Procédures légères
Génotypage et suivi d’un nouvel indicateur du cycle de l’azote dans un troupeau de vaches laitières croisées
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Pour caractériser la génétique d'un troupeau laitier croisé et suivre un isotope de l'azote depuis l'alimentation jusqu'aux sols, 128 bovins sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les prises de sang à la veine caudale concernent au maximum 70 génisses sur cinq ans, et jusqu'à 114 vaches subissent un prélèvement de fèces par mois, dix mois par an, réalisé par fouille rectale quand elles ne défèquent pas spontanément, chaque contention durant cinq minutes au plus. Des prélèvements de poils par rasage de la queue et des collectes d'urine par massage de la zone entre la vulve et le pis complètent le dispositif. Le résumé indique que les bovins restent dans le troupeau après chaque procédure, alors que les données structurées de la déclaration ne comptent que 100 réutilisations sur 128 et rangent les 28 bovins restants parmi ceux qui sont mis à mort.
Objectifs
Le projet vise à caractériser d’une part la génétique des vaches d’un système laitier agroécologique, et d’autre part d’étudier le potentiel d’un isotope naturel de l’azote à caractériser le cycle de l’azote dans ce système. Les objectifs généraux du système d’élevage sur lequel s’appuie ce projet sont de permettre aux éleveurs de vivre de leur système laitier dans un contexte de changement climatique, en économisant l’eau et l’énergie fossile, tout en contribuant à une agriculture durable, sur les plans économique, social et environnemental, et en favorisant le bien-être animal. La stratégie d’élevage a pour objectif de valoriser par le pâturage, les ressources fourragères diversifiées. Ainsi 2 périodes de vêlage, centrées sur les périodes de pousse de l’herbe (printemps et automne), ont été mises en place. La génétique des animaux a été diversifiée afin de produire du lait riche en matière utile, avec des vaches ayant de bonnes capacités de reproduction, moins sensibles aux maladies et bien adaptées au pâturage de ressources diversifiées. Pour cela, un croisement a été engagé entre 3 races aux complémentaires, la Holstein (bonne productrice), la Rouge Scandinave (fertile) et la Jersiaise (fertile, produisant un lait riche en matière utile et résistante à la chaleur). Par ailleurs, les lactations ont été allongées à 16 mois, avec un vêlage tous les 18 mois, alternativement au printemps et à l’automne pour chaque cohorte de naissance, afin d’allonger la carrière et la durée de vie productive des vaches. Les génisses vêlent à 2 ans pour limiter les périodes improductives. La caractérisation des animaux vise à mieux comprendre les liens entre leur génétique et leurs performances zootechniques ou leur santé, au sein d’un système agroécologique original et soumis à des canicules estivales de par sa localisation. Le second objectif du projet est d’évaluer l’utilisation d’une forme particulière de l’azote (un isotope) comme traceur pour suivre le devenir de cet élément dans le système d’élevage : depuis l’alimentation des vaches jusqu’aux déjections, aux effluents, au sol et aux plantes, afin de mieux comprendre la circulation et le recyclage de l’azote au sein de l’exploitation. Un meilleur recyclage de l’azote traduit une meilleure utilisation de cet élément au sein du système et permet de limiter les pertes vers l’environnement. Au niveau de l’animal, le suivi de ce traceur sera réalisé à partir d’échantillons de lait, de poils, d’urine et de fèces.
Bénéfices attendus
Les bénéfices globaux attendus du projet sont d’aider à accélérer et accompagner la transition agroécologique des élevages bovins laitiers soumis au changement climatique. La caractérisation de la génétique des animaux, associée aux données zootechniques, d’alimentation et sanitaires recueillies dans le cadre du suivi du troupeau, permettra d’étudier l’intérêt du croisement de race, du pâturage diversifié et des lactations allongées pour la santé des animaux, et leur capacité à produire du lait de qualité face aux aléas climatiques. Les résultats obtenus fourniront des recommandations concrètes (croisement de races, plan de vêlage, diversification de l’alimentation) pour accompagner la transition agroécologique des élevages bovins laitiers du principal bassin laitier français qui est situé au nord ouest de la France (Bretagne, Normandie, Pays de la Loire) et subira des conditions climatiques similaires à celles du site d’étude d’ici une dizaine d’années. Dans le cadre du projet sur l’azote, les résultats serviront à mieux comprendre le devenir de l’azote dans les systèmes de polyculture-élevage et à déterminer les systèmes limitant les pertes d’azote vers l’environnement. Les résultats permettront de déterminer l’intérêt de doser l’isotope d’azote dans les poils des ruminants, comme indicateur rapide et non-invasif des pertes en azote du système d’élevage.
Procédures
Durant les 5 années du projet, 1 prise de sang par animal et 1 prélèvement de fèces par mois et par animal auront lieu sur des animaux vigiles. Les prises de sang concerneront au maximum 70 génisses sur les 5 ans du projet (14 génisses par an), et la durée totale maximale d’une prise de sang sera de 5 minutes par animal, contention comprise. Les prélèvements de fèces concerneront au maximum 114 animaux sur les 5 ans du projet (12 vaches la première année puis au maximum 72 vaches pendant les 4 années suivantes, soit un total de 114 animaux différents sur les 5 ans, en prenant en compte l’entrée dans le troupeau laitier de 14 génisses maximum par an) avec 1 prélèvement par mois et par animal, au maximum 10 mois dans l’année. Dans les situations où les vaches ne défèqueraient pas spontanément, les prélèvements de fèces seront réalisés par fouille rectale. La durée totale maximale d’une fouille rectale sera de 5 minutes par animal, contention comprise. Sur ces 114 animaux, 56 pourront avoir une prise de sang durant les 5 ans du projet, en plus de la fouille rectale. Il s’agit des génisses entrant dans le troupeau laitier comme primipares à l’âge de 2 ans.
Impact sur les animaux
Les prises de sang (à la veine caudale) nécessiteront une contention de courte durée (5 minutes maximum) et pourront causer un inconfort léger au niveau du site d’introduction de l’aiguille au moment du prélèvement ainsi qu’un stress ponctuel. Les prélèvements de fèces (par fouille rectale, dans les situations où les animaux ne défèquent pas spontanément lors des prélèvements) nécessiteront une contention de courte durée (5 minutes maximum) et pourront causer un inconfort léger pour les animaux au moment de la manipulation du prélèvement. Dans le cas des prélèvements de poils (par rasage sur la queue), un inconfort très léger et bref lié au passage de la tondeuse est possible, la contention est limitée à 5 minutes au maximum. La collecte d’urine (par stimulation de la miction en massant la zone entre la vulve et le pis) nécessite une contention de courte durée (5 minutes maximum), il pourrait être ressenti un inconfort très léger et de courte durée.
Devenir
A la fin du projet, le troupeau d'OasYs constitué de 72 vaches laitières et 28 génisses poursuivra l’expérimentation système. Les animaux restent dans le troupeau après chaque procédure car il s’agit d’une expérimentation système menée à l’échelle de la ferme et sur le long-terme, et les nuisances prévues pour les animaux sont très légères.
Remplacement
L’expérimentation visant à fournir des solutions agroécologiques pour l’élevage bovin laitier en évaluant les performances d’un système mis en place grandeur nature, il n’est pas possible de remplacer les animaux par des études en laboratoire ou avec des modèles.
Réduction
Les prises de sang visent à caractériser la génétique de toutes les génisses entrant chaque année (14 animaux au maximum) dans le troupeau laitier du système d’élevage étudié. L’objectif est de documenter à terme tout le troupeau laitier, afin de pouvoir établir des liens entre les différents types de croisement et les performances zootechniques, la santé et l’alimentation des animaux. Cet effectif de génisses qui renouvelle le troupeau est limité au maximum en allongeant autant que possible la carrière des vaches. Ce sont entre 9 et 14 génisses qui entrent chaque année dans le troupeau laitier en fonction de la réussite à la reproduction des vaches. Le troupeau laitier est constitué d’un lot de 72 vaches laitières combinant en 2026, 9 types de croisement génétique sur 5 générations, des nombres de lactation allant de 1 à 6, et 3 niveaux de lactation (en lien avec les 2 périodes de vêlage et l’allongement des lactations). Il n’est donc pas possible de réduire davantage l’effectif si l’on veut pouvoir étudier l’interaction entre tous ces facteurs. Par ailleurs, l’effectif du troupeau laitier (72 vaches) correspond à celui classiquement présent dans les élevages de la région. Dans le cadre de l’expérimentation sur l’azote qui utilise les animaux du système d’élevage étudié, le nombre d’animaux considérés sera dans un premier temps réduit à 12 vaches laitières pour les prélèvements de fèces. Si les dosages de l’isotope de l’azote montrent des différences entre type de croisement ou nombre de lactation, c’est tout le troupeau qui pourra être prélevé durant la durée du projet.
Raffinement
Nous indiquons ici à la fois le raffinement mis en place globalement sur le troupeau du système étudié et celui lié plus spécifiquement au projet d’étude génétique et du cycle de l’azote. De nombreux leviers ont été mis en place sur le troupeau du système étudié pour favoriser le bien-être animal. En premier lieu, les animaux sont maintenus en groupe social avec un lot de vaches laitières, un lot de petites génisses et un lot de génisses et vaches taries. De plus, les animaux disposent d’une alimentation avec des fourrages diversifiés que ce soit à l’auge ou au pâturage, qui leur permet d’exprimer leurs choix alimentaires, leur curiosité et de satisfaire leur envie de diversité alimentaire. Par ailleurs, les vaches sortent pâturer en moyenne 300 jours par an, ce qui leur permet d’exprimer leur comportement naturel en matière d’alimentation, de couchage et d’interaction avec leurs congénères. Le faible taux de chargement, limité à environ 1 vache/ha contre plus de 2 vaches/ha dans les systèmes classiques, permet de limiter la compétition alimentaire entre les animaux. La diversification au pâturage repose à la fois sur des prairies et des couverts herbacés diversifiés, mais également sur des arbres, arbustes ou lianes fourragères, contre lesquels les animaux peuvent aussi se frotter ou qui peuvent leur servir d’ombrage. En été, lorsque les températures dépassent 30°C, les vaches restent à l’étable durant la journée, puis si les températures extérieures sont plus clémentes que celles à l’intérieur des bâtiments, elles sortent pâturer en fin de journée et jusqu’à la traite du matin. Toutes les parcelles sont bordées de haies qui peuvent servir d’abri en cas d’intempérie. Les animaux ont un accès permanent à l’eau que ce soit à l’étable ou au pâturage. Enfin l’étable est munie de brosses et les logettes comportent des tapis avec de la sciure. L’ensemble des prélèvements du projet (sang, poils, fèces, urines) est réalisé en cage de contention. Lors de ces prélèvements, l’animal reste au maximum 5 minutes dans la cage de contention. Les animaux sont habitués à passer dans la cage de contention car ils y sont pesés tous les mois. Les prélèvements de fèces ne seront réalisés par fouille rectale que si les animaux ne défèquent pas spontanément. Les animaux sont par ailleurs habitués aux animaliers qui s’en occupent quotidiennement, pour leur alimentation ou pour la traite.
Choix des espèces
Nous travaillons directement sur l’espèce animale d’élevage (bovins laitiers) répondant à notre question scientifique et aux attentes des éleveurs et éleveuses. L’expérimentation est réalisée à l’échelle de la ferme et elle comporte pour cela des animaux de leur naissance à leur réforme. Cela permet d’étudier le fonctionnement et de fournir des résultats sur un système bovin laitier en prenant en compte toute la durée de vie des vaches laitières. Cela permet également de pouvoir comparer les résultats à ceux obtenus sur des fermes commerciales. Les prises de sang sont réalisées sur des génisses entre 6 et 15 mois, afin de conserver leur génétique rapidement et avant une sortie anticipée du troupeau qui pourrait survenir suite à d’éventuels problèmes de santé. Les fouilles rectales sont réalisées sur des vaches ayant vêlé afin de faire un lien entre alimentation ou conditions environnementales et production laitière.
Plateforme préclinique de modélisation des réactions allergiques chez la souris [MODIFICATION]
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
14 500 souris sont utilisées sur trois ans pour 465 études précliniques, soit 100 à 400 souris par molécule testée, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles sont sensibilisées à des allergènes puis soumises à une épreuve qui peut déclencher un choc anaphylactique, avec hypothermie, démangeaisons, gonflements et troubles respiratoires, certaines lignées étant humanisées par greffe de cellules humaines. 12 400 sont tuées, le porteur indiquant qu'elles "ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général" après avoir reçu des candidats médicaments, et 2 100 passent au projet de formation interne aux gestes techniques, ce qui évite d'en commander pour la formation. L'effectif ne repose sur aucun calcul de puissance, le porteur écrivant qu'"Aucune approche statistique n'a été réalisée", l'estimation venant des études des années antérieures et d'une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial".
Objectifs
Les allergies médiées par les immunoglobulines E (IgE), ou hypersensibilités, sont des réactions immunitaires exagérées à des antigènes environnementaux inoffensifs tels que des allergènes alimentaires, des pollens, des acariens ou encore des venins. Ces réactions peuvent aller de simples manifestations locales (urticaire, rhinite) à des manifestations systémiques graves telles que l’anaphylaxie. L’hypersensibilité de type I, aussi appelée réaction allergique immédiate, est une réponse immunitaire excessive qui se produit rapidement (quelques minutes) après l’exposition à un allergène chez une personne sensibilisée. Conséquences : inflammation, rougeur, démangeaisons, œdème, bronchoconstriction, etc. L’hypersensibilité de type IV, aussi appelée hypersensibilité retardée, est une réaction immunitaire cellulaire qui se manifeste 24 à 72 heures après l’exposition à un antigène. Conséquences : infiltration cellulaire, œdème, rougeur, induration. La compréhension des mécanismes de l’hypersensibilité de type I et IV et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques nécessite le développement de modèles précliniques fiables, reproductibles et transposables à l’homme. L'objectif principal de ce projet est de développer et caractériser différents modèles murins d’allergie médiée par les IgE et les lymphocytes T, en utilisant des souris conventionnelles non-humanisées ou humanisées (système immunitaire ou foie) ou doublement humanisées (système immunitaire + foie ). Les modèles développés serviront à mimer les différentes formes de réactions allergiques, systémiques ou localisées, afin de mieux comprendre les réponses immunitaires et d’évaluer à terme des outils préventifs, prophylactiques ou thérapeutiques. Des souris « non allergiques » (non sensibilisées) pourront être utilisés afin de déterminer la pharmacocinétique / pharmacodynamique des candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à proposer une plateforme complète de modélisation préclinique des allergies médiées par les IgE, adaptée à l'étude des mécanismes immunologiques et à l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques. On entend par « une plateforme complète » toute la chaîne de valeur préclinique, dans une logique de personnalisation, qualité et efficacité scientifique, ne se limitant pas à la simple exécution technique d’un modèle. Cela repose sur une approche progressive, car les expériences peuvent débuter si nécessaire par l’utilisation de modèles murins classiques pour les phases exploratoires, puis intégrant des modèles humanisés uniquement lorsque cela est nécessaire pour affiner la pertinence des résultats dans un contexte proche de l’humain.
Procédures
Identification par puce électronique :2 fois maximum si puce non fonctionnelle ou perdue. Durée de quelques secondes. Administration : la fréquence dépend du protocole d’étude sauf pour les injections d’anticorps qui sera de 2 fois maximum. Chaque injection durera entre 10 et 15 secondes. Administration orale de l’allergène : 8-10 fois maximum. Chaque administration orale durera 20 secondes. Administration par nébulisation : la fréquence dépend du protocole d’étude, durée de 5 min maximum. Administration locale, par contact cutané, de l’allergène : 8-10 fois maximum. Chaque administration locale durera 20 secondes. Les volumes administrés seront proportionnels au poids de l’animal. Le nombre d’administration dépendra du traitement et de la voie d’administration choisie. Le suivi de la réponse anaphylactique se fera par un scoring allergique dans le cas d’allergie systémique active ou passive. Dans le cas d’allergie passive cutanée le suivi de la réponse allergique se fera par mesure de l’épaississement des oreilles, sous anesthésie, ainsi que par l’évaluation de la perméabilité vasculaire. Durée de 10 à 15 secondes. Afin de suivre l'évolution de la pathologie et d'objectiver les effets des molécules à visées thérapeutiques, des prises de sang seront réalisées. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire et figurera dans le protocolé d’étude.
Impact sur les animaux
-Identification par puce électronique classique ou thermopuce (prise de température) : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides : les nuisances attendues sont des hématomes et des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Administration de traitements : il n’y a pas de nuisances attendues, mais il existe un risque d’observer des effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées. - Prélèvements sanguins : il n’y a pas de nuisance attendue mais un risque d’anémie, d’hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne. -Prise de température corporelle à l’aide d’une sonde : irritation, inflammation, stress. Le challenge est également susceptible d’induire une réaction allergique ou un choc anaphylactique pouvant se manifester notamment par une hypothermie, la présence de démangeaisons, de gonflements, de problèmes respiratoires et un impact sur l’activité de la souris. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés car ils auront reçu des candidats médicaments pour lesquels un impact négatif sur la santé des souris ne peut être exclu. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de ce projet pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Cette réutilisation permet de ne pas commander des souris spécifiquement pour la formation mais d’utiliser nos souris déjà présentes.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer, in vitro, un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer les réactions physiologiques humaines responsables de la mise en place d’une allergie, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques de médicaments en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de traitements innovants pour les patients.
Réduction
Un total de [MODIFICATION] 14 500 souris seront utilisées, couvrant une période de [MODIFICATION] 3 ans, permettant de réaliser 465 études précliniques. Le nombre de souris par étude sera de 5 à 10 individus par groupe (pour faire face à la variabilité du modèle), avec un minimum de 4 groupes (1 groupe placebo et 3 groupes traités). Ce nombre total d’animaux inclut les groupes contrôles, les tests pilotes de validation de modèle, les répétitions inter-expérimentateurs et les pertes éventuelles. Il est prévu de tester approximativement entre 50 et 60 molécules de nature différente sur la durée de validité de ce projet. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum. Cette estimation permet de garantir la robustesse statistique des résultats tout en respectant le principe de Réduction, grâce à une mutualisation des groupes contrôles et des revalidations de modèles précédents. Chaque molécule nécessite entre 100 à 400 animaux selon le protocole expérimental (modèle local ou systémique, voie d’administration, durée, nombre de groupes, etc.)
Raffinement
En début d’étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées en cage ventilée, préférentiellement par groupe social stable composé de 5 individus. Des compléments alimentaires (ex : Diet Gel) pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Entre autres, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple des morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, tunnel en carton, kraft et/ou boules de coton. A leur entrée dans l’animalerie, les souris recevront une période d’acclimatation de 4 jours minimum. Les souris pourront recevoir des puces électroniques permettant de mesure la température corporelle afin d’éviter une prise rectale plus impactante. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique, du score d’allergie et de la perte de poids. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée ou tout score clinique et allergique ainsi que perte de poids dépassant les seuils définis.
Choix des espèces
90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. L’utilisation de modèles murins d’allergie au pollen a déjà été démontré dans la littérature scientifique. Poursuivre sur cette espèce est donc indiqué. De plus, lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain, ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente, permet la création de lignées humanisées. Pour les souris non humanisées les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur system immunitaire. Pour les souris humanisées les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.
Étude de l’effet des dérivés indoliques produits par une bactérie intestinale spécifique et par ses vésicules extracellulaires chez un modèle de souris atteint de colite.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Colonisées par une seule bactérie et hébergées en isolateur, les souris de ce projet sont inoculées à trois ou quatre semaines, avant la maturation de leur immunité. 104 souris sont utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles subissent jusqu'à sept gavages, un tous les deux jours, et 80 d'entre elles reçoivent pendant une semaine un traitement dans l'eau de boisson qui provoque une inflammation intestinale, avec diarrhées, déshydratation, perte de poids importante et hypothermie. Toutes sont mises à mort pour prélever des organes, et le porteur range parmi les débouchés attendus, à côté de la maladie de Crohn et de l'entérocolite nécrosante du nouveau-né, le "développement de compléments alimentaires".
Objectifs
De nombreuses bactéries de l’intestin sont capables de produire de petites particules appelées vésicules extracellulaires (EVs) capables de transporter des molécules au sein de l’organisme. Nous supposons que certaines molécules transportées par les EVs s pourraient avoir des effets bénéfiques notamment sur la résorption des colites chez la souris. Nous savons que certaines bactéries peuvent résorber les colites chez la souris notamment via l’acide indole-3-lactique (ILA). Cela a été démontré chez plusieurs bactéries, mais pas chez la bactérie étudiée qui est la bactérie prépondérante chez les nourrissons en bonne santé. L’objectif sera de démontrer que l’ILA produit par la bactérie étudiée favorise la résorption des colites tout en évaluant le potentiel postbiotique des EVs à compenser la carence en dérivés indoliques synthétisés par le microbiote intestinal dans le modèle murin. Un postbiotique est une préparation de microorganismes inanimés et/ou leurs composants qui confèrent à son hôte un bénéfice de santé.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre comment certaines molécules bénéfiques produites par les bactéries intestinales sont transportées dans l’organisme grâce aux vésicules extracellulaires. Ainsi, nous pourrons en apprendre davantage sur leurs bénéfices en santé, notamment dans les pathologies affectant l’intégrité et l’inflammation de l’intestin. Ces EVs pourront alors être utilisées comme postbiotique (préparation venant d’un micro-organisme inanimé ou leurs composants ayant un effet bénéfique sur la santé) afin de protéger l’intestin contre des pathologies qui le fragilisent (ex. maladie de Crohn, intestin irritable) ou qui peuvent conduire au décès chez les nouveau-nés (entérocolite nécrosante)… De plus, ces données pourraient permettre le développement de compléments alimentaires.
Procédures
Tous les animaux vigiles seront soumis à des gavages réguliers (tous les 2 jours et avec un maximum de 7 gavages). Cela peut entraîner un stress de courte durée (1 à 2 min). 80 animaux (au maximum) seront également soumis à un traitement dans l’eau de boisson entraînant une inflammation intestinale pendant 1 semaine. Cela peut entraîner une perte de poids et une déshydratation. Les prélèvements de fèces, seront effectués 4 fois sur 64 animaux. Ils entrainent un léger stress de 2 à 5 minutes.
Impact sur les animaux
L’inflammation intestinale induite par l’administration d’un traitement dans l’eau de boisson est associée à des effets indésirables attendus (douleurs). Elle peut entraîner des diarrhées entraînant une déshydratation et une perte de poids importante ainsi qu’une hypothermie. Ce traitement durera une semaine. Le gavage (moins de 2 minutes) et la mise dans les pots transparents pour prélever les pellets fécaux (moins de 5 minutes) peuvent entraîner un léger stress de courte durée. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour le reste du projet. La bactérie étudiée et ses vésicules extracellulaires sont présentes naturellement dans le microbiote intestinal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en vue de prélèvements d’organes.
Remplacement
Ce projet vise à déterminer l’effet de l’inoculation d’une souche bactérienne produisant ou non des dérivés indoliques, ainsi que l’effet compensatoire des vésicules extracellulaires de cette même souche sur différents organes lors d’une inflammation intestinale. Des études préliminaires in vitro sur une lignée épithéliale inflammée ont montré que les EVs de cette bactérie avaient des effets anti-inflammatoires. Pour connaître leurs capacités à résorber ou freiner le développement d’une inflammation liée à une pathologie, ainsi que leur circulation dans le corps, l’utilisation d’animaux est donc nécessaire pour atteindre notre objectif. En effet, à ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico assez complexe n’est disponible pour analyser ces effets, notamment sur le cerveau qui est un organe très complexe. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire pour atteindre notre objectif.
Réduction
Pour les études préliminaires nous utiliserons 8 animaux par groupe, ce qui sera un nombre suffisant pour observer les effets du composé testé et pour la détection de la fluorescence. Le nombre minimal d’animaux à utiliser pour répondre aux questions posées a été déterminé par une analyse de puissance basée sur un test statistique. En considérant un risque alpha de 5% et une puissance statistique de 80%, un effectif de 16 animaux par groupe est nécessaire pour le projet. Chaque groupe comprend 8 mâles et 8 femelles afin de tenir compte de l’effet potentiel du sexe. De plus, il s’agit d’un projet utilisant des souris colonisées par une seule bactérie donc en cas de contamination nous devrions recommencer totalement un lot expérimental. Pour cela, nous ajoutons 16 animaux afin de pouvoir refaire un groupe en cas de contamination. Cela fait un total de 104 animaux utilisés pour ce projet.
Raffinement
Avant le début de chaque procédure, les souris auront une semaine d’acclimatation aux isolateurs expérimentaux pendant laquelle ils seront habitués aux manipulations. Il y aura une observation quotidienne des animaux, une observation individuelle hebdomadaire à l’occasion des interventions d’entretien (change des cages, etc…) et une observation accrue (plusieurs fois par jour) durant les inoculations orales et l’inflammation intestinale susceptible d’entrainer de la douleur, de la souffrance ou du stress. L’enrichissement de nidification sera également augmenté, et de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans la cage pendant le traitement inflammatoire. Une grille de score a été définie pour évaluer l’état des souris. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués si nécessaire. Les animaux seront hébergés en isolateur dans des cages standards par groupe de sexe identique (4 par cage). Du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des tunnels en plastique seront ajoutés dans les cages.
Choix des espèces
La souris à microbiote contrôlé est un modèle établi pour les recherches sur le microbiote intestinal avec une pertinence démontrée pour la physiologie humaine. Les animaux utilisés seront agés de 3-4 semaines lors de l’inoculation de la bactérie car l’objectif est d’étudier l’impact de molécules et vésicules dérivées du microbiote chez les jeunes individus avant la maturation de leur immunité pour privilégier la réponse spécifique au DSS.
Afin de répondre aux exigences réglementaires de contrôle de qualité de vaccins vétérinaires bénéficiant d’une AMM, ce projet vise à confirmer l’activité de formulations vaccinales destinées aux porcs, au moyen de procédures de classe de gravité sévère.
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Les porcs témoins, qui ne reçoivent pas le vaccin, développent hyperthermie, anorexie, diarrhée suivie de méléna, amaigrissement, vomissements, ataxie et prostration après injection d'une souche virulente. 400 porcs sont utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère, à un âge de six à sept semaines pour l'épreuve de peste porcine classique. Ces épreuves servent à libérer des lots de vaccins vétérinaires déjà autorisés, la Pharmacopée Européenne et les réglementations des pays destinataires demandant des tests sur des animaux non-humains pour l'autorisation de mise sur le marché. Après avoir énuméré ces symptômes, le porteur conclut que "Ces tests garantissent la sûreté, l'efficacité et la qualité du produit pour les animaux".
Objectifs
Afin d’être en adéquation avec les exigences réglementaires de la Pharmacopée Européenne et des pays tiers destinataires dans la constitution du dossier d'autorisation de mise sur le marché, ce projet vise à déterminer l’activité de vaccins destinés à des porcs. Les contrôles d’activité par épreuve se basent sur le développement ou non de la pathologie après injection de la souche (les porcs vaccinés sont protégés). Ils sont effectués sur espèce cible. La Pharmacopée Européenne demande la démonstration de résultats, certains obtenus sur l’animal. Ces tests permettent la libération de milliers de vaccins pour porcs par an.
Bénéfices attendus
Ces tests permettent la libération de milliers de doses de vaccins améliorant considérablement la qualité sanitaire des élevages et la sécurité alimentaire des consommateurs.
Procédures
2 administrations sont prévues pour tous les animaux en vigile. L'acte dure moins d'une minute 1 prélèvement sanguin est prévu sur tous les animaux en vigile. L'acte dure moins d'une minute
Impact sur les animaux
Les témoins montrent les symptômes liés à la maladie infectieuse testée. Les dommages liés au test sont une souffrance pour les animaux témoins et une douleur légère avec une augmentation du stress due à des prélèvements, aux injections et aux manipulations. Chez les témoins, les symptômes les plus courants observés dans le cadre de ces tests sont l'hyperthermie, l’anorexie, la diarrhée suivie de méléna, un amaigrissement, des vomissements, des troubles nerveux (ataxie et agressivité) et une prostration. Ces tests garantissent la sûreté, l’efficacité et la qualité du produit pour les animaux.
Devenir
Les animaux non protégés sont euthanasiés pour effectuer des prélèvements post-mortem. Tous les autres animaux sont euthanasiés du fait de l'injection d'une souche virulente
Remplacement
La Pharmacopée Européenne et les réglementations des pays tiers destinataires du produit demandent des tests sur animaux pour l’AMM. Il n’est actuellement pas possible de les remplacer sans un changement de la réglementation de tous les pays.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est imposé par la réglementation des pays. La réduction du nombre est possible grâce à la mutualisation de groupes témoins.
Raffinement
Des points limites spécifiques aux pathologies sont définis. Le personnel vérifie l’évolution de l’état général et si les points limites spécifiques sont atteints. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les porcs sont hébergés en groupe et des enrichissements adaptés du milieu ont été mis en place dans les hébergements. Les porcs disposent de morceaux de chaînes, de bouts de tuyaux dans leur box pour pouvoir s’occuper. Il est aussi possible de mettre à disposition des jouets à macher et des balles. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
Ce choix résulte du fait que ce soit l’espèce cible. Les porcs doivent avoir entre 6 et 7 semaines pour le contrôle d’activité par épreuve de la peste porcine classique. Ce stade de développement correspond à celui requis pour répondre à la Pharmacopée Européenne et au dossier déposé aux autorités.
MODIFICATION Evaluation de la tolérance induite par des antigènes en vue de l’identification de nouveaux candidats vaccins pour la prévention des troubles allergiques
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Les souris dont le score clinique atteint un seuil jugé critique sont mises à mort avant la fin de l'étude, le porteur écartant les analgésiques au motif qu'ils "modifient la réponse immune étudiée". 5 200 souris sont utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles reçoivent un allergène alimentaire, arachide ou œuf, jusqu'à quatre fois pour les sensibiliser, puis subissent une épreuve allergique par voie orale, cutanée ou respiratoire, dont les effets déclarés vont jusqu'aux signes neurologiques et aux troubles respiratoires. Une partie sert de donneuse de cellules immunitaires ou de sérum à des souris receveuses déjà sensibilisées, l'ensemble visant l'essai clinique puis la mise sur le marché de préparations vaccinales.
Objectifs
Les allergies sont des réactions d’hypersensibilité à des substances, appelées allergènes, présentes dans l’environnement et qui sont normalement inoffensives car tolérés par le système immunitaire. Les réactions peuvent être diverses, des plus bénignes aux plus sévères. Les allergies correspondent à une perte de tolérance envers ces substances. La tolérance immunitaire se définit par la capacité du système immunitaire à ne pas manifester de réaction agressive vis-à-vis de certains antigènes avec lesquels il a été au préalable en contact. Le projet s’organise en 3 étapes, le développement des modèles d’allergie et l’évaluation, sur l’animal, de l’efficacité d’un candidat vaccin contre les troubles allergiques alimentaires connues chez l’homme. 1/Mise en place des modèles d’allergie alimentaire dit de sensibilisation à l’allergènes : dans un premier temps des études seront réalisées pour établir les modèles animaux afin de représenter la maladie d’intérêt dite « allergique » par exemple l’allergie aux arachides. Ces études permettront de définir entre autres les doses d’allergène générant d’une part la sensibilisation à l’allergène et d’autre part la réaction d’hypersensibilité qui seront inoculées chez l’animal ou encore la voie d’administration. 2/ étude d’évaluation des vaccins anti-allergies Une fois ces modèles d’allergies établies, des études d’évaluation de la capacité d’un vaccin à restaurer la tolérance contre ces allergènes alimentaires seront effectuées. Pour cela, les animaux recevront le candidat vaccin dont l’efficacité sera mesurée par le degré d’efficacité induit contre l’inoculation de l’allergène. ---------------- AJOUT :3/ Comprendre et documenter le mécanisme d’action d’un vaccin thérapeutique en opérant le transfert de populations de cellules immunitaires ou sérum d’une souris dite « donneuse », qui aura reçu préalablement le candidat vaccin ou un « placebo », vers une souris dite « receveuse », laquelle aura préalablement été sensibilisée à un allergène alimentaire (ex l’arachide, œufs...) La souris « receveuse » sera alors éprouvée par cet allergène. La réaction allergique sera monitorée et la réponse immunitaire sera analysée ex vivo. Il est attendu que le transfert de certaines cellules immunitaires ou sérum de la souris donneuse permettrait à la souris receveuse sensibilisée de ne pas développer de manifestations cliniques allergiques à la suite d’une épreuve.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont l’utilisation en essai clinique, et éventuellement la mise sur le marché, de différentes préparations vaccinales permettant de protéger efficacement les patients contre les troubles allergiques alimentaires et répondre aux besoins cliniques des patients. Ce projet permettra également, d’évaluer les nouvelles voies d’administration ou les nouvelles formes pharmaceutiques qui permettent d’améliorer la performance du vaccin tolérogène. Enfin, ce projet permet de comprendre les mécanismes d’action, la caractérisation de la réponse immunitaire dans le cadre d’hypersensibilité. La découverte de nouveaux candidats permettra de lutter contre les phénomènes croissants d’allergie alimentaire et de sauver des vies humaines dans le monde. ---------------------------------- AJOUT : Le développement de candidats vaccins tolérogènes constituerait une avancée majeure dans la lutte contre l’augmentation continue de la prévalence des allergies alimentaires. À terme, ces approches innovantes pourraient améliorer significativement la qualité de vie des patients, tout en réduisant le risque de réactions allergiques sévères, voire potentiellement mortelles, à l’échelle mondiale.
Procédures
Les études de tolérance consistent à administrer des vaccins dont la dose peut être unique ou multiple (un à six fois) sous différentes voies d’immunisation en vue de protéger contre une épreuve d’hypersensiblité par un allergène. La sensibilisation à l’allergène se fait par des doses répétées (deux à quatre fois). L'épreuve allergique est unique, plus rarement répétée. Plusieurs voies d'épreuve allergique en fonction du type d’allergie (orale, topique, respiratoire) peuvent être utilisées. Ces différents types d’injection durent moins d’une minute.
Impact sur les animaux
L’administration des candidats vaccins ou de traitements anti-allergiques génère des signes cliniques légers (réactogénicité locale avec principalement de l’érythème voire parfois un gonflement et une induration des tissus, rarement des poils hérissés et une perte de poids transitoire de moins de 10%). ---------------AJOUT / L’injection de cellules ou sérum par voie intraveineuse génère des signes cliniques légers FIN.-------------- Dans le cas de l’induction de l’allergie, en fonction du protocole appliqué, les effets indésirables sont légers à sévères (poils hérissés, baisse d’activité, hyper/hypothermie, signes neurologiques et troubles respiratoires et une perte de poids transitoire de moins de 15%). ------------AJOUT Ces signes seront surtout attendus dans les groupes de souris qui ne seront pas vacciné ou encore dans le cadre ayant reçu les cellules ou le sérum des souris « placebo ». FIN ---------------------Les nuisances associées aux prélèvements sont un inconfort local, il peut y avoir un petit hématome (prélèvement sanguin) en conséquence la contrainte représentée par les prélèvements est évaluée en degré léger.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés après épreuve allergique afin d’évaluer la réponse immune. Les volumes sanguins prélevés nécessaires ou le prélèvement d’organes ne permettant pas le maintien en survie des animaux. L’euthanasie pourra être pratiquée plus précocement en fonction du type de test, de l’évolution des signes cliniques et de l’expérience du technicien animalier ou de recherche pour abréger la souffrance.
Remplacement
Dans le cadre du développement de candidats vaccins ou de traitements anti-allergiques la réponse immunitaire ainsi que l'effet tolérogène doivent être évalués sur un organisme entier. Ainsi à ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro pour évaluer les capacités d’un vaccin ou d’un traitement anti-allergique à induire une tolérance contre un allergène, et reproduire la complexité des réponses cellulaires et humorales impliquées dans la mise en place d’une immunité contre un allergène. Le recours à l'animal de laboratoire s'avère donc nécessaire.
Réduction
Chaque étude est évaluée au plus juste et est revue par les biostatisticiens afin de définir le nombre minimum et suffisant d'animaux requis permettant une analyse statistique des résultats. Quelques soient les espèces, les scientifiques après revue bibliographique sur la maladie d’intérêt et en fonction du nombre de lots à tester élaborent le plan de l’étude. Afin de réduire le nombre de lots, ceux-ci sont d’abord présélectionnés en amont sur des modèles vitro existants. Le plan d’étude est revu par l’équipe de recherche qui comprend d’autres scientifiques ainsi que des biostatisticiens afin de revoir les groupes et le nombre d’animaux afin de le réduire à un nombre suffisant pour que l’étude soit robuste
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Pour chaque étude, une période d’acclimatation est prévue et permet de diminuer le stress des animaux avant les épreuves. L’ensemble des contentions et des gestes techniques sont réalisés par du personnel qualifié. En fonction de l’allergène, une grille d'évaluation des signes cliniques post-induction sera mise en place entre le responsable d'étude, les biostatisticiens et les vétérinaires cliniciens. Cette grille permet d’évaluer le niveau de souffrance des animaux selon des critères cliniques spécifiques de l’allergène, par un personnel spécifiquement formé. Dès que le score atteint un seuil jugé critique, les animaux sont euthanasiés avant la fin de l'étude pour abréger leur souffrance. Les autres options de traitement des points limites sont malheureusement exclues car les analgésiques modifient la réponse immune étudiée Des points limites sont mis en place et seront appliqués. Ainsi, un suivi clinique quotidien 7/7 jours est réalisé tout au long de l’étude, avec surveillance du poids. La voie, la fréquence et le volume des prélèvements sont conformes aux pratiques en vigueur décrites dans le module interne de formation aux manipulations. En fonction des voies, des anesthésiques sont utilisés.
Choix des espèces
La souris est sélectionnée du fait des modèles d’allergie décrits dans la littérature et des connaissances scientifiques. D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : taille des animaux, disponibilité des outils immunologiques adaptés à l’espèce (cytokines, marqueurs cellulaires…).
Etude des effets cérébraux de l’induction de troubles du spectre autistique par exposition précoce à un polluant chez le rat (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour mesurer les effets cérébraux d'un retardateur de flamme soupçonné de provoquer des troubles du spectre autistique, 30 rates gestantes reçoivent le polluant par gavage quotidien pendant 42 jours, sur toute la gestation et la lactation, et 362 rats en tout sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Leurs descendants passent un test d'activité de 72 heures, un test d'anxiété de 10 minutes et un test d'interactions sociales de 30 minutes, puis une séance d'imagerie cérébrale sous anesthésie après injection d'un traceur radioactif, à jeun. Les portées de plus de dix ratons sont réduites, les surnuméraires tirés au sort étant déplacés vers d'autres portées ou tués pour prélèvement de tissus. 300 rats sont mis à mort à 10, 21 ou 80 jours de vie, et 62 autres, les 32 ayant passé le test de sociabilité et les 30 femelles reproductrices, sont maintenus en vie pour être réaffectés à d'autres projets.
Objectifs
Les Troubles du Spectre Autistique se caractérisent par des difficultés de communication et des comportements répétitifs. La génétique n'explique que 25 % des cas, ce qui suggère que des facteurs environnementaux, comme les polluants chimiques, jouent un rôle important. Les retardateurs de flamme sont identifiés comme substances préoccupantes en raison de leurs effets toxiques pour le cerveau. Des recherches précédentes ont montré que l'exposition à un de ces polluants pendant la gestation et la lactation provoque des comportements autistiques et des altérations cérébrales chez les jeunes rats, comparables à celles observées dans un modèle d’autisme induit par un médicament utilisé comme modèle de référence. Ces dommages comprennent une inflammation du cerveau et des changements dans la façon dont les cellules nerveuses communiquent entre elles. Pour étudier plus en détail ces effets, ce projet visera à utiliser une technique d'imagerie chez des jeunes rats exposés à ce polluant ou au médicament de référence. Un traceur sera utilisé pour mesurer l'activité métabolique du cerveau afin de mieux comprendre les mécanismes cérébraux associés à ces troubles. Des prélèvements seront effectués à plusieurs âges afin de suivre l’évolution de cette activité et de l’inflammation au cours de la maturation cérébrale et de l’installation des comportements de type autistique. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs, l’animalerie 1/2 sera en charge de la mise en place du modèle animal et l’animalerie 2/2 de l’imagerie cérébrale.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les effets d’un polluant chimique sur le développement du cerveau. Il permettra d’identifier, à l’échelle du cerveau entier, les régions et les fonctions cérébrales pouvant être altérées après une exposition, ainsi que les liens possibles entre ces différentes modifications. Les connaissances obtenues contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans les Troubles du Spectre Autistique. À plus long terme, ces résultats pourront soutenir la mise en place de mesures de prévention adaptées, en particulier pour les populations les plus vulnérables telles que les femmes enceintes et les jeunes enfants.
Procédures
Femelles gestantes : Administration quotidienne par gavage (1 minute) du polluant ou de l’huile servant de contrôle pendant 42 jours, couvrant les périodes de gestation et de lactation. Injection (30 secondes) du médicament de référence induisant des troubles du spectre autistique ou du contrôle (eau injectable) une seule fois au 12ème jour de gestation. Descendants : La réalisation des tests comportementaux pour évaluer les niveaux d’activité (1 fois, 72 heures), d’anxiété (1 fois, 10 minutes) et d’interactions sociales (1 fois, 30 minutes). Imagerie cérébrale : Une séance d'imagerie cérébrale sous anesthésie (1 fois, 30 minutes) après administration d’un traceur radioactif (1 fois, 5 minutes d’anesthésie), pour mesurer l’activité métabolique cérébrale.
Impact sur les animaux
Les nuisances/effets indésirables attendus sont les suivants : Pour les femelles gestantes : La piqure d’aiguille pour l’injection intrapéritonéale du médicament de référence entraine un stress physique mineur et une douleur légère de courte durée (1 fois). L’administration du polluant par gavage (42 fois) et l’habituation à la technique (7 fois) entraine un stress physique mineur de courte durée. Pour les descendants : L’existence d’un phénotype comportemental de type autistique entraine un risque d’anxiété accru. - La réalisation des tests comportementaux (3 tests) entraine un stress physique mineur. - L’anesthésie entraine une stress physique mineur de courte durée et un risque léger d’hypothermie. - La mise à jeun des animaux avant les imageries entraine un risque d’hypoglycémie.
Devenir
En cas de portées trop nombreuses (supérieures à 10 ratons), celles-ci seront réduites en plaçant des ratons surnuméraires tirés au sort dans d’autres portées d’effectifs plus faibles (< 10) ou en les euthanasiant. Dans ce cas, les tissus seront prélevés pour des analyses. L’ensemble des rats nés dans cette étude (300) sera euthanasié à 10, 21 ou 80 jours de vie pour analyses des tissus. Enfin les 32 rats ayant participé aux tests de sociabilité ainsi que les femelles ayant servi à la reproduction (30) seront maintenus en vie et pourront être réaffectés à d’autres projets.
Remplacement
L'utilisation d'animaux est essentielle pour reproduire la complexité des Troubles du Spectre Autistique observés chez l'Homme. Le modèle d’autisme utilisé dans ce projet est reconnu et validé chez les rongeurs, il permet de créer des troubles comportementaux et cérébraux similaires à ceux observés chez l'Homme. Les deux modèles qui seront utilisés (celui exposé au polluant objet de l’étude et le modèle de référence des troubles du spectre autistique) permettront d’utiliser l'imagerie cérébrale pour étudier les effets d'un polluant et comprendre le lien avec le développement de l’autisme. Cette imagerie nécessite l'étude de l'activité cérébrale d'animaux vivants.
Réduction
Compte-tenu des objectifs de l’étude (développement de Troubles du Spectre Autistique chez la descendance par exposition maternelle à un polluant), la portée doit être considérée comme l’unité statistique. Le nombre d’animaux par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Ainsi, ce projet inclura un total de 30 rat femelles gestantes ainsi que leurs descendants. Chaque portée sera limitée à 10 ratons, soit 300 jeunes. À ce nombre il convient d’ajouter 32 rats (16 femelles et 16 mâles) qui seront utilisés dans le test de sociabilité. Ce protocole impliquera donc au total 362 animaux. Parmi ces animaux, 54 réaliseront des tests comportementaux puis 37 réaliseront les analyses d’imagerie. Les autres ratons des portées seront utilisés pour prélever des tissus et réaliser des analyses ultérieures.
Raffinement
Dans l’EU1/2, les femelles gestantes et allaitantes seront hébergées avec leurs petits jusqu'à 21 jours après la naissance. Ensuite, les jeunes rats resteront ensemble sans leur mère entre 21 et 28 jours pour maintenir leurs liens sociaux. À 28 jours, les rats seront séparés par sexe. Les tests comportementaux seront effectués durant la nuit, période d'activité naturelle des rats. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être en accord avec une grille de score adaptée, et manipulés par un personnel entraîné afin de réduire le stress. À 50 jours, les rats seront transportés dans des cages prévues à cet effet vers l'animalerie de la plateforme d'imagerie EU2/2, et hébergés avec des conditions similaires à leur habitat précédent pour minimiser les perturbations. Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale, en suivant des protocoles rigoureux adaptés à chaque animal. Le radiotraceur sera injecté par du personnel qualifié, avec des doses précises. Pendant l’imagerie, l'anesthésie sera surveillée en temps réel pour assurer la sécurité des animaux. Après la procédure, les rats seront surveillés attentivement dans un environnement calme pour une récupération rapide et sans complications. Après la décroissance de la radioactivité, les animaux seront transportés dans des cages prévues à cet effet pour retourner dans l’EU1/2.
Choix des espèces
Les caractéristiques comportementales du rat, en particulier du point de vue du comportement social font que cette espèce est à privilégier pour l’étude du comportement et l’induction des modèles de Troubles du Spectre Autistique par le médicament de référence ou l’exposition au polluant. Les femelles pour la reproduction seront utilisées au même stade de maturité (11–12 semaines) que dans les études antérieures, afin d’assurer la comparabilité des résultats. Les descendants seront étudiés à différents stades : 10, 21 et 80 jours après la naissance. L’évaluation des modifications métaboliques au moyen de la technique d’imagerie cérébrale aura lieu à 60 jours de vie postnatale. Les âges postnataux de 10 et 21 jours ont été choisis car ils correspondent à une période clé du développement cérébral chez les rongeurs, marquée par une forte formation de connexions entre les neurones, juste avant leur réorganisation autour de 21 jours. La période de 60 à 80 jours correspond quant à elle à une période où les comportements de type autistique sont pleinement établis.
Etude du rôle d’une enzyme de la machinerie épigénétique au cours du développement embryonnaire précoce chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Mises à mort selon la présence d'un bouchon vaginal après accouplement, 75 des 90 souris femelles de ce projet servent à collecter des embryons aux premiers stades du développement, les 15 autres retournant à l'élevage pour maintenir la lignée. Elles reçoivent deux injections d'hormones espacées de 48 heures pour augmenter le nombre d'ovocytes produits, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le projet cherche à comprendre comment un ARN régulateur contrôle l'organisation de l'ADN entre la fécondation et l'implantation. Sur le remplacement, le porteur indique suivre les publications sur les embryoïdes et les blastoïdes, tout en affirmant que ces structures doivent être comparées à de "vrais embryons obtenus chez l'animal" pour être validées.
Objectifs
Ce projet consiste en la superovulation de souris femelles pour l’obtention après accouplement d’embryons. L’objectif scientifique est l’étude du rôle d’une enzyme au cours du développement embryonnaire précoce (entre la fécondation et l’implantation). La procédure de superovulation consiste en l’injection d’hormones et permet d’augmenter le nombre d’embryons obtenus par femelle. Nous cherchons à comprendre comment une molécule particulière d’ARN, qui ne sert pas à fabriquer une protéine mais joue un rôle de régulation, contrôle l’activité d’un gène qui intervient dans l’organisation de l’ADN à l’intérieur des cellules. Or, la façon dont l’ADN est organisé influence les gènes qui sont utilisés ou non-utilisés au cours du développement de l’embryon. Pour étudier ce phénomène, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui ne possèdent plus cette molécule d’ARN régulatrice. En comparant ces souris à des souris normales, nous pourrons déterminer quel est le rôle de cet ARN dans le contrôle de l’expression du gène étudié. Nous analyserons notamment comment l’absence de cet ARN modifie l’organisation de l’ADN dans le noyau des cellules et l’activité des gènes lors des premières étapes du développement embryonnaire. Ces travaux permettront de mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent l’expression des gènes au début de la vie et la manière dont les cellules acquièrent leur identité et leurs fonctions.
Bénéfices attendus
A court terme, la procédure de superovulation permet d’obtenir des embryons pour réaliser le projet scientifique Ce projet scientifique permettra d’améliorer de manière significative la compréhension des mécanismes fondamentaux du développement embryonnaire précoce, en particulier les processus qui contrôlent l’activité des gènes après la fécondation. Les connaissances générées contribueront à mieux comprendre comment l’activité des gènes est régulée au tout début du développement, notamment le rôle des modifications chimiques de l’ADN et de son organisation. À plus long terme, ces résultats pourront avoir des retombées dans le domaine des biotechnologies de la reproduction. Notamment, ils pourraient permettre l’amélioration des techniques de procréation médicalement assistée (PMA) grâce à une meilleure compréhension des premières étapes du développement embryonnaire. Enfin, ce projet participe à l’avancée des connaissances fondamentales en biologie du développement, constituant une base essentielle pour de futures applications biomédicales.
Procédures
Les animaux recevront deux injections de quelques secondes espacées de 48 heures afin de stimuler la production d’ovocytes. Cette procédure est couramment utilisée et entraîne une gêne et une douleur légères et transitoires.
Impact sur les animaux
Les femelles subissent deux injections pour stimuler l’ovulation, induisant une gêne et d’une douleur très légère.
Devenir
L’euthanasie des femelles est nécessaire pour permettre la collecte des embryons à des stades précoces du développement. Seules les femelles avec un bouchon vaginal seront mises à mort. Les femelles sans bouchon vaginal après accouplement seront replacées dans l’élevage pour le maintien de la lignée.
Remplacement
Notre modèle biologique est l’embryon de souris, et il n’existe pas actuellement d’alternative équivalente en culture cellulaire. Des recherches sont en cours pour utiliser des cellules souches afin d’obtenir de structures ressemblant à des embryons (appelées « embryoïdes » ou « blastoïdes ») et nous suivons de près les publications de la littérature sur ce sujet. Cependant, ces modèles doivent être comparés à de vrais embryons obtenus chez l’animal pour être validés. D’autre part, ces modèles ressemblent à des embryons aux stades tardifs du développement, mais pas aux premiers stades plus précoces. Donc cela rend nécessaire l’utilisation d’embryons pour étudier ces étapes précoces.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été calculé pour être le plus faible possible tout en restant compatible avec : 1- la réalisation des différentes analyses cellulaires 2- l’utilisation de méthodes statistiques adaptées, permettant d’interpréter les résultats. Les femelles sont traitées pour augmenter le nombre d’embryons produits, ce qui permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires. Nous nous engageons également à améliorer en continu les techniques utilisées, en tenant compte des progrès technologiques, afin de réduire le nombre d’embryons nécessaires et donc le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les protocoles expérimentaux ont été conçus pour limiter au maximum le stress et prévenir toute souffrance chez les animaux : •les manipulations (notamment les injections) sont réalisées par du personnel formé, en utilisant des techniques adaptées pour réduire le stress (manipulation douce, rapide et maîtrisée). Le nombre de manipulations est limité au strict nécessaire ; •un suivi quotidien est assuré afin de détecter rapidement tout signe de douleur ou d’altération de l’état général. Ceci pourrait être due à une infection au point d’injection. Or, depuis 15 ans d’étude nécessitant des stimulations hormonales, ce cas ne s’est jamais présenté. Des points limites (modification du comportement, de l’activité ou de l’état général) sont définis pour permettre une intervention rapide. En cas de souffrance persistante ou importante, l’animal est retiré de l’étude et mis à mort sans délai ; •enfin, une attention particulière est portée à l’amélioration continue des pratiques afin de réduire encore l’impact des procédures sur les animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence pour l’étude du développement embryonnaire. La souris est un modèle d’étude particulièrement adapté car de nombreux mécanismes biologiques impliqués dans le développement de l’embryon sont très similaires chez tous les mammifères. Son développement embryonnaire est également très bien connu des scientifiques, ce qui permet de suivre avec précision les différentes étapes de la formation de l’embryon et de mieux comprendre les résultats obtenus. De plus, il existe des souris spécialement modifiées pour la recherche, ce qui permet d’étudier le rôle de gènes ou de molécules spécifiques dans des conditions contrôlées. À l’heure actuelle, ces recherches ne peuvent pas être réalisées de façon aussi complète avec des méthodes alternatives en laboratoire, car elles nécessitent d’observer les interactions complexes qui se produisent au sein d’un organisme vivant pendant les premières étapes du développement. Les animaux utilisés pour obtenir des embryons, et donc accouplés, sont des adultes (à partir de 6 semaines, âge auquel les femelles peuvent se reproduire). La période de fertilité optimale et de sensibilité à la stimulation hormonale est entre 6 et 12 semaines pour les souris. Nous nous placerons donc dans cette période afin d’optimiser le nombre de femelles utilisées par rapport au nombre d’embryons récoltés.
Elevage d’une lignée de souris développant une maladie vasculaire génétique rare (Projet multi-sites : 2/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Chaque souriceau reçoit une puce électronique sous la peau du cou, puis se fait couper un bout de queue avant le sevrage ou perforer l'oreille après quatorze jours, éveillé, et une seconde biopsie reste possible. 3 030 souris vont être utilisées dans ces procédures que le porteur classe en souffrance légère, pour entretenir par fécondation in vitro une lignée reproduisant une maladie génétique du tissu conjonctif qui fragilise les artères. Il décrit pourtant une mort qui "survient subitement sans aucun symptôme identifié" chez les souris qui développent la maladie, et situe les ruptures artérielles spontanées autour de 50 % à 24 semaines chez les mâles mutés, alors que les mâles produits ici partent en expérimentation à 4 semaines. Le devenir affiché, 3 030 morts, ne recouvre pas ce que dit le texte : une part des souris est expédiée vers d'autres projets "en vue de leur utilisation", la mise à mort frappant celles dont le génotypage n'est pas conforme, celles qui portent une anomalie congénitale, celles produites au-delà de la taille d'élevage voulue et celles dont l'expédition est annulée.
Objectifs
L'objectif de ce projet est l’étude de modèles souris reproduisant une maladie génétique rare vasculaire du tissu conjonctif qui provoque une souplesse anormale des articulations, une peau très élastique et des tissus fragilisés dont les vaisseaux sanguins. Chez l’Homme, la majorité des décès est due à des ruptures artérielles. Ce projet et la procédure qu'il comporte seront mis en œuvre sur notre Etablissement utilisateur 1 et sur notre Etablissement utilisateur 2.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est de valider des essais de différents traitements médicamenteux ayant permis d'améliorer la survie des souris développent cette maladie. A terme, les résultats de ce projet permettraient de mieux comprendre les mécanismes conduisant à ces ruptures artérielles afin de proposer des thérapies et d'améliorer le diagnostic, le confort de vie des patients et le traitement.
Procédures
Les naissances auront lieu sur notre Etablissement utilisateur 2. Chaque petit obtenu sera marqué par injection sous cutanée d’une puce électronique pour un suivi individuel et sera génotypés pour identifier les animaux d’intérêt. L'injection de la puce est rapide et se fait par voie sous-cutanée dans la région du cou ; la contention de l'animal dure moins d'une minute. Le prélèvement de bout de queue et/ou d'oreille dure également moins d'une minute. Le prélèvement se fait sur animaux vigiles, avant le sevrage pour le prélèvement d'un bout de queue et après l'âge de 14 jours pour le prélèvement d'oreille. De manière générale, une seule biopsie est réalisée par animal, en cas de nécessité de refaire la caractérisation génétique, une deuxième biopsie par animal pourrait être réalisée en suivant les préconisations liées à l'âge de l'animal. Au niveau de notre Etablissement utilisateur 1 les animaux seront seulement hébergés, il n'y aura pas de naissance attendue. Une biopsie de queue et/ou d'oreille serra cependant prélevée sur les animaux selon les modalités décrites plus haut.
Impact sur les animaux
Dans le cas des souris développent la maladie, la mort survient subitement sans aucun symptôme identifié. La biopsie, en particulier le prélèvement d'un bout de queue, peut causer de la douleur et de l'inconfort aux animaux. Même si la procédure est rapide, la coupure d'un bout de queue ou la perforation de l'oreille peut être douloureuse. La manipulation des animaux pour biopsie peut causer du stress et de l'anxiété. Suite à la biopsie, les animaux pourraient être temporairement limités dans leurs activités normales, notamment si la douleur ou l'inconfort les affecte.
Devenir
Les animaux sont soit expédiés en vue de leur utilisation, soit mis à mort lorsque les résultats du génotypage ne sont pas conformes, lorsque la taille de l’élevage souhaitée est atteinte ou lorsqu’ils présentent une anomalie congénitale. Si des animaux d'intérêts ne peuvent pas être expédiés (du fait par exemple d'une annulation de l'expérience), ils seront mis à mort.
Remplacement
L’étude sur cellules en culture ne permet que d’explorer des modifications limitées dans des conditions de culture particulière. L'étude des conséquences des mutations sur animal entier est donc indispensable pour la compréhension des mécanismes globales de la maladie.
Réduction
Afin de réduite la quantité d'animaux utilisé dans ce projet, nous produirons les lots uniquement par Fécondation In Vitro (FIV). La production d'animaux par FIV permet de réduite au minimum le nombre d'animaux utilisé pour la production des lots (au vu des données que nous avons et de notre expertise nous estimons que le sperme collecté sur 2 mâles permettra de produire environ 350 petits). De plus, aucun stock d'animaux ne sera conservé pour le maintien d'une colonie ; les animaux produits par FIV seront uniquement destinés à l'expérimentation.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Des grilles de score de surveillance avec des points limites suffisamment prédictifs seront renseignées. Le transport entre les 2 EU prend moins d’une heure. Au cours de ce voyage, les animaux seront placés dans des colis munis de filtres (afin de maintenir leur statut sanitaire), de litière, d’aliment, d’enrichissement et d’hydrogel. Les animaux seront transportés via des camions ventilés et thermorégulés.
Choix des espèces
Ce modèle de souris transgéniques a déjà été créé et caractérisé. Nous avons donc besoin de poursuivre les études sur ce dernier. Les mâles utilisés pour les cryoconservations de sperme seront utilisés entre 10 et 20 semaines d'âges. Les mâles produits seront eux envoyés en expérimentation à 4 semaines d'âge. Seuls les mâles seront utilisés pour l'expérimentation car les ruptures artérielles spontanées sont observées essentiellement chez les souris mutées mâles (de l’ordre de 50% à 24 semaines) vs les souris femelles (de l’ordre de 20%), et un effet spécifique de la testostérone a été observé et en cours d’analyse.
Détermination préliminaire des profils pharmacocinétiques, toxicocinétiques de substances actives à propriétés phytosanitaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Le projet alimente les dossiers réglementaires de substances phytosanitaires, à raison d'environ cinquante études par an sur les produits retenus après criblage en laboratoire. 17 280 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent les substances par la bouche jusqu'à trois fois par jour pendant quatorze jours, par voie intraveineuse jusqu'à six fois en vingt-quatre heures, sur la peau, ou par inhalation pendant une heure vigiles et jusqu'à quatre heures sous anesthésie. Le porteur écrit qu'"aucune altération de l'état de santé des animaux n'est attendue", et justifie le recours aux souris par le fait que les tests sur cellules ne sont pas "pleinement reconnues" pour les produits phytosanitaires.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre comment certains produits utilisés pour protéger les plantes (comme les pesticides ou produits phytosanitaires) se comportent dans le corps d’un humain. Ce projet cherche à savoir comment ces substances peuvent entrer dans l’organisme de l’homme (par ingestion, contact avec la peau ou inhalation), combien de temps elles y restent, et comment elles sont transformées. L’objectif est d’estimer de manière réaliste l’exposition humaine, que ce soit par l’alimentation (via des résidus dans les aliments) ou dans un cadre professionnel (par exemple pour les personnes qui manipulent ces produits). Avant d’être étudiées chez la souris, les substances sont d’abord testées et sélectionnées en laboratoire (sans animal). Seules celles qui respectent les exigences réglementaires en matière de sécurité pour l’humain et l’environnement sont ensuite retenues. Le projet prévoit environ 50 études par an. Sur une durée de cinq ans, cela représentera environ 17 280 animaux, répartis entre trois types de procédures expérimentales.
Bénéfices attendus
À court terme, ces études permettent de mesurer de façon réaliste la quantité de ces substances à laquelle les humains peuvent être exposés, que ce soit par l’alimentation ou par contact avec la peau ou l’air. Elles servent aussi à fixer des limites de sécurité, par exemple la quantité maximale de résidus autorisée dans les aliments, avec une large marge de sécurité pour protéger la santé. Ces travaux permettent également d’identifier les substances ou leurs dérivés qui pourraient être dangereux, notamment ceux qui s’accumulent dans le corps ou restent longtemps dans l’environnement. Cela aide à éviter d’autoriser des produits pouvant provoquer des maladies graves comme des cancers ou des troubles du système nerveux.
Procédures
Dans ce projet, les gestes réalisés sur les souris sont simples et de courte durée. Les animaux sont régulièrement pesés, ce qui prend seulement quelques secondes, afin de suivre leur état de santé. Les substances étudiées peuvent être administrées de différentes façons : • par la bouche (comme prendre un médicament), soit une seule fois ou de façon répétée avec un maximum de 3 fois par jour pendant 14 jours. La manipulation dure 30s. • par injection dans la circulation sanguine, soit une seule fois ou de façon répétée avec un maximum de 6 fois par jour sur 24h ou au plus 3 fois par jour pendant 3 jours. La manipulation dure au maximum 2 min. • par application sur la peau, soit une seule fois ou de façon répétée avec un maximum de 6 fois par jour sur 24h ou au plus 3 fois par jour pendant 3 jours. La manipulation dure au maximum 30s • par application sous la peau, en une seule fois. La manipulation dure 30s • par inhalation sous forme d’air ou de fines gouttelettes en une seule fois. La manipulation peut durer entre une heure sur un animal vigile et quatre heures sur un animal anesthésié. La durée des études va de deux à trois semaines. Des prélèvements de sang nécessitent une manipulation courte sur un animal vigile d’environ 2 min. Le sang collecté permet d’analyser comment le produit s’absorbe, circule et se distribue dans l’organisme ou les organes. Ces prélèvements sont réalisés en petites quantités, avec des limites strictes pour prévenir toute anémie et privilégier un temps de récupération entre chaque prélèvement. Certains prélèvements sont réalisés sous anesthésie en fin d’étude. Les urines et les selles peuvent aussi être collectées ponctuellement sur 23h après administration dans des cages adaptées pour compléter les analyses.
Impact sur les animaux
Aucune altération de l’état de santé des animaux n’est attendue avec les procédures prévues. Toutefois, en raison du caractère exploratoire des études, des effets imprévus peuvent survenir (perte de poids, variations de la température corporelle, modifications du comportement). Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique régulier à l’aide d’une grille de scoring. Des points limites humanitaires sont définis afin d’interrompre l’expérimentation et de mettre en œuvre une prise en charge adaptée, y compris l’euthanasie si nécessaire, afin d’éviter toute souffrance inutile.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir collecter les matrices biologiques ou organes pour évaluer la distribution dans un organisme vivant des substances actives phytosanitaires.
Remplacement
Des tests sur cellules permettent de faire un premier tri des substances, en étudiant leur absorption et leur transformation. Cependant, ces méthodes ne suffisent pas à comprendre entièrement leur comportement dans un organisme vivant et ne sont pas encore pleinement reconnues pour les produits phytosanitaires. À ce jour, l’étude chez l’animal reste nécessaire pour évaluer de manière globale leur devenir dans l’organisme et s’assurer de leur sécurité pour l’humain, les animaux et l’environnement, conformément à la réglementation européenne.
Réduction
Les substances sont d’abord largement testées en laboratoire (sur ordinateur et sur cellules) pour prévoir leur comportement dans l’organisme. Cela permet de ne garder que les plus pertinentes et de réduire fortement le nombre d’animaux utilisés. Grâce à des techniques d’analyse très sensibles, de très petites quantités de sang sont suffisantes. On peut ainsi effectuer plusieurs prélèvements sur un même animal et obtenir toutes les informations nécessaires, tout en limitant leur nombre. Le nombre d’animaux est donc réduit au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables : en général au minimum 3 animaux pour les études de base et au maximum 8 pour certaines analyses spécifiques. Le nombre d’animaux utilisés sur cinq ans est estimé à 17280
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages adaptées, avec des éléments d’enrichissement pour leur confort et leur permettre de faire leur nid. Ils sont observés chaque jour pour vérifier leur état de santé. L’environnement et les animaux sont régulièrement contrôlés pour garantir de bonnes conditions sanitaires par des analyses ciblées et appropriées. Si un animal présente un problème, il reçoit des soins adaptés ou est euthanasié si nécessaire, selon des règles précises. Des mesures sont aussi prévues pour réagir rapidement en cas d’événement inattendu. Des critères d’arrêt anticipé sont définis ainsi pour éviter toute souffrance inutile. Tous les gestes pouvant être douloureux ou les situations très contraignantes pour l’animal sont réalisés sous anesthésie, et les manipulations sont limitées au strict nécessaire. Pour limiter les risques, en cas de dose potentiellement toxique, un seul animal est testé en premier. Si des effets indésirables apparaissent, les autres animaux ne sont pas exposés. Enfin, toutes les procédures sont réalisées par du personnel qualifié et formé, avec des formations régulières pour améliorer les pratiques et le bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus souvent utilisé pour étudier le devenir et la sécurité des substances. Son fonctionnement biologique est assez proche de celui de l’humain, ce qui permet de mieux prévoir les effets chez l’homme. Elle est recommandée par les autorités scientifiques pour ce type de projet (lignes directrices OCDE TG 417). Sa petite taille et les techniques de micro échantillonnage permettent de respecter les 3R tout en obtenant des données robustes. Sur le plan scientifique, la souris présente une physiologie et un métabolisme bien caractérisés, permettant une évaluation fiable des processus d’absorption, de distribution, de métabolisme et d’excrétion. Il permet l’identification des métabolites majeurs circulants et l’établissement de relations robustes entre la dose administrée et l’exposition systémique. D’un point de vue technique et éthique, la souris est adaptée aux prélèvements sériés de très petits volumes et aux études de bilan de masse, tout en permettant l’optimisation des designs expérimentaux conformément au principe des 3R. Ce choix assure ainsi la production de données pharmacocinétiques fiables, interprétables et pleinement exploitables sur le plan réglementaire. Le stade adulte sera utilisé par défaut (à partir de 7 semaines) car c’est celui qui permet de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l’espèce pour une entité donnée. Toutefois, il sera possible d’utiliser des animaux à un stade plus précoce (âgés de 15 jours) pour établir des données d’exposition spécifique de ces composés phytosanitaire sur des nouveaux nés. Le stade adulte sera utilisé par défaut (à partir de 7 semaines) car c’est celui qui permet de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l’espèce pour une entité donnée. Toutefois, il sera possible d’utiliser des animaux à un stade plus précoce (âgés de 15 jours) pour établir des données d’exposition spécifique de ces composés phytosanitaire sur des nouveaux nés.
Décontamination de lignées transgéniques par césarienne chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Décontaminer des lignées génétiquement modifiées pour les proposer comme un "nouveau type de service aux utilisateurs de l'animalerie" : 9 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers et modérés. Quinze femelles par lignée reçoivent des stimulations hormonales pour synchroniser l'ovulation et produire davantage d'embryons, avant deux injections, un prélèvement et une intervention chirurgicale de quinze minutes. Les 900 femelles donneuses sont mises à mort, les 9 000 souriceaux extraits étant gardés en vie pour constituer les lignées propres annoncées. Le porteur qualifie l'intervention chirurgicale de stress important pour les souriceaux, et écrit que l'emploi du "modèle animal" est "indispensable pour générer les embryons", sans autre argument sur le remplacement.
Objectifs
Ce projet a pour but de proposer un nouveau type de service aux utilisateurs de l'animalerie: l'introduction de nouvelles lignées génétiquement modifiées propres. Cela permettrait d'introduire et de créer de nouvelles lignées génétiquement modifiées propres qui ne sont, à l'heure actuelle, pas disponible chez les différents fournisseurs ou dans les animaleries académiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra aux utilisateurs d'introduire de nouvelles lignées génétiquement modifiées propres pour leurs projets de recherche. Ce projet permettrait également de créer des lignées contenant des mmicro-organismes choisis en fonction des spécificités des équipes mais également de sauver une lignée qui aurait été accidentellement contaminée.
Procédures
Les souris recevront 2 injections d'une durée de 1minute. Un prélèvement sera réalisée sur les animaux d'une durée de 2minutes. Une intervention chirurgicale sera effectuée de 15 minutes
Impact sur les animaux
Les injections peuvent causer un inconfort temporaire induisant une faible douleur et un stress estimé à quelques secondes. L'intervention chirurgicale représentera un stress important pour les souriceaux
Devenir
Les femelles donneuses seront mises à mort. Les souriceaux seront gardés en vie.
Remplacement
L'emploi du modèle animal est indispensable pour générer les embryons nécessaires à la décontamination des lignées.
Réduction
Un nombre de 15 femelles par lignée sera utilisé pour garantir la bonne réalisation de la décontamination. Les stimulations hormonales ont également pour but de synchroniser l'ovulation et d'augmenter le nombre d'embryons produits permettant un meilleur taux de réussite de la manipulation.
Raffinement
Un enrichissement sera mis en place dans chaque cage comprenant du coton pour la nidification et des balançoires en bois. Lors du prélèvement le temps sera limitié au maximum pour réduire le stress et les souriceaux seront placés sur des tapis chauffants.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce est ici imposé par la nature des modèles animaux existants. Des femelles matures sexuellement seront utilisées en tant que donneuses. Pour les receveuses, nous veillerons à ce que les femelles aient déjà eu une portée pour limiter les risques.
Efficacité d’un vaccin contre la péritonite infectieuse féline
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Tous tués pour autopsie, y compris ceux qui ne développeront aucun signe clinique parce qu'ils pourraient rester porteurs du virus, 375 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers, modérés et sévères. Chatons de sept à cinquante-deux semaines pour une partie d'entre eux, ils reçoivent un à trois candidats vaccins, puis le virus de la péritonite infectieuse féline sous anesthésie, avant jusqu'à onze prélèvements sanguins et onze séances de deux écouvillons rectaux. La maladie provoquée peut aller jusqu'à la dyspnée sévère, l'ictère, l'ascite et l'ataxie, et le porteur écrit que les analgésiques "ne peuvent pas être utilisés car ceux-ci masqueraient l'arrivée des signes cliniques". L'évaluation sur le chat est présentée comme une "exigence règlementaire", le porteur ajoutant que deux à trois candidats vaccins seront testés sur la durée du projet.
Objectifs
Le projet a pour but ultime d’évaluer l’efficacité de vaccins contre la péritonite infectieuse féline par administration de l’agent pathogène. Dans un premier temps, il est nécessaire de mettre en place des études de mise au point de modèles d’épreuve afin de récréer, expérimentalement, la maladie telle qu’elle se développerait chez le chat de manière naturelle et d’être au plus proche des conditions réelles. Le modèle ainsi mis en place permettra d'évaluer des candidats vaccins. Après administration du candidat vaccin, la réponse immunitaire est suivie par des prélèvements sanguins à intervalles définis en fonction de la réponse attendue aux différents stades du projet. Enfin, l’administration de l’agent pathogène (virus de la péritonite infectieuse féline (PIF) de type I ou de type II), permet d’évaluer l’efficacité des candidats vaccins et de déterminer les effets bénéfiques : protection contre la pathologie, réduction des signes cliniques, réduction de l’excrétion de l’agent pathogène. Comme il n'y a pas de marqueur évident et fiable de la maladie en dehors des signes cliniques, ni d'indicateur démontré de l'efficacité protective des vaccins contre la PIF (pas de sérologie fiable/spécifique ou autre paramètre biologique/immunitaire corrélé à la protection), l’efficacité ne peut être démontrée que par injection du virus de la maladie et suivi des manifestations cliniques.
Bénéfices attendus
La finalité de ces études est de développer un /des produit(s) efficace(s) pour réduire l’impact de la péritonite infectieuse féline sur les populations de chat. 2 à 3 candidats vaccins seront testés pendant la durée de ce projet.
Procédures
1 à 3 administrations de formulation vaccinale, par voie orale, nasale ou sous-cutanée, sur animal vigile. L’acte est inférieur à 1 minute. 1 à 2 administrations de la souche d’épreuve sur animal anesthésié par voie orale oro-nasal ou intra péritonéale. L’acte peut durer quelques minutes en fonction de l’anesthésie. Jusqu’à 11 prélèvements sanguins sur animal vigile ou anesthésié en fonction du comportement de l’animal. L’acte est inférieur à 1 minute. Jusqu’à 11 sessions de 2 écouvillons rectaux sur animal vigile, l’acte est inférieur à 1 minute.
Impact sur les animaux
Les contentions peuvent générer du stress chez l’animal. Les administrations ainsi que les prélèvements sanguins peuvent provoquer du stress et de l’inconfort au moment du geste, une habituation à la contention et aux actes est prévue dans les salles de procédures. En fonction du comportement de l’animal et de l’acte sur l’animal, une anesthésie sera mise en place. Le développement de la maladie peut engendrer des signes cliniques sévère qui déclencheront des points limites : une dégradation importante de l’état général, perte de poids supérieur à 20% adulte (15% chaton), dyspnée sévère, ictère, ascite, atteinte neurologique (ataxie, nystagmus).
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés pour les besoins de l’étude : autopsie. Par ailleurs, même s’ils ne développent pas les signes cliniques, ils peuvent être des porteurs sains et infecter d’autre chats.
Remplacement
Lorsque cela est possible, une première étape dans le projet de développement de vaccins consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection, réduisant ainsi le nombre de candidats à tester in vivo donc le nombre d’animaux utilisés. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible.
Réduction
En l’absence de Pharmacopée européenne, nous nous basons sur notre historique sur la conduite d’études PIF pour laquelle ces effectifs ont permis de mettre en place le modèle d’épreuve et d’évaluer des candidats vaccins dans le passé. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste de façon à minimiser le nombre de chats utilisés en limitant le risque d’études non conclusives. L’effectif nécessaire est estimé en fonction de la connaissance de la souche d'épreuve (maitrise ou connaissance du taux d'animaux atteints/robustesse du modèle d'épreuve) et de l'efficacité présumée du vaccin. Comme la pathologie est rarement développée par tous les individus, un effectif suffisant est nécessaire pour attester de la fiabilité du modèle et concomitamment de l’efficacité du/des vaccin(s) testé(s). En revanche, des prélèvements d’organes et liquide d’épanchement sur des chats cliniquement atteints lors d’une étude de modèle d’épreuve sont prévus afin de préparer, si possible, un futur stock de souche d’épreuve sans avoir recours des chats supplémentaires pour cette seule finalité (production de souche type I).
Raffinement
Pour chaque étude, une période d’acclimatation des animaux, d'une durée optimale de 7 jours (minimale de 4 jours), est systématiquement prévue et a pour but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique. Si cette durée n’est pas suffisante elle sera rallongée jusqu’à ce que les animaux soient aptes à entrer dans la procédure. Les chats hébergés dans nos locaux font l’objet d’un soin de qualité avec respect de leur bien-être. Ils sont hébergés en groupe avec de nombreux aménagements pour se percher et faire leurs griffes. Les jouets présents dans les zones d’hébergement et dans les zones de jeu sont régulièrement changés pour favoriser la curiosité. Afin de limiter le stress lié aux actes (contention, administrations, prélèvements), ces derniers seront travaillés en renforcement positif avec friandises et caresses. La durée de ce travail est indéterminée, il sera réalisé jusqu’à ce que les animaux ne montrent plus de signes de stress contre-indiquant leur entrée dans la procédure (le cas échéant). Une méthode low stress de contention des chats avec le dispositif CatWrap pourra aussi être utilisée. Les administrations de l'agent pathogène s'effectuent sur animal anesthésié. Les prélèvements chez le chat pourront être réalisés sous anesthésie en fonction du comportement de l'animal. Le protocole anesthésique sera évalué au plus juste pour limiter les effets secondaires indésirables (les molécules et doses seront adaptées pour favoriser un réveil rapide). Les animaux anesthésiés seront individuellement placés sous surveillance, au calme et au chaud si besoin et ce jusqu’à leur réveil complet. Le personnel intervenant dans l’étude sera formé aux gestes techniques afin de travailler avec le plus d’expertise possible. Les animaux sont observés quotidiennement ou plus fréquemment, si jugé nécessaire, ce qui permet de détecter tout signe comportemental anormal (spontané ou provoqué) et/ou toute anomalie physique non attendue. En cas de déviation de l'état normal d'un animal et selon l'arbre décisionnel, le responsable de l’étude, le vétérinaire désigné ou le vétérinaire d'astreinte, décidera d'augmenter les fréquences d'observations. Des points limites spécifiques sont définis et appliqués. Les analgésiques ne peuvent pas être utilisés car ceux-ci masqueraient l'arrivée des signes cliniques. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
L’évaluation sur espèce cible (chat) est une exigence règlementaire et le modèle optimal pour réaliser les études à ce stade de connaissance La majorité des chats utilisés sont des jeunes d’environ 2 - 3 mois ou des adultes. Plus précisément : - Les études d’efficacité immédiate utilisent de jeunes chats (chatons âgés entre 7 et 52 semaines). L’âge des chats au moment de l’épreuve dépend des caractéristiques du produit à tester. - Les études de durée d’immunité utilisent des chats adultes (âge >12 mois) pour tester la durée de protection conférée par le produit. - Pour la mise au point de modèle d’épreuve, les 2 catégories d’animaux sont utilisées en fonction de l’objectif de l’étude.
Etudes précliniques non-réglementaire d’une immunothérapie des muqueuses avec l’IgA pour le traitement du cancer de l’estomac
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Greffées par laparoscopie pour 48 d'entre elles, puis suivies en imagerie chaque semaine et prélevées de sang toutes les deux semaines, 525 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers, modérés et sévères, toutes tuées à l'issue pour prélever estomac, foie et poumons. De la troisième à la huitième semaine, huit souris sont tuées chaque semaine pour observer la croissance des tumeurs, et 270 autres reçoivent une greffe puis des gavages ou des injections aux posologies comparées. L'objet immédiat est de vérifier qu'un anticorps déjà actif in vitro atteint la tumeur de l'estomac et les métastases. Le porteur décrit une douleur post-chirurgicale observable pendant 48 heures et qualifie les autres gestes de "léger stress", tout en annonçant pour les patients une "révolution" et une "amélioration sans précédent" de leur qualité de vie.
Objectifs
Dans le monde, il y a environ 1 million de nouveau cas de cancer de l’estomac chaque année. Cela place ce cancer au 5ème rang des cancers les plus fréquents au niveau mondial. En France, on estime à environ 7000 nouveaux cas par an avec un taux de survie à 5 ans de 30% environ. Les traitements actuels sont le plus souvent la chirurgie, les chimiothérapies et les immunothérapies ciblant des caractéristiques non spécifiques des cellules cancéreuses. Ces traitements entraînent de forts effets secondaires impactant fortement la vie quotidienne des patients. Nous avons mis au point un nouveau médicament qui cible directement un marqueur de surface des cellules cancéreuses et dont l’efficacité a été prouvée in-vitro. Nous voulons apporter la preuve qu’il est aussi efficace in vivo dans une situation où la cellule cancéreuse a le même environnement tissulaire que chez l’Homme. Une 1ère étude pré-clinique non-réglementaire a été menée avec succès, nous permettant aujourd’hui de continuer notre développement en ciblant le cancer de l’estomac avant de mener les études précliniques réglementaires.
Bénéfices attendus
Nous développons une nouvelle thérapeutique qui montre des résultats prometteurs dans la réduction des tumeurs locales. L'efficacité du médicament est l'élément critique pour l'adoption d'un nouveau médicament, mais la voie d'administration l'est tout autant : en prenant le produit par voie orale, le patient redevient acteur de son long parcours de soins et il n'a plus besoin de se déplacer à l'hôpital pour poursuivre son traitement. L'impact sur l'amélioration de la qualité de vie du patient sera considérable, lorsque le médicament sera approuvé et utilisé. Maintenir les patients à domicile en leur permettant de poursuivre leur traitement à distance améliore considérablement l'accès aux soins pour les patients vivant dans des zones rurales dépourvues d'infrastructures médicales importantes (Hôpitaux universitaires, centres de recherche contre le cancer de pointe, centres d'investigation clinique pour les essais cliniques). De plus, les traitements contre le cancer sont généralement extrêmement toxiques, constituant un challenge pour les médecins prescripteurs qui doivent trouver le meilleur équilibre entre bénéfice thérapeutique et tolérance pour le patient. Les effets secondaires nombreux et variés selon les conditions physiologiques du patient rendent le parcours de soins du patient extrêmement difficile à vivre. A cela s'ajoute la lourdeur d'un traitement qui nécessite une administration régulière à l'hôpital (parfois chaque semaine), souvent pendant de longues heures (4 à 6 heures) voire des jours, par perfusion sous contrôle médical. Pour le bien-être du patient, l'administration orale d'un traitement anticancéreux représentera une révolution et une amélioration sans précédent de sa qualité de vie. Enfin, notre démarche s’inscrit dans le contexte du traitement d’indications orphelines telles que les lésions précancéreuses de la muqueuse buccale, qui laissent, par définition, les patients sans aucune chance de traitement.
Procédures
Tous les animaux vont avoir un prélèvement de tissus au niveau de la queue sous anesthésie gazeuse ce qui va entrainer un léger stress de quelques minutes. Elles seront bouclées lors de cette anesthésie. 48 animaux vont avoir une laparoscopie pour la greffe orthotopique. Parmi, ces animaux Chaque semaine, ils seront suivis en imagerie. Ils auront également un prélèvement de sang toutes les 2 semaines. Dès la 3ème semaine et jusqu’à la 8ème, 8 animaux seront euthanasiés par semaine pour observer la croissance cellulaire. Pour les tests d’efficacité du médicament, 270 animaux recevront une greffe. Pour chaque groupe, différentes posologies de traitements par gavage et/ou injections seront administrées. Le suivi sera réalisé en imagerie et par observation quotidienne de l’état général des animaux en accord avec une grille de score et le bien-être animal.
Impact sur les animaux
L’injection en intra-péritonéale du réactif pour la bioluminescence permettant l’analyse par imagerie de l’animal vont entrainer au réveil de l’animal un léger stress. Les gestes de chirurgie entrainent au réveil des animaux de l'inconfort et du stress malgré la prise en charge de la douleur avec l'analgésie et des anti-inflammatoire. Cette douleur résultante peut être observée pendant 48h. Les traitements par intra-veineuse ou par injection péritonéale n’entraineront pas de douleur supérieure à celle d’une piqure d’aiguille avec un léger stress de courte durée sur les animaux sur la durée de la contention. Les traitements lors des gavages entraineront un léger stress de courte durée lors de la contention.
Devenir
Après le traitement, chaque cohorte sera mise à mort à un temps donné afin de prélever les organes (estomac, foie, poumon…) pour observer la présence de tumeur au niveau de l'estomac et la présence de métastases dans les autres organes. En parallèle, des analyses permettront d’observer les populations immunitaires recrutées au niveau de la tumeur mais aussi des autres organes permettant de valider l’action des anticorps médicaments
Remplacement
Des tests in vitro ont été au préalable effectués afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de notre traitement . La reconnaissance du marqueur tumoral, le recrutement et activation des cellules immunes par notre molécule, l’induction de la mort cellulaire tumorale sont validés de manière in-vitro. Cependant le recours à des techniques totalement in vitro ou sur organes isolés ne permettent pas de valider complètement l’efficacité de notre molécule. La complexité de l’environnement cellulaire de la tumeur et la voie d’administration sont primordials sur la biodistribution de notre molécule. En effet, les différents traitements testés ont besoin de l’environnement tumoral afin d’être efficaces car ils engendrent des mécanismes cellulaires (par exemple, le recrutement des cellules du système immunitaire muqueux ou le trafic sanguin et lymphatique). Enfin, ces techniques in vivo nous permettent de vérifier l’accessibilité de notre traitement à la tumeur tissulaire ou aux métastases à distance du site primaire tumoral et du site d’absorption de notre molécule).
Réduction
Afin de tester ces différentes conditions de manière fiable, il faut un nombre suffisant d’animaux afin d’obtenir des résultats robustes nous permettant de passer à des études pré-cliniques réglementaires puis cliniques chez l’Homme. La première procédure permettra de déterminer la vitesse de croissance et le temps d’essaimage de métastases d’une greffe tumorale orthotopique et de valider la technique de monitoring par imagerie en bioluminescence. Cette imagerie optique permet de réduire le nombre d’animaux utilisés puisque le suivi du développement tumoral se fait de manière longitudinale sur un même groupe d’animaux. La bioluminescence permet également d’anticiper l’apparition des tumeurs profondes non visibles autrement que par l’imagerie et d’inclure ce suivi dans la grille de score. Cet outil qu’est la bioluminescence nous permettra de sélectionner que les animaux ayant une taille de tumeur correspondant à notre besoin ainsi que de déterminer la présence ou non de métastases. Effectivement, lors de l’étude précédente, certains animaux présentaient une taille de tumeur plus importante que la moyenne du lot (dû à la variabilité expérimentale dans l’implantation tumorale) et ne pouvaient donc pas rentrer dans l’analyse. Cette procédure nous permettra de commencer les traitements à partir d’une certaine taille tumorale (correspondant à celle obtenus lors de l’apparition de métastases) et donc de limiter le nombre d’animaux dans la procédure tout en garantissant que ceux greffés et sélectionnés correspondent aux critères de l’étude et donc seront analysables à la fin de la procédure.
Raffinement
Afin de limiter le stress des animaux, une période minimale de 5 jours d'acclimations à la zone d'hébergement expérimentale sera effectuée. Ils seront également progressivement manipulés régulièrement lors du change et des surveillances afin de les habituer aux contentions et autres manipulations. Les procédures de chirurgie seront réalisées selon les dernières recommandations de l’afstal 20235 avec une anesthésie stable et contrôlée en isoflurane (3% induction puis maintien à 1,5%) avec prise en charge multimodale de l’analgésie avec buprénorphine, alpha2 agoniste et anesthésie locale. L’asepsie sera la plus importante possible. La gestion de l’analgésie post-opératoire sera stricte et suivie pour éviter toute douleur aux animaux. Un échange sera fait avec l'équipe de soigneur pour optimiser les soins en post-opératoire (éviter tout mouvement ou changement de cage aux animaux durant cette période, apport d'eau et nourriture gélifiée, augmentation des enrichissements de type nid pour conserver sa température). Tout au long des procédures de chirurgie et d’imagerie les animaux seront maintenus sur tapis chauffant à 37°C. Pour éviter toute sécheresse oculaire du gel ophtalmique de cyclosporine sera appliqué. L'apport de l'imagerie optique par bioluminescence dans le suivi du développement tumoral permet aussi de s'inscrire dans une démarche de raffinement puisque cet outil permet de réaliser un suivi de paramètres intrinsèques de manière très peu invasive pour les animaux. Durant toute la procédure, les animaux seront étroitement surveillés en applicant le suivis des points limites grâce à la grille de score mise en place pour ce projet.
Choix des espèces
L’espèce a été choisie pour son temps de gestation court, de plus, cette espèce est utilisée à des fins scientifiques internationalement et possède un système immunitaire proche de celui de l’Homme. Les animaux utilisés auront entre 2 et 8 mois afin d'avoir un système immunitaire non défaillant.