Procédures légères

12 124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, chacune pouvant subir jusqu'à 24 tests comportementaux répartis sur six semaines. Une chirurgie de la cuisse droite leur inflige une douleur neuropathique chronique d'une dizaine de semaines, avec des difficultés à se déplacer pendant les 48 à 72 heures qui suivent. Les souriceaux sont amputés d'un bout de queue avant l'âge de dix jours pour le génotypage, moment où le porteur estime la souffrance moindre. Cette douleur, indique le RNT, "ne peut pas être soulagée, car c'est le sujet de la recherche", face à des traitements dont il espère seulement qu'ils pourraient un jour être mieux ciblés.

Objectifs

Ce projet de recherche vise à améliorer les traitements contre la douleur neuropathique, une douleur causée par des lésions ou des maladies du système nerveux, touchant environ 6 % de la population en France. Actuellement, certains antidépresseurs et anticonvulsivants sont les meilleures options disponibles, mais ils ne fonctionnent pas pour tout le monde et ont de nombreux effets secondaires. De plus, on comprend mal comment ces médicaments soulagent la douleur neuropathique. Comprendre comment ces médicaments fonctionnent est essentiel pour améliorer les traitements actuels et en développer de nouveaux, plus ciblés. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes par lesquels les antidépresseurs et les anticonvulsivants soulagent la douleur neuropathique. Nos recherches ont déjà montré que ces traitements ont un effet anti-inflammatoire et influencent le système circadien, qui régule nos cycles biologiques. Nous voulons maintenant explorer plus en détail ces cibles pour améliorer les traitements de la douleur neuropathique.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche vise à améliorer les traitements contre la douleur neuropathique mais également de trouver de nouvelles cibles thérapeutique. Nous pensons que les résultats de ce projet pourraient non seulement améliorer les traitements actuels en permettant une meilleure utilisation clinique grâce à une meilleure compréhension de leur fonctionnement, mais aussi aider à développer de nouveaux traitements plus ciblés et avec moins d'effets secondaires que ceux existants.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale induisant une douleur chronique pendant environ 10 semaines. La chirurgie, réalisée au niveau de la cuisse droite, durera environ 5 minutes sous anesthésie générale. Certains animaux subiront une injection au niveau thoracique sous anesthésie générale, tandis que d'autres recevront une unique injection au niveau lombaire à 25 jours sous anesthésie gazeuse. Une partie des animaux recevra un traitement (soit administré pendant 3 semaines dans leur eau de boisson, soit par gavage vigile une unique fois). De plus, les animaux seront soumis à plusieurs tests comportementaux d'une durée de 3 à 10 minutes chacun (avec un maximum de 24 tests par animal sur une période de 6 semaines), avec un intervalle minimum de 24 heures entre chaque test. Enfin, une biopsie de queue pour génotypage sera réalisée sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux ressentiront une douleur modérée qui ne peut pas être soulagée, car c’est le sujet de la recherche. Une douleur transitoire sera également induite lors de la biopsie de queue pour le génotypage des animaux transgéniques. Après la chirurgie neuropathique, les animaux auront des difficultés à se déplacer pendant 48 à 72 heures. Certains animaux recevront des injections dans la région lombaire. Tous les animaux subiront une série de tests comportementaux pour évaluer la douleur, ce qui génèrera un léger stress. Les animaux recevront des traitements d’antidépresseurs ou d'anticonvulsivants, soit en dose unique, soit en traitement prolongé, sans nuisances attendues.

Devenir

Les animaux n’ayant pas le génotype attendu seront mis à mort. Les animaux en fin de projet seront également mis à mort pour la réalisation de prélèvements nécessaires aux analyses moléculaires, car ce sont des animaux non naïfs qui ne peuvent être réutilisés dans des projets ultérieurs.

Remplacement

Pour notre étude, nous ne pouvons malheureusement pas remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. Pour analyser l'effet des antidépresseurs ou des anticonvulsivants sur la douleur chronique et les réactions émotionnelles, nous devons observer le comportement des animaux vivants.

Réduction

Nous essayons de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en obtenant des résultats scientifiques fiables. D'après les études et la variabilité individuelle, chaque groupe expérimental comprendra au maximum 12 souris mâles et 12 femelles. Un calcul statistique a été fait pour s'assurer que nos résultats seront valides. Les animaux passeront par plusieurs tests comportementaux pour réduire leur nombre. Les analyses statistiques finales seront réalisées pour confirmer la validité de nos résultats.

Raffinement

Les animaux sont logés par groupes de 4 ou 5 pour répondre à leurs besoins sociaux. Nous mettons du coton dans les cages pour qu'ils puissent faire des nids et des barreaux en bois pour qu'ils puissent ronger, ce qui réduit l'agressivité. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter tout signe de stress ou d'inconfort. Pendant les chirurgies, des anesthésies sont toujours utilisées et un suivi post-chirurgical est effectué. Des points limites sont mises en place pour garantir leur bien-être. Si de nouvelles méthodes moins stressantes ou douloureuses sont découvertes, nous les intégrerons à nos procédures.

Choix des espèces

Le modèle d’animal neuropathique utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris (travaux antérieurs de notre équipe). En outre, de nombreuses lignées de souris transgéniques existent et sont disponibles, facilitant ainsi l’étude génétique des mécanismes. Pour le génotypage, les souriceaux seront utilisés avant d'avoir 10 jours car la minéralisation des os de la queue ainsi que le développement de la vascularisation ne sont pas encore complets, ce qui minimise la souffrance des petits. Pour toutes les autres procédures, étant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (arrivée des animaux à 8 semaines lorsqu’ils sont jeunes adultes puis début des procédures à partir de 10 semaines).

3 275 souris femelles reçoivent des injections d'hormones destinées à leur faire produire un maximum d'ovocytes, 875 subissent une chirurgie utérine de quinze minutes sous anesthésie pour recevoir des embryons, et 80 mâles sont vasectomisés. 3 355 souris vont ainsi être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet est présenté comme un moyen de "diminuer considérablement les volumes d'élevage" grâce à la congélation d'embryons et de sperme. Produire ces embryons passe par la mise à mort des femelles donneuses au moment du prélèvement des ovocytes, et par celle des mâles vasectomisés après dix mois d'accouplements stériles, les femelles receveuses étant maintenues en vie jusqu'au sevrage des souriceaux.

Objectifs

Le projet consiste à offrir aux équipes du centre de recherche la possibilité d’arrêter l’élevage de certaines lignées de souris lorsqu’un projet est terminé ou n’est plus soutenu financièrement, de stocker les lignées par cryoconservation, processus qui consiste à congeler et conserver des embryons ou des spermatozoïdes à ultra basse température afin de préserver leur intégrité et de les revitaliser lorsque nécessaire. Ce procédé permet d’assurer la sauvegarde des modèles et de diminuer considérablement les volumes d'élevage. Par ailleurs, l’échange d’embryons ou de spermes congelés est également le moyen de transférer des lignées de souris entre animaleries en s’affranchissant des statuts sanitaires puisque la réimplantation d’embryons permet de se débarrasser d’un certain nombre d’opportunistes que de nombreuses animaleries excluent de leurs élevages. La décontamination de lignées de souris par transfert d’embryons permet également d’intégrer des animaux de statut sanitaire non compatible dans notre animalerie exempte de pathogènes nuisibles pour la souris. Pour cela, nous prévoyons de réaliser en 5 ans au sein de notre animalerie : 1) 50 cryoconservations de lignées par congélation d’embryons et 50 cryoconservations de lignées par congélation de spermes pour la sauvegarde et l’arrêt des élevages. 2) 100 reviviscences de lignées pour les contrôles qualité des congélations d’embryons et de spermes et 25 reviviscences pour le redémarrage des élevages de lignées à partir d’embryons congelés ou à partir de spermes congelés par fécondation in vitro. 3) 50 décontaminations de lignées par transfert d’embryons pour intégrer des animaux de statut sanitaire non compatible dans notre animalerie. Pour le bien-être des animaux, nous respecterons les 5 libertés universelles, ils seront hébergés en groupe, disposeront de nourriture et d’eau ad libitum et d’enrichissements dans les cages. Dans le souci d’éviter et de réduire toute douleur ou souffrance animale, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie et sous analgésie. La surveillance quotidienne sera effectuée, elle permettra le contrôle post-opératoire et de déceler d’éventuels signes de souffrance dont l’évaluation à l’aide d’une grille de score conduira à la mise en place d’une médication adaptée.

Bénéfices attendus

Le projet donne la possibilité d’arrêter l’élevage des lignées de souris lorsqu’un projet scientifique est terminé ou n’est plus financé, de stocker les lignées par cryoconservation, processus qui consiste à congeler et conserver des embryons ou des spermatozoïdes à ultra basse température afin de préserver leur intégrité et de les revitaliser lorsque nécessaire. Il permet donc d’assurer la sauvegarde des modèles et de diminuer considérablement les volumes d'élevage. Par ailleurs, l’échange d’embryons ou de spermes congelés et la décontamination par transfert d’embryons sont des moyens de transférer des lignées de souris entre animaleries en s’affranchissant des statuts sanitaires.

Procédures

Les animaux femelles seront soumis à des injections d'hormones, cela concernera 3275 animaux et les injections dureront quelques secondes. Les animaux mâles seront vasectomisés chirurgicalement sous anesthésie générale, cela concernera 80 animaux et l’intervention durera 15 minutes. La réimplantation d’embryons dans l'utérus des femelles receveuses se fera chirurgicalement sous anesthésie générale, cela concernera 875 animaux et l’intervention durera 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les injections d’hormones, anesthésiques et antalgiques, la pose de sutures et d’agrafes lors des étapes de chirurgie constitueront une nuisance pour les animaux et pourrons être source d'angoisse, de douleur ou d’apparition de lésions.

Devenir

Les animaux femelles dont le nombre d'ovules produits est augmenté par des injections d’hormones seront mises à mort pour le prélèvement des ovocytes ou des embryons. Les animaux mâles vasectomisés seront mis en accouplement pour induire un état propice à l'implantation des embryons chez les femelles receveuses pendant 10 mois puis mis à mort. Les animaux femelles dont le cycle ovarien est synchronisé par des injections d'hormones seront accouplées avec les animaux mâles vasectomisés pour induire un état favorable à l'implantation des embryons, puis ré-implantées avec les embryons et maintenues en vie jusqu’au sevrage des souriceaux.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux est indispensable car seul un animal vivant et entier peut produire les gamètes nécessaires à l’archivage ou à la reviviscence des lignées de souris génétiquement modifiées. Nous proposons de réaliser les contrôles qualité des lots d’embryons et de sperme congelés par des tests in vitro, en nous assurant de la bonne évolution des embryons du stade 2 cellules au stade blastocyste en milieu défini, évitant ainsi l’utilisation d’animaux avec une ré-implantation des embryons dans des femelles receveuses. Afin d’éviter de dupliquer la cryoconservation des lignées de souris génétiquement modifiées, une recherche systématique dans les banques d’archivage de lignées sera réalisée et conditionnera la réalisation de la procédure.

Réduction

Nous arrêterons les congélations d’embryons lorsque nous aurons atteint 250 à 400 embryons (en fonction du nombre de modifications génétiques et de la fertilité des modèles) congelés et validés. Nous privilégierons la congélation de sperme qui nécessite très peu d’animaux pour les lignées avec une seule modification génétique. Les expérimentations de décontamination et de revitalisation seront limitées à l’obtention des animaux porteurs du généotype d'intêret nécessaires à l’établissement des lignées. Afin de réduire le nombre d’animaux femelles à accoupler avec les mâles vasectomisés pour la production de femelles dans un état de l'utérus propice pour la réimplantation des embryons, nous réaliserons une synchronisation du cycle ovarien des femelles à l’aide d'hormones car seules les femelles en ovulation acceptent l'accouplement avec les mâles.

Raffinement

Afin d’éviter les risques de perforations suite aux injections dans le péritoine, nous réaliserons les injections d’hormones en sous-cutané car l’efficacité est équivalente pour la production d'ovocytes chez les animaux femelles. Afin d’améliorer le cadre de vie des animaux, les besoins physiologiques seront respectés (nourriture et eau ad libitum). Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés. Nous optimiserons les conditions d’hébergement des animaux par la présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés, lanières de papier et/ou coton) et par leur maintien en groupes afin d’éviter le stress de l’isolement. Pour la même raison, les animaux mâles devant être maintenus isolés, seront par intermittence hébergés en présence de femelles. Les procédures chirurgicales de vasectomie des mâles et de réimplantation des embryons dans les femelles receveuses seront réalisées sous anesthésie, une analgésie et un suivi seront mis en place. La réimplantation des embryons dans les femelles receveuses se fera dans une seule corne utérine et nécessitant une seule incision. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne minutieuse par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille d’évaluation du bien-être (traitement cutané avec un désinfectant en cas de signes d'infection, pose de nouveaux points de suture ou d'agrafes sous anesthésie générale en cas de perte d'agrafes ou rupture de points de suture externes, analgésie en cas d'apparition de signes de souffrance et sans amélioration, programmation de la mise à mort).

Choix des espèces

Le projet consiste à assurer la sauvegarde des modèles animaux souris et à diminuer les élevages par la cryoconservation mais aussi à décontaminer les lignées de souris pour les transférer entre animaleries de statuts sanitaires différents. La décontamination par transfert d’embryons et la congélation d’embryons nécessitent la production d'un grand nombre d'ovocytes chez les femelles donneuses, leur mise en accouplement et la récupération des embryons après mise à mort. Ces techniques nécessitent également la réimplantation des embryons dans les femelles receveuses dont l'utérus est en état propice obtenu par la mise en accouplement avec des mâles vasectomisés stériles. Le projet nécessite donc le recours aux animaux. Les femelles donneuses d’embryons seront stimulées par injection d’hormones en début de puberté (5 semaines) car c’est l’âge qui permet de recueillir le plus d’ovocytes matures. Les mâles qui seront vasectomisés seront des mâles pubères adultes (6-8 semaines) et donc capables de s’accoupler avec les femelles receveuses. Les femelles receveuses pour les réimplantations d’embryons seront des femelles pubères adultes (6-20 semaines) afin que la réimplantation soit efficace grâce à des cornes utérines fonctionnelles et une bonne imprégnation hormonale après accouplement avec les mâles vasectomisés.

1 072 souris seront tuées pour que leurs tissus cérébraux soient analysés, et 144 autres, écartées parce qu'elles portent le "mauvais génotype", partiront vers d'autres projets comme animaux témoins. Au total 1 216 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles portent des malformations vasculaires cérébrales reproduisant les angiomes caverneux humains, reçoivent une injection quotidienne pendant trois jours, passent jusqu'à une heure sous anesthésie en imagerie, parfois après induction d'une inflammation, avant une chirurgie de quinze minutes destinée à récupérer les tissus. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ou informatique ne peut remplacer l'animal vivant dès lors qu'il s'agit d'un "organe entier", et qualifie le passage à la souris d'étape "indispensable".

Objectifs

L’angiome caverneux est une malformation vasculaire localisée essentiellement dans le cerveau. Cette maladie affecte 1 individu sur 200. La forme héréditaire des angiomes caverneux est souvent liée à des mutations génétiques. Cette malformation se caractérise par des amas de vaisseaux sanguins dans le cerveau qui peuvent provoquer des saignements et des problèmes neurologiques. À ce jour, il n’existe aucun traitement médicamenteux pour les patients. L’unique option est la suppression de la lésion par neurochirurgie, qui peut se révéler impossible selon la localisation de la lésion, en raison d’un risque vital pour le patient. Il est donc urgent de trouver des traitements empêchant le grossissement des lésions existantes, voire même de les faire disparaître et ainsi diminuer le risque de saignement. Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs et a pour objectif est de tester 3 médicaments qui ont été identifiés dans des études préliminaires afin évaluer leurs capacités à arrêter la formation des lésions vasculaires dans nos modèles animaux qui présentent les caractéristiques de la pathologie humaine des angiomes caverneux.

Bénéfices attendus

Il n'existe pas de traitement médicamenteux disponible pour les angiomes caverneux et la suppression par chirurgie n'est pas toujours possible. De plus, le risque de nouveaux saignements dans les années suivant la chirurgie est élevé. Ce projet vise à tester des traitements afin de savoir si ces derniers bloquent la formation des lésions vasculaires dans nos modèles atteints de la maladie. Ces recherches pourraient ouvrir la voie à la découverte d’un traitement thérapeutique efficace sans effet secondaire.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur, seule l’élevage et la reproduction des animaux sera réalisée. Dans le second établissement utilisateur, la distribution des médicaments dans le cerveau sera d’abord évaluée. Puis, l’étude impliquera une injection du traitement de 30 secondes, une fois par jour pendant trois jours suivie d’une imagerie d’une durée de 1h maximum, réalisée sous anesthésie, suite, ou non à l’induction d’une inflammation. Et enfin, une chirurgie d’une durée de 15 minutes sera réalisée afin de récupérer les tissus à analyser.

Impact sur les animaux

La distribution des médicaments dans le cerveau sera d’abord évaluée. Ces résultats permettront d’adapter le protocole d’administration sur les animaux présentant la pathologie. Ces derniers recevront un traitement administré pendant 3 jours consécutifs, pouvant induire une légère douleur, afin de tester l’efficacité de molécules candidates sur la progression de la maladie. L’évolution des lésions et la réponse au traitement sont suivies par imagerie, d’une durée de 1h maximum et peuvent engendrer un léger stress.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin d’effectuer les analyses sur des tissus récupérés. Les 144 animaux réutilisés correspondent aux souris de mauvais génotype, qui pourront être réutilisées pour des prélèvements ou d'autres projets comme animaux sauvages.

Remplacement

Notre projet se fera dans la continuité d'études réalisées sur des cellules. Le projet portant sur l’étude de la réponse d’organe entier (cerveau), il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. En effet, un organe isolé ou une espèce autre que les mammifères, ne permettra pas d’évaluer l’efficacité des médicaments candidat pour le traitement des angiomes caverneux. Le passage au modèle animaux est donc une étape indispensable afin d’observer les effets des composés administrés dans l'organisme. De plus, la souris possède toute la complexité du réseau vasculaire cérébral trouvé chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux minimum pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives a été calculé en se basant sur les études précédentes menées au laboratoire. Le nombre d’animaux nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats.

Raffinement

Une semaine d’acclimatation est prévue à l’arrivée des animaux dans l’animalerie. Pour réduire les nuisances attendues, l’ensemble des expérimentations seront réalisées sous anesthésie et analgésie adaptées, les animaux seront maintenus en température et un suivi de la fréquence cardiaque et respiratoire sera effectué lors des séances d'imagerie. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir des points limites adaptés permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être animal. Tous les croisements réalisés viseront à obtenir exclusivement des animaux viables ayant les mêmes symptômes que les patients avant déclaration de la pathologie.

Choix des espèces

Les animaux utilisés représentent le modèle le plus pertinent pour nos études, car il reproduit de manière fidèle les caractéristiques clés de la pathologie humaine des angiomes caverneux. Les animaux auront entre 6 et 12 semaines lors des expérimentations afin d’être en conditions semblables à la pathologie humaine étudiée.

5 609 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 2 912 d'entre elles sont tatouées aux phalanges puis amputées de l'extrémité de la queue pour le génotypage, 1 680 reçoivent une implantation de cellules d'adénocarcinome suivie de chimiothérapie trois fois par semaine et d'irradiations, et 1 008 subissent une chirurgie de vingt minutes créant des métastases hépatiques. Le porteur écrit que la croissance tumorale peut provoquer perte d'appétit, perte de poids et signes moteurs, quand le débouché thérapeutique évoqué se limite à des inhibiteurs qui "pourraient" être utilisés un jour. Il conclut que la souris reste "indispensable" pour observer ces enzymes dans un "organisme entier proche de l'homme".

Objectifs

Le système immunitaire joue un rôle important dans la mise en place et le développement des cancers. Notre projet vise à déterminer le rôle des protéines convertases (PCs) dans le recrutement du système immunitaire par les tumeurs. Les PCs sont des enzymes dont les quantités sont fortement augmentées dans de nombreux cancers et qui sont impliquées dans la progression des tumeurs et l’établissement des métastases. De plus, dans le cancer du colon les PCs sont nécessaires à la régulation de l’activité des cellules immunitaires que sont les lymphocytes T. Dans ce projet, nous souhaitons identifier précisément quelles convertases jouent un rôle dans le recrutement des cellules du système immunitaire par les tumeurs, nos candidats sont la Furine et PC7. Pour mettre en œuvre ce projet, nous créerons une lignée de souris génétiquement modifiées qui n’exprimeront ni PC7, ni la Furine dans les lymphocytes T. Ce nouveau modèle nous permettra de définir le rôle de PC7 et de la Furine dans la progression tumorale et l'adaptation des cellules immunitaires.

Bénéfices attendus

Les protéines sont des molécules biologiques présentes dans toutes les cellules vivantes. Lors de leur synthèse, elles peuvent nécessiter des modifications pour devenir actives biologiquement. Ces modifications sont mises en œuvre par les PCs et jouent un rôle important dans dans l’acquisition des caractéristiques cancéreuses des cellules, et dans l'adaptation du système immunitaire. Ce projet amènera à une meilleure compréhension du rôle des PCs , PC7 et Furine dans l'établissement des tumeurs. Nous nous intéressons plus particulièrement à ces deux convertases car des inhibiteurs spécifiques pourraient être utilisés comme de nouvelles thérapies ciblées seuls ou en combinaison avec des agents déjà existants et/ou la radiothérapie pour le traitement de certains cancers.

Procédures

2912 animaux seront soumis à deux gestes invasifs consécutifs pour être tatoués et génotypés par le personnel qualifié et expérimenté de notre établissement utilisateur: 1/ Identification par tatouage digital (réalisé une fois et durée de quelques secondes) et 2/ biopsie de la queue (réalisé une fois et durée de quelques secondes). Pour l'étude de la prolifération tumorale nous implanterons des cellules tumorales d'adenocarcinomes chez 1680 animaux. Les injections auront lieu une fois et durent 5 minutes. Les traitements avec la chimiothérapie seront faits 3 fois par semaine et durent moins d'une minute. Les traitements par irradiation des tumeurs durent entre 3 et 15 minutes et sont répétées deux fois à deux jours d'intervalle. Enfin le modèle de métastases hépatiques nécessitera une chirurgie réalisée sur 1008 animaux en 20 minutes par souris, une seule chirurgie par animal. Le suivi des tumeurs par bioluminescence dure entre 6 et 25 minutes, une à deux fois par semaine. Un prélèvement de sang par animal sera réalisé sous anesthésie et analgésie et dure en moyenne 15 min.

Impact sur les animaux

Le génotypage est composé de deux actes techniques invasifs, le tatouage au niveau des phalanges et/ou des coussinets et la biopsie de la queue qui consiste en un prélèvement de l'extrémité de la queue. Ces deux gestes provoquent une très légère douleur. L'animal est maintenu en contention pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure ce qui est une source de stress. Le développement de tumeurs ou de metastases hépatiques peuvent générer des souffrances se manifestant par des pertes d’appétit donc de poids, des signes physiques ou moteurs. L'irradiation peut induire des irritations locales pour les tumeurs sous-cutanées. Toutes les douleurs liées au protocole seront prises en charge et des mesures compensatoires seront appliquées.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. Les tumeurs et les organes seront collectés pour analyses immunohistochimiques, transcriptomiques et protéomiques.

Remplacement

Des tests sur des cellules tumorales et des cellules immunitaires en culture in vitro nous ont déjà permis de déterminer certains effets de l'inhibition de PC7 et de la Furine. Nous avons aussi utilisés des organoides pour intégrer une structure tridimensionnelle à nos cultures de cellules tumorales ainsi que des co-cultures (cellules tumorales et cellules immunitaires). Cependant, l’utilisation de modèles in vivo comme la souris est indispensable à la compréhension des mécanismes d’action des PCs dans un organisme entier proche de l'homme, incluant lors du développement tumoral, le microenvironnement, les contraintes physiques, le système vasculaire et le système immunitaire, qui ne sont pas retrouvés in vitro. Cette étape est également nécessaire puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme comme thérapie.

Réduction

Les études statistiques seront réalisées pour comparer 4 groupes ( WT, Furin Fl/Fl*CD4-Cre+, PC7 KO/KO et PC7 KO/KO*Furin Fl/Fl*CD4-Cre+). Afin de limiter le nombre d'animaux, tous les individus porteurs d'un génotype d'intérêt seront utilisés dans nos expériences de prolifération tumorale mais aussi pour des approches in vitro réalisées à partir de prélèvements post-motem (comme par exemple l'isolation des cellules immunitaires à partir de la rate ou de la tumeur). Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons calculé le nombre minimal de souris par groupe pour atteindre une puissance statistique satisfaisante qui correspond à 14 souris ( 7 mâles et 7 femelles) pour l’analyse de survie par le test de Kaplan-Meyer (atteinte de points limites). Nous prévoyons de répéter 3 fois les expériences, avec des lots de 14 souris pour les implantations sous-cutanées. Le sexe des animaux n'ayant pas d'influence sur nos résultats, nous utiliserons des animaux femelles et mâles

Raffinement

Le bien-être de l’animal au quotidien est nécessaire au bon déroulement de nos reproductions et expériences, mais également à la reproductibilité de nos résultats. Les animaux sont hébérgés dans des cages aux normes (au minimum 2 par cage et 5 au maximum) suivant l'âge et le poids des animaux. Des enrichissements (maisons rouges, jouets) sont présents dans les cages. Au cours de nos expériences, un suivi attentif quotidien des animaux est fait par du personnel compétent et formé, weekend, vacances et jours fériés compris. Les animaux en expérimentation sont pesés un fois par semaine, dès qu'une perte de poids est observée, du nursing et une pesée quotidienne est mis en place. Une fiche de suivie des animaux est remplie par le personnel de l'animalerie. Des mesures compensatoires sont prises si nécessaires. En revanche si l'état de l'animal malgré les mesures compensatoires ne s'améliore pas, le responsable de projet décidera de l'arrêt de l'expérience pour cet animal. Au moindre doute, nous ferons appel aux conseils de notre vétérinaire ou de la structure du Bien-Etre Animal (SBEA). Des injections d'analgésique pourront être réalisées et renouvelées en fonction de la souffrance de l'animal. Des tapis chauffants seront également utilisés dès l’anesthésie des souris, pendant l’opération, et lors de la phase de réveil.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle car c'est un animal de petite taille, facile à héberger et à manipuler. Les séquences peptidiques des convertases sont bien conservées entre l'homme et la souris. De plus, l’organisation du système vasculaire de la souris et sa relation avec le microenvironnement tumoral sont très proches de ceux observés chez l’homme. Enfin, nous avons des modèles transgéniques disponibles uniquement chez la souris pour lesquels nous pourrons utiliser des lignées tumorales syngéniques. Les souris seront tatouées et génotypées entre 7 et 12 jours après leur naissance. Dans les expériences d’implantation de cellules tumorales, les souris auront entre 14 et 16 semaines . Ces adultes présentent de bonnes réponses immunitaires et sont faciles à manipuler.

Soumises sous anesthésie à dix minutes de manipulation de l'intestin destinée à bloquer leur transit, 900 souris vont être utilisées, toutes tuées ensuite pour prélèvements. 600 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 300 d'un niveau léger. Le transit est mesuré par gavage d'une solution de charbon, avec une attente pouvant aller jusqu'à six heures, et par l'insertion d'une bille dans le côlon, l'animal restant isolé en cage individuelle jusqu'à une heure, puis les souris sont mises à jeun quinze heures. Le porteur ramène les nuisances à un inconfort abdominal et au stress du jeûne et de l'isolement, sans jamais décrire en quoi consiste cette manipulation de l'intestin ni comment l'intestin est atteint.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'identifier de nouvelles voies physiopathologiques du ralentissement voire de l'arret du transit intestinal post opératoire suite à une manipulation intestinale en utilisant un modèle murin. En effet, ce ralentissement/arrêt du transit intestinal survient frequemment chez les patients ayant subit une manipulation intestinale lors d'une chirurgie.

Bénéfices attendus

Il n'existe pas de traitement médicamenteux connu à ce jour malgré l'incidence élevée de cette complication chirurgicale. Le bénéfice de ce projet est d'identifier des gènes impliqués dans la physiopathologie et donc des cibles thérapeutiques. Cela permettra de réduire la durée d’hospitalisation et la mortalité des patients.

Procédures

Une manipulation intestinale durant 10 minutes permettant d’induire l’ileus post opératoire chez la souris va être réalisée sous anesthésie générale et analgésie. La vitesse de transit des différentes portions du tractus digestif (intestin grêle et colon) va être relevée ainsi que la vitesse du transit total grâce à l’administration par voie orale d’une solution de charbon (durée de l'administration : 5 secondes) qui va permettre de relever le temps d’apparition d’une selle noire (entre 2 et 3 heures – temps limité à 6 heures pour l’animal). La vitesse du transit dans le colon sera mesurée grâce à l’insertion intra-colique d’une bille (dont la taille est équivalente à une fécès de souris) (durée de l'insertion : 10 secondes) à l’aide de vaseline et sous anesthésie. Le temps d’expulsion de la bille sera le reflet de la vitesse du transit colique (autour de 2 minutes – temps limité à 1h pour l’animal). Lors de cette mesure l'animal sera dans une cage individuelle.La vitesse du transit de l’intestin grêle sera ensuite mesurée 24 heures après la chirurgie grâce à l’administration par voie orale d’une solution de charbon qui permet de visualiser à l’œil nu l’avancement du charbon dans l’intestin grêle post mortem (20 minutes après le gavage). Les animaux seront mis à jeun (non stricte) pendant 15h pour cette mesure.

Impact sur les animaux

inconfort abdominal (constipation, ballonements, gaz) induit par la manipulation intestinale stress induit par le jeun, l’isolement pendant 1h dans une cage individuelle lors de la mesure de la motricité colique.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux sont euthanasiés en vue des réaliser des prélevements et les analyser.

Remplacement

Les méthodes alternatives permettant l’étude de l'ileus post-opératoire et notamment de la motricité intestinale sont inexistantes. En effet les modèles in vitro actuels ne permettent pas de reconstituer l'environnement et les intéractions complexes entre les différents acteurs menant à l'ileus post opératoire. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Grâce au projet précédent, un modèle fiable de cette chirurgie a été mis en place. La robustesse de la chirurgie a permis de diminuer au maximum la variabilité entre les animaux et donc de réduire le nombre d'animaux par groupe. Les rongeurs utilisés sont consanguins et du même âge pour obtenir des résultats robustes. Lors de l'euthanasie, les organes ou parties d’organes non requis pour l’expérience en cours sont conservés pour d’autres utilisations éventuelles, constituant une bio-banque accessible à l’équipe ou aux collaborateurs, prévenant l’utilisation d’autres animaux. Une recherche bibliographique approfondie a été réalisée en amont pour sélectionner les techniques les plus légères possible après la chirurgie.

Raffinement

Les souris seront mises par groupe afin d’établir une hierarchie et des contacts visuels, olfactifs, auditifs et tactiles. La surface au sol nécessaire par animal sera respectée. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. L’environnement des souris est enrichi avec a minima un igloo et du materiel de nidification tel que des serpentins et du sopalin. Le change de la litière est réalisé 1 fois tous les 15 jours. Les animaux ont au minimum une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. L’état des animaux est vérifié quotidiennement. Lors de la chirurgie, un tapis chauffant est systématiquement utilisé, les animaux sont sous anesthésie profonde surveillée et un agent analgésique est administré en période pré et post-opératoire. En complément du tapis chauffant, des chaufferettes réglées à 37°C sont disposées de part et d'autre de l'animal afin d'éviter l'hypothermie. Lorsque les animaux sont réveillés ils sont remis dans leur cage avec du coton pour améliorer leur confort. Les expérimentateurs réalisant les procédures sont tous dotés du diplôme de chirurgie et appliquent les bonnes pratiques pour le suivi des compétences. L'état des animaux sera relevé et scoré à chaque surveillance à l'aide d'une fiche de scoring spécifiquement adaptée à la chirurgie abdominale. Les points limites sont indiqués dans cette fiche et seront appliqués dès que nécessaire.

Choix des espèces

La souris présente certains intérêts décisifs justifiant leur utilisation comme modèle dans ce type de projet : la physiologie digestive de la souris est très proche de celle de l'Homme et la manipulation intestinale qui a lieu lors d’une chirurgie de patient humain peut être reproduite à l’identique chez la souris. Des animaux adultes seront utilisés pour étudier le système digestif mature.

Nées de croisements de lignées transgéniques entretenues au laboratoire, 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 160 d'entre elles et léger pour 80. Sur les animaux vivants, le seul geste décrit est une biopsie de l'oreille au sevrage pour lire le génotype, le reste du projet portant sur des embryons et des fœtus mutants récupérés après la mise à mort des mères gestantes, à cinq stades de gestation. Le porteur reconnaît que ces embryons portent des malformations du crâne et du cou, et affirme qu'elles ne provoquent ni détresse ni douleur pendant la gestation. Une partie des souris de génotype recherché est gardée en vie pour renouveler le stock de reproducteurs, l'ensemble étant tué à la fin du projet, et les individus non analysés seront selon ses mots "traités, stockés et exploités pour l'optimisation des protocoles".

Objectifs

Chez l’humain, certaines malformations de naissance touchent spécifiquement le système musculosquelettique cervical, comme dans les syndromes de Klippel-Feil et de Loeys-Dietz, pathologies rares mais sévères. Du point de vue génétique, il a été montré que des acteurs d'une voie de signalisation étaient mutés chez les patients, mais l’origine des malformations est encore inconnue. Une voie de signalisation est une séquence d'étapes impliquant plusieurs gènes qui fonctionnent ensemble pour contrôler les fonctions cellulaires. Afin de comprendre pourquoi la région cervicale est affectée dans ces pathologies, il est primordial d’élucider la fonction de la voie de signalisation TGF-beta au cours du développement embryonnaire sur des modèles animaux proches de l’humain sur l’échelle évolutive. Notre objectif est de générer de nouveaux modèles de souris mutées pour l’un des récepteurs à la TGF-beta permettant ainsi d’inactiver sa fonction et d’étudier les répercussions sur le développement du système musculosquelettique cervical chez les mammifères. Nos recherches ont précédemment mis en évidence que les précurseurs du tissu conjonctif qui orchestrent le développement musculaire ont différentes origines embryonnaires au niveau du cou. Afin de déterminer la contribution relative de la voie TGF-beta dans les différentes populations cellulaires produisant le tissu conjoinctif cervical, nous allons utiliser les outils génétiques disponibles chez la souris qui permettent d’inactiver les gènes specifiquement dans certains groupes de cellules au cours du développement. Ces expérimentations permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires à l’origine des malformations musculosquelettiques cervicales caractérisant les pathologies touchant le tissu conjonctif comme chez les patients atteints des syndromes de Klippel-Feil ou de Loeys-Dietz.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ce projet de recherche fondamentale produira des connaissances nouvelles pour la compréhension du rôle de la voie TGF-beta et des précurseurs du tissu conjonctif dans la formation du système musculosquelettique qui est affecté dans de nombreuses pathologies de naissance ou dégénératives humaines, mais aussi dans certaines formes de cancers. Nos données permettront d’établir au mieux le diagnostique, la prise en charge et le suivi clinique personnalisé essentiel à l’amélioration de la qualité de vie des patients après la naissance.

Procédures

Seule une rapide biopsie d'oreille pour caractériser le génotype des individus sera effectuée sur animaux vivants au moment du sevrage avant les mises en accouplement après atteinte de la maturité sexuelle.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de notre projet, les animaux adultes ne présenteront pas de nuissances dûes à l’alteration de leur génome. Cependant, un suivi journalier sera fait de façon à assurer leur bien être. Les embryons et fœtus mutants inactivés pour la voie TGF-beta issus des croisements des lignées d’intérêt porteront des malformations au niveau cranio-cervical qui ne généreront ni détresse ou douleurs pendant la gestation, et seront récupérés avant leur naissance, en majorité avant le dernier tier de gestation après la mise à mort de la mère dans le respect du bien-être animal de manière non douloureuse.

Devenir

Certains animaux de génotype d'intérêt seront gardés en vie pour renouveler le stock des reproducteurs à la fin de la procédure 1. L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin du projet car ne seront pas réutilisés.

Remplacement

La dynamique de développement embryonnaire implique des processus cellulaires et moléculaires complexes qui ne peuvent ni être modélisés, ni reproduits in vitro ce qui rend inévitable de réaliser ces expériences chez l’animal. L’étude in vivo est la plus adaptée pour étudier la formation du système musculosquelettique cervical. Plus particulièrement, effectuer ces observations chez la souris permet une approche génétique nécessaire à l’étude de la formation musculosquelettique sur un modèle de mammifère phylogénétiquement proche de l’humain.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour s’assurer de la reproductibilité et pénétrance des phénotypes et pour permettre une interprétation pertinente des résultats tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle (n=3/conditions si résultats reproductibles). Pour chaque accouplement, nous considérons un nombre moyen de 8 embryons/portée. Selon les règles mendéliennes, 1/4 de la portée sera du génotype délétère d'intérêt et 3/4 de la portée de génotype contrôle. Afin de valider la redondance et la pénétrance des résultats, un minimum de 3 invidividus mutants (et 2 contrôles) sont nécéssaires. Nous évaluons donc 2 portées issues de ces croisements, et ce pour chacun des 5 stades développementaux d’intérêt (à 10.5, 11.5, 12.5, 14.5 et 16.5 jours post-fertilisation). Les individus non utilisés pour l’analyse seront traités, stockés et exploités pour l’optimisation des protocoles.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de ce projet expérimental, les individus seront surveillés de manière journalière afin de vérifier la prise alimentaire et d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Tout au long des expériences, les animaux seront maintenus en groupes sociaux d’au moins deux individus et le milieu sera enrichi avec du matériel n'interférant pas avec l'analyse. L’atteinte des points limites entraînera la mise à mort des individus concernés.

Choix des espèces

Pour réaliser ce projet, notre modèle biologique est la souris (Mus Musculus), choix dicté par plusieurs raisons : - La souris est l’espèce animale la plus étudiée en expérimentation animale et dans les recherches biomédicales. La proximité phylogénétique des souris et de l’humain permet d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. - Les connaissances accumulées sur cet organisme modèle ont permis d’identifier de nombreux mécanismes impliqués dans le développement embryonnaire. - Cet animal de petite taille, est facile à maintenir en animalerie, possède un fort taux de reproduction et offre une panoplie d’outils génétiques. - Nos précédents protocoles ont été optimisés pour ce modèle, avec un contrôle maximum des paramètres vitaux. Le projet implique seulement des croisements entre individus adultes sexuellement matures pour obtenir les reproducteurs d’intérêt (entre 6 semaines et 6 mois pour les femelles et 8 semaines et 12 mois pour les mâles). Les reproducteurs sexuellement matures seront croisés entre eux pour générer des embryons et fœtus d'intérêt qui seront analysés aux stades clés du développement du système musculosquelettique.