Procédures légères

Jusqu'à cinq injections par semaine pendant huit semaines, une biopsie de la queue, puis 48 heures en cage métabolique où le porteur décrit inconfort, froid et isolement. 13 696 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le résumé consacre une phrase à l'objectif, comprendre l'interaction entre deux protéines dans le développement d'une maladie bénigne de la prostate, et une phrase aux bénéfices attendus. Rien n'y rattache l'effectif de 13 696 souris, le porteur indiquant seulement avoir calculé ses stratégies d'accouplement d'après des expériences antérieures.

Objectifs

L’objectif du projet est de comprendre l’interaction entre deux protéines dans le développement d’une maladie bénigne de la prostate.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est de participer à l’accumulation de connaissances sur le développement d’une maladie bénigne de la prostate tout en proposant de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Biopsie – 1 (1 seconde) ; Injection – jusqu’à 5 par semaine durant 8 semaines (quelques secondes) ; Cage métabolique – 1 (48h).

Impact sur les animaux

Biopsie de queue : Douleur légère et rapide (une seconde). Injection: Stress et douleur légère et rapide (quelques secondes). Cage métabolique : Inconfort, froid et isolement pendant 48h

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des tissus d'intérêt.

Remplacement

Selon le principe du Remplacement, des études préliminaires ont été menées sur des modèles cellulaires in vitro afin d’évaluer la pertinence et la durée des traitements choisis. Pour répondre à ces questions, l’utilisation de modèles de souris est indispensable car aucun système in vitro ne permet de reproduire le développement de cette maladie de la prostate, ni les interactions avec les différentes cellules immunitaires qui ont une grande dynamique au sein d’un même organe et dans le corps.

Réduction

Les stratégies d’accouplements ont été calculés selon des expériences antérieurs pour générer un nombre suffisant d’animaux pour réaliser au mieux les expériences. En outre, les croisements ont été optimisés pour produire les animaux d’intérêt. Le nombre de souris utilisé sera réduit au minimum tout en permettant une analyse statistique fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les souris seront sous surveillance quotidienne de la part de l’équipe professionnelle de zootechnie et lorsque cela est nécessaire une grille de score adaptée sera mise en place et rempli de manière hebdomadaire. Toutes les étapes du projet sont soumises à des points-limites de gravité variable qui conduisent à une décision immédiate ou différée, qui peut inclure, le renforcement de la surveillance des animaux, l'augmentation de l'enrichissement et/ou à la mise à mort. Les injections sont effectuées avec des aiguilles adaptées. Si une infection apparait sur la zone d’injections répétée, de la pommade antiseptique sera appliqué jusqu’à disparition des symptomes.

Choix des espèces

La souris permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Il existe en effet d’un modèle de souris ayant une maladie begnine de la prostate représentant fidèlement la pathologie humaine. De plus, les modèles animaux créent le lien indispensable entre les tests in vitro et les études cliniques. De nombreux outils d’analyse ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Pour l’approche pharmacologique, il sera utilisé des animaux âgés de 3 mois, stade précoce du développement de la maladie begnine de la prostate et de 6 mois, âge où la pathologie est bien installée. Ceci permettra d’étudier le rôle de l’inhibition du récepteur étudié ou de l’un de ses ligands sur la pathogénèse ou en potentiel traitement.

Tuées en cours ou en fin de procédure pour prélever les tissus de leur oreille interne, 694 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie d'entre elles est génétiquement sourde. Elles subissent des mesures de l'audition, une chirurgie de quinze minutes et l'administration d'un traitement génique dans l'oreille interne, soit par la voie chirurgicale classique, soit par un dépôt assisté par laser dont le porteur annonce qu'il ne génère "aucune douleur ou traumatisme", des douleurs étant en revanche attendues durant les deux jours qui suivent la chirurgie. Le porteur appuie le choix de l'espèce sur l'affirmation que le patrimoine génétique de la souris est "identique à 99% à celui de l'espèce humaine", et opère les souriceaux à treize jours, âge auquel leur audition commence à être évaluable.

Objectifs

La surdité profonde héréditaire humaine liée à la mutation du gène de l’Otoferline est actuellement l’objet des premiers tests de thérapie génique de l’oreille interne chez l’homme. Mais, cette thérapie ne restaure que la forme principale de l’Otoferline et repose sur une chirurgie invasive et traumatisante pour l’oreille interne, réduisant le taux de réussite. Notre laboratoire a montré qu’une seconde forme de l’Otoferline est également exprimée. Nous proposons de mesurer les bénéfices qu’apporterait une double thérapie génique réparant les deux formes de l’Otoferline dans la restauration de la fonction auditive. En parallèle, nous développerons une méthode de délivrance de thérapie génique dans l’oreille interne, innovante et non traumatisante. En adaptant la technique de bioimpression assistée par laser, il est possible de faire de l’administration de thérapie génique permettant la correction de surdité d’origine génétique. Nous souhaitons valider un nouveau dispositif laser conduit à l’aide d’une fibre optique et permettant le dépôt ciblé de thérapie génique sur l’oreille interne humaine, sans chirurgie invasive. L’objectif est de valider la récupération de l’audition chez un modèle de souris génétiquement sourdes avec cette technique révolutionnaire. A l’issue de ce projet, nous disposerons des arguments pour introduire la seconde forme de l’Otoferline dans les protocoles de thérapies géniques chez l’homme et transposer la méthode de délivrance assistée par laser dans tous les futurs traitements ciblant l’oreille interne avec un laser conduit par fibre optique.

Bénéfices attendus

Les premiers traitements par thérapie génique des surdités profondes chez des patients déficients pour le gène de l’Otoferline sont prometteurs mais restent à améliorer. La caractérisation fonctionnelle d’une autre forme de cette protéine dans la fonction auditive démontrera le bénéfice médical d’une thérapie génique incluant sa restauration. Cette prise en compte dans les thérapies des patients traités devrait suivre rapidement après la publication des travaux. De plus, ce projet permettra d’améliorer le dispositif d’administration de thérapie génique ciblée vers le système auditif sans risque d’endommager des structures auditives, contrairement aux stratégies développées à ce jour. D’un point de vue technique, ce projet est une étape-clé pour optimiser la technologie de délivrance ciblée de médicaments assistée par laser. Le développement d’un prototype avec un partenaire industriel se fera durant le projet. Les études cliniques de ce système interviendraient à l’issue du projet.

Procédures

Selon la procédure, les animaux seront soumis à des mesures de l’audition, n’excédant pas 15 minutes. Cette mesure est similaire aux mesures réalisées sur l’homme éveillé. Les animaux seront soumis à une chirurgie (durée de 15 minutes) et à une administration de médicaments ciblant l’oreille, soit par une méthode classique (durée de 5 minutes), soit par délivrance assistée par laser (durée de 10 à 12 minutes au total pour installer la souris, paramétrer le laser puis administrer le médicament). L’administration de médicaments assistée par laser ne génèrent aucune douleur ou traumatisme chez l’animal, et est réalisée sous anesthésie générale car cela nécessite une immobilisation complète de l’animal. Dans leur globalité, les procédures préopératoires et opératoires n’excèdent pas 40 minutes maximum afin de limiter la durée de l’anesthésie. Toutes ces interventions seront faites sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir du stress avant et lors des anesthésie (entre 2 et 5 minutes). Un délai de 24h minimum sera respecté entre les anesthésies pour le limiter. Des douleurs pourront être ressenties après la chirurgie durant les 2 jours post-opératoires. Les protocoles de dépôt assisté par laser et de mesure de l’audition n'engendreront aucune douleur.

Devenir

En cours ou à la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort par une méthode garantissant l’absence de nuisances, de stress et de douleur. Sur l’ensemble des animaux du projet, les tissus de l’oreille interne seront prélevés pour des analyses quantitatives et qualitatives.

Remplacement

L’application de thérapie génique assistée par laser s’insérant dans un projet d’application clinique future, il est nécessaire de valider son efficacité (diffusion et transfert) et son innocuité (sans impact auditif) sur un modèle animal. La caractérisation de ces surdités est également nécessaire pour mieux comprendre l’effet de la thérapie génique. Seules les conditions in vivo chez l’animal permettent d’évaluer l’effet de la procédure sur l’audition. Ces mesures doivent être effectuées sur des animaux mammifères qui possèdent un système auditif suffisamment proche de l’homme, et un défaut auditif génétique similaire. Aucun environnement multifactoriel ne permet de reproduire ce modèle in vitro. Néanmoins, des études in vitro et ex vivo seront réalisées pour valider le transfert de la thérapie génique au niveau cellulaire, et sélectionner les paramètres laser du dépôt ciblé, de la perméabilisation, et du gel contenant la thérapie génique.

Réduction

Avant de procéder aux expérimentations animales, des tests préliminaires seront effectués afin de fixer l’entièreté des paramètres de bioimpression (paramètres laser et composition de l’hydrogel) et afin de valider la méthode de perméabilisation. Chaque souris sera utilisée pour l’entièreté de la procédure correspondante afin d’en limiter le nombre. Nous utiliserons le plus petit nombre possible de souris par procédure. Le nombre total de 694 souris sur l’ensemble du projet permet de s’assurer de la répétabilité des manipulations avec une marge de manœuvre en cas d’échec, compte tenu du degré de variabilité inter-individuelle, mais un nombre plus faible d’animaux pourrait être suffisant pour obtenir un traitement statistique significatif des données obtenues.

Raffinement

Nous utiliserons des analgésiques en injection ou en gouttes dans toutes les procédures pour réduire la douleur. Les signes d’anesthésies seront monitorés visuellement pour assurer le meilleur confort possible à l’animal durant la procédure. Lors des procédures chirurgicales, selon une grille d’évaluation, l’expérimentateur pourra augmenter la force de l’anesthésie, administrer un bonus d’analgésiques ou bien interrompre l’intervention pour épargner une nuisance trop importante à l’animal. En amont, les gestes opératoires seront mis au point et répétés sur des animaux morts. Dans les jours suivant la chirurgie, la surveillance des animaux sera régie par une grille d’évaluation pour détecter toute forme de nuisances et y remédier : des soins adéquats seront apportés, soit par médication, soit par désinfection de la plaie. Un niveau maximum de score de nuisances est établi à partir duquel on considère que la souffrance de l’animal ne peut plus être jugulée. Le porteur de projet prend alors la décision de la mise à mort de l’animal. Une communication soutenue avec les zootechniciens garantit un suivi qualitatif des animaux. Le stress sera réduit en manipulant régulièrement les animaux dès leur naissance et avant l'anesthésie pour qu'ils s'habituent aux expérimentateurs.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle idéal pour explorer les surdités génétiques humaines. Son patrimoine génétique est identique à 99% à celui de l’espèce humaine. De nombreuses lignées de souris portant des mutations sur des gènes responsables de pathologies chez l’humain existent. L’évaluation de l’impact de la bioimpression assistée par laser sur la fonction auditive et l’efficacité de la thérapie génique dans l’oreille interne nécessite de réaliser des expérimentations sur l’animal. La caractérisation des surdités d’origine génétique et les mesures de l'audition associées ne peuvent se faire sur des animaux non-mammifères car leur système auditif est trop éloigné de celui de l'homme. Chez la souris, l’anatomie cochléaire est également similaire, et la fenêtre ronde est bien accessible par voie chirurgicale. Des études présentent les voies d’accès à la membrane de la fenêtre ronde chez la souris, afin d’avoir une chirurgie reproductible et le moins traumatique possible. Les chirurgies pour la bio-impression concernent des souris âgées de 13 jours, stade qui correspond à l'entrée en fonction du système auditif chez la souris et où l’audition commence à être évaluable. De plus, les souris plus âgées présentent une structure anatomique limitant l’accès à la fenêtre ronde. Les chirurgies de thérapies géniques sont efficaces dès 3 jours, permettant l’apparition de l’effet souhaité dès le 6éme jour et le maintien de cet effet pendant plusieurs mois. Les stades 1 mois et 2 mois correspondent au début des pertes auditives dans certaines souris étudiées. Les stades 3 mois, 6 mois et 1 an nous permettront de caractériser l'évolution des pertes auditives durant le vieillissement naturel des souris.

Gavées pendant leur gestation, 255 souris femelles portent les embryons qui sont l'objet réel de l'étude. Au total 450 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées par dislocation cervicale à la fin des procédures pour prélever leurs tissus. Cent cinquante d'entre elles subissent quatre électrocardiogrammes sous anesthésie gazeuse espacés d'un mois, deux de cinq minutes et deux de vingt-cinq minutes, avec deux injections intrapéritonéales, l'ensemble visant à comprendre comment se forme la cloison entre les deux ventricules du cœur et comment s'y installe le circuit électrique. Le porteur affirme étudier "des embryons de souris non impactés directement par les procédures", tout en gavant leurs mères pendant la gestation et en annonçant une perte de fonction de gènes chez la souris.

Objectifs

Les malformations cardiaques affectent une naissance sur cent avec un impact sociétal majeur. Les défauts de formation du septum ventriculaire, autrement dit la paroi qui sépare le sang riche en oxygène dans le ventricuale gauche du sang pauvre en oxygène dans le ventricule droit, comptent parmi les malformations les plus courantes observées chez l’homme. Ces malformations sont souvent accompagnées de troubles du rythme avec des arrythmies ventriculaires pouvant entrainer la mort subite. Cette association s’explique par le fait que le septum ventriculaire sert de support au développement du système de conduction ventriculaire, le circuit électrique responsable de la synchronisation des battements du cœur. Malgré l'importance clinique des malformations septales et des arythmies ventriculaires, il reste des questions majeures pour comprendre leurs étiologies. 1. Comment se forme le septum ventriculaire ? La signalisation de l'acide rétinoïque (AR) jouant un role important pour la septation ventriculaire, le but de ce projet est d'identifier les régions du septum et les gènes cibles de l'AR nécessaires à la septation grâce à des techniques de traçage génétique combiné à une perte de fonction de ces gènes chez la souris. 2. Comment l'association entre le septum et le système de conduction se produit-elle au cours du développement ? Nous étudierons l'émergence des différents composants du septum et du système de conduction à l'aide de nouveaux outils génétiques et d’analyse de traçage génétique. 3. Comment le système de conduction se développe- t-il dans les cœurs présentant des malformations du septum ventriculaire ? Nous caractériserons le système de conduction dans deux modèles murins de malformations septales ventriculaires : les cœurs de souris modèles du syndrome de délétion 22q11.2 (DiGeorge), et les cœurs déficients en signalisation de l’AR. L'ensemble de nos résultats permettra de mieux comprendre les liens entre la forme et la fonction du cœur en développement, ainsi que les mécanismes pathologiques qui sous-tendent les malformations du septum et les arythmies ventriculaires.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet vise à apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes qui sous-tendent le développement normal et pathologique du septum ventriculaire. Ces connaissances sont essentielles pour comprendre l'étiologie des malformations cardiaques congénitales humaines (1 sur 100 naissances vivantes) et des syndromes génétiques humains avec des malformations cardiaques, tels que ceux observés dans le syndrome de délétion 22q11.2 (DiGeorge) ou les cardiomyopathies congénitales. Vu la conservation de la structure du cœur chez l'homme et la souris, la souris constitue un modèle génétiquement puissant pour répondre à ces questions fondamentales et cliniquement pertinentes. Dans le long terme, ces résultats pourraient avoir des répercussions dans le développement des nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques de ces malformations cardiaques.

Procédures

Dans ce projet, nous étudierons essentiellement des embryons de souris générées par croisement de souris adultes sans phénotype dommageable. Les interventions dans de notre projet concernent le gavage de souris femelles gestantes (une fois 1 minute dans leur vie N=255, ou deux fois concernant une partie des souris de la procédure 2 N=15) et l’enregistrement d’un électrocardiogramme sous anesthésie gazeuse de 4 ECG par souris espacé d’un mois entre chaque enregistrement, deux fois pendant 5 minutes et deux fois 25 minutes dans leur vie (N=150). Une injection IP (5 secondes) sous anesthésie gazeuse sera réalisée deux fois dans leur vie pendant l’enregistrement de l’ECG.

Impact sur les animaux

Les lignées de souris avec lesquelles nous travaillerons n'ont pas de phénotype dommageable chez les adultes. Dans ce projet, nous étudierons essentiellement des embryons de souris non impactés directement par les procédures. Les effets indésirables sur les animaux adultes seront réduits au stress lors de la contention pour le gavage ou enregistrement d’un électrocardiogramme. Les injections IP réalisées sous anesthésie gazeuse sont indolores pour les souris et n’ont pas d’impact à long terme. Nous appliquerons les mesures adéquates pour réduire leur stress et veiller à leur bien-être.

Devenir

Tous les animaux adultes seront euthanasiés par dislocation cervicale à la fin des procédures pour le prélèvement des tissus.

Remplacement

Les méthodes in vitro (culture de cellules ou organoïdes) ne peuvent remplacer ni la morphogénèse du cœur dans l’embryon aux stades étudiés, ni la fonction cardiaque comme la synchronisation des battements du coeur, en raison de l’isolement des cellules du contexte physiologique et de l’impossibilité d’analyser conjointement differentes destinées cellulaires.

Réduction

Nous nous efforçons de limiter le nombre d’animaux par groupe en tenant compte des contrôles et en utilisant le maximum de données de chaque animal. Nos expériences précédentes dans ces expérimentations sur des souris transgéniques montrent une certaine hétérogénéité dans les résultats. Nous en avons tenu compte dans l’estimation de l’effectif nécessaire pour obtenir un minimum de 3 répétitions pour chaque résultat.

Raffinement

Nous sommes attentifs à limiter le stress (souris maintenues en groupe, avec enrichissement de l’environnement), les souris ayant subi un gavage ou suite à un enregistrement d’électrocardiogramme seront placées en milieu enrichi (coton, dôme) dans une zone de stabulation dédiée, avec moins de bruit et de passages, et seront observées quotidiennement par un animalier ou l’expérimentateur. Nous insistons sur la formation et l’expérience des personnes pratiquant les injections et le gavage. La maîtrise de ces gestes réduisent d’une part le temps de contention, diminuant ainsi les effets stress chez les animaux, et garantissent la bonne tolérance de la procédure et une meilleure reproductibilité auprès des animaux. Nous établissons les points limites les plus précoces possibles en fonction de l’objectif de l’expérimentation.

Choix des espèces

L’expérimentation animale qui utilise des souris sauvages et génétiquement modifiées est indispensable à l’étude et à la réalisation de notre projet. Les souris génétiquement modifiées fournissent des modèles de cardiopathies congénitales et des troubles du rythme cardiaque. Les animaux génétiquement modifiés sont un atout majeur pour nos projets afin d’identifier l’origine embryonnaire de ces anomalies, de suivre le devenir des cellules au cours de la formation du coeur, et d’intégrer les processus développementaux. Les résultats doivent permettre des avancées majeures pour la compréhension et le traitement à long terme de ces pathologies chez l’homme. Chez la souris, le développement et le fonctionnement physiologique du cœur sont similaires à ceux décrits chez l’Homme. Ceci est particulièrement vrai pour le septum interventriculaire et le système de conduction ventriculaire. L’utilisation de souris génétiquement modifiées représente donc le modèle le plus pertinent en ce qui concerne la compréhension de ces maladies humaines. Procédures 1 et 2 : femelles adultes gestantes. Procédure 3 et 4 : Souris adultes.

L'application d'imiquimod sur la peau provoque rougeurs, desquamation, épaississement et parfois excoriations, avec des démangeaisons, pendant environ huit jours : c'est ainsi qu'un psoriasis est déclenché chez 2 350 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes seront tuées en fin de procédure pour prélever le sang total et des tissus. S'y ajoutent une application de microbiote cutané humain, des séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse et une prise de sang, l'ensemble servant à tester des molécules candidates contre le psoriasis, y compris chez des souris porteuses d'une protéine humaine impliquée dans l'inflammation. Le porteur affirme conduire chaque geste de façon à "garantir à la fois le bien-être animal et la qualité des données produites", et vante un "excellent modèle de psoriasis" sans jamais nommer l'espèce dans le passage qui justifie ce choix, où il parle au pluriel de "ces espèces".

Objectifs

Le psoriasis est une maladie auto-immune de la peau qui touche 1 à 3 % de la population mondiale. Chez l’homme, le psoriasis se caractérise par des lésions cutanée du cuir chevelu, des genoux et des coudes, associée à une atteinte des ongles. Dans les cas graves, l'atteinte cutanée peut être généralisée (érythrodermie) et il peut exister des atteintes des articulations. Cette dermatose évolue de façon chronique avec des poussées entrecoupées de périodes de rémissions de durée variable au cours desquelles les lésions sont minimes. Aucun traitement curatif n’est connu actuellement, mais des traitements symptomatiques existent. Il est donc important d’avoir un modèle préclinique prédictif du psoriasis et afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques, il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle. Le projet sera conduit chez des souris sauvages et chez des souris transgéniques exprimant une protéine humaine impliquée dans les processus inflammatoires et dont le rôle dans la physiopathologie du psoriasis suscite un intérêt croissant. L’utilisation conjointe de ces deux types d'animaux vise à mieux comprendre l’impact de l’expression de cette protéine sur l’intensité de la réponse inflammatoire cutanée et sur la réponse aux traitements testés.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de faire progresser les connaissances scientifiques et appliquées dans le domaine du psoriasis en évaluant l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques dans un modèle préclinique pertinent. Il permettra d’identifier des composés innovants (ou repositionnés) présentant un potentiel anti-psoriasique, ainsi que d’évaluer différentes formulations et voies d’administration, en particulier topiques, adaptées à cette pathologie cutanée. De plus, il permettra de mieux comprendre l’impact de l’expression d'une protéine spécifique sur l’intensité de la réponse inflammatoire cutanée et sur la réponse aux traitements testés. Pendant la durée du projet, les études conduites permettront de sélectionner les molécules les plus prometteuses sur la base de critères objectifs d’efficacité et de tolérance. L’évaluation de différentes doses et schémas d’administration contribuera à l’optimisation des fenêtres thérapeutiques. Le projet permettra également d’explorer des effets de synergie entre plusieurs molécules ou entre une molécule et une formulation spécifique. Les données cliniques, biologiques, histologiques et d’imagerie générées amélioreront la compréhension des mécanismes inflammatoires impliqués dans le psoriasis et de leur modulation pharmacologique. À plus long terme, ce projet apportera des preuves d’efficacité précliniques indispensables au développement clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le psoriasis. L’identification de molécules plus efficaces, de formulations optimisées et de doses mieux adaptées pourrait conduire à des traitements plus ciblés, mieux tolérés et plus efficaces pour les patients. Les connaissances acquises sur l’optimisation des associations thérapeutiques pourront également être transposées à d’autres maladies inflammatoires chroniques, avec un bénéfice potentiel élargi pour la santé humaine.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à un ensemble d’interventions techniques brèves, non chirurgicales , nécessaires à l’induction et au suivi de la pathologie. Les interventions réalisées lors de l’induction et du suivi du modèle sont les suivantes : manipulation quotidienne des animaux (1 à 2 minutes maximum), contention pour administrations de molécules à visée thérapeutique (durée d’intervention de 30 à 60 secondes en fonction de la voie d’administration), examens d’imagerie non invasive par Tomographie Optique de Cohérence ou OCT / par imagerie de fluorescence / par imagerie de bioluminescence sous anesthésie gazeuse (une à deux fois par animal ; durée de la session d’imagerie : 5 minutes maximum), un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (une fois au cours de la procédure d’induction, durée d’environ 3 minutes). Chaque intervention est conduite par un personnel qualifié, en conditions contrôlées, afin de garantir à la fois le bien-être animal et la qualité des données produites.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont susceptibles d’entraîner des effets indésirables transitoires chez les animaux, principalement liés à l’induction du psoriasis, aux manipulations répétées et aux administrations de traitements. L’application topique de microbiote cutanée humain peut provoquer un stress ponctuel lié à la contention de l’animal ainsi qu’un inconfort, sans entraîner de lésions cutanées et/ ou d’infections chez les animaux. L’induction du psoriasis par application topique d’imiquimod entraîne l’apparition de lésions cutanées inflammatoires localisées (érythème, desquamation, un épaississement de la peau et parfois des excoriations). Ces lésions peuvent être associées à un inconfort local et à des démangeaisons. Leur intensité est variable et elles persistent pendant la phase d’induction, d’une durée d’environ 8 jours, puis régressent progressivement lors de la phase de traitement ou après l’arrêt de l’induction. Les manipulations répétées (applications topiques, évaluations cliniques, imagerie non invasive) ainsi que les anesthésies gazeuses répétées peuvent induire un stress modéré et transitoire, pouvant se traduire par une diminution temporaire de l’activité ou une modification passagère du comportement. Un retour à un comportement normal est attendu rapidement après chaque intervention. Les administrations de traitements par voie orale, parentérale ou topique, ainsi que les prélèvements sanguins de faible volume, peuvent provoquer un inconfort ponctuel et un stress léger, sans douleur prolongée attendue. Une perte de poids modérée et transitoire peut être observée chez ces animaux au cours de l’étude. L’ensemble de ces effets est réversible et fait l’objet d’un suivi quotidien (poids, hydratation et comportement), avec application de points limites prédéfinis afin de prévenir toute souffrance excessive.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car des prélèvements de sang total seront réalisés. Des prélèvements tissulaires post-mortem pourront également être réalisés.

Remplacement

Afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques, il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro de psoriasis pouvant remplacer complètement le micro-environnement cutané en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux appliqués directement sur la peau en application externe (topique) - L’efficacité ne pouvant être testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’homme).

Réduction

La stratégie d’expérimentation consiste à suivre les mêmes animaux dans le temps (étude longitudinale) par observation répétée avec ou sans procédure d’imagerie. Chaque animal devient son propre contrôle car il est observé une première fois avant de commencer les traitements (observation à T=0) puis à différents temps. Cette approche expérimentale permet d’obtenir des résultats plus fiables avec moins d’animaux. Le nombre d’animaux sera de 10 animaux maximums par groupe de traitement (groupe d’animaux devant recevoir la molécule à tester ou le traitement thérapeutique). Ce nombre est le minimum statistiquement nécessaire pour avoir des résultats robustes. Des analyses seront réalisées à la fin de(s) la procédure(s) sur les tissus provenant des animaux afin d’obtenir le plus d’informations possibles relatives à l’efficacité des molécules administrées ou des traitements thérapeutiques effectués sur les animaux et d’éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires.

Raffinement

Conformément à la réglementation en vigueur, ce projet est conçu afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance, l’angoisse et toute nuisance durable infligées aux animaux, tout en garantissant la validité scientifique des résultats. Le recours à l’imagerie non invasive (par exemple l'imagerie par bioluminescence ou fluorescence) permet un suivi longitudinal des lésions chez les mêmes animaux, limitant ainsi le nombre de manipulations terminales et la répétition de procédures invasives. Une surveillance clinique quotidienne est mise en place pendant toute la durée des procédures, incluant l’évaluation du poids, de l’état d’hydratation, du comportement, de l’activité et de l’état des lésions cutanées. Des points limites précoces et prédictifs ont été définis afin de permettre une interruption rapide de la procédure ou une mise à mort anticipée en cas de dégradation de l’état général de l’animal. En cas de signes de déshydratation ou de perte de poids, des mesures correctrices immédiates seront mises en œuvre (apport alimentaire humidifié, gels nutritionnels, réhydratation par sérum physiologique). Les conditions d’hébergement sont enrichies (igloos, tunnels, matériaux de nidification) afin de réduire le stress. Les manipulations potentiellement stressantes (imagerie, prélèvements, administrations) seront réalisées sous anesthésie gazeuse, permettant une induction et un réveil rapides, avec un inconfort limité. Les volumes et fréquences de prélèvements sanguins sont strictement limités. Tout au long de la durée de vie du projet, une veille scientifique et réglementaire sera assurée. Les animaux seront manipulés par du personnel formé et expérimenté, afin de limiter la durée et l’impact des interventions.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée dans ce projet représente un excellent modèle de psoriasis. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l'évaluation du psoriasis induit dans ces espèces. Ces animaux développent des symptômes de psoriasis très semblables à ceux observés chez l'humain. De plus, ces modèles présentent certains intérêts pratiques indéniables : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (8-12 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Ce stade de développement correspond à l’âge de maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Tous les animaux auront le même âge. Les résultats publiés avec ce modèle utilisent des animaux de cet âge.

Produire du sérum sanguin servant de réactif aux laboratoires : 350 rongeurs, soit 200 souris, 50 rats, 50 cobayes et 50 hamsters dorés, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à la fin de chaque campagne pour récolter le plus de sérum possible. Chacun reçoit une ou deux injections d'antigène ou de vaccin sans anesthésie, à trois ou quatre semaines d'intervalle, subit un ou deux prélèvements sanguins puis un prélèvement terminal sous anesthésie. Des nodules peuvent apparaître chez les rats et les cobayes. Le nombre d'individus utilisés ne repose sur aucun calcul : il est "fixé par les laboratoires en fonction de leurs besoins", et le porteur écrit qu'il n'est "actuellement pas possible de le réduire".

Objectifs

Ce projet a pour objectifs : - la production de réactifs sériques (anticorps polyclonaux) nécessaires aux laboratoires pour effectuer et valider les tests in vitro, et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés dans les procédures de contrôles qualité ayant pour but la libération d’un lot pharmaceutique. Ces tests sont effectués sur espèces rongeurs, il n’existe actuellement pas de modèle in vitro alternatif. - être en adéquation avec les exigences réglementaires du dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM).

Bénéfices attendus

Les campagnes de production de serum sont demandées par les laboratoires selon leurs stocks et leur permettent la réalisation des contrôles in vitro. Environ 1 campagne sur les 5 ans sur les espèces rat, cobaye et hamster et 3 à 4 campagnes sur les 5 ans sur l'espèce souris. Ceci permet la libération de milliers de vaccins qui protègent efficacement les animaux contre les maladies infectieuses améliorant directement la qualité sanitaire des élevages. Ces tests permettent la mise en place de méthodes alternatives.

Procédures

1 à 2 administrations de produits (antigène ou vaccin), en sous cutanée ou intrapéritonéale ou intramusculaire (en fonction des techniques) à 3, 4 semaines d'intervalles sur animal vigile. L'acte est inférieur à 1 minute. 1 à 2 prélèvements sanguin sur animal vigile. L'acte est inférieur à 1 minute. 1 prélèvement terminal sur animal anesthésié. L'acte est inférieur à 1 minute.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir une douleur légère de courte durée dû aux administrations et aux prélèvements. Des nodules peuvent apparaitre chez les rats et les cobayes

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la production afin de récolter un maximum de sérum

Remplacement

La réalisation des contrôles in vitro nécessite la production de sérums (anticorps polyclonaux) qui sont utilisés comme réactifs dans des tests de contrôle. Actuellement, cette production est possible uniquement dans un modèle in vivo. Aucun modèle in vitro alternatif n’a pu être mis au point pour la production d’anticorps polyclonaux.

Réduction

Le nombre d’animaux est fixé par les laboratoires en fonction de leurs besoins et du type de réactifs nécessaire. Il n’est actuellement pas possible de le réduire.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 jours minimum est requise pour les rongeurs. Les animaux sont observés quotidiennement. Des analgésiques sont prévus en cas d'apparition de nodules douloureux. Les prélèvements terminaux s'effectuent sous une anesthésie profonde. Des géloses hydratantes sont introduites suite aux prélèvements submandibulaires chez la souris. Des points limites sont définis en cas de dégradation de l'état de santé des animaux. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Tous les animaux sont hébergés en groupe. Des enrichissements du milieu ont été mis en place dans les hébergements. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.

Choix des espèces

Les réactifs produits sont spécifiques et liés à l’espèce. Rongeurs : 4 à 10 semaines

Ouverture de l'abdomen sous anesthésie générale sur des femelles gestantes, injection dans le cerveau des embryons puis cinq impulsions électriques de cinq millisecondes : 2 952 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Les souriceaux subissent une biopsie de la queue, d'autres souris une chirurgie d'une heure suivie d'injections sous-cutanées trois jours de suite, d'autres encore une injection intracardiaque de vingt minutes sous anesthésie. Le projet cherche à savoir ce qu'une population de neurones normalement vouée à disparaître au cours du développement fait au cerveau, et ce qui se passe quand ces cellules survivent anormalement. Le bénéfice annoncé tient en une ligne, "étendre nos connaissances" sur ces neurones et leur rôle, sans retombée médicale avancée, pour près de trois mille souris tuées.

Objectifs

Notre projet a pour objectif de mieux comprendre l’influence d’une population neuronale transitoire sur le développement du cerveau. Nous voulons également explorer les conséquences de la survie anormale de ces cellules sur la formation du cerveau.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est d’étendre nos connaissances sur la génération et la mort de nos neurones d’intérêt et quel est leur rôle dans le développement du cerveau.

Procédures

MODIFICATION Les souriceaux des lignées subiront une biopsie à la queue pendant une contention de quelques secondes. Des souris subiront une injection intrapéritonéale et une intervention chirurgicale de 60 minutes sous anesthésie générale, puis une injection sous cutanées d'une durée de deux minutes une fois par jour pendant 3 jours. Les femelles gestantes subiront une injection intrapéritonéale et une intervention chirurgicale de 45 minutes sous anesthésie générale, comprenant une ouverture de l'abdomen et des points de sutures, puis une injection sous cutanées sous anesthésie d'une durée de deux minutes une fois par jour pendant 3 jours. Les embryons subiront une injection intra-cérébrale d'une durée de 5 secondes et 5 pulses de 5ms de courant électrique. Des animaux subiront une anesthésie générale suivie d'une injection intracardiaquependant 20 minutes.

Impact sur les animaux

La biopsie à la queue provoque une douleur légère. Les injections peuvent induire une douleur légère et brève. Les actes chirurgicaux des procédures peuvent entrainer une souffrance qui est minorée ou évitée par le traitement analgésique. Les étapes d’anesthésie et de contention peuvent également provoquer un stress chez l’animal.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques et génétiques.

Remplacement

Les questions scientifiques que nous nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur des cerveaux. Il s’agit ici d’études sur le développement et le fonctionnement du cerveau, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère. Aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.

Réduction

Pour le maintient des lignées génétiquement modifiées, nous nous limiterons à la production des animaux nécéssaires en limitant les accouplements au maximum. Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique, ainsi que par nos expériences antérieures sur ce type d’études de modèles animaux. L’analyse statistique sera réalisée par un test statistique adéquat.

Raffinement

Tous les animaux vivent en groupes familiaux ou sociaux dans un environnement enrichi avec eau et nourriture illimitées. Lors de la chirurgie les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées et reçoivent des injections d'analgésiques avant et après l'opération. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation de la santé des animaux est mise en place. Une administration d'analgésique ou la mise à mort de l'animal est envisagée en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement et le fonctionnement du système nerveux, principalement en raison de sa similarité avec l’Homme. En effet, seuls les mammifères présentent un cerveau organisé en 6 couches inversées. Pour le marquage et la biopsie, les souriceaux ont entre 5 et 10 jours, âge auquel on peut tatouer les coussinets des phalanges. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Les expérimentations sont menées sur des animaux aux stades de développement embryonnaire où interviennent les phénomènes étudiés.