Procédures légères

5 609 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 2 912 d'entre elles sont tatouées aux phalanges puis amputées de l'extrémité de la queue pour le génotypage, 1 680 reçoivent une implantation de cellules d'adénocarcinome suivie de chimiothérapie trois fois par semaine et d'irradiations, et 1 008 subissent une chirurgie de vingt minutes créant des métastases hépatiques. Le porteur écrit que la croissance tumorale peut provoquer perte d'appétit, perte de poids et signes moteurs, quand le débouché thérapeutique évoqué se limite à des inhibiteurs qui "pourraient" être utilisés un jour. Il conclut que la souris reste "indispensable" pour observer ces enzymes dans un "organisme entier proche de l'homme".

Objectifs

Le système immunitaire joue un rôle important dans la mise en place et le développement des cancers. Notre projet vise à déterminer le rôle des protéines convertases (PCs) dans le recrutement du système immunitaire par les tumeurs. Les PCs sont des enzymes dont les quantités sont fortement augmentées dans de nombreux cancers et qui sont impliquées dans la progression des tumeurs et l’établissement des métastases. De plus, dans le cancer du colon les PCs sont nécessaires à la régulation de l’activité des cellules immunitaires que sont les lymphocytes T. Dans ce projet, nous souhaitons identifier précisément quelles convertases jouent un rôle dans le recrutement des cellules du système immunitaire par les tumeurs, nos candidats sont la Furine et PC7. Pour mettre en œuvre ce projet, nous créerons une lignée de souris génétiquement modifiées qui n’exprimeront ni PC7, ni la Furine dans les lymphocytes T. Ce nouveau modèle nous permettra de définir le rôle de PC7 et de la Furine dans la progression tumorale et l'adaptation des cellules immunitaires.

Bénéfices attendus

Les protéines sont des molécules biologiques présentes dans toutes les cellules vivantes. Lors de leur synthèse, elles peuvent nécessiter des modifications pour devenir actives biologiquement. Ces modifications sont mises en œuvre par les PCs et jouent un rôle important dans dans l’acquisition des caractéristiques cancéreuses des cellules, et dans l'adaptation du système immunitaire. Ce projet amènera à une meilleure compréhension du rôle des PCs , PC7 et Furine dans l'établissement des tumeurs. Nous nous intéressons plus particulièrement à ces deux convertases car des inhibiteurs spécifiques pourraient être utilisés comme de nouvelles thérapies ciblées seuls ou en combinaison avec des agents déjà existants et/ou la radiothérapie pour le traitement de certains cancers.

Procédures

2912 animaux seront soumis à deux gestes invasifs consécutifs pour être tatoués et génotypés par le personnel qualifié et expérimenté de notre établissement utilisateur: 1/ Identification par tatouage digital (réalisé une fois et durée de quelques secondes) et 2/ biopsie de la queue (réalisé une fois et durée de quelques secondes). Pour l'étude de la prolifération tumorale nous implanterons des cellules tumorales d'adenocarcinomes chez 1680 animaux. Les injections auront lieu une fois et durent 5 minutes. Les traitements avec la chimiothérapie seront faits 3 fois par semaine et durent moins d'une minute. Les traitements par irradiation des tumeurs durent entre 3 et 15 minutes et sont répétées deux fois à deux jours d'intervalle. Enfin le modèle de métastases hépatiques nécessitera une chirurgie réalisée sur 1008 animaux en 20 minutes par souris, une seule chirurgie par animal. Le suivi des tumeurs par bioluminescence dure entre 6 et 25 minutes, une à deux fois par semaine. Un prélèvement de sang par animal sera réalisé sous anesthésie et analgésie et dure en moyenne 15 min.

Impact sur les animaux

Le génotypage est composé de deux actes techniques invasifs, le tatouage au niveau des phalanges et/ou des coussinets et la biopsie de la queue qui consiste en un prélèvement de l'extrémité de la queue. Ces deux gestes provoquent une très légère douleur. L'animal est maintenu en contention pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure ce qui est une source de stress. Le développement de tumeurs ou de metastases hépatiques peuvent générer des souffrances se manifestant par des pertes d’appétit donc de poids, des signes physiques ou moteurs. L'irradiation peut induire des irritations locales pour les tumeurs sous-cutanées. Toutes les douleurs liées au protocole seront prises en charge et des mesures compensatoires seront appliquées.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. Les tumeurs et les organes seront collectés pour analyses immunohistochimiques, transcriptomiques et protéomiques.

Remplacement

Des tests sur des cellules tumorales et des cellules immunitaires en culture in vitro nous ont déjà permis de déterminer certains effets de l'inhibition de PC7 et de la Furine. Nous avons aussi utilisés des organoides pour intégrer une structure tridimensionnelle à nos cultures de cellules tumorales ainsi que des co-cultures (cellules tumorales et cellules immunitaires). Cependant, l’utilisation de modèles in vivo comme la souris est indispensable à la compréhension des mécanismes d’action des PCs dans un organisme entier proche de l'homme, incluant lors du développement tumoral, le microenvironnement, les contraintes physiques, le système vasculaire et le système immunitaire, qui ne sont pas retrouvés in vitro. Cette étape est également nécessaire puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme comme thérapie.

Réduction

Les études statistiques seront réalisées pour comparer 4 groupes ( WT, Furin Fl/Fl*CD4-Cre+, PC7 KO/KO et PC7 KO/KO*Furin Fl/Fl*CD4-Cre+). Afin de limiter le nombre d'animaux, tous les individus porteurs d'un génotype d'intérêt seront utilisés dans nos expériences de prolifération tumorale mais aussi pour des approches in vitro réalisées à partir de prélèvements post-motem (comme par exemple l'isolation des cellules immunitaires à partir de la rate ou de la tumeur). Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons calculé le nombre minimal de souris par groupe pour atteindre une puissance statistique satisfaisante qui correspond à 14 souris ( 7 mâles et 7 femelles) pour l’analyse de survie par le test de Kaplan-Meyer (atteinte de points limites). Nous prévoyons de répéter 3 fois les expériences, avec des lots de 14 souris pour les implantations sous-cutanées. Le sexe des animaux n'ayant pas d'influence sur nos résultats, nous utiliserons des animaux femelles et mâles

Raffinement

Le bien-être de l’animal au quotidien est nécessaire au bon déroulement de nos reproductions et expériences, mais également à la reproductibilité de nos résultats. Les animaux sont hébérgés dans des cages aux normes (au minimum 2 par cage et 5 au maximum) suivant l'âge et le poids des animaux. Des enrichissements (maisons rouges, jouets) sont présents dans les cages. Au cours de nos expériences, un suivi attentif quotidien des animaux est fait par du personnel compétent et formé, weekend, vacances et jours fériés compris. Les animaux en expérimentation sont pesés un fois par semaine, dès qu'une perte de poids est observée, du nursing et une pesée quotidienne est mis en place. Une fiche de suivie des animaux est remplie par le personnel de l'animalerie. Des mesures compensatoires sont prises si nécessaires. En revanche si l'état de l'animal malgré les mesures compensatoires ne s'améliore pas, le responsable de projet décidera de l'arrêt de l'expérience pour cet animal. Au moindre doute, nous ferons appel aux conseils de notre vétérinaire ou de la structure du Bien-Etre Animal (SBEA). Des injections d'analgésique pourront être réalisées et renouvelées en fonction de la souffrance de l'animal. Des tapis chauffants seront également utilisés dès l’anesthésie des souris, pendant l’opération, et lors de la phase de réveil.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle car c'est un animal de petite taille, facile à héberger et à manipuler. Les séquences peptidiques des convertases sont bien conservées entre l'homme et la souris. De plus, l’organisation du système vasculaire de la souris et sa relation avec le microenvironnement tumoral sont très proches de ceux observés chez l’homme. Enfin, nous avons des modèles transgéniques disponibles uniquement chez la souris pour lesquels nous pourrons utiliser des lignées tumorales syngéniques. Les souris seront tatouées et génotypées entre 7 et 12 jours après leur naissance. Dans les expériences d’implantation de cellules tumorales, les souris auront entre 14 et 16 semaines . Ces adultes présentent de bonnes réponses immunitaires et sont faciles à manipuler.

Soumises sous anesthésie à dix minutes de manipulation de l'intestin destinée à bloquer leur transit, 900 souris vont être utilisées, toutes tuées ensuite pour prélèvements. 600 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 300 d'un niveau léger. Le transit est mesuré par gavage d'une solution de charbon, avec une attente pouvant aller jusqu'à six heures, et par l'insertion d'une bille dans le côlon, l'animal restant isolé en cage individuelle jusqu'à une heure, puis les souris sont mises à jeun quinze heures. Le porteur ramène les nuisances à un inconfort abdominal et au stress du jeûne et de l'isolement, sans jamais décrire en quoi consiste cette manipulation de l'intestin ni comment l'intestin est atteint.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'identifier de nouvelles voies physiopathologiques du ralentissement voire de l'arret du transit intestinal post opératoire suite à une manipulation intestinale en utilisant un modèle murin. En effet, ce ralentissement/arrêt du transit intestinal survient frequemment chez les patients ayant subit une manipulation intestinale lors d'une chirurgie.

Bénéfices attendus

Il n'existe pas de traitement médicamenteux connu à ce jour malgré l'incidence élevée de cette complication chirurgicale. Le bénéfice de ce projet est d'identifier des gènes impliqués dans la physiopathologie et donc des cibles thérapeutiques. Cela permettra de réduire la durée d’hospitalisation et la mortalité des patients.

Procédures

Une manipulation intestinale durant 10 minutes permettant d’induire l’ileus post opératoire chez la souris va être réalisée sous anesthésie générale et analgésie. La vitesse de transit des différentes portions du tractus digestif (intestin grêle et colon) va être relevée ainsi que la vitesse du transit total grâce à l’administration par voie orale d’une solution de charbon (durée de l'administration : 5 secondes) qui va permettre de relever le temps d’apparition d’une selle noire (entre 2 et 3 heures – temps limité à 6 heures pour l’animal). La vitesse du transit dans le colon sera mesurée grâce à l’insertion intra-colique d’une bille (dont la taille est équivalente à une fécès de souris) (durée de l'insertion : 10 secondes) à l’aide de vaseline et sous anesthésie. Le temps d’expulsion de la bille sera le reflet de la vitesse du transit colique (autour de 2 minutes – temps limité à 1h pour l’animal). Lors de cette mesure l'animal sera dans une cage individuelle.La vitesse du transit de l’intestin grêle sera ensuite mesurée 24 heures après la chirurgie grâce à l’administration par voie orale d’une solution de charbon qui permet de visualiser à l’œil nu l’avancement du charbon dans l’intestin grêle post mortem (20 minutes après le gavage). Les animaux seront mis à jeun (non stricte) pendant 15h pour cette mesure.

Impact sur les animaux

inconfort abdominal (constipation, ballonements, gaz) induit par la manipulation intestinale stress induit par le jeun, l’isolement pendant 1h dans une cage individuelle lors de la mesure de la motricité colique.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux sont euthanasiés en vue des réaliser des prélevements et les analyser.

Remplacement

Les méthodes alternatives permettant l’étude de l'ileus post-opératoire et notamment de la motricité intestinale sont inexistantes. En effet les modèles in vitro actuels ne permettent pas de reconstituer l'environnement et les intéractions complexes entre les différents acteurs menant à l'ileus post opératoire. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Grâce au projet précédent, un modèle fiable de cette chirurgie a été mis en place. La robustesse de la chirurgie a permis de diminuer au maximum la variabilité entre les animaux et donc de réduire le nombre d'animaux par groupe. Les rongeurs utilisés sont consanguins et du même âge pour obtenir des résultats robustes. Lors de l'euthanasie, les organes ou parties d’organes non requis pour l’expérience en cours sont conservés pour d’autres utilisations éventuelles, constituant une bio-banque accessible à l’équipe ou aux collaborateurs, prévenant l’utilisation d’autres animaux. Une recherche bibliographique approfondie a été réalisée en amont pour sélectionner les techniques les plus légères possible après la chirurgie.

Raffinement

Les souris seront mises par groupe afin d’établir une hierarchie et des contacts visuels, olfactifs, auditifs et tactiles. La surface au sol nécessaire par animal sera respectée. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. L’environnement des souris est enrichi avec a minima un igloo et du materiel de nidification tel que des serpentins et du sopalin. Le change de la litière est réalisé 1 fois tous les 15 jours. Les animaux ont au minimum une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. L’état des animaux est vérifié quotidiennement. Lors de la chirurgie, un tapis chauffant est systématiquement utilisé, les animaux sont sous anesthésie profonde surveillée et un agent analgésique est administré en période pré et post-opératoire. En complément du tapis chauffant, des chaufferettes réglées à 37°C sont disposées de part et d'autre de l'animal afin d'éviter l'hypothermie. Lorsque les animaux sont réveillés ils sont remis dans leur cage avec du coton pour améliorer leur confort. Les expérimentateurs réalisant les procédures sont tous dotés du diplôme de chirurgie et appliquent les bonnes pratiques pour le suivi des compétences. L'état des animaux sera relevé et scoré à chaque surveillance à l'aide d'une fiche de scoring spécifiquement adaptée à la chirurgie abdominale. Les points limites sont indiqués dans cette fiche et seront appliqués dès que nécessaire.

Choix des espèces

La souris présente certains intérêts décisifs justifiant leur utilisation comme modèle dans ce type de projet : la physiologie digestive de la souris est très proche de celle de l'Homme et la manipulation intestinale qui a lieu lors d’une chirurgie de patient humain peut être reproduite à l’identique chez la souris. Des animaux adultes seront utilisés pour étudier le système digestif mature.

Nées de croisements de lignées transgéniques entretenues au laboratoire, 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 160 d'entre elles et léger pour 80. Sur les animaux vivants, le seul geste décrit est une biopsie de l'oreille au sevrage pour lire le génotype, le reste du projet portant sur des embryons et des fœtus mutants récupérés après la mise à mort des mères gestantes, à cinq stades de gestation. Le porteur reconnaît que ces embryons portent des malformations du crâne et du cou, et affirme qu'elles ne provoquent ni détresse ni douleur pendant la gestation. Une partie des souris de génotype recherché est gardée en vie pour renouveler le stock de reproducteurs, l'ensemble étant tué à la fin du projet, et les individus non analysés seront selon ses mots "traités, stockés et exploités pour l'optimisation des protocoles".

Objectifs

Chez l’humain, certaines malformations de naissance touchent spécifiquement le système musculosquelettique cervical, comme dans les syndromes de Klippel-Feil et de Loeys-Dietz, pathologies rares mais sévères. Du point de vue génétique, il a été montré que des acteurs d'une voie de signalisation étaient mutés chez les patients, mais l’origine des malformations est encore inconnue. Une voie de signalisation est une séquence d'étapes impliquant plusieurs gènes qui fonctionnent ensemble pour contrôler les fonctions cellulaires. Afin de comprendre pourquoi la région cervicale est affectée dans ces pathologies, il est primordial d’élucider la fonction de la voie de signalisation TGF-beta au cours du développement embryonnaire sur des modèles animaux proches de l’humain sur l’échelle évolutive. Notre objectif est de générer de nouveaux modèles de souris mutées pour l’un des récepteurs à la TGF-beta permettant ainsi d’inactiver sa fonction et d’étudier les répercussions sur le développement du système musculosquelettique cervical chez les mammifères. Nos recherches ont précédemment mis en évidence que les précurseurs du tissu conjonctif qui orchestrent le développement musculaire ont différentes origines embryonnaires au niveau du cou. Afin de déterminer la contribution relative de la voie TGF-beta dans les différentes populations cellulaires produisant le tissu conjoinctif cervical, nous allons utiliser les outils génétiques disponibles chez la souris qui permettent d’inactiver les gènes specifiquement dans certains groupes de cellules au cours du développement. Ces expérimentations permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires à l’origine des malformations musculosquelettiques cervicales caractérisant les pathologies touchant le tissu conjonctif comme chez les patients atteints des syndromes de Klippel-Feil ou de Loeys-Dietz.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ce projet de recherche fondamentale produira des connaissances nouvelles pour la compréhension du rôle de la voie TGF-beta et des précurseurs du tissu conjonctif dans la formation du système musculosquelettique qui est affecté dans de nombreuses pathologies de naissance ou dégénératives humaines, mais aussi dans certaines formes de cancers. Nos données permettront d’établir au mieux le diagnostique, la prise en charge et le suivi clinique personnalisé essentiel à l’amélioration de la qualité de vie des patients après la naissance.

Procédures

Seule une rapide biopsie d'oreille pour caractériser le génotype des individus sera effectuée sur animaux vivants au moment du sevrage avant les mises en accouplement après atteinte de la maturité sexuelle.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de notre projet, les animaux adultes ne présenteront pas de nuissances dûes à l’alteration de leur génome. Cependant, un suivi journalier sera fait de façon à assurer leur bien être. Les embryons et fœtus mutants inactivés pour la voie TGF-beta issus des croisements des lignées d’intérêt porteront des malformations au niveau cranio-cervical qui ne généreront ni détresse ou douleurs pendant la gestation, et seront récupérés avant leur naissance, en majorité avant le dernier tier de gestation après la mise à mort de la mère dans le respect du bien-être animal de manière non douloureuse.

Devenir

Certains animaux de génotype d'intérêt seront gardés en vie pour renouveler le stock des reproducteurs à la fin de la procédure 1. L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin du projet car ne seront pas réutilisés.

Remplacement

La dynamique de développement embryonnaire implique des processus cellulaires et moléculaires complexes qui ne peuvent ni être modélisés, ni reproduits in vitro ce qui rend inévitable de réaliser ces expériences chez l’animal. L’étude in vivo est la plus adaptée pour étudier la formation du système musculosquelettique cervical. Plus particulièrement, effectuer ces observations chez la souris permet une approche génétique nécessaire à l’étude de la formation musculosquelettique sur un modèle de mammifère phylogénétiquement proche de l’humain.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour s’assurer de la reproductibilité et pénétrance des phénotypes et pour permettre une interprétation pertinente des résultats tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle (n=3/conditions si résultats reproductibles). Pour chaque accouplement, nous considérons un nombre moyen de 8 embryons/portée. Selon les règles mendéliennes, 1/4 de la portée sera du génotype délétère d'intérêt et 3/4 de la portée de génotype contrôle. Afin de valider la redondance et la pénétrance des résultats, un minimum de 3 invidividus mutants (et 2 contrôles) sont nécéssaires. Nous évaluons donc 2 portées issues de ces croisements, et ce pour chacun des 5 stades développementaux d’intérêt (à 10.5, 11.5, 12.5, 14.5 et 16.5 jours post-fertilisation). Les individus non utilisés pour l’analyse seront traités, stockés et exploités pour l’optimisation des protocoles.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de ce projet expérimental, les individus seront surveillés de manière journalière afin de vérifier la prise alimentaire et d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Tout au long des expériences, les animaux seront maintenus en groupes sociaux d’au moins deux individus et le milieu sera enrichi avec du matériel n'interférant pas avec l'analyse. L’atteinte des points limites entraînera la mise à mort des individus concernés.

Choix des espèces

Pour réaliser ce projet, notre modèle biologique est la souris (Mus Musculus), choix dicté par plusieurs raisons : - La souris est l’espèce animale la plus étudiée en expérimentation animale et dans les recherches biomédicales. La proximité phylogénétique des souris et de l’humain permet d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. - Les connaissances accumulées sur cet organisme modèle ont permis d’identifier de nombreux mécanismes impliqués dans le développement embryonnaire. - Cet animal de petite taille, est facile à maintenir en animalerie, possède un fort taux de reproduction et offre une panoplie d’outils génétiques. - Nos précédents protocoles ont été optimisés pour ce modèle, avec un contrôle maximum des paramètres vitaux. Le projet implique seulement des croisements entre individus adultes sexuellement matures pour obtenir les reproducteurs d’intérêt (entre 6 semaines et 6 mois pour les femelles et 8 semaines et 12 mois pour les mâles). Les reproducteurs sexuellement matures seront croisés entre eux pour générer des embryons et fœtus d'intérêt qui seront analysés aux stades clés du développement du système musculosquelettique.

Infectés par un parasite qui ne se développe que chez Gallus gallus, 1 000 poulets vont être utilisés pour mesurer l'efficacité de désinfectants destinés aux bâtiments d'élevage avicole, 700 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 300 un niveau léger. Élevés à l'abri de toute contamination depuis l'éclosion, ils reçoivent à seize jours une inoculation orale de coccidies traitées ou non par désinfectant. L'effet recherché est une diarrhée avec plumes ébouriffées pendant trois à quatre jours et des lésions intestinales de niveau 3 sur une échelle de 4, faites de points de nécrose sur la muqueuse du duodénum et du jéjunum. Le porteur range ce travail parmi les moyens d'améliorer la santé et le bien-être des animaux non-humains en élevage, 965 poulets étant tués et 35, écartés à la pesée de quinze jours, réutilisés ailleurs.

Objectifs

Les parasites du genre Eimeria sont responsables des coccidioses aviaires, maladies intestinales à fort impact sanitaire et économique chez la volaille. Leur gestion représente un enjeu économique majeur pour la filière avicole et un élément important pour l’amélioration de la santé et du bien-être des animaux. Plusieurs moyens de lutte existent : des anticoccidiens distribués dans l’aliment, des vaccins anticoccidiens et des désinfectants ayant un effet sur les formes infectieuses de ces parasites présentes dans l’environnement, les oocystes. Ce projet a pour objectif de développer et proposer un outil spécifique à la filière avicole afin d’évaluer l’efficacité de désinfectants sur les oocystes d’Eimeria spp. et de fournir une réponse adaptée à la problématique des éleveurs. Les oocystes sont mis en contact avec une souillure représentative des élevages avicoles (cocktail contenant de l’aliment, des fientes de volailles et de la poussière produite par les oiseaux) puis déposés sur des supports non poreux (coupons en inox) ou poreux (coupons de terre autoclavée). Les produits à évaluer sont ensuite déposés sur ces supports. La dernière étape du projet vise à tester la viabilité des oocystes traités de différentes manières par rapport à des oocystes non traités, en infectant des poulets avec ces oocystes traités ou non traités.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à proposer un modèle d’étude de l’efficacité de désinfectants sur les oocystes d'Eimeria, spécifiquement adapté aux bâtiments d’élevage de volailles, en utilisant des coccidies parasites des poulets, et en testant les produits sur deux types de surface, poreuse et non poreuse pour représenter les deux types de bâtiments existants en production de poulets : avec sol bétonné ou avec sol en terre battue. De plus, la présence de biofilms et leur nature pouvant influencer l’efficacité des désinfectants, une évaluation préalable de la quantité de matière produite par l’activité des poulets en élevage (quantité de matières fécales produites, quantité d’aliment gaspillé et quantité de poussière produite) et restant après lavage d’un bâtiment (prélèvements de surface après lavage) a permis de définir un biofilm à mélanger avec les oocystes sur les supports afin de se rapprocher des conditions d’utilisation des désinfectants dans les bâtiments d’élevage. Un tel modèle permettra d’évaluer plus objectivement et efficacement l’intérêt potentiel de désinfectants, ceux ayant déjà des indications oocysticides et de nouveaux candidats n’ayant pas cette indication. L’objectif est de contribuer à améliorer la biosécurité en élevage avec une optimisation des choix et des usages des désinfectants, pour réduire l’utilisation de produits médicamenteux et promouvoir la qualité de la production avicole. Ce projet peut permettre de contribuer à une meilleure gestion du risque de coccidiose dans les élevages, en utilisant les produits les plus efficaces.

Procédures

Inoculations par voie orale de suspensions contenant des parasites infectieux sur animaux vigiles à l’âge de 16 jours : une seule inoculation par animal, avec contention de l'animal par un agent et inoculation par un autre agent. La durée de l'inoculation est inférieure à cinq secondes et la durée de la contention, inoculation comprise, est inférieure à la minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont des signes cliniques et lésions intestinales proportionnels à l'intensité de développement des coccidies. Les doses envisagées doivent permettre d'obtenir des signes cliniques modérés avec les oocystes non traités (diarrhée et plumes ébouriffées pendant trois à quatre jours) et des lésions intestinales d'intensité 3 sur une échelle comportant quatre niveaux d'intensité. Les lésions d'intensité 3 sont caractérisées par des points blancs de nécrose nombreux sur la muqueuse du duodénum et du jéjunum, causés par les cellules détruites par les parasites. Une baisse de gain de poids et une augmentation de l'indice de consommation sont attendus pendant cette période.

Devenir

Mise à mort de tous les sujets mis en place dans l'animalerie d'expérimentation : infectés avec des parasites ou témoins hébergés dans la même animalerie que les sujets infectés, risquant d’être contaminés par les oiseaux infectés expérimentalement. Les sujets écartés de l'étude lors de la pesée à 15 jours pourront être réutilisés dans d'autres procédures.

Remplacement

Les tests in vitro de mesure de viabilité des oocystes sont très peu nombreux et ne concernent qu’Eimeria tenella pour le poulet. La capacité des parasites à sortir des oocystes et éventuellement à envahir des cellules dans les seuls tests disponibles, ne garantit pas que ces parasites seront capables de réaliser leur cycle de développement en totalité. Ainsi, des désinfectants ne bloquant pas ces premières étapes en totalité pourraient être considérés comme de mauvais candidats alors que l’effet pourrait se manifester plus tard dans le cycle de développement parasitaire, dans le cas où le produit aurait affaibli initialement les parasites sans pour autant les tuer. De plus, aucun modèle n’est développé pour Eimeria acervulina, qui est la coccidie la plus fréquente, la plus dommageable économiquement et une des moins faciles à diagnostiquer. Il n’y a donc pas actuellement de modèle adapté à Eimeria acervulina permettant de se passer de modèle animal.

Réduction

Les effectifs ont été réduits à vingt sujets par lot, ce qui permet d'obtenir des différences significatives pour une baisse de gain de poids moyen d'environ 15 à 20% par rapport à des animaux non infectés (ou infectés avec une dose n'entraînant pas de baisse de gain de poids). Un lot de référence sera constitué de 20 sujets subdivisé en cinq sous-lots de quatre sujets recevant des doses croissantes d'oocystes non traités, afin d'établir une échelle indicative des indices lésionnels. L'utilisation de quatre sujets par dose au lieu de vingt est envisageable car les lésions sont dose-dépendantes et même si l'échelle sera moins fiable que les résultats des différents lots expérimentaux, il sera possible d'estimer un pourcentage de destruction ou d'inactivation des oocystes traités.

Raffinement

Les oiseaux seront hébergés dans des cages conformes aux conditions exigées pour les animaux utilisés à des fins scientifiques, en groupes homogènes, avec un éclairage naturel, complété par un éclairage artificiel en période de jours courts, et une période d’obscurité la nuit de durée continue minimale de 6 heures, une maîtrise de la température ambiante conforme aux exigences requises en fonction de l’âge des oiseaux, une gestion de la pression et un suivi de l’hygrométrie. Des cordelettes en sisal seront suspendues dans les cages, ainsi que des CD à hauteur des animaux, afin qu'ils puissent jouer avec. Des perchoirs seront installés dans chaque cage. Les points limites définis dans les procédures seront appliqués strictement pendant toute la durée de chaque essai.

Choix des espèces

Le modèle sélectionné pour l'étude sur les oocystes est la coccidie Eimeria acervulina, qui est un parasite strictement inféodé à l'espèce Gallus gallus. Cette coccidie ne se développe que chez le poulet. Les oiseaux seront mis en place à l’âge d’un jour, après éclosion et récupération au couvoir, afin d’éviter toute contamination accidentelle avec des coccidies. Ils seront élevés en animalerie protégée jusqu’à l’âge de 15 jours. Ils seront inoculés le lendemain. L’essai durera ensuite huit jours, afin que la totalité d’un cycle parasitaire soit réalisée et totalement terminée. Ces âges correspondent aux périodes d’apparition les plus fréquentes de cette coccidie dans les élevages, et la durée du cycle parasitaire n’excédant pas sept jours, il n’est pas nécessaire de les garder au-delà huit jours pour pouvoir mesurer les effets des parasites sur les animaux.

Pour valider un test qui mime le survol d'un prédateur, 218 souris vont être utilisées, 128 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 90 d'un niveau léger. Elles reçoivent de la corticostérone pendant huit semaines, hormone du stress dont le porteur reconnaît qu'elle produit un stress léger à partir de la cinquième semaine. Elles sont ensuite exposées à un stimulus imitant l'attaque et à des sons brefs et intenses sur dix minutes, avec anxiolytiques et antidépresseurs pour une partie des groupes. Toutes sont tuées, parce que les procédures subies peuvent modifier leur comportement ultérieur et pour prélever les tissus cérébraux d'une partie d'entre elles.

Objectifs

Une personne souffre de troubles anxieux lorsqu’elle ressent une anxiété forte et durable sans lien avec un danger ou une menace réelle, qui perturbe son fonctionnement normal et ses activités quotidiennes. 15% des adultes de 18 à 65 ans présentent des troubles anxieux sévères sur une année donnée, et 21% en présenteront au cours de leur vie. Les mécanismes à l’origine des dérèglements qui font basculer de l’anxiété physiologique aux troubles anxieux pathologiques restent encore à découvrir. De plus, les traitements actuels (anxiolytiques, antidépresseurs) présentent une efficacité limitée dans la durée, associée à des effets secondaires importants. Ce projet a pour objectif de valider un nouveau test comportemental au laboratoire pour mimer certains déficits associés aux troubles anxieux chez l'humain. Les troubles anxieux se caractérisent notamment par une expression aberrante des réponses de défense face à une menace potentielle. Chez le rongeur, on peut par exemple observer un comportement d’immobilité ou de fuite en fonction de sa perception de l’imminence de l’attaque d’un prédateur. Ce choix peut être modulé par des facteurs internes à l’animal comme son niveau de stress. Dans ce contexte, il n’existe pas de test préclinique bien calibré capable d’évaluer simplement d’éventuelles anomalies dans la réponse à la menace. Dans ce projet, nous utiliserons le paradigme de "survol" qui mime en laboratoire le risque d'attaque d'un prédateur et nous vérifierons si ce test permet de révéler des réponses altérées/inadaptées dans un modèle de stress chronique et des effets bénéfiques de médicaments.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider une nouvelle approche plus éthologique pour évaluer une réponse au stress altérée chez la souris. En effet, le test de survol reproduit un comportement qui correspondent à une situation fréquemment rencontrée dans la nature par le rongeur contrairement à d'autres tests utilisés pour évaluer l'efficacité des médicaments. Il permettra de renforcer l'arsenal de tests précliniques pour modéliser les pathologies liées au stress. L'étude de l'effet de médicaments connus évaluera la valeur prédictive du test qui pourra ensuite être utilisé pour identifier d’autres candidats médicaments.

Procédures

Une injection (30 secondes). Exposition à l'hormone de stress pendant 8 semaines. Exposition à un stimulus mimant un prédateur (4 secondes) et à des sons brefs et intenses sur une période de 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les injections peuvent générer un stress léger de courte durée (30 secondes environ). L’administration de corticostérone pendant 8 semaines engendre un stress légér à partir de la cinquième semaine de traitement. Les tests comportementaux représentent également une nuisance d'une durée variable (2 minutes, 5 minutes, 10 minutes) et dont l'intensité peut être légère à modérée en fonction des groupes expérimentaux (traitement chronique par l'hormone de stress, traitements anxiolytiques et antidépresseurs).

Devenir

Les animaux seront mis à mort car les procédures auxquelles ils ont été exposés peuvent modifier leur comportement ultérieur. Pour une partie des animaux, des tissus doivent être prélevés pour étudier les circuits cérébraux impliqués dans les comportements observés.

Remplacement

L’objectif du projet est l’étude de comportements complexes: anxiété, hypervigilance et réponse à la menace. Pour cela il est indispensable de travailler sur un modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base d' études préliminaires et est réduit au minimum nécessaire pour obtenir une puissance suffisante pour les analyses statistiques, soit 15 à 16 animaux par groupe. Afin de limiter le nombre d'animaux, les symptômes seront étudiés sur les mêmes individus en limitant le nombre total de tests à 3.

Raffinement

Les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation de 2 minutes par souris avant le début des tests comportementaux. Ils sont également habitués à la pièce expérimentale et au dispositif. Les animaux seront suivis quotidiennement par des personnels formés au soin. Si une altération de l’état est observée, une grille de scoring sera utilisée pour déterminer la conduite à tenir.

Choix des espèces

La souris est une espèce modèle sensible au stress chez qui l'on peut reproduire les symptômes anxio-dépressifs observés chez l'homme. Ce modèle a de plus une bonne validité prédictive pour révéler l'efficacité des médicaments ciblant les pathologies liées au stress. Dans ce projet nous souhaitons étudier le comportement de l’adulte. Les expériences débuteront sur des animaux âgés de 8 semaines.

5 167 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 4 915 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées sous anesthésie, gavées ou traitées par voie intratrachéale, une partie recevant en plus une greffe de tumeur. Les effets attendus sont des ulcérations intestinales, des diarrhées, une inflammation et une fibrose pulmonaires, une immunosuppression et une perte de poids. Le porteur annonce que ces composés pourraient "transformer la prise en charge des patients sous radiothérapie", puis écrit qu'ils "présentent un profil de sécurité élevé, réduisant considérablement les nuisances pour les animaux", alors que les atteintes décrites viennent des radiations qu'il administre.

Objectifs

La radiothérapie est l’une des armes thérapeutiques majeures contre le cancer, utilisée pour éradiquer les tumeurs par des rayonnements ionisants. Bien qu’elle soit efficace, elle est associée à des effets secondaires notables, résultant de l’impact inévitable des radiations sur les tissus sains environnants. Ces dommages collatéraux touchent particulièrement les organes à régénération rapide, comme le tractus intestinal, le parenchyme pulmonaire et le système hématopoïétique, entraînant des effets délétères aigus et chroniques. Sur le court terme, les patients subissent des troubles inflammatoires aigus, des atteintes digestives sévères, et des pneumopathies. À long terme, les complications incluent des fibroses, des dysfonctionnements métaboliques et des altérations du système immunitaire, qui compromettent leur qualité de vie et leur récupération. Dans ce contexte, l’utilisation d'une molécule radioprotectrice innovante, ainsi que d’autres puissants antioxydants connus, représente une avancée prometteuse. Conçu pour protéger les tissus sains tout en préservant l’efficacité antitumorale des radiations, cette molécule radioprotectrice pourrait limiter les effets secondaires locaux et systémiques de la radiothérapie, offrant ainsi une meilleure qualité de vie aux patients. Par ailleurs, en augmentant la fenêtre thérapeutique, cette molécule pourrait permettre de développer des combinaisons anti-cancéreuses impliquant par exemple la radiothérapie et les immunothérapies. Cette étude vise à évaluer le potentiel de cette molécule et d’autres antioxydants puissants comme radioprotecteurs en explorant leurs effets sur différents tissus sensibles. Nous étudierons l’efficacité de chacun des composés pour protéger l’intestin des lésions causées par la radiothérapie abdominale, notamment en préservant le microbiote et en modulant les réponses systémiques. Nous explorerons également leurs effets sur la prévention des dommages pulmonaires, comme l’inflammation et la fibrose, et dans la protection du système sanguin, en favorisant la récupération cellulaire et en limitant les perturbations métaboliques et inflammatoires.

Bénéfices attendus

Le projet visant à utiliser une molécule radioprotectrice et d’autres puissants antioxydants innovants pour protéger les tissus sains des radiations ionisantes pourrait transformer la prise en charge des patients sous radiothérapie. En réduisant les effets secondaires tels que les ulcérations intestinales, les fibroses pulmonaires et les troubles du système sanguin, cette molécule (et autres) améliorerait significativement la qualité de vie des patients. Ces derniers pourraient mieux tolérer les traitements, avec moins de fatigue, de douleurs et de complications graves, ce qui favoriserait un rétablissement plus rapide. Sur le plan thérapeutique, ces composés permettraient d'augmenter les doses de radiations administrées, optimisant ainsi l'efficacité des traitements, notamment pour les cancers résistants. L'innovation scientifique derrière ce projet, basée sur des technologies avancées, pourrait également conduire à de nouvelles cibles thérapeutiques, avec des applications potentielles au-delà de la radiothérapie, comme les expositions accidentelles aux radiations. La validation clinique accélérée du projet permettrait de réduire les délais d'introduction de cette molécule dans les traitements, offrant ainsi une option thérapeutique plus tôt pour les patients. Enfin, cette molécule radioprotectrice (et autres composés) pourrait réduire les coûts liés aux complications secondaires, tout en limitant l'impact psychologique et social de la radiothérapie, facilitant un retour plus rapide à la vie normale. En somme, ce projet promet non seulement de protéger les patients contre les effets secondaires, mais aussi d'améliorer l'efficacité des traitements, tout en ayant un impact sociétal et économique positif.

Procédures

Une injection de cellules tumorales sera réalisée chez certains animaux, durée 10 secondes, sous anesthésie locale. L’injection des composés se fera soit par gavage sur animaux vigiles, durée 10 secondes, soit en injection ou par voie, intratrachéale (une à quatre administrations selon les composés et selon la procédure 1), durée 10 secondes, sous anesthésie locale. Les souris seront anesthésiées pendant l’irradiation (maximum 15 minutes), une fois. Les prélèvements de sang sur les souris seront réalisés sous anesthésie générale, n=3, durée 3 minutes.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues concernent les effets liés aux radiations elles-mêmes. Les animaux pourraient présenter des atteintes gastro-intestinales, telles que des ulcérations ou des diarrhées, des complications pulmonaires comme une inflammation ou une fibrose, ainsi qu’une immunosuppression temporaire augmentant leur vulnérabilité aux infections. Une perte de poids et une fatigue générale pourraient également être observées, conséquence directe des dommages causés par les radiations. Pour certains groupes de souris, une nuisance supplémentaire pourrait provenir de l'implantation de tumeurs afin de simuler des conditions cliniques réalistes. Cette procédure, bien que nécessaire, peut entraîner un stress, une douleur, ou une gêne liée à la croissance de la tumeur. En ce qui concerne les antioxydants, le risque d’effets indésirables est extrêmement faible. Ces molécules sont généralement bien tolérées quelle que soit leur voie d’administration, et les doses administrées dans ce type d’étude sont soigneusement ajustées pour minimiser tout risque de toxicité systémique ou d’effets paradoxaux. Le principal inconfort résidera dans les manipulations nécessaires pour l’administration des traitements et le suivi clinique, telles que les prises de sang ou les interventions liées aux protocoles de radiothérapie. Ainsi, bien que des effets secondaires liés aux radiations et à l’implantation de tumeurs soient prévisibles, les antioxydants utilisés dans cette étude présentent un profil de sécurité élevé, réduisant considérablement les nuisances pour les animaux tout en garantissant des résultats scientifiques pertinents.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales afin d'analyser les tissus et les organes post-mortem.

Remplacement

Il a clairement été mise en évidence ces dernières décennies que le système immunitaire et le microenvironnement tumoral jouent un rôle fondamental dans la progression tumorale ainsi que dans la réponse à la radiothérapie et aux traitements anticancéreux en général. Il n’existe actuellement pas d’alternative permettant de récapituler aussi bien qu’un organisme vivant l’ensemble de ces interactions dans leur nombre et leur complexité. De même, il n'exsite pas de sytème permettant de reproduire les interactions entre les éléments du sang, les cytokines, la tumeur et le sytème immunitaire dans sa globalité.

Réduction

Pour observer des différences qui soient statistiquement interprétables entre les différents groupes de traitements, nous avons utilisé un outil informatique afin de réduire au maximum le nombre d’animaux. De plus, nous utilisons des modèles pour ce projet pour lesquels il y a beaucoup de données dans la littérature concernant la réponse à la radiothérapie et l'immunothérapie. Ceci nous permettra de réduire les conditions expérimentales et donc le nombre de souris.

Raffinement

Les interventions seront faites sous anesthésie locale ou générale, suivant l'intervention. Les animaux seront observés quotidiennement (vérification de l’état général) et pesés 3 fois par semaine (pour surveiller la survenue d’une éventuelle perte de poids. Un aliment adapté sera fournit en cas de perte de poids).Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Un antalgique prescrit sera utilisé en cas de signes de douleur.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et elle est parmi les plus utilisées pour étudier les réponses immunitaires pendant le développement tumoral. Les outils (notamment les anticorps et les bibliothèques pour RNA-seq) et les banques de données de référence sont très développés chez la souris. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez cette espèce en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui promeut et facilite le transfert des résultats obtenus vers des applications cliniques. Les souris seront âgées de 8 à 10 semaines, âge auquel les souris sont suffisamment matures pour ce type d’étude.