Procédures légères

Pour tester des alternatives à la brumisation dans les élevages de poulets de chair, 600 poussins sont exposés à 32 °C pendant cinq heures d'affilée, à deux reprises au cours de leur croissance. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 522 d'entre eux et modéré pour 78. La température rectale est mesurée sur animal vigile, thermomètre introduit dans le cloaque, avant, pendant et après chaque coup de chaleur, sur 25 poulets par traitement. Le porteur indique qu'une température élevée peut provoquer halètement, léthargie, stress oxydatif et troubles de l'absorption intestinale, et que des problèmes de locomotion peuvent apparaître chez les 78 animaux gardés jusqu'à 49 jours. 300 poulets sont mis à mort à 42 jours, l'âge d'abattage des poulets lourds standards, les 300 autres étant rendus à l'élevage.

Objectifs

Les éleveurs sont parmi les professionnels les plus exposés aux aléas climatiques. Ils seront sans doute parmi les plus impactés par les évolutions qui vont s’opérer au cours des prochaines décennies. Ils sont donc particulièrement sensibilisés à ces sujets. Ce projet vise à produire des connaissances nouvelles et des outils nécessaires pour accompagner les éleveurs avicoles dans la mutation des systèmes d’exploitation qu’ils vont devoir opérer pour s’adapter au changement climatique (« adaptation ») et limiter leur impact sur le climat (« atténuation »). Plusieurs méthodes d’adaptation au changement climatique seront testées. Ces méthodes pourront permettre de mettre en place des solutions concrètes en élevage avicole de poulet de chair standard pendant la période estivale. Les épisodes caniculaires deviendront à terme plus longs et plus intenses pour les animaux. Aujourd’hui, la brumisation est une méthode couramment utilisée afin de réguler la température à l’intérieur des batiments d’élevage. Cependant, elle augmente l’impact environnemental des élevages. En effet, la brumisation nécessite une augmentation de l’utilisation d’eau en période de sécheresse. De plus, cette méthode augmente fortement l’hygrométrie et peut détériorer l’état des litières engendrant des problèmes de santé. Il est donc nécessaire de proposer aux éleveurs des solutions plus durables afin de maintenir les performances et la santé de leurs animaux. Afin de tester plusieurs alternatives à la brumisation, deux essais seront mis en place avec des poulets de chair à croissance rapide. Deux scénarios climatiques de stress thermique cyclique seront utilisés afin de tester plusieurs solutions d’adaptation et d’atténuation. Les objectifs opérationnels sont 1/ d’évaluer l’effet du refroidissement de l’eau de boisson 2/ de gérer la quantité d’aliment ingéré en période chaude 3/ de tester un aliment spécialement adapté pour les périodes chaudes.

Bénéfices attendus

Les éleveurs sont fortement impactés par le réchauffement climatique. La brumisation utilisée en période de canicule est un coût supplémentaire pour l’élevage. Ainsi, de plus en plus de recherches se concentrent sur la mise au point de méthodes pour diminuer l’impact des températures élevées sur la croissance, la santé et le bien-être des poulets de chair. Ainsi, le refroidissement de l’eau permettrait aux animaux de mieux réguler leur température corporelle et de réduire le rythme d’halétement. Cela permettrait également d’économiser l’eau qui devient de plus en plus une denrée rare. La mise à jeun permettrait d’éviter une dépense énergétique et une production de chaleur due à la digestion et l’absorption des nutriments. Ces essais permettront de tester des solutions applicables en élevage qui pourront ensuite être recommandées aux éleveurs. Avenant: Les animaux maintenu en élevage de 42 à 49 jours permetteront de collecter des données permettant de modéliser la phase de récupération des animaux à ce stress.

Procédures

La température rectale sera mesurée sur animal vigile avant, pendant et après le stress thermique et ce, pour les deux périodes de coup de chaleur. Cette intervention sera faite sur 25 animaux par traitement. Les animaux mesurés ne seront pas les mêmes entre les deux périodes de stress thermique.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une température de 32°C pendant 5h d’affilée. Une température élevée peut provoquer une augmentation de l’halètement, une léthargie, une accumulation de tissu adipeux, une augmentation du stress oxydatif et des mécanismes d’inflammation. Au niveau intestinal, une température élevée peut induire des désordres d’absorption. L’eau à volonté permettra aux animaux de réguler leur température corporelle. Enfin, la mesure de température rectale nécessite une contention de l’animal et une introduction du thermomètre dans le cloaque pouvant générer un stress. Avenant: Pour les 78 animaux maintenue en élevage de 42 à 49 jours, des problèmes de locomotion peuvent survenir après le dernier stress thermique

Devenir

Pour l’essai 2, les animaux seront mis à mort à 42 jours, ce qui correspond à l’âge d’abattage des poulets lourds standards. Avenant: 78 animaux seront maintenu en élevage jusqu'à 49 jours pour étudier leur capacité à récupérer d'un coup de chaleur et d'étudier les mécanismes physiologiques qui sous tendent cette réponse

Remplacement

Compte tenu des objectifs finaux du projet (évaluation des effets du refroidissement de l’eau de boisson et de la gestion de la prise alimentaire en condition de stress thermique) et de l’absence de techniques in vitro ou de données suffisantes pour de la modélisation permettant de répondre à ces objectifs, l’espèce aviaire ne peut être substituée.

Réduction

Les animaux seront nourris à l’aide de mangeoires électroniques permettant la mesure individuelle automatique du poids et de la consommation alimentaire des animaux. Contrairement à un dispositif en parquet (8 parquets par traitement), ce dispositif permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés dans ce projet. Un total de 300 poussins de 1 jour non sexés sont requis pour chacun des essais (soit un total de 600 animaux sur l’ensemble du projet). Cela permet de constituer 6 groupes de 50 animaux et ainsiévaluer 6 traitements différents. L’unité statistique est l’individu. Concernant la consommation d’aliment, sur la période de 21 à 25 jours, un effectif de 50 poulets par traitement est suffisant pour observer une différence significative de 50g d’aliment ingéré entre les traitements « eau tempérée » et « eau refroidie ». Pour la période de 35 à 42 jours, une différence de consommation est attendue. Les animaux du traitement « aliment à volonté » devraient consommés 7% de plus que les animaux du traitement « aliment intermittent ». Concernant le poids vif à 42 jours, un effectif de 50 poulets nous permettra de voir une différence significative de 130g entre les traitements « eau tempérée » et « eau refroidie ». Pour l’essai 2, la composition des carcasses sera évaluée à la fin de la période d’élevage. Le stress thermique induit une accumulation de gras abdominal. Cela pourrait être réduit via la période de jeun. Une diminution du gras abdominal de 0,26 % (pourcentage de poids vif) est attendue entre les traitements « aliment à volonté » et « aliment intermittent ». Ces estimations ont été faites à partir de données de la littérature et avec un logiciel de statistiques. Au regard de la bibliographie et d’expériences précédentes, le nombre d’animaux/groupe que nous avons définis est nécessaire et suffisant pour mettre en évidence des différences de performances (s’il y en avait).

Raffinement

Les animaux seront élevés au sol, avec une litière en copeaux de bois, en groupe sociaux pendant toute la durée de l’expérience, à une densité inférieure (11 animaux/m²) au maximum autorisé. Ils auront la possibilité d’explorer et de se percher. Un perchoir sera mis à disposition dans chaque parquet. Les effets du stress thermique sur le comportement des animaux pourront être évalués à l’aide d’une méthode d’évaluation du bien-être. Le comportement des animaux sera suivi quotidiennement afin de détecter tout risque de souffrance ou de mal-être. Toute manifestation de symptômes comportementaux persistants définis par les critères suivants, prostration, animal ayant cessé de s’alimenter et de s’abreuver, entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation. Avenant: Entre J42 à J49, la motivation des animaux sera évaluée avec un test de distrubution d'une nourriture appétante (larves séchés) et de réactivité à l'homme.

Choix des espèces

Le poulet domestique a été choisi comme modèle car c’est l’espèce agronomique cible du projet. La souche à croissance rapide utilisée dans cet essai est la souche principale utilisée en élevage de poulet de chair standard. L’objectif de ce projet est d’évaluer la croissance et la consommation alimentaire des poulets de façon individualisée, grâce aux mangeoires électroniques, dans des conditions contrôlées pendant toute la période d’élevage. Ainsi, nous utiliserons des animaux de 1 jour, fournis par un couvoir commercial et nous élèverons les animaux jusqu’à l’âge de 42 jours, âge classique d’abattage des poulets standards lourds. Avenant: Allongement de la durée d'élevage de 42 à 49 jours pour 78 animaux

Les truites qui développent un furoncle de plus d'un centimètre carré, qui nagent sur le dos ou cessent de s'alimenter sont retirées et tuées par surdosage d'anesthésique. 3 172 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 2 692 un niveau léger. Elles reçoivent une marque d'identification, une à trois prises de sang espacées d'au moins quatre semaines, puis une infection par bain avec la bactérie de la furonculose. Le porteur prévoit en outre 300 poissons déclarés non conformes, hors gamme de poids ou ayant rejeté leur marque, pour entraîner les expérimentateurs aux gestes techniques, l'ensemble visant des protocoles de vaccination utilisables en pisciculture et une réduction des pertes économiques.

Objectifs

La furonculose est une maladie bactérienne des Salmonidés due à la bactérie Aeromonas salmonicida sub. salmonicida. Elle entraîne des pertes économiques importantes en raison de sa forte mortalité lors des formes suraiguës et des lésions cutanées qu’elle provoque dans les cas aigus à chroniques. La maladie est saisonnière et touche toutes les classes d’âges des poissons, particulièrement en période estivale. Les vaccins et antibiotiques actuellement utilisés pour prévenir et traiter la furonculose présentent des limites en termes d’efficacité, de lutte contre l’antibiorésistance et de prévention des contaminations environnementales. Ce projet vise donc à optimiser les stratégies vaccinales en comparant différentes protocoles vaccinaux et modalités d'administration contre la furonculose chez la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss), afin d’optimiser leur efficacité et réduire la dépendance aux antibiotiques. Il inclut une évaluation des réponses immunitaires induites et de la protection conférée par chaque protocole, tout en intégrant les contraintes et besoins des professionnels dont les vétérinaires aquacoles prescripteurs. L’objectif est de développer une stratégie vaccinale réaliste, applicable en élevage piscicole et contribuant à une gestion sanitaire durable.

Bénéfices attendus

Les protocoles vaccinaux qui seront testés ont été élaborés à partir des pratiques déjà présentes sur le terrain et des améliorations scientifiques et techniques suggérées par les professionnels. L’évaluation des protocoles vaccinaux permettra d’optimiser la protection des truites contre la furonculose. Les résultats serviront à fournir aux vétérinaires aquacoles et aux éleveurs des recommandations précises sur les schémas vaccinaux les plus efficaces, les moins délétères pour les animaux et les plus faciles / pratiques à administrer. En améliorant les pratiques vaccinales des poissons, ce projet contribuera à : réduire la mortalité des poissons d’élevage, limiter l’usage des antibiotiques, participant ainsi à la lutte contre l’antibiorésistance, favoriser des pratiques d’élevage durables et améliorer le bien-être des poissons en réduisant les impacts des maladies infectieuses et le stress des animaux.

Procédures

Les animaux seront soumis à la pose de tag pour les identifier, à des prises de sang (1 à 3 selon les animaux, espacées d'au moins 4 semaines) et d'infection expérimentale en condition contrôlée. Toutes les manipulations seront réalisées sous anesthésie, par des personnes expériementées, en possession du niveau "concepteur" ou de niveau "applicateur" de la formation "expérimentation animale", et formées aux gestes techniques nécessaires à la procédure

Impact sur les animaux

L'évaluation de l'efficacité vaccinale nécessite d'infecter les truites avec la bactérie Aeromonas salmonicida sub salmonicida. Les manifestations cliniques liées à ce challenge infectieux peuvent entrainer de la souffrance chez les animaux. Le protocole de challenge infectieux par balnéation mis au point dans une étude antérieure (Moreau et al, 2023) permet de limiter ces manifestations. Les poissons seront euthanasiés dès l'observation de furoncles de taille supérieure à 1 cm2 ou de poissons moribonds (mélanisme, nage erratique sur le dos, arrêt de prise alimentaire), selon la grille des points limites en pièce jointe.

Devenir

L'euthanasie des poissons est prévue en fin de protocole, pour des raisons notamment sanitaires (impossibilité de relacher ou de réutiliser des poissons potentiellement infectés par A. salmonicida)

Remplacement

L'objectif du projet étant d'évaluer l'efficacité de la vaccination contre la furonculose, cela ne peut se faire que sur animaux vivants. L'expérimentation animale est nécessaire car il n'existe pas encore de modèle in vitro pour l’étude de l'immunité post-vaccinale chez les poissons.

Réduction

Le nombre de poisson par lot a été déterminé par une approche statistique. Pour vérifier la répétabilité de notre protocole, chaque condition sera réalisée en triplicat. 300 poissons surnuméraires car non conformes (poids hors de la gamme souhaitée, rejet du Tag) sont prévus et serviront pour former les expérimentateurs impliqués aux gestes techniques.

Raffinement

Une observation quotidienne des poissons est assurée. Lors des procédures de challenge infectieux, les poissons font l’objet d’une observation plus rigoureuse deux fois par jour, chaque jour, de manière systématique. • Seuils d’alarme liés aux paramètres d’ambiance : Température de l’eau : si >20°C et non rectifiable, arrêt de l’expérimentation. Oxygène dissous : si 1 cm²) seront retirés de l’expérimentation et euthanasiés par surdosage d’anesthésique. De plus, les conditions d’élevage sont améliorées, avec une densité animale réduite à 25 kg/m³, bien en deçà des pratiques courantes en élevage (50-70 kg/m³), et l'enrichissement des bacs avec des tubes pour permettre aux poissons de se cacher et limiter le stress.

Choix des espèces

La truite arc en Ciel est un hôte naturel d'Aeromonas salmonicida. C'est de plus l'espèce de poisson la plus élevée en France et donc pour laquelle il est important d'améliorer l'efficacité vaccinale. Les truites utilisées seront de 5 g à l’arrivée à la station aquacole d'Oniris, atteignant 20-150 g en cours d’expérimentation. la période durant laquelle le poid des poissons est de 5 à 20 g correspond à la période optimale pour la vaccination en pisciculture. La furonculose est une maladie que l'on observe à différents stades d'élevage (alevins, truites portions = 200-250g et grosse truite > 1kg). D'après notre questionnaire mené auprès des vétérinaires aquacoles, ces poids correspondent aux pratiques de vaccination sur le terrain. En effet, les vétérinaires indiquent que 10 g est le poids optimal pour la vaccination par immersion, car il permet une meilleure absorption du vaccin sans affecter la croissance des poissons. De même, un poids de 20 g est privilégié pour l’injection intrapéritonéale. Ces pratiques sont couramment adoptées en élevage afin d'assurer un développement de la réponse immunitaire durant la croissance des truites.

484 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dont 400 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 84 un niveau léger. Elles reçoivent des injections dans la veine et dans le ventre, une irradiation de dix minutes au maximum sous anesthésie profonde, une greffe de moelle osseuse et des prélèvements de sang. Le porteur signale une immunodéficience transitoire et une dépigmentation après l'irradiation, cette dernière étant qualifiée de sans conséquence sur le bien-être de l'animal. Il conclut que la maturation du système immunitaire ne peut s'étudier que sur un "organisme entier".

Objectifs

Les cellules immunitaires nous protègent des infections et de l'émergence de tumeurs. Cependant, pour être pleinement efficace, elles doivent se maturer progressivement durant les périodes d'homéostasie, c'est-à-dire lorsque l'organisme est en équilibre, en l'absence d'infections ou de pathologies. Notre objectif est de définir les mécanismes qui favorisent un développement optimal des cellules immunitaires pendant ces périodes d'homéostasie où tout va bien.

Bénéfices attendus

En identifiant les facteurs contribuant au développement correct des cellules immunitaires en l’absence de pathologie, ce projet pourrait ouvrir la voie à des stratégies préventives contre diverses infections. Il pourrait aussi permettre d’augmenter les réponses immunitaires chez des populations à risque.

Procédures

- Injection dans la veine dans des souris sous anesthésie gazeuse (1 fois 2min/souris) - Injections dans le ventre (1 fois 20s/souris) - Injection dans le ventre (pour anesthésie profonde) : 1 fois par animal– durée 30 secondes - irradiation (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal– durée 10 minutes maximum, - Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie et application d'analgésie locale ) : 1 fois par animal– durée 30 secondes

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont : i) une légère douleur générée par les injections ; ii) le stress généré par l’anesthésie et les contentions lors des prises de poids; iii) une légère douleur et le stress généré par les prélèvements de sang, l’irradiation et le transfert de moelle osseuse ; iv) le stress généré par le transport entre l’animalerie et l’irradiateur. Légère perte de poids transitoire suite à l’irradiation. - Immunodéficience transitoire due à l’irradiation. Dépigmentation du fait de l’irradiation sans conséquence sur le bien-être de l’animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort. Nous préléverons alors différents tissus pour établir différentes analyses.

Remplacement

La maturation du système immunitaire est un processus complexe qui implique l'interaction de divers acteurs, tels que le microbiote (la flore microbienne), le système immunitaire inné et le système immunitaire adaptatif, et ne peut actuellement être étudiée qu'à l'échelle de l'organisme entier. Par ailleurs, nous avons renforcé nos hypothèses et éliminé un grand nombre de pistes en effectuant une recherche bibliographique exhaustive et en réalisant divers tests in vitro, réduisant ainsi de manière significative notre utilisation d'animaux dans notre projet.

Réduction

Nous avons toute l’expertise technique. Ainsi, il n’y a pas de mises au point nécessaires. Le nombre de souris proposées dans ce projet a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Ce nombre a été calculé à partir d’outil statistique. Ce nombre peut encore être réduit si les tests de prises de décisions (préliminaires) ne valident pas nos hypothèses avancées. Utilisation de technologie de pointe nous permettant de faire certaines analyses de façon combinée réduisant significativement le nombre d’animaux utilisés. Nous utilisons également à la fois les souris mâles et femelles.

Raffinement

En complément des suivis réglementaires quotidiens des zootechniciens, un suivi 5 fois par semaine sera fait par les expérimentateurs permettant un repérage rapide des premiers signes de mal-être. – Des points limites définis et précoces nous permettant d’agir rapidement ont été mis en place. – Hébergement et manipulation des souris dans un environnement stérile - Anesthésie des animaux lors de manipulations invasives comme l’injection dans la veine et ainsi réduire le stress de l’animal et éviter des mouvements de l’animal pouvant le blesser. – Pour favoriser le bien-être des animaux, leur environnement sera enrichi de nids en cartons pour se cacher et de bâtonnets en coton pour créer un nid. - Après l'irradiation, une alimentation plus souple, comprenant des croquettes humidifiées et du gel hydratant, sera mise à disposition dans les cages pendant quelques jours pour faciliter la récupération des animaux. - Une anesthésie locale sera administrée pour réduire la douleur résultant de l’injection ou de la prise de sang. - Pas d’isolement des souris pour respecter au tant que faire ce peu le comportement social des souris.

Choix des espèces

L'utilisation du modèle souris se justifie car nous disposons de toute l’expertise scientifique et technique. Les souris sont un modèle très utilisé en recherche pour adresser les différentes branches du système immunitaire et ainsi la communauté scientifique dispose de divers modèles génétiques et outils scientifiques nous permettant d’adresser ce projet le plus efficacement possible. Le stade adulte (souris 2 mois) est choisi de façon à avoir un système immunitaire mature.

La lignée de souris utilisée développe un pelage rêche, une posture voûtée, une baisse d'activité, parfois une opacité de la cornée et une paralysie des pattes arrière vers sept mois, avant une mort prématurée entre sept et dix mois. 420 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 330 et modéré pour 90. Chacune subit un prélèvement au bout de la queue vers sept à dix jours, une partie recevant ensuite une injection intraveineuse de thérapie génique sous anesthésie, puis jusqu'à sept séries de trois tests moteurs espacées de deux mois. Sur les 420, 90 seulement sont utilisées pour l'évaluation thérapeutique et l'étude de survie, les autres étant tuées comme animaux d'élevage ou parce qu'elles ne portent pas le génotype recherché, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent être ni replacées ni réutilisées du fait de leur modification génétique.

Objectifs

La Mucopolysaccharidose de type IIIA (MPSIIIA), ou maladie de San Filippo A, est une maladie rare dite de surcharge lysosomale, et qui affecte 0.7 à 1.8 nouveau-nés pour 100000 naissances chez l’Homme en Europe. Elle se caractérise par une atteinte sévère du système nerveux central. Elle débute le plus souvent aux âges de 2 à 6 ans avec un retard du développement psychomoteur, des troubles du comportement, un défaut d'attention, une hyperactivité et une agressivité. L'espérance de vie des enfants atteints de cette pathologie est de l'ordre de 15 à 20 ans. Actuellement, aucun traitement approuvé ne peut aboutir à la guérison. Les seuls soins apportés visent à traiter les complications liées à la maladie et améliorer la qualité de vie des malades et de leur entourage. L’objectif du projet sera d’élever une lignée de souris génétiquement modifiée, modèle de la maladie MPSIIIA, afin dans un deuxième temps d’évaluer les effets d’une approche de thérapie génique pour lutter contre cette maladie chez ce modèle animal.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de prouver la non-toxicité et l’efficacité d’une thérapie génique pour le traitement de la mucopolysaccharidose de type IIIA chez un modèle murin. A plus long terme cela pourrait permettre d’identifier et proposer une nouvelle piste de traitement chez l’Homme pour cette pathologie actuellement incurable.

Procédures

Dans le cadre de l’élevage pour obtenir nos lots expérimentaux il sera nécessaire de réaliser un prélèvement de l’extrémité de la queue pour connaitre le patrimoine génétique de nos animaux. Cet acte sera fait une fois sur de jeunes animaux vigiles (durée 1 minute par animal environ). Une partie des animaux auront une injection intraveineuse de thérapie génique sous anesthésie générale (durée 5 min, une fois). Tous les animaux utilisés dans l’évaluation thérapeutique participeront à trois tests comportementaux différents pour mesurer leurs capacités motrices et évaluer l’effet du traitement sur ces capacités motrices (20 min test 1, 3x5 min test 2 et 2 minutes test 3). Cette série de 3 tests sera réalisée au maximum 7 fois avec un minimum de 2 mois entre chaque série. Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour connaitre leur patrimoine génétique. Il existe un risque rare cardio-respiratoire et un risque d’hypothermie durant l’anesthésie. L’animal pourra ressentir un stress lors des contentions et manipulations mais également lors de l’induction de l’anesthésie. L’animal pourra ressentir une légère douleur et un inconfort lié à la piqure de l’aiguille suite à l’injection intraveineuse La lignée de souris utilisée dans ce projet présente un phénotype dommageable en lien avec sa modification génétique se traduisant par un pelage rêche, une réduction d’activité et une posture voutée. Une opacité cornéenne et une paralysie des pattes arrières pourront également intervenir vers le 7ème mois de vie. Ces animaux décèderont de manière prématurée entre le 7ème et le 10ème mois d’âge.

Devenir

En fin de procédure tous les animaux qui auront reçu la thérapie génique seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires en post-mortem pour recueillir nos données d’efficacité. Les animaux d’élevage et les animaux non porteurs des génotypes d’intérêt seront euthanasiés car ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés dans d’autres projets du fait de leur modification génétique spécifique.

Remplacement

Le projet vise à valider une thérapie génique pour la mucopolysaccharidose de type IIIA incurable chez l’Homme à ce jour. Les modèles in vitro ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire et cellulaire de l’approche de thérapie génique ; elle nécessite à présent d’être validée dans un premier contexte physiologique chez un mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez un modèle pertinent de la pathologie, dans notre cas la souris.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe en maintenant des résultats statistiquement fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre maximal de 12 souris par groupe a été défini pour évaluer l’effet thérapeutique de notre approche, et 6 pour l’étude de survie, afin de réaliser des tests statistiques fiables. Au total nous utiliserons 72 souris pour l’évaluation de l’effet thérapeutique et 18 souris pour l’étude de survie. Nos résultats seront analysés avec les tests statistiques appropriés. Afin d’obtenir ces animaux des lots expérimentaux nous produirons au total 420 animaux au cours de ce projet en pilotant de manière raisonnée notre élevage et en ne produisant que le nombre d’animaux strictement nécessaires.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne apportée par l’équipe de zootechnie, la mise en place de points limites et de soins adaptés. Pour l'évaluation de l'effet de notre thérapie nous inclurons uniquement des animaux qui font plus de 10g pour une meilleure récupération des animaux à l'anesthésie et à l'intervention. Lors de l'anesthésie pour injection nous maintiendrons la température de l'animal en le plaçant sur un tapis chauffant thermorégulé à 37 degrés Celsius et en assurant son réveil dans une chambre de réveil chauffée. Un gel ophtalmique sera appliqué au niveau des yeux pour prévenir tout inconfort suite à l'injection. Cette injection est faite avec le plus petit diamètre d'aiguille possible. Un suivi rapproché est effectué au réveil et dans les jours suivants l'injection. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux est réalisé sur de jeunes animaux (moins de sensibilité à la douleur et cicatrisation rapide) et de la plus petite taille possible. C’est un geste rapide et maitrisé qui est réalisé dans un endroit calme par des personnes compétentes. Nous adapterons nos accouplements pour produire nos lots expérimentaux de la manière la plus optimisée possible. Le suivi du phénotype dommageable sera pris en charge (observation, assistance nutritionnelle), les tests de comportements sont raffinés avec un test par jour. Pour l'euthanasie médicamenteuse nous réaliserons une pré-sédation des animaux afin de faciliter l'injection de l'euthanasiant et limiter la douleur associée.

Choix des espèces

Le modèle murin est particulièrement adapté pour reproduire et étudier des maladies humaines (modification génétique possible, outils moléculaire disponible...). Nous utilisons pour ce projet le modèle de souris génétiquement modifiées qui reproduit le phénotype de la maladie MPSIIIA présent chez l’Homme. Cela nous permettra donc d’évaluer l’effet thérapeutique de notre approche. Les animaux seront prélevés à l’âge de 7 à 10 jours pour connaitre leur patrimoine génétique. Ils seront ensuite utilisés soit entre 3 semaines et 6 mois pour l’étude de l’effet thérapeutique soit jusqu’à ce qu’ils présentent des signes spécifiques ou à maximum 18 mois pour l’étude de survie.

Le lendemain de leur naissance, des souriceaux vigiles reçoivent une injection dans le cerveau, une crème anesthésiante ayant été posée trente minutes plus tôt sur le crâne. Une semaine après, l'extrémité de leur queue est prélevée pour savoir s'ils portent la mutation, puis viennent sept pesées, sept mesures de taille, cinq mesures de tête et des tests de redressement répétés. 150 souris au maximum vont être utilisées, dont 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le porteur relevant chez les souriceaux modèles de la maladie de Prader-Willi une mortalité accrue de 10 à 15 % dans la première semaine de vie. Les souriceaux porteurs de la maladie sont tués au sevrage, tandis que 57 animaux, dont 18 femelles reproductrices, seront réutilisés dans d'autres projets et trois mâles gardés en vie pour maintenir la lignée.

Objectifs

La maladie de Prader-Willi est due à la perte de certains gènes et se manifeste dès la naissance. Pour compenser ce manque, un traitement administré au plus tôt chez le nouveau né malade pourrait contrecarrer le développement de la maladie. Ainsi, dans ce projet, nous voulons mettre en lumière les effets positifs sur le développement de jeunes souriceaux, d’un nouveau médicament validé précédemment sur des cellules en culture et qui sera administré un jour après la naissance. Nous testerons trois doses différentes afin de déterminer la plus efficace, qui pourra alors être utilisée comme valeur de référence dans les thérapies contre la maladie de Prader Willi chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Cette phase du projet va tester la capacité d'un médicament à corriger certains symptômes de la maladie de Prader-Willi chez des souris nouveau-nées. Nous veillerons à déterminer la dose la plus efficace pour traiter les enfants atteints par cette maladie qui touche environ 250 nouveau-nés par an en France. Nous espérons observer chez les animaux malades traités une diminution de la faiblesse de leurs mouvements, un poids et une taille générale semblables ou se rapprochant de ceux des animaux témoins, ainsi qu’une vitesse de développement des mouvements équivalente. En outre, nous espérons observer chez les animaux traités un intérêt envers l’environnement identique à celui de nos animaux témoins. De même nous évaluerons la réduction des comportements répétitifs chez ces groupes traités.

Procédures

L’ensemble des souriceaux subira une injection unique du médicament dans le cerveau le lendemain de leur naissance (environ 10 secondes), puis, au terme d’une semaine d’existence, un prélèvement de l’extrémité de la queue afin de savoir si l’animal est porteur de la maladie ou normal (environ 5 secondes). Les juvéniles subiront un ensemble de mesures du développement incluant suivi pondéral (7 pesées de 10 secondes espacées de 3 jours), 7 mesures de taille de 10 secondes (espacées de 3 jours), 5 mesures de la longueur de la tête de 10 secondes (espacées de 3 jours), ainsi que 2 tests d’évaluation du neurodéveloppement de durées inférieures ou égales à 120 secondes, réalisés 4 fois aux âges précoces et séparés de 1 journée chaque.

Impact sur les animaux

Les animaux modèles de la maladie de Prader-Willi sont généralement plus petits que les animaux témoins et ont des comportements modérément affectés. Ils ne montrent pas de signes de douleur ou de difficultés à survivre, mais une mortalité accrue de 10-15% la première semaine après la naissance est néanmoins relevée. Le retrait transitoire (de 20s à 2min30s environ) des souriceaux nouveau-nés de la portée pour les expérimentations comportementales, les pesées et les mesures de taille peuvent entrainer un stress léger de courte durée et sans douleur. L'injection unique du médicament dans le cerveau chez souriceaux vigiles peut entrainer un inconfort transitoire lié à la contention des souris, tandis que l'injection peut entrainer un stress léger et une douleur modérée de courte durée. L'inconfort lié à la position du corps au début du test de redressement est limitée temporellement par le comportement de l'animal qui va naturellement chercher à redresser sa position ; si un animal échoue en cela, le test sera arrêté au bout de 2 minutes ce qui bornera ses effets à un stress léger et de durée limitée. Le prélèvement de l’extrémité de la queue pour savoir si l’animal est porteur de la maladie ou normal peut entraîner un stress léger sans douleur.

Devenir

La mise à mort des 30 à 150 juvéniles d’intérêt sera réalisée au sevrage. Les animaux des trois groupes constitués d’individus sains injectés par le traitement test aux doses D1 à D3 pourront être réutilisés pour d'autres projets de recherche une fois leur sevrage atteint. Les trois mâles reproducteurs seront gardés en vie pour le maintien de cette lignée dans notre structure. Les 18 femelles reproductrices seront réutilisées pour d'autres projets de recherche.

Remplacement

Ce projet vise à évaluer l'effet d'un traitement de thérapie génique chez de jeunes souris modèles de la maladie de Prader-Willi. Ce traitement a déjà été étudié et validé par des expérimentations préliminaires menées sur des lignées cellulaires humaines, sans utilisation d’animaux. L'efficacité du traitement selon 3 doses testées sera maintenant étudiée sur un modèle animal et ce, via plusieurs critères biologiques qui ne peuvent être évalués sans l’utilisation d’animaux tels que la croissance des individus, leur métabolisme et leur comportement.

Réduction

Ce projet utilisera 30 souriceaux (au minimum), effectif qui pourra s’étendre à 150 au maximum. Les effectifs les plus faibles permettant d’obtenir un effet statistique significatif ont été calculés et retenus pour les expériences ; pour ce faire, nous avons utilisé un logiciel informatique afin de déterminer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données issues de précédentes recherches.

Raffinement

Les souris porteuses de la maladie de Prader-Willi présentent 0 à 15% de mortalitéle jour de leur naissance. A partir du second jour de vie, il n’est pas reporté d’excès de mortalité chez ces souris en condition classique d’élevage et d'hébergement : les animaux sont en mesure de se déplacer et de se nourrir correctement, les petits ne sont pas rejetés par les mères et, hormis une petite taile, ils ne montrent pas d’incapacité fonctionnelle justifiant de mesures de raffinement spécifiques. Les mâles porteurs de la maladie de Prader-Willi seront d'abord acclimatés avec des éléments d’enrichissement simples. Après deux semaines, ils seront mis en accouplement à raison de deux femelles par mâle. Ensuite, les femelles gestantes seront hébergées seules jusqu’à la mise bas. Pour les souriceaux nouveau-nés injectés, de la crème anesthésiante sera appliquée sur le crâne 30 minutes avant l’injection. Après l'injection, les petits seront roulés dans la litière de leur cage d’origine et un suivi de l'absence de rejet par la mère sera opéré lors de son replacement dans sa portée d’origine. Si un petit était rejeté par sa mère, une démarche de ré-adoption par une autre femelle sera alors mis en place. Tous les animaux de ce projet seront surveillés quotidiennement ainsi que lors des tests réalisés afin de surveiller si les points limites établis sont atteints.

Choix des espèces

La souris est le seul animal pour lequel un modèle de la maladie de Prader Willi existe. Le développement de la maladie chez la souris est proche de celui observé chez l’humain. Dans notre projet, le traitement dès le lendemain de la naissance est choisi afin de mimer le traitement en bas-âge des patients Prader Willi.

Un cathéter posé dans la veine de la queue, une heure d'IRM sous anesthésie, puis deux nouvelles séances d'imagerie à quatre et vingt-quatre heures : 62 souris suivent ce protocole, dont une partie après avoir reçu sous la peau une injection de cellules tumorales. Les procédures sont classées en niveau de souffrance léger pour 42 souris et modéré pour 20. L'objet du projet est de tester si trois enrobages polymères rendent des nanoparticules assez discrètes vis-à-vis du foie et du système immunitaire pour circuler plusieurs heures dans le sang et atteindre une tumeur. Toutes les souris sont tuées pour le prélèvement des organes et de la tumeur, celles dont la tumeur dépasse 10 % du poids corporel ou qui perdent plus de 20 % de leur poids étant sorties de l'étude et mises à mort avant terme.

Objectifs

Après une étude préalable réalisée in vitro sur des cellules en culture, l’objectif de ce projet est l’évaluation in vivo de nouveaux composés issues des nanotechnologies comme agents de contraste pour l’imagerie médicale. Ces composés sont prometteurs pour l'amélioration du diagnostic et la thérapie du cancer. Ils permettent notamment une augmentation de contraste des images obtenues par résonance magnétique nucléaire (IRM). La difficulté majeure rencontrée pour l'utilisation de ces composés est qu'ils sont très rapidement captés en quelques minutes par les systèmes de défense de l'organisme comme le foie et les cellules du système immunitaire. Si les composés ne restent pas suffisamment longtemps dans la circulation sanguine, ils n'ont pas le temps de passer dans le tissu tumoral. Des modifications de la surface de ces composés par greffage de polymères particuliers permet de les rendre relativement invisibles du système de défense. Ainsi, leur temps de présence dans le sang s'allonge, augmentant la probabilité de passage du composé dans le tissu tumoral. Pour ce projet nous allons tout d'abord évaluer avec pour critère principal de sélection, l’invisibilité biologique pour 3 types de polymères à 3 concentrations différentes. Le temps de présence dans la circulation attendu est de plusieurs heures avec nos composés Puis sur un modèle de souris porteuse d'une tumeur, nous testerons les 2 meilleurs agents à 2 concentrations différentes. L’imagerie sera réalisée avec un IRM dédié au petit animal sous anesthésie pour éviter les mouvements durant les acquisitions.

Bénéfices attendus

Ces nouveaux agents de contraste sont développés dans le but de limiter les doses à injecter chez les patients, et pour pallier le fait qu’une seule technique d’imagerie se révèle souvent insuffisante pour poser un diagnostic précis. La mise au point d’agents de contraste bimodaux (combinant deux types d’imagerie complémentaires) et vectorisés (aptes à cibler sélectivement la zone d’intérêt), devient une nécessité en matière de santé. Leur utilisation permettrait d’accéder rapidement à un diagnostic plus précis et de définir le traitement le plus approprié, limitant ainsi les effets secondaires, améliorant la prise en charge des patients, et réduisant les coûts de santé. Des études menées auprès de professionnels du secteur montrent qu’un intérêt particulier se dégage pour une sonde associant la précision spatiale de l’IRM à la grande sensibilité de l’imagerie nucléaire, du fait de leur complémentarité et du développement d’appareils combinant IRM et imagerie nucléaire. Pour autant, et même si de nombreuses publications rapportent la synthèse de sondes associant IRM et imagerie nucléaire, aucune sonde duale adaptée n’est actuellement disponible sur le marché. Les nanomatériaux sont de bons candidats pour le développement de tels outils bimodaux, notamment par les possibilités de vectorisation/modification qu’ils apportent.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 types d’interventions dans ce projet : (1) une imagerie par IRM sous anesthésie in vivo non invasive et non traumatique, 3 sessions : la première dure 1 h, la seconde dure 10 min et est réalisée après 4h suivant l’injection de l’agent de contraste, enfin la dernière est réalisée 24h après la première. (2) pose d’un cathéter réalisé en moins de 10 minutes pour injection par voie intraveineuse à la première session d’imagerie, le cathéter est enlevé à la fin de la première session d’imagerie, l’animal étant toujours sous l’effet de l’anesthésie gazeuse. (3) pour certains animaux, une injection sous-cutanée de cellules tumorales, durée incluant la préparation 10 min.

Impact sur les animaux

- La pose d’un cathéter : le cathéter est posé dans la veine caudale , il peut induire un hématome et une altération temporelle de la veine. -Induction tumorale : la génération d'une tumeur peut entrainer une perte de poids de l’animal, des souffrances et éventuellement des troubles fonctionnels.

Devenir

A l’issue de la procédure 1, tous les animaux sont mis à mort car les organes sont prélevés pour analyse. A l'issue de la procédure 2 sur les animaux porteurs d’une tumeur solide, tous les animaux sont mis à mort car les organes et la tumeur sont prélevés pour analyse.

Remplacement

Certaines phases d'optimisation des nano-particules (vérification de la stabilité, toxicité cellulaire) seront intégralement menées in vitro. Cependant, la validation des propriétés de distribution aux organes, d’élimination par voie urinaire et/ou hépatobiliaire tout comme les propriétés de ciblage tumoral ne peuvent se faire qu’en utilisant le petit animal. Les propriétés pharmacocinétiques des nanoparticules de distribution et élimination seront caractérisées chez l’animal sain avant de passer sur un modèle tumoral pour caractériser et mesurer leur capacité à intégrer la tumeur.

Réduction

L'imagerie, par opposition aux bio-distributions in vivo classiques, permet de réduire le nombre global d'animaux mis en œuvre pour une procédure donnée car la même cohorte pourra être suivie au cours du temps ce qui permet de réduire la variabilité inter animal (chaque souris étant son propre contrôle). Les mêmes animaux pourront également subir plusieurs sessions d’imagerie (une session après 4h et après 24h suivant l’injection de l’agent de contraste). Les variables quantitatives issues de l'analyse des images obtenues en IRM seront analysées en utilisant des méthodes de statistique paramétrique ou non paramétrique selon la distribution des données. Pour la première phase de caractérisation de nos nano-sondes, des animaux non inclus dans un protocole dont la mise à mort était programmée pourront être utilisés.

Raffinement

La première phase de caractérisation in vivo des nano-sondes sera menées sur des souris saines pour réduire autant que possible l’inclusion d’animaux porteur de tumeur sous-cutanée. Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63, décret n°2013-118 du 1er février 2013). Tout animal présentant des signes de souffrance, de léthargie, une perte de poids supérieure à 20% ou une tumeur dépassant 10% du poids corporel sera exclu de l’étude et sacrifié. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Pour les animaux devant subir une injection sous-cutanée de cellule tumorales, l'anesthésie sera réalisée classiquement par induction à l'isoflurane. Les animaux sont maintenus dans la salle de chirurgie sous une source de chaleur et leur respiration est observée jusqu’à leur réveil. En cas d’apparition de signes de douleur (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, déshydratation, yeux et abdomen creux, automutilation etc.), une dose d’analgésique sera administrée, si l’état général de l’animal ne s’améliore pas dans les 48h et qu’aucune solution ne peut être apportée, ce dernier sera mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle de la souris est reconnu comme pertinent pour l'évaluation préclinique des caractéristiques des agents de contraste en imagerie. La souris possède comme l’homme une vésicule biliaire ce qui permet de visualiser la voie d’élimination hépatique. Le modèle de tumeur sous-cutanée chez la souris est bien maitrisé. Les animaux pour la phase d’évaluation de la furtivité seront utilisés au stade de jeunes adultes à adulte (de 7 à 16 semaines environ) après atteinte de la maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Des animaux jeunes de 4 à 6 semaines seront utilisés pour la génération d’une tumeur sous-cutanée. Ce stade est optimal pour l'induction tumorale par transplantation de cellules cancéreuses. Ces animaux seront explorés par IRM (entre 7 et 10 semaines).