet d'analyser chaque embryon individuellement tout en tenant compte du fait que les embryons d'une m?me m?re ne sont pas totalement ind?pendants. Cette approche nous a permis de r?duire de pr?s de moiti? le nombre de m?res n?cessaires par rapport ? une m?thode classique. De plus, nous analysons syst?matiquement tous les embryons de chaque port?e : aucun animal euthanasi? n'est perdu ou inutilis?, ce qui est en accord avec le principe de r?duction. Le nombre total d?animaux de ce projet est 3388.

Raffinement

Comment prenons-nous soin des animaux ? Tout au long du projet, nous mettons en ?uvre des mesures pour minimiser la douleur, le stress et l'inconfort des animaux. Toutes les interventions chirurgicales sont r?alis?es sous anesth?sie g?n?rale, avec un traitement contre la douleur administr? avant, pendant et apr?s l'op?ration. Un anesth?sique local est ?galement appliqu? au niveau de l'incision. Pendant l'op?ration, la temp?rature corporelle de l'animal est maintenue gr?ce ? un tapis chauffant, et les yeux sont prot?g?s par un gel pour ?viter le dess?chement. La dur?e de la chirurgie est limit?e ? 30 minutes maximum. Apr?s l'op?ration, les animaux sont plac?s sur un tapis chauffant pour leur r?veil et surveill?s ?troitement deux fois par jour pendant 48 heures. Un aliment enrichi est mis ? leur disposition d?s la veille de l'intervention. Pour les injections quotidiennes (seconde partie du projet), nous utilisons des aiguilles tr?s fines et une technique adapt?e aux femelles en gestation, afin de rendre le geste le plus bref et le moins stressant possible. Chaque manipulation dure moins de deux minutes. Dans les deux cas, les animaux sont h?berg?s dans des conditions optimales : cages ventil?es, liti?re adapt?e, mat?riel de nidification, temp?rature et humidit? contr?l?es. Les femelles en gestation b?n?ficient d'un compl?ment alimentaire. Une grille de suivi du bien-?tre est appliqu?e quotidiennement : poids, ?tat du pelage, comportement, signes de douleur. Tout animal pr?sentant des signes de souffrance significatifs est imm?diatement pris en charge ou, si n?cessaire, exclu du protocole et euthanasi? de mani?re rapide et indolore afin de lui ?viter toute souffrance prolong?e.

Choix des espèces

Chez la souris, la gestation est courte et chaque port?e compte beaucoup de petits. Autre avantage : au sein d'une m?me port?e, on trouve ? la fois les souris que l'on veut ?tudier (dites mutantes) et leurs fr?res et s?urs normaux (les contr?les). Comparer des animaux issus de la m?me port?e rend les r?sultats plus fiables, car ils partagent le m?me patrimoine g?n?tique et le m?me environnement. Le d?veloppement du cerveau de la souris est par ailleurs tr?s bien connu, ce qui facilite les ?tudes d'anatomie et de fonctionnement et aide ? rep?rer des effets nets et reproductibles. Surtout, la formation du syst?me nerveux chez l'embryon de souris ressemble beaucoup ? celle de l'humain : c'est ce qui en fait un excellent mod?le pour comprendre ce qui se passe chez nous. Pour ?tudier le r?le des g?nes pendant cette formation, nous utilisons l'?lectroporation. C?est une technique mise au point chez la souris qui permet d'introduire du mat?riel g?n?tique directement dans le cerveau de l'embryon. La m?thode est simple, rapide et efficace, elle ab?me peu les cellules, et elle pr?sente un avantage ?thique majeur : en traitant environ 6 embryons par port?e, elle n?cessite beaucoup moins d'animaux adultes que la cr?ation d'une lign?e g?n?tiquement modifi?e classique. Nous examinerons ensuite les effets de ces modifications ? plusieurs moments du d?veloppement : soit chez l'embryon (aux 14ieme, 15ieme et 16ieme jours de gestation), soit chez le souriceau apr?s la naissance. Ce suivi ? diff?rents stades est indispensable, car les mol?cules que nous ?tudions (les morphog?nes et leurs r?cepteurs) ne jouent pas le m?me r?le d'un stade ? l'autre : leur action ?volue au fil du d?veloppement. Il faut donc observer chaque ?tape pr?cis?ment pour comprendre l'ensemble de leurs fonctions.

Exposées à l'acide perfluorooctanesulfonique dans leur eau de boisson du quinzième jour de gestation au vingt-et-unième jour après la naissance, des souris femelles transmettent ce polluant à leurs petits. Devenus adultes à 90 jours, une partie de ces souriceaux reçoit pendant six semaines une molécule mélangée à une nourriture en poudre pour détruire leur myéline, avec perte de poids, baisse d'activité et risque de défaut d'usure des dents, puis deux séances d'IRM d'une heure sous anesthésie générale. 276 souris sont utilisées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées à la fin pour les prélèvements de tissus, le porteur précisant que les mères ne peuvent pas être réutilisées "en raison de leur exposition à l'acide perfluorooctanesulfonique (PFOS)".

Objectifs

La scl?rose en plaques est une maladie du syst?me nerveux qui touche de plus en plus de personnes dans les pays d?velopp?s. Elle se caract?rise par une d?gradation progressive de la my?line, une substance qui entoure les fibres nerveuses et permet la transmission rapide des signaux dans le cerveau et la moelle ?pini?re. Si les causes exactes de cette maladie ne sont pas encore compl?tement connues, certains facteurs environnementaux pourraient jouer un r?le dans son apparition ou son aggravation. Ce projet vise ? ?tudier si une exposition pr?coce ? un type de polluants chimiques tr?s r?pandus dans notre quotidien, appel?s PFAS (utilis?s par exemple dans les rev?tements antiadh?sifs ou les textiles d?perlants), peut perturber la formation ou la r?paration de la my?line. Ces polluants, tr?s persistants dans l?environnement, s?accumulent facilement dans les tissus gras comme la my?line, ce qui pourrait en fragiliser la structure et nuire ? son bon fonctionnement. Nous chercherons d?abord ? comprendre si l?un de ces compos?s, le PFOS, influence la formation de la my?line chez le souriceau apr?s une exposition pendant la gestation et l?allaitement. Nous ?tudierons ensuite si cette exposition pr?coce entra?ne des effets durables ? l??ge adulte, en particulier sur la stabilit? de la my?line et sa capacit? ? se r?parer. Pour cela, nous analyserons si le PFOS s?accumule dans les r?gions riches en my?line dans le cerveau et si cela modifie sa composition, en utilisant des m?thodes de pointe bas?es sur la chimie analytique. Les r?sultats pourraient aider ? mieux comprendre comment certains polluants environnementaux influencent le d?veloppement c?r?bral et participent ? des maladies neurod?g?n?ratives comme la scl?rose en plaques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d?apporter de nouvelles connaissances sur les effets potentiels d?une exposition pr?coce ? certains polluants pr?sents dans notre environnement sur la sant? du cerveau. En particulier, il pourrait aider ? mieux comprendre si et comment une exposition ? l?acide perfluorooctanesulfonique (PFOS), pendant la grossesse et les premi?res semaines de vie, perturbe la formation et la stabilit? de la gaine de my?line, qui prot?ge les fibres nerveuses. Une telle alt?ration pourrait rendre le syst?me nerveux plus vuln?rable ? certaines maladies, comme la scl?rose en plaques. Les r?sultats attendus pourraient permettre de mieux identifier les m?canismes par lesquels ces substances chimiques peuvent affecter durablement le fonctionnement du cerveau. Le projet permettra aussi de d?terminer ? partir de quelle concentration ces effets apparaissent chez la souris, ce qui est important pour ?valuer les risques pour la sant? humaine. Enfin, ces travaux pourraient alimenter des recommandations de sant? publique concernant l?exposition des femmes enceintes et des jeunes enfants ? ce type de polluants, et contribuer ? la compr?hension des maladies li?es ? une alt?ration de la my?line.

Procédures

Les femelles gestantes expos?es recevront de l?acide perfluorooctanesulfonique (PFOS) dans leur eau de boisson entre le quinzi?me jour de gestation et le vingt-et-uni?me jour post-natal. Une partie des souriceaux obtenus suite ? cette exposition ? l?acide perfluorooctanesulfonique (PFOS) recevra ? l??ge adulte et pendant 6 semaines une mol?cule dans leur nourriture afin d?induire une d?my?linisation. Une partie d?entre eux aura ensuite une imagerie par r?sonance magn?tique sous anesth?sie g?n?rale (60 minutes maximum, deux fois) pour suivre l??tendu des l?sions de la my?line.

Impact sur les animaux

Le mod?le de d?my?linisation pourra provoquer de mani?re temporaire une perte de poids ou une baisse d?activit? chez les animaux. La modification de la texture de l?alimentation (poudre) pourra induire un risque de d?faut d?usure des dents des animaux. L?anesth?sie g?n?rale n?cessaire pour la r?alisation de l?imagerie par r?sonance magn?tique sera associ?e ? des risques d?hypothermie, de s?cheresse oculaire et de difficult?s cardiaque et respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasi?s en fin de proc?dure d?une part parce que des pr?l?vements de tissus post-mortem et des analyses sont n?cessaires pour r?pondre ? notre question scientifique. D?autre part les femelles ne pourront pas ?tre r?utilis?es en raison de leur exposition ? l?acide perfluorooctanesulfonique (PFOS).

Remplacement

Avant de recourir ? des exp?riences sur des animaux vivants, plusieurs ?tudes en laboratoire ont ?t? men?es sur des cellules en culture et des tissus isol?s du cerveau, ainsi que sur un mod?le animal alternatif, le t?tard de x?nope. Ces approches ont permis de d?montrer que l?acide perfluorooctanesulfonique (PFOS) perturbe la formation et la r?paration de la my?line ? court terme. Cependant, ces mod?les ne permettent pas de reproduire les conditions r?elles d?exposition, comme cela peut survenir pendant le d?veloppement chez un individu vivant. Ils ne permettent pas non plus d??tudier l?accumulation du polluant dans le cerveau ni ses effets ? long terme sur la structure de la my?line. Nous aurons donc recours ? la souris, une esp?ce chez laquelle la composition de la my?line est bien connue, ce qui permet de faire des analyses pr?cises et fiables. Ce choix s?appuie directement sur les limites identifi?es dans nos approches pr?c?dentes. Il s?agit d?un prolongement n?cessaire pour r?pondre ? une nouvelle question scientifique, en s?appuyant sur un mod?le physiologique complet. Le recours ? l?animal est donc justifi? ici puisque les autres mod?les ne permettent pas de r?pondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre d?animaux par groupe a ?t? optimis? en s?appuyant sur nos exp?riences ant?rieures, avec un effectif r?duit mais suffisant pour obtenir des r?sultats robustes et tenir compte de la variabilit? biologique entre individus. Les groupes exp?rimentaux incluent ? chaque fois des m?les et des femelles, ce qui permet d??valuer les ?ventuelles diff?rences li?es au sexe sans multiplier le nombre d?animaux. Le protocole inclut une r?partition ?quilibr?e entre m?les et femelles, afin d??viter d?avoir ? multiplier les groupes dans des exp?riences distinctes. Au total, 276 souris seront utilis?es dans ce projet. Ce chiffre tient compte d?une l?g?re marge de s?curit? pour pallier la variabilit? naturelle du nombre de petits par port?e notamment. L?ensemble de ces choix refl?te un souci constant de limiter l?utilisation d?animaux tout en garantissant la qualit? scientifique des donn?es. Pour analyser nos r?sultats sans compromettre la pr?cision statistique, nous utiliserons une m?thode adapt?e aux petits ?chantillons qui garantira la robustesse de nos conclusions.

Raffinement

Les animaux b?n?ficieront d?un enrichissement de leur environnement (carr? de coton, b?tonnets de bois ? ronger). Ils seront observ?s quotidiennement par l??quipe zootechnique et 2 fois par semaine minimum par notre ?quipe. En cas d'anomalie celle-ci sera g?r?e en collaboration entre notre ?quipe, la Structure charg?e du Bien Etre Animal (SBEA) et le v?t?rinaire afin de mettre en place une prise en charge adapt?e pour l?animal. Des points limites sont d?finis et seront respect?s pour ?viter toute souffrance animale. Les femelles gestantes et en lactation d?un m?me groupe de traitement seront plac?es en duo par cage, afin d??viter tout isolement social, favoriser les comportements naturels de nidification et permettre une entraide maternelle pendant la lactation. Apr?s deux jours d?acclimatation, valid?s par le SBEA, l?exposition d?butera au quinzi?me jour de gestation (jour embryonnaire 15, E15). Cette organisation permet de garantir la gestation des femelles tout en limitant le nombre d?animaux n?cessaires au projet. Ce sch?ma exp?rimental a d?j? ?t? utilis? sans effet d?l?t?re observ? chez les femelles gestantes ni sur le d?veloppement des port?es. Elles seront pes?es ? leur arriv?e puis 5 jours apr?s afin de suivre le bon d?roul? de la gestation mais ne seront pas plus manipul?es afin de r?duire au maximum le stress g?n?r? par les manipulations. A leur naissance, une v?rification visuelle des petits sera r?alis?e pour s?assurer de leur bonne prise en charge par leur m?re puis ils seront pes?s 1 ? 2 fois par semaine ? partir de 7 jours d??ge afin de nous assurer qu?ils ne pr?sentent pas de croissance anormale et, ou, difficult?s ? s?alimenter. A partir de leur sevrage ils seront peser et et surveiller hebdomadairement en plus de l?observation quotidienne. Pendant la d?my?linisation, l??tat g?n?ral et le poids des animaux seront surveill?s 1 fois par semaine minimum. Une transition alimentaire sera assur?e sur 48h pour que les animaux s?habituent ? la nourriture en poudre et un enrichissement suppl?mentaire sera ajout? dans la cage pour qu?ils puissent assurer leur comportement naturel de rongeur (ajout de b?tonnets de bois ? ronger suppl?mentaires). Lors des imageries, les animaux seront plac?s sous anesth?sie g?n?rale. Leur temp?rature corporelle sera maintenue pendant l'anesth?sie et un gel ophtalmique sera appliqu? pour ?viter toute s?cheresse oculaire. Nous v?rifierons la profondeur de l'anesth?sie et les surveillerons jusqu'? leur r?veil complet.

Choix des espèces

L?esp?ce choisie pour ce projet est la souris, qui est largement utilis?e en recherche scientifique. Ce mod?le pr?sente de nombreux avantages, tant sur le plan scientifique que pratique. Sur le plan scientifique, la souris est l?un des organismes les mieux connus : son g?nome a ?t? enti?rement s?quenc?, et de nombreux m?canismes li?s au d?veloppement du cerveau, ? la formation de la my?line et aux effets des substances polluantes ont ?t? d?crits. C?est ?galement l?esp?ce de r?f?rence pour l??tude des effets des perturbateurs endocriniens et pour l?analyse fine de la composition en lipides de la gaine de my?line. Enfin, elle est particuli?rement adapt?e pour l?utilisation du mod?le de d?my?linisation choisi ici et valid? pour ?tudier les m?canismes de perte et de r?paration de la my?line. Tous les protocoles que nous utilisons sont bien ma?tris?s pour cette esp?ce, ce qui r?duit les risques de complications et favorise son bien-?tre. Les animaux seront utilis?s ? diff?rents stades de d?veloppement, selon les objectifs de chaque exp?rience. Les femelles gestantes seront de jeunes adultes ?g?es d?environ trois mois afin d??tre sexuellement matures. L?exposition au PFOS sera faite ? partir du 15e jour de gestation jusqu?au 21e jour apr?s la naissance, ce qui correspond ? une p?riode particuli?rement sensible du d?veloppement c?r?bral. Pour les animaux expos?s pendant la gestation nous r?aliserons ensuite nos analyses ? diff?rents stades : tout d?abord 21 jours d??ge, un stade o? la formation de la my?line atteint un pic important chez la souris, cela permettant de mesurer pr?cis?ment l?accumulation du polluant et ses effets pr?coces. Puis dans un deuxi?me temps ? 90 jours d??ge, un stade adulte permettant d??valuer si les effets de l?exposition pr?coce persistent ? long terme, lorsque le cerveau a atteint un stade de maturit?. Pour le mod?le impliquant une d?my?linisation celle-ci sera r?alis?e ? partir de ce stade de 90 jours et pendant 6 semaines pour induire la perte de my?line, suivi d?une p?riode d?une semaine de r?cup?ration afin d??tudier les m?canismes de r?paration naturelle de cette gaine nerveuse.