Procédures légères

Expédiés vers d'autres laboratoires, gardés pour un usage interne ou mis à mort selon les besoins de l'élevage, 901 000 souris et 3 000 rats immunodéficients vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Leur seule procédure décrite est une biopsie sur animal vigile pour le génotypage, l'essentiel de l'activité étant la reproduction, la fécondation in vitro et la cryoconservation des gamètes sur deux établissements. Ces rongeurs sont dépourvus de défenses immunitaires pour accepter sans les rejeter des greffes de tumeurs ou de cellules humaines, ce qui les rend sensibles à la moindre contamination et impose un élevage sous barrière sanitaire. Le porteur écrit avoir calculé les effectifs sur son savoir-faire et ses données historiques, et précise qu'aucune approche statistique n'a été réalisée.

Objectifs

Dans le développement de la recherche pour traiter les maladies humaines, les modèles de souris dépourvues d’un système immunitaire, c’est-à-dire des éléments du sang permettant de lutter contre les infections et les tumeurs sont devenus de plus en plus nombreux. Ce sont des souris immunodéficientes, donc dépourvues d’un système de défense contre des éléments étrangers au corps de la souris. Grâce à un système immunitaire très faible, ces modèles de souris peuvent recevoir des morceaux d’organes, des morceaux de cancers, ou les éléments du sang d’autres espèces comme l’Homme sans que ces éléments étrangers soient attaqués et détruits par le système de défense de la souris. Le but de ce projet est d’élever ces modèles de souris immunodéficientes afin de pouvoir les utiliser dans des projets qui peuvent imiter toutes sortes de maladies humaines. Ces animaux pourront servir par exemple à comprendre comment certaines maladies fonctionnent, à chercher des nouveaux traitements contre le cancer. Ces animaux peuvent aussi servir à reconstituer dans le corps de la souris un système de défense contre les microbes (système immunitaire) provenant de l’Homme pour étudier des maladies touchant le système immunitaire humain, ou pour trouver des traitements utilisant ce système de défense humain. De nouvelles méthodes dans le domaine de la lutte contre le cancer utilisent justement le système de défense humain et lui apprennent à attaquer les cancers afin de les détruire. Cela peut donc être reconstitué dans le corps de la souris, avec un système immunitaire humain, et un cancer humain, avant d’être testé chez des personnes atteints de cancer. Ces animaux dépourvus de système de défense contre les éléments étrangers sont susceptibles de développer dans la nature des maladies, c’est pourquoi elles sont élevées dans des conditions sanitaires élevées afin qu’elles ne soient pas malades. Les animaux issus de cet élevage pourront servir dans notre établissement à créer certains modèles, comme les modèles avec un système immunitaire humain, ou alors pourront être directement redirigés vers d‘autres centre de recherche qui pourront les utiliser dans le cadre de leurs recherches spécifiques, comme la recherche contre le cancer ou la recherche sur les maladies du système immunitaire humain.

Bénéfices attendus

L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux présentant des déficiences immunitaires à divers degrés et par des voies différentes provoquées par la délétion qualitativement ou quantitativement d'un ou plusieurs gènes. Certains modèles sont génétiquement modifiés afin de les rendre plus immunodéficients et de leur permettre de tolérer des tissus ou des cellules d’autres espèces, notamment humains. Ces modèles de souris et de rats permettent de reconstituer un système immunitaire humain, et permettent la greffe de tissus humains, comme des tissus tumoraux, au plus proche de la maladie humaine, et sont donc très pertinents pour le développement de traitements pharmacologiques dans le domaine de la cancérologie et de l’immunité.

Procédures

Les souris et les rats sont immunodéficients donc sans certaines cellules de l’immunité impliquées dans la défense de l’organisme contre les microorganismes extérieurs (pathogènes, opportunistes). Ces animaux sont maintenus dans des structures avec un niveau sanitaire élevé (SOPF signifiant sans une liste de pathogènes et d'opportunistes) afin de ne pas développer de phénotype dommageable. Pour certains animaux, une biopsie est réalisée sur animal vigile pour son génotypage. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs, EU1 pour l'élevage et EU2 pour les prestations de sciences de la reproduction (accouplement, fécondation in vitro, et cryopréservation des gamètes).

Impact sur les animaux

Les animaux sont immunodéficients et sont donc particulièrement sensibles aux organismes extérieurs (microorganismes pathogènes, opportunistes) pouvant amener des infections et une dégradation de leur état.

Devenir

Les animaux sont soit expédiés dans un autre établissement utilisateur ou utilisés dans notre établissement (utilisation continue), soit mis à mort (gestion de l'élevage).

Remplacement

Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ses hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal ; en effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de cancers ou de maladies auto-immunes ou de maladies infectieuses, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.

Réduction

Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.

Raffinement

L’hébergement est réalisé dans des conditions sanitaires élevées SOPF, c’est-à-dire exemptes d’organismes pathogènes ou opportunistes. Dans ces conditions, les animaux ne déclarent pas de pathologie liée à leur immunodéficience. Un hébergement standard est réalisé (litière, enrichissement et congénères) associé à une surveillance quotidienne. Pour des lignées particulièrement fragiles, un enrichissement complémentaire est mis en place (matériel de nidification supplémentaires) et les densités au sevrage peuvent être diminuées. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Une attention particulière est apportée aux barrières sanitaires et aux contrôles sanitaires permettant de garantir le statut sanitaire SOPF nécessaire au maintien en bonne santé de ces souches immunodéficientes. Les animaux aptes au transport seront livrés d’un établissement à l’autre via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Les génomes des souris et des rats sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d’ovocyte, des adultes matures sexuellement seront utilisés.

Soixante-dix minutes d'anesthésie générale d'affilée et un prélèvement de 10 mL de sang : 13 poules pondeuses vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, et toutes seront réutilisées dans un autre projet. Elles reçoivent un cathéter dans la veine de l'aile ou de la patte, passent un scanner de 5 minutes puis une IRM d'une heure, une première prise de sang étant faite sur animal vigile. L'objectif est de constituer des images et des valeurs de référence chez la poule, de mesurer l'effet de l'isoflurane sur les paramètres sanguins et de tester en éprouvette la compatibilité des sangs entre individus. Le porteur justifie l'espèce par la demande croissante de soins vétérinaires pour les poules gardées comme animaux de compagnie, la médecine d'élevage étant selon lui inadaptée à un individu unique.

Objectifs

Les poules domestiques voient leur popularité augmenter auprès des particuliers qui ne les considèrent plus seulement comme animal de production mais aussi comme animal de compagnie. Il y a donc une demande de plus en plus forte d’un niveau élevé de soins vétérinaires pour ces animaux. Néanmoins, la majorité des connaissances vétérinaires chez cette espèce provient de la médecine d’élevage, inadaptée à la gestion d’un individu unique ou d’un petit groupe d’individus. Les images normales et mesures de référence chez la poule ont récemment été décrites pour les techniques de radiographie et d’échographie. A l’heure actuelle, il n’existe dans la littérature scientifique aucune étude s’intéressant à la pratique d’imagerie avancée (Tomodensitométrie TDM et Imagerie par résonnance magnétique IRM) chez la poule, en dehors d'une étude de 1989 sur la TDM. Cependant la résolution de l’examen à l'époque rend cette étude peu utile en pratique. Les autres études TDM chez la poule se concentrent sur un organe particulier (appareil respiratoire, rate, certains os) mais aucune ne décrit les résultats pour une région entière (cavité abdominale, squelette complet, etc…),ce qui est essentiel pour l’interprétation clinique. Pour l’IRM, les données chez la poule sont quasi inexistantes . Aucune étude ne compare les résultats de ces deux techniques complémentaires par le type de tissu présentant la meilleure résolution. Il y a donc un réel besoin d’études décrivant l’anatomie normale de la poule utilisant ces deux techniques afin de permettre leur utilisation et interprétation optimales en clinique. Par ailleurs, s’il est connu que l’anesthésie gazeuse à l’isoflurane affecte les paramètres hématologiques des mammifères, cela n’a été que peu étudié en médecine aviaire, et aucune donnée n'est disponible pour la poule. La connaissance de ces potentielles altérations revêt une importance certaine dans la surveillance anesthésique et la planification du risque chez cette espèce. Enfin, la compatibilité sanguine inter-individuelle en vue d'une transfusion est peu étudiée chez les oiseaux (groupes sanguins non décrits). Une première étape est donc l'étude de compatibilité des sangs (via des tests de mélange de sangs in vitro) pour évaluer la présence ou non d'incompatibilité entre individus de cette espèce.

Bénéfices attendus

L’objectif est de réaliser des examens d’imagerie TDM et IRM chez des poules saines afin de pouvoir décrire les images normales chez cette espèce et comparer l’apport en clinique des deux techniques d'imagerie. Ces résultats pourront servir de point d’ancrage à de futures études portant sur le diagnostic spécifique d'affections en utilisant les techniques TDM et IRM. Cette étude permettra par ailleurs d’évaluer l’effet de l’anesthésie gazeuse sur les paramètres hématologiques de la poule afin d’adapter au mieux en pratique la surveillance anesthésique et la planification du risque anesthésique chez cette espèce. Enfin, cette étude permettra d’évaluer l’existence ou non d’incompatibilité transfusionnelle entre divers individus et pourra servir d’étude préliminaire pour une étude plus poussée sur l'existence d’éventuels groupes sanguins chez cette espèce.

Procédures

Placement d’un cathéter intraveineux dans la veine ulnaire ou métatarsienne médiale (3 min environ) puis examen d’imagerie médicale (scanner 5 min) et IRM (60 min) sous la même anesthésie générale (soit un total d’environ 70 min d’anesthésie générale). 2 prélèvements sanguins (1 min à chaque fois, 0,2 et 10 mL respectivement), un vigile, le 2ième se faisant au cours de l’anesthésie générale mentionnée ci-dessus.

Impact sur les animaux

Une douleur légère est attendue lors de la ponction sanguine préanesthésique, ainsi qu’un léger stress lié à la 1ère contention et la manipulation des animaux (en maintenant les ailes plaquées au corps). Une douleur légère liée la piqûre pour mise en place du cathéter et la seconde prise de sang en fin de procédure (effectuées sous anesthésie générale) peut éventuellement être ressentie. Mort à l’anesthésie possible bien qu’extrêmement rare avec des animaux sains et de cet âge. Le réveil anesthésique chez les oiseaux est très rapide et les animaux retrouvent un comportement normal dans les quelques minutes suivants l’arrêt de l’anesthésie gazeuse.

Devenir

La procédure prévue n’aura aucun impact à court, moyen ou long terme sur l’état de santé de l’animal permettant donc sa réutilisation dans un autre projet, ce dernier étant de classe modérée.

Remplacement

Les objectifs de l’étude étant de décrire l’anatomie par imagerie TDM et IRM de la poule, l’effet de l’anesthésie gazeuse sur les paramètres hématologiques de cette espèce et la possible existence d’incompatibilité transfusionnelle chez cette espèce, il n’est pas possible de substituer un modèle non animal. L’utilisation pour la bonne interprétation de l’examen d’imagerie d’un produit de contraste, nécessite par ailleurs que l’animal soit vivant et l’étude de l’effet de l’isoflurane sur des paramètres sanguins ne peut de même se faire que sur un animal vivant.

Réduction

Le calcul du nombre d’individus à inclure a été réalisé sur l’objectif de comparaison des paramètres hématologiques avant et après l’anesthésie gazeuse. Réalisé à partir de tests statistiques, ce calcul révèle qu’un nombre de 12 individus est suffisant pour révéler une différence d’hématocrite jugée cliniquement significative. Ce nombre permet également la réalisation d'un nombre préliminaire de tests in vitro de compatibilité sanguine suffisant pour évaluer l’existence ou non de réactions. Enfin, concernant l’étude d’imagerie, les poules utilisées dans l’étude seront toutes de la même race et donc du même format. Ce nombre de 12 permettra de rapporter des valeurs indicatives pour chacunes des mesures d’imagerie et d’évaluer la concordance de certaines de ces mesures entre les deux techniques d’imagerie. Cependant, et bien que non attendu, un 13ième individu est prévu mais ne sera utilisé qu'en cas d'exclusion d'un individu de l'étude.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en enclos collectif, en groupe homogène, en cycle jour/nuit avec minimum 6h de nuit, dans une animalerie dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés. Ils bénéficient d’une période d’acclimatation de 7 à 10 jours, mises à profit pour habituer les poules à la présence de l’Homme et à leur manipulation lors des opérations de change et lors de la collecte des œufs. Sont mis à disposition dans la salle comme enrichissement de la litière en copeaux de pin permettant les activités de fouissage, des perchoirs (au moins 30 cm par poule), des disques compacts suspendus et des pondoirs (1 pour 2-3 poules) et au moins 4 points d’eau. Les poules sont observées quotidiennement pendant leur hébergement puis deux fois par jour pendant 3 jours après une anesthésie. Afin de limiter le stress, les examens d’imagerie et les prises de sang (sauf la 1ère) sont réalisés sous anesthésie générale. Ainsi, aucun stress ou douleur n’est attendu autre que le stress de la manipulation et la douleur légère pouvant être ressentie lors des ponctions de veine sous anesthésie générale. Seule la 1ère prise de sang sera réalisée sur animal vigile. Mais dans tous les cas, l’application d’un anesthésique local sous forme de gel en regard de la veine à ponctionner sera préalablement réalisée. Les fréquences cardiaques et respiratoires sont surveillées pendant toute la durée de l’anesthésie et des points-limites précoces ont été définis basés sur ces paramètres amenant à une action graduée.

Choix des espèces

Les poules domestiques constituent l’espèce-cible pour laquelle ce projet a été développé (application clinique directe). Des poules adultes seront utilisées car cela correspond à la situation la plus fréquemment rencontrée en clinique vétérinaire.

Dépourvues de système immunitaire par construction, donc exposées à toute infection bactérienne ou virale, 7 030 souris sont élevées cinq ans durant pour fournir des receveuses de greffes de cellules cancéreuses humaines. Leur seule procédure déclarée est la mise en accouplement, répétée sur plusieurs cycles, dans un niveau de souffrance léger. Elles vivent en confinement sous atmosphère filtrée, en isolateur ou en cage ventilée, manipulées aux gants et à la pince désinfectée. Toutes sont tuées à la fin de l'élevage, le porteur indiquant qu'elles seront alors trop âgées pour être placées dans d'autres procédures.

Objectifs

L'objectif du projet est d'étudier les mécanismes biologiques impliqués dans le développement normal et pathologique de différents types de cellules humaines, en particulier de certains cancers humains, comme les cancers du sang appelées leucémies. Certaines expériences, par exemple, nécessitent la transplantation de cellules humaines malades chez les animaux, pour créer des modèles expérimentaux in vivo permettant d’étudier et de traiter le développement du cancer ciblé par de nouvelles stratégies thérapeutiques, potentiellement applicables dans le futur aux patients. Ces projets reposent donc sur la greffe de cellules humaines normales ou cancéreuses, issues de patients, qui ont besoin d'une environnement particulier pour se développer, sans être rejetées pour le système immunitaire de l'hôte (ici la souris) transplanté. On parle de xénogreffe. Nous réalisons ces élevages localement afin de pouvoir disposer de souris bien intégrées dans leur environnement, non stressées par un voyage, en nombre suffisant et que nous avons préalablement testées pour leur capacité à accepter les greffons humains.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont de disposer de modèles animaux murins de qualité, en bonne santé, non stressées et bien intégrées dans notre animalerie, que nous avons testées au préalable pour être de bonnes receveuses de cellules humaines normales et cancéreuses, permettant d'avoir des résultats scientifiques reproductibles rapidement et donc d'utiliser moins d'animaux. En outre, la production locale de ces trois lignées pourra aider à comprendre plus rapidement comment traiter des cancers pour lesquels à l’heure actuelle les traitements sont à améliorer. Le fait de les produire en local permet aussi un gain de temps dans l’étude et la recherche de traitement.

Procédures

Les souris seront mises en accouplement pour plusieurs cycles de reproduction pendant les 5 ans de la procédure.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées sont immunodéficientes (sans système immunitaire), elles sont donc théoriquement sensibles aux infections bactériennes et virales. Les effets indésirables pourraient être en lien avec une infection (amaigrissement, poil terne, isolement, changement de comportement lors de l’allaitement)

Devenir

Les souris utilisées pour la reproduction seront euthanasiées en fin de procédure d'élevage car ces animaux seront trop âgés pour être replacés dans d'autres procédures expérimentales.

Remplacement

Les projets que nous développons étudient le développement physiologique normal et pathologique du sang (notamment le développement de certains cancers du sang comme les leucémies). Quand cela est possible nous réalisons des expériences de culture cellulaire. Toutefois certains aspects ne peuvent pas être réalisés dans une boite de culture (in vitro) car ils nécessitent d’être étudiés dans un organisme entier et font notamment appel à la complexité des interactions entre cellules dans un organe entier ou entre différents organes qu'il n'est pas possible de générer autrement que dans un modèle animal. Il n'y a donc pas d'alternative non animale aux élevages de ces souris, même si nous faisons de notre mieux pour étudier les questions déjà ex-vivo avant de poser des questions in-vivo.

Réduction

Nous essayons de rationaliser notre production d'animaux, donc de ne pas avoir trop de couples en route, afin d'éviter une sur-production par rapport à la demande pour les projets en cours. Si les productions de souriceaux sont optimales pour répondre aux besoins des projets expérimentaux, nous régulons la production en diminuant le nombre de couples. Le nombre d’animaux prévu pour ces élevages dépend des projets de recherche dans lesquels ils sont utilisés. Nous l'avons calculé en prenant comme base des travaux de recherche réalisés au sein de notre laboratoire sur les dernières années et en essayant de programmer au mieux nos futurs projets.

Raffinement

Les souris immunodéficientes sont élevées et accouplées en confinement, sous atmosphère filtrée, donc exempt de pathogènes, soit en isolateur, soit en cages de portoir ventilé. Les changes des cages sont réalisés sous poste de sécurité microbiologique afin de réduire au maximum les risques de contact avec des agents infectieux. L'eau de boisson est une eau filtrée en bouteille du commerce et l'alimentation est stérilisée par irradiation. Toutes les manipulations des animaux sont réalisées avec des gants et des pinces aseptisées à l'alcool.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris qui sont des mammifères de petite taille à l'âge adulte, faciles à élever et à reproduire en captivité. Leurs génétique et comportement sont bien connus ce qui permet de mesurer facilement le bien-être, la souffrance et l'angoisse des animaux en captivité et d'y remédier le cas échéant ; ce qui en fait un bon modèle pour atteindre les objectifs scientifiques adossés aux élevages. Dans ce protocole nous avons besoin de souris adultes, en âge de reproduction, qui sont une espèce bien intégrée. Les souches de souris que nous élevons n'ont pas (ou peu) de défense immunitaire ce qui permet à des greffons cellulaires d'origine étrangère (nous travaillons avec des cellules humaines normales et cancéreuses et on parle de xénogreffe) de s'implanter et de se développer.

150 vaches laitières de trois races vont être utilisées pendant deux ans dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, et toutes restent en vie à l'issue. Elles sont bloquées au cornadis pour douze prises de sang, pesées chaque semaine et notées chaque mois sur leur état corporel. L'expérience consiste à faire varier leurs apports énergétiques à différents moments de la lactation, pour mesurer comment elles mobilisent leurs réserves, produisent du lait et se reproduisent. Le porteur rattache ce travail à la durabilité des élevages et revendique de montrer aux éleveurs que la conduite d'un grand troupeau à l'herbe est possible en France.

Objectifs

Cette expérimentation pluriannuelle prévue sur 2 ans (2024-2026) vise à évaluer le rôle des réserves corporelles et de leur gestion différenciée au cours de la lactation sur la carrière et les performances des vaches laitières. En début de lactation, les vaches laitières mobilisent plus ou moins leurs réserves corporelles pour pallier au déficit énergétique, conséquence d’une capacité d’ingestion insuffisante. Ces réserves corporelles sont par la suite reconstituées afin de préparer la lactation suivante. Le début de lactation correspond aussi chez les bovins à la période de reproduction qui se déroule entre 40 et 90 jours de lactation afin d’obtenir, si possible un veau par an. Or, un excès de mobilisation des réserves corporelles, en durée et/ou en intensité, s’avère défavorable au succès des différentes étapes de la reproduction (reprise de cyclicité, expression des chaleurs, fécondation, nidation, …). La mobilisation des réserves corporelles dépend de nombreux facteurs, plus ou moins maitrisables et influencés par l’éleveur. Parmi ceux-là, l’état corporel au vêlage, le potentiel de production laitière (notamment la race) et le niveau des apports alimentaires en début de lactation sont des leviers d’action possibles. Si des recommandations existent en matière d’état corporel optimum aux diverses étapes du cycle lactation-reproduction, les règles de gestion mises à la disposition de l’éleveur pour assumer ces objectifs recommandés sont quasi inexistantes. Il importe donc de mieux décrire l’influence de ces réserves corporelles, les facteurs de variation et de définir des moyens d’action, notamment au travers la conduite alimentaire et la répartition des apports au cours de la lactation. L’objectif de cette expérience est donc de moduler l’état corporel des vaches laitières grâce à des niveaux d’apports énergétiques différents à divers moments de la lactation chez 3 races laitières aux aptitudes différentes

Bénéfices attendus

L'alimentation des vaches laitières en système herbager est un axe fort de la durabilité des élevages français, tant du point de vue de la réduction de l'empreinte carbone de l'élevage que de sa contribution à la biodiversité et la qualité des paysages grâce aux prairies. Ce projet vise justement à apporter aux éleveurs des indicateurs clés de la conduite de ces systèmes, à partir d'une analyse multicritères. Ce projet vise aussi à montrer aux éleveurs que la conduite d'un grand troupeau à l'herbe est possible en France.

Procédures

Pour la caractérisation fine des animaux, des prélèvements sanguins seront effectués 12 fois au cours de l’expérimentation sur les femelles, maintenues au cornadis. Les mesures de poids (une fois par semaine) se feront sans geste technique autre que le déplacement et la contention des animaux. Pour la mesure de la note d'état, les vaches seront maintenues au cornadis une fois par mois. Voici le temps estimé pour chaque acte : Prise de sang : 2 minutes Mesure du poids : 1 minutes Mesure de la note d'état : 5 minutes

Impact sur les animaux

la principale nuisance attendue sur les animaux est liée à la contention nécessaire aux différentes procédures décrites. Celle-ci est minime puisque les animaux sont habitués dès le plus jeune âge aux manipulations. A celle-ci s'ajoute également la douleur possible liée à la prise de sang.

Devenir

Les procédures n’entravent pas le devenir de l’animal et n’ont qu’un effet limité et de court terme sur son bien-être. Aussi, l’ensemble des animaux inclus dans cette expérimentation va poursuivre une vie normale d’un animal de rente dans un troupeau de bovins laitiers.

Remplacement

Les mécanismes étudiés mettent en jeu des interactions complexes au sein de l'animal, en interaction avec le système d'élevage qu'il est impossible de reproduire dans un modèle cellulaire, de culture d'organe ou in silico.

Réduction

Les analyses statistiques prévisionnelles, intégrant de l’espérance d’écart entre traitements et la variabilité inter vaches connue, ont permis de définir le nombre minimum d’animaux nécessaires par lot expérimental, à savoir un effectif de 50 vaches par race. La pluri-annualité de cette expérimentation permet d’autre part de réduire l’effectif nécessaire chaque année et limite les besoins en renouvellement, donc la réforme des animaux.

Raffinement

Chaque intervention a été pensée de manière à limiter les nuisances pour les animaux (limitation des volumes de sang prélevés, vaches bloquées en groupe au cornadis pour limiter le stress…) . Les procédures impliquées dans le projet sont de sévérité légère et appliquées par des opérateurs expérimentés. Les conditions d'hébergement et d'alimentation répondent aux normes d’élevage en intérieur avec une aire paillée et une ration de fourrages en accès libre ad libitum. La majeure partie de l'année, les animaux sont au pâturage, non restreints et avec un accès à l'eau et à l'ombre dans toutes les parcelles grâce aux nombreux arbres implantés dans et autour des parcelles. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. La prophylaxie et le traitement des animaux en cas d’affection ne sont pas modifiés par la mise en oeuvre du projet. Tout animal présentant un trouble de santé sera soigné en fonction de la pathologie conformément aux pratiques de l'élevage, et, au besoin, le vétérinaire praticien sera consulté. Les animaux sont gardés en vie en fin d'expérimentation.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie est le bovin. Il s’agit de femelles de race Holstein, Jersiaise et Normande, grandes races laitières françaises (et internationale pour la Holstein et la Jersiaise). Ces animaux ne sont pas transgéniques et ont été obtenus par des méthodes de reproduction utilisées en élevage classique. Les animaux seront des adultes en lactation car la production de lait est nécessaire pour répondre aux questions scientifiques.

Tuées au sevrage si elles n'ont pas le bon génotype ou le bon sexe, tuées après deux mois sans portée si elles ont servi à la reproduction, tuées à vingt semaines pour les femelles et trente pour les mâles si elles attendaient un accouplement : le devenir des souris de cet élevage tient en trois motifs d'élimination. 3 360 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, 320 d'entre elles restant en vie pour l'élevage. Chacune subit le prélèvement d'un fragment de queue de moins de deux millimètres pour génotypage, opéré en une dizaine de secondes sur animal éveillé, avec une seconde biopsie à l'oreille en cas d'échec. Le porteur indique que la méthode de génotypage sur poil, qui éviterait de couper la queue, "n'est pas encore disponible" dans son animalerie.

Objectifs

Ce projet explore la contribution de certaines cellules immunitaires dans une maladie pulmonaire chronique et mortelle pour laquelle il n'existe à ce jour aucun traitement curatif. Dans ce contexte, nous utiliserons des lignées de souris comme modèles d'étude: une lignée surexprimant ces cellules immunitaires, une lignée exprimant un faible nombre et une lignée dépourvue de ces cellules immunitaires. Ces 3 lignées ne développent pas spontanément de maladie, les modifications génétiques dont elles sont porteuses ne génèrent pas d’inconfort. Pour ce projet, nous avons tout d'abord besoin d’étudier l'ADN de ces souris (prélèvement d'un petit bout de leur queue) pour s'assurer de la présence de la mutation qui permet la diminution des cellules de défense avant de pouvoir réaliser des accouplements des souris ou de réaliser des expérimentations.

Bénéfices attendus

Le projet va permettre, par la caractérisation génétique des animaux, l’optimisation de la gestion des élevages et la production d’animaux pour étudier le rôle de certaines cellules du système immunitaire dans le développement d'une maladie respiratoire sévère et incurable. Au-delà des aspects de recherche fondamentale, l’utilisation de ces lignées de souris pourraient nous permettre d’ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour aider les patients souffrant de ce type maladie

Procédures

Un prélèvement unique d’un fragment de tissu au niveau de la queue (durée de 10 secondes sur animaux vigiles) sera réalisé. Dans les cas d’absence de matériel génétique (évènement extrêmement rare) au moment du génotypage une nouvelle biopsie unique sera réalisée au niveau de l'oreille (durée de 10 secondes sur animaux vigiles).

Impact sur les animaux

La biopsie de l’extrémité de la queue (moins de 2 mm) peut causer une brève douleur et un léger saignement qui sera monitoré et arrêté par une légère pression exercée localement. Si une rougeur au niveau de la queue est observée nous appliquerons un antiseptique (Chlorhexidine).

Devenir

Les souris produites au cours de ce projet seront soit incluses dans d’autres protocoles expérimentaux, soit utilisées pour prélèvement d’organes post-mortem, soit utilisées ou stockées pour générer de nouveaux accouplements. Les souris ne présentant pas les bonnes modifications de gènes ou le bon sexe seront immédiatement euthanasiées. Les souris utilisées pour des accouplements seront euthanasiées lorsqu'elles n'auront plus donné de portées depuis 2 mois. Les souris stockées pour de futurs accouplements seront euthanasiées lorsqu’elles seront âgées de plus de 20 semaines pour les femelles et de plus de 30 semaines pour les mâles (souris trop âgées pour être utilisées en accouplement).

Remplacement

Afin de limiter l’utilisation de modèles animaux, des méthodes alternatives sont déjà utilisées dans notre projet, comme des expériences in vitro et des co-cultures de cellules pulmonaires humaines et de cellules immunitaires. Cependant, à ce jour, il n’existe pas de méthode alternative pour modéliser la réponse d’un organe entier vivant dans le cas du développement de la maladie respiratoire étudiée. En outre, la bonne compréhension des mécanismes immunitaires au sein des poumons est strictement dépendante de l’étude du recrutement des cellules immunitaires dans un modèle animal. Au vu de l’organisation de l’équipe et des expérimentations prévues, il est nécessaire d’avoir un marquage des animaux par tatouage aux phalanges et un prélèvement de queues pour génotypage, qui correspond à la technique validée au sein de l’équipe. La technique de génotypage par prélèvement de poil n'étant pas encore disponible dans notre animalerie.

Réduction

Nous adapterons l'élevage au besoin des projets de recherche de l'équipe. Nous connaissons bien l'ensemble de ces lignées de souris transgéniques (nombre et taille des portées), ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée. En effet, le nombre de couples en reproduction est monitoré au plus près afin de l’adapter en temps réel aux besoins expérimentaux. A cette fin, les animaux sont génotypés au moment du sevrage pour anticiper les besoins avant la naissance de la génération suivante et afin de grouper les animaux d’intérêts pour d'autres projets.

Raffinement

Le prélèvement de tissu au niveau de la queue sera réalisé selon une méthode éprouvée, précise et standardisée, ce qui limitera les effets indésirables tels que le stress et la douleur. L’absence se saignement sera surveillée dans les minutes qui suivent le prélèvement. Dans le cas contraire, une compression sera réalisée afin de favoriser la coagulation sanguine. De plus un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé afin de vérifier leur bien-être. Si une rougeur au niveau de la queue est observée nous appliquerons un antiseptique (Chlorhexidine).

Choix des espèces

L’utilisation du modèle animal murin dans notre projet se justifie par des raisons scientifiques. D’une part, les modèles murins de la maladie pulmonaire étudiée sont largement décrits dans la littérature et reproduisent des aspects cliniques observés chez l’homme. D’autre part, l’étude du système immunitaire murin a conduit vers de nombreuses découvertes dans le domaine d’immunothérapie. Les souris offrent aussi la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et ainsi de cibler le rôle d’un type de cellules immunitaires en particulier dans le poumon. Les cellules immunitaires étudiées dans le projet sont très conservées entre espèces et présentent de nombreux points communs chez l’homme et la souris, permettant la mise en place de modèles pré-cliniques bien profitables dans le domaine thérapeutique. Les animaux seront identifiés et génotypés dès que le sexage est possible (5 à 10 jours). Cela permet de rapidement déterminer le génotype des animaux afin de les regrouper et d’adapter le nombre de couples en reproduction au plus proche des besoins expérimentaux. Les souris seront mises en accouplement à l’âge adulte (au moins 8 semaines), stade qui correspond à leur maturité sexuelle, et au maximum à 15 semaines au début de l’accouplement.