Procédures légères

45 rats vont être utilisés, chacun subissant jusqu'à cinq prélèvements sanguins en trois jours, sans anesthésie, et des séjours en cage à métabolisme au fond grillagé, isolé de ses congénères et sans enrichissement. Vingt-cinq relèvent d'un niveau de souffrance léger, vingt d'un niveau modéré, et tous sont tués pour le prélèvement des organes. Une injection sous-cutanée de polymère précède la série de prélèvements, l'objet étant de suivre la dégradation de matériaux utilisés dans les médicaments et les dispositifs médicaux. Les retombées annoncées vont d'un nouveau standard international d'analyse au suivi des microplastiques, renvoyé au long terme, quand le recours aux animaux est justifié par des exigences réglementaires portant sur un "organisme entier".

Objectifs

La médecine moderne s’appuie fortement sur l’utilisation de polymères (matériaux de type silicone, cellulose, polyéthylène, polypropylène, néoprène, chlorure de polyvinyle, nylon…) pour développer de nouvelles solutions thérapeutiques, que ce soit dans la formulation de médicaments ou l’implantologie (dispositifs médicaux). C’est dans ce cadre que s’inscrit ce projet, qui a pour but de faciliter le suivi et le devenir des polymères dégradables dans l’organisme. L’objectif de l’étude est d’étudier le devenir des polymères et d'identifier leurs produits de dégradation dans l’organisme.

Bénéfices attendus

Les retombées attendues sont à la fois au niveau de la santé des patients en contact avec les polymères, et à la fois au niveau de l’environnement. Il faut dans un premier temps répondre aux exigences réglementaires qui régissent les médicaments et les dispositifs médicaux en développant des méthodes de marquage et d’analyse qui permettront un suivi simple, non toxique et non biaisé du devenir de ces produits dans l’organisme. Sur le moyen terme, le projet doit permettre d’établir un nouveau standard international d’analyse des polymères dégradables en santé et pour les applications environnementales. A plus long terme il est envisagé d’élargir cette méthode de suivi de dégradation par à d’autres polymères et d’autres champs d’application comme par exemple le devenir des microplastiques dans des milieux biologiques complexes.

Procédures

Les animaux recevront une injection sous-cutanée du produit à tester (quelques secondes). Afin de suivre la distribution dans l'organisme, des prélèvements sanguins seront réalisés à différents temps, sans anesthésie, et 5 fois maximum par animal sur 3 jours (2 min par prélèvement).

Impact sur les animaux

La réalisation d’une étude de biodistribution nécessite des prélèvements sanguins répétés, avec une contention de courte durée mais pouvant induire un stress. De plus, pour les prélèvements urinaires, les animaux devront être hébergés en cages à métabolisme, entraînant un isolement sans contact avec leurs congénères et un confort altéré par la surface réduite et le fond grillagé de la cage.

Devenir

Afin d'évaluer la biodistribution des produits dans l'organisme, il sera nécessaire de prélever les organes. C'est pourquoi tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure.

Remplacement

Les exigences réglementaires imposent une documentation précise du devenir in vivo des composants d’un système de libération prolongée. Ces études nécessitent un organisme entier pour évaluer en pré-clinique les biodistributions des polymères utilisés, d’où le recours à des animaux.

Réduction

Une sélection des polymères à tester sera préalablement réalisée in vitro, pour limiter le nombre d'animaux utilisés. L’effectif de chaque groupe expérimental a été évalué de façon à obtenir un panel de données de 5 individus par temps permettant d’obtenir des résultats scientifiquement pertinents, mais en limitant le nombre global d'animaux à 10 par polymère testé. En effet, le prélèvement tissulaire n'étant pas prévu à chaque temps, et la volémie du rat permettant de réaliser des prélèvements sanguins répétés sur un même animal, cela a contribué à réduire les effectifs.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, les injections sous-cutanées et les prélèvements sanguins seront réalisés dans le respect des bonnes pratiques sur animal vigil. Les animaux seront surveillés après l'injection des produits à tester. Tout signe clinique inhabituel ou inquiétant sera noté sur une fiche de suivi reprenant les observations générales de comportement et d'apparence. Cependant les polymères étant déjà connus, aucun signe de toxicité n'est attendu. Une vigilance particulière sera mise en oeuvre pour les animaux qui nécessiteront un hébergement en cages à métabolisme, entraînant l’hébergement individuel, l’absence d’enrichissement, et un confort altéré par la surface réduite et le fond grillagé de la cage. Avant de commencer les tests, les animaux seront acclimatés à la cage à raison de 2 heures par jour pendant 3 jours. Les points de vigilance seront l'alimentation (les animaux ne mangent pas ou moins), l'hydratation (les animaux ne boivent pas ou moins), les signes de stress (comportement ou apparence).

Choix des espèces

Le rat est un modèle de choix pour les études de biodistribution et de pharmacocinétique. Les animaux choisis seront à un stade jeune adulte, à un poids autour de 300 g car leur taille et leur volume sanguin permettent la répétition de prélèvements, nécessaires pour le suivi régulier des produits testés au cours du temps. C'est une souche non-consanguine qui a été choisie, ce qui permet de conserver les différences inter-individus, plus représentative de la population humaine.

Nées dans l'établissement à partir d'une lignée porteuse d'une mutation du gène de la dysferline, 237 souris vont être utilisées, dont 111 pour le seul entretien de l'élevage. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 96 d'entre elles et modéré pour 141. Elles reçoivent une injection unique dans la veine caudale sous anesthésie gazeuse, puis deux tests de force musculaire tous les trois mois jusqu'à l'âge de douze mois, l'expérimentation s'arrêtant avant l'âge où la myopathie devient cliniquement visible. Le porteur écrit que la récupération fonctionnelle ne peut s'explorer que sur des modèles vivants et qu'un essai in vivo ne peut être évité.

Objectifs

Les dysferlinopathies sont un groupe de maladies musculaires rares et héréditaires caractérisées par des mutations dans le gène de la dysferline, ce qui entraîne une altération de la fonction de cette protéine. Les atteintes cliniques dans les dysferlinopathies incluent généralement : - une faiblesse musculaire progressive. Cette faiblesse affecte principalement les muscles des membres, en particulier les épaules, les hanches et les cuisses. - une perte de la force et de la fonction musculaire : Avec la progression de la maladie, les patients peuvent éprouver une diminution de la force musculaire, ce qui entraîne des difficultés à effectuer des activités quotidiennes telles que monter les escaliers, se lever d'une chaise, ou porter des objets lourds. - une dystrophie musculaire : La dégénérescence progressive des muscles peut conduire à une dystrophie musculaire, caractérisée par une perte de masse musculaire et une détérioration de la structure des fibres musculaires. Ces atteintes cliniques peuvent varier en gravité d'un individu à l'autre. Les souris présentant une mutation dans le gène de la dysferline présentent une atteinte musculaire très progressive avec un impact clinique pour l'animal au-delà de 13 mois. Au cours d'un projet antérieur, nous avons testé une approche thérapeutique par injection intramusculaire d'un AAV (adeno associated virus) codant pour une mini dysferline fonctionnelle (protéine plus courte que la forme normale mais ayant conservée sa fonction). Ces traitements ont permis d'améliorer le phénotype histologique du modèle murin. Ce nouveau projet, a pour objectif de tester l'efficacité de cette thérapie génique par administration par voie systémique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce travail seront principalement pour les patients atteints de ce type de myopathie. En effet si notre hypothèse s’avère valide la thérapie génique va pouvoir éviter la dégénérescence des fibres musculaires observée chez les patients et offrir une thérapie potentielle

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection dans la veine caudale latérale sous anesthésie générale gazeuse (une seule injection/ une seule anesthésie). Ils seront également soumis tous les 3 mois à 2 tests de force musculaire (moins de 30 minutes par test))

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés au cours de ce projet vont développer une atteinte musculaire progressive ayant surtout un impact histologique puisqu'aucun animal ne sera gardé au-delà de l'âge auquel la myopathie clinique se déclare. Les injections intra veineuses peuvent générer une douleur locale, de courte durée. Les animaux vont également participer à des tests fonctionnels qui sont des sources de stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse d'organes.

Remplacement

Les techniques in vitro ne peuvent être utilisées qu’afin de voir un effet à l’échelle cellulaire de l’administration de la mini-dysferline. La récupération fonctionnelle permise par l’administration systémique ne peut être explorée que sur des modèles vivants. Les premières étapes de notre projet ont démontré que cette approche était fonctionnelle ; nous devons maintenant étendre cette étude à des injections intraveineuses. Malheureusement, l’approche thérapeutique envisagée ne peut pas éviter un essai sur un modèle in vivo.

Réduction

Afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet, nous avons utilisé des tests statistiques appropriés qui nous a permis de définir que nous aurons besoin d'au moins 9 souris par groupe expérimental. Afin de faire face à d’éventuelles pertes d’animaux ou incidents techniques, nous avons augmenté ce nombre de 15%, nous arrivons à un total de 10 souris par groupe maximum, pour les souris traitées sur un an ce nombre est légèrement augmenté pour pallier les pertes, nous aurons donc 12 souris soit au total 126 souris. En prenant en compte les souris pour l’élevage ce nombre atteint 237 souris.

Raffinement

Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Les animaux seront hébergés par groupe de 5 avant d’entrer en procédure. L’environnement sera enrichi en fonction des préférences des animaux à l’aide de bandelettes de kraft et de dômes en carton. Les animaux en procédure seront hébergés à plusieurs, sauf pour les mâles reproducteurs (procédure 1) qui auront alors un triple enrichissement (buchettes en bois). La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention à faible stress (mains en coupelles ou tunnels). Le modèle que nous allons utiliser a été caractérisé d'un point de vue clinique et nous connaissons l’âge d’apparition de signe de souffrance ou de détresse qui est très tardif. Nous allons étudier les animaux avant l’apparition des signes impactant le bien-être des animaux ; le suivi des points limites nous permettra de limiter au strict minimum l’apparition de souffrance éventuelle.Ce suivi se fera à l’aide d’une grille de scoring chaque semaine ou plus fréquemment si des anomalies sont observées. Les critères se basent notamment sur le poids, l’aspect de l’animal, son comportement ainsi que sa posture.

Choix des espèces

L’anatomie et la fonction des muscles squelettiques sont proches des muscles humains. Les souris génétiquement modifiées sont de bons modèles d’étude des atteintes du système neuromusculaire, de leurs physiopathologies et de leurs causes génétiques. Afin d'étudier l'évolution naturelle de la pathologie, les animaux seront étudiés de l'âge de 1 mois jusqu'à l'âge de 12 mois dans les procédures 2 et 3.

Capturés à la ligne puis anesthésiés, 100 brochets sauvages des lacs alpins se voient prélever un fragment de nageoire dorsale de la taille d'un grain de riz. 60 autres, élevés en pisciculture et transportés jusqu'à 1 h 45 en cuves oxygénées, reçoivent sous anesthésie une marque souple de 5 cm implantée dans le muscle du dos, qu'ils porteront à vie. Les procédures sont classées d'un niveau de souffrance léger pour les premiers et modéré pour les seconds, et les 160 individus sont remis à l'eau après contrôle de leur état et réveil complet. Le suivi des recaptures repose sur les prises des pêcheurs de loisir, dans une étude qui juge de l'efficacité des repeuplements organisés par les associations de pêche sur une espèce classée vulnérable.

Objectifs

Le brochet est l’une des espèces emblématiques de poissons de lacs alpins. Principal prédateur autochtone de eaux douces métropolitaines, cette espèce très recherchée par les pêcheurs est également soumise à de nombreuses pressions, principalement en lien avec la dégradation de l'habitat naturel (zones de frai, pollution, etc.). C'est une espèce indicatrice des grands milieux d'eau douce tempérés (lacs et grandes rivières), dont la présence indique le bon fonctionnement. Elle est considérée comme « Vulnérable », premier échelon des espèces menacées, par la Liste Rouge Régionale de 2023. Les suivis réalisés par l’Office Français de la Biodiversité (OFB) ainsi que par les pêcheurs confirment le déclin progressif de ces populations sur les lacs alpins. Le but de cette étude est de comprendre le fonctionnement des populations de brochet commun sur les lacs où l'espèce apparaît sur le déclin. Pour se faire, elle comprendra 2 volets : - Une estimation de la diversité génétique de la population, basée des analyses de fragments de nageoires dorsales, prélevés sur des individus « sauvages » ; - Une estimation de l'efficacité des repeuplements effectués par les associations de pêche locales, par l’intermédiaire du suivi des recaptures de brochets issus de pisciculture (faites par les pêcheurs amateurs de loisir), via l’emploi de marques passives dites « spaghettis » implantées à la base de la nageoire dorsale.

Bénéfices attendus

Cette étude rentre dans le cadre d’un objectif de compréhension de l’état de la population de brochets actuelle au travers de la diversité génétique qu’elle présente, et de l’efficacité des opérations de repeuplement sur les lacs afin de juger de leur pertinence. Au final ces informations permettront d’orienter les politiques de gestion et de protection de l’espèce sur ces lacs.

Procédures

Pour le volet « analyse de la diversité génétique » de la procédure n°1, capture de poissons à la ligne puis prélèvement sous anesthésie d’un fragment de tissu de la nageoire dorsale (de la taille d’un grain de riz, soit 2mm X 3mm au maximum). Pour le volet « repeuplement » de la procédure n°2, insertion sous anesthésie d’une marque « spaghetti » dans le muscle dorsal. Les poissons concernés sont issus d’une pisciculture, située à 1h45 de route maximum, et arrivant par cuves oxygénées.

Impact sur les animaux

En accord avec le classement proposé, les effets indésirables des interventions, après raffinement peuvent être les suivants : Pour la procédure n°1 (classement proposé : légère) visant à analyser la diversité génétique, l’intervention entrainera une ablation infime et momentanée (régénération rapide en quelques semaines) du tissu membraneux de la nageoire dorsale, représentant moins de 1% de sa surface. Elle ne vise à entraver aucune des 5 libertés individuelles de l’animal. Les individus seront potentiellement soumis au stress lié à la manipulation et à la stabulation avant ou après l’anesthésie. Le prélèvement de tissu membraneux se déroulant sous anesthésie générale, il n’est pas attendu de stimulus nociceptif ni de malaise associé. Pour la procédure n°2 (classement proposé : modérée) visant à implanter une marque passive sur le dos à la base de la nageoire dorsale, l’intervention entrainera le port définitif d’une marque souple, de taille et poids réduits (tube de 3mm de diamètre pour 5 cm de long, poids 1 gr) visant l’identification des individus. Elle vise également à n’entraver aucune des 5 libertés individuelles de l’animal, notamment le déplacement des individus, en raison de sa taille réduite. Les individus seront potentiellement soumis au stress lié à la manipulation et à la stabulation près ou post-intervention. Les individus seront potentiellement soumis au stress lié à la manipulation et à la stabulation avant ou après l’anesthésie. L’implantation de la marque en intramusculaire se déroulant sous anesthésie générale, il n’est pas attendu de stimulus nociceptif ni de malaise associé. A l’issue des interventions, tous les individus sont relâchés dans le milieu naturel pour accomplissement de leur cycle de vie.

Devenir

Pour le volet caractérisation « génétique » des poissons sauvages, les prélèvements ne nécessitent pas la mise à mort des individus, la remise à l’eau sur le lieu de capture sera donc réalisée. Pour le volet « repeuplement », le but est ici de connaître le devenir des poissons relâchés dans les lacs, d’où leur remise à l’eau.

Remplacement

Le volet « génétique » s’intéresse aux poissons vivants actuellement dans les lacs, il est donc nécessaire d’accéder directement à des individus pour estimer la diversité génétique des populations (les méthodes recourant à l’analyse de l’eau ne permettent d’étudier cette échelle fine, pas plus que la simple observation de la morphologie des individus). Le volet « marquage » pour le suivi du repeuplement s’intéresse au devenir des poissons relâchés, issu de pisciculture, lors des campagnes de repeuplement des lacs. L’objectif visant l’étude globale des brochets dans leur milieu naturel, toute étude réalisée en milieu contrôlé n’est pas envisageable. Il n’existe pas de modèle statistique permettant de répondre aux besoins de l’étude.

Réduction

En ce qui concerne le volet génétique, la taille de l'échantillon doit être suffisante pour dégager des résultats fiables et statistiquement interprétables, et garantit une bonne vision de la diversité génétique des population étudiées. Aussi, nous visons 50 individus pour chacun des 2 lacs ; soit 100 poissons au total. Pour les individus marqués, il apparaît donc nécessaire de recourir au même nombre d’individus habituellement introduits pour le repeuplement annuel, soit un objectif de 60 individus.

Raffinement

Toutes les manipulations visant à procéder au prélèvement de fragment de nageoire, ou de pose de la marque « spaghetti », se feront sous anesthésie par du personnel qualifié sur le site d’étude. Pour les poissons venant de pisciculture, un temps d’habituation de 30 min sera pris pour acclimater les poissons aux conditions du milieu. L'ensemble des poissons ne sera remis à l'eau qu’après contrôle de l’état sanitaire (absence de lésions) et récupération totale de l’anesthésie (nage et respiration normales). Pendant l’anesthésie générale, obtenue par balnéation, les poissons seront sous surveillance, toute modification dans le comportement lors de cette dernière (réveil prématuré) sera ainsi prévenue. La manipulation des poissons sera réalisée de manière à prévenir toute infection : Le port des EPI (gants et lunettes) sera obligatoire lors de la préparation du bain de balnéation pour l'anesthésie et lors du marquage ; le matériel de prélèvement et/ou de marquage sera nettoyé, désinfecté et rincé à l’eau distillée avant chaque utilisation et la zone d’implantation de la marque spaghetti, pour le suivi du repeuplement sera désinfectée. Le bain d’anesthésiant sera renouvelé autant de fois que nécessaire (lorsque le temps d’endormissement dépassera 2 min). Après anesthésie, un soin sera apporté au réveil des individus, par la surveillance des paramètres du milieu (oxygène et température) et le retour pour les individus à l’état de nage (maintien) et de respiration normale.

Choix des espèces

Le brochet commun est l'espèce cible de l'étude. La présence de cette espèce, à la fois patrimoniale et très recherchée par les pêcheurs, est un indicateur du bon fonctionnement des écosystèmes lacustres de leurs annexes (zones humides, roselières en bordure). S’agissant d’une espèce « vulnérable » d’après le classement des espèces menacées (en raison du réchauffement climatique et de la dégradation des habitats), l’objectif final de cette étude est de comprendre et d’enrailler le déclin observé de l’espèce sur les lacs alpins. Les brochets marqués et relâchés, issus de pisciculture seront au stade mature, 2 ans pour les mâles et 3 ans pour les femelles, ce qui correspond à une taille comprise entre 40 et 60 cm. En ce qui concerne l’étude génétique, nous visons la caractérisation des potentiels géniteurs, une taille minimale de 30 cm sera considérée pour procéder au prélèvement du fragment de nageoire.

Une première procédure produit les souris transgéniques qui alimentent ensuite toutes les autres du projet, où elles ne peuvent plus être réutilisées. 3 441 souris vont être utilisées au total, dont 3 306 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes finissent tuées pour l'analyse de leur réponse immunitaire hors de l'organisme. Elles reçoivent un agent infectieux ou un agent inflammatoire par injection intramusculaire ou sous-cutanée, puis passent une chirurgie sans réveil pouvant durer six heures pour l'observation de leurs cellules au microscope. Le porteur compare la douleur au site d'injection à celle d'une vaccination chez l'humain, et indique que cultures cellulaires et organoïdes servent à caler les doses avant le passage à l'animal, sans pouvoir "récapituler la complexité des réponses immunitaires".

Objectifs

La réponse immunitaire contre un agent infectieux consiste à mobiliser, de manière ciblée et séquentielle, les cellules capables de lutter contre cette agression, limitant ainsi sa propagation. La vaccination, de son côté, "éduque" le système immunitaire pour qu'il puisse réagir efficacement à une future infection. Ces deux mécanismes sont complexes et impliquent le recrutement coordonné de différents types cellulaires à travers divers sites anatomiques. L’objectif de ce projet est de décortiquer ces différentes étapes du mécanisme immunitaire au niveau des tissus et des organes lymphoïdes drainants lors de la présence de microorganismes invasifs ou pendant la vaccination par une technologie émergente qui permet le développement d’un vaccin rapidement. Nous souhaiterions nous appuyer sur des modèles murins génétiquement modifiés, et des techniques d’imagerie afin d’améliorer notre connaissance de la mise en place de la réponse immunitaire précoce et plus tardive. Ce projet se décompose en 3 étapes: o Étape 1 : identification des souris transgéniques nécessaires afin d’étudier différents types cellulaires, acteurs de « l’immunité », ainsi que certaines voies de signalisation. o Étape 2 : A. Inoculation « du microbe invasif » ou de l’« agent inflammatoire » induisant des processus inflammatoires aïgus » afin de réaliser une étude de quantitative et qualitative des cellules immunitaires recrutées pendant la réponse immunitaire. B. Vaccination par une nouvelle technologie et étude de la réponse immunitaire induite. La réponse immunitaire sera comparée à une vaccination plus classique. o Étape 3 : Visualisation par imagerie des tissus hôtes « du microbe invasif » et des ganglions drainants ces tissus afin d’analyser les interactions ou la communication entre les cellules du système immunitaire. Ce projet de recherche devrait permettre d’identifier les acteurs cellulaires participant à une réponse inflammatoires précise dans le cas d’un agent infectieux, d’un agoniste ou d’une vaccination. Une meilleure connaissance de ces mécanismes permettrait d’optimiser les stratégies thérapeutiques en clinique.

Bénéfices attendus

La réalisation de cette recherche est cruciale pour mieux comprendre les mécanismes fondamentaux de la réponse immunitaire face aux infections et aux vaccins. En combinant des approches génétiques et de microscopie intra-vitale, nous avons la possibilité d’étudier en temps réel les interactions cellulaires au sein d’un organisme vivant, offrant ainsi une vision dynamique et globale des processus immunitaires. Ces recherches permettront non seulement d’identifier les gènes et cellules clés impliquées dans la défense contre les agents pathogènes, mais aussi de déchiffrer les étapes critiques de la coordination spatio-temporelle de la réponse immune. Ce savoir pourra par la suite être utilisé afin de mettre au point de nouvelles thérapies ciblées, capables de moduler la réponse immunitaire de manière plus précise et efficace, comme la vaccination. En effet, la vaccination est un pilier essentiel de la santé publique, car elle permet de prévenir la propagation de maladies infectieuses potentiellement graves, voire mortelles. En "éduquant" le système immunitaire à reconnaître et à combattre des agents pathogènes spécifiques, les vaccins protègent non seulement les individus vaccinés, mais aussi la collectivité dans son ensemble. Nos résultats pourront donc ouvrir de nouvelles pistes dans le domaine de l’élaboration de vaccins.

Procédures

Les animaux seront soumis : - Pour le génotypage : un prélèvement sanguin au niveau de la queue d’une courte durée (quelques secondes) par prélèvement. - Une injection intramusculaire ou en sous-cutanée en début de procédure d’une durée de quelques secondes ou une injection intramusculaire ou en sous cutanée en début de procédure (quelques secondes) puis une chirurgie sous anesthésie d’une durée maximale de 6 heures. - La chirurgie pour la microscopie est sans réveil.

Impact sur les animaux

Ce projet sera attentif aux cinq libertés individuelles de l’animal. Cependant, certaines des procédures pourraient avoir un effet indésirable sur l’animal. Certains animaux seront prélevés au niveau de la veine caudale ce qui pourrait entrainer une légère douleur au site de prélèvement. Certains animaux pourraient ressentir une douleur modérée au site d’injection, qui ne devrait pas dépasser celle ressentie chez l’homme lors d’une vaccination. Le site d’injection pourrait devenir inflammatoire pendant les 3 premiers jours et inconfortable pour l’animal. Dans ce cas, l’environnement de sa cage pourra être adapté (changement de litière pour de la cellulose, alimentation humide) Certains animaux recevront une injection qui pourra entrainer une légère douleur avant d’être anesthésiés.

Devenir

Les animaux générés par la procédure 1 seront utilisés pour toutes les procédures décrites dans ce projet. Les animaux des autres procédures seront mis à mort pour l’étude de la réponse immunitaire ex-vivo et ne pourront donc pas être réutilisés.

Remplacement

De nombreuses expériences seront validées au préalable in vitro à l’aide des lignées cellulaires pour remplacer les animaux. Ces expériences pourront être effectuées dans des cultures cellulaires ou des organoïdes (Structures 3 dimensions mimant certaines des communications inter cellulaires in vivo) et nous permettront de déterminer des doses ou la cinétique sur laquelle nous souhaiterions étudier la réponse immunitaire dans le cas d’une infection ou d’une vaccination. Différentes doses seront utilisées in vitro afin de déterminer la dose optimale de la thérapie. Ces travaux nous permettront de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons par la suite pour identifier le mode d’action de la thérapie in vivo. Une telle approche permettra de réduire de façon significative le nombre d’animaux dont nous aurons besoin pour notre recherche. Néanmoins, les tests in vitro ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieu in vivo. C’est la raison pour laquelle nous avons recours aux animaux afin de décortiquer la complexité de la réponse immunitaire.

Réduction

Ce projet de recherche propose de réduire le nombre d’animaux utilisé si les différences à différent temps ou entre les sexes n’est pas importante. Par ailleurs, l'utilisation de l'imagerie sur l'animal vivant permet de réduire le nombre d'animaux utilisés car l'observation en temps réel permet d'acquérir plusieurs données à partir d’un même animal, en observant les cellules immunitaires avant traitement, puis dans les heures qui suivent l'administration des traitements. Dès que possible, différents tests seront effectuées sur les même animaux afin de limiter leur utilisation. Les effectifs par groupe (3-4) sont cohérentes avec les tailles d'effet très fortes attendues, correspondant à des différences très marquées entre les groupes. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car ils auront reçus un agent infectieux ou une vaccination et seront mis à mort à la fin de la procédure. Enfin, si les premiers tests ne donnent pas les résultats attendus, les autres expériences ne seront pas réalisées. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet seront réduits.

Raffinement

Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis fréquemment et des points limites sont établis pour raffiner les procédures et soulager les animaux à l’aide d’analgésique ou de les mettre à mort si la souffrance persiste. Pour les prélèvements sanguins, la queue sera désinfectée avant et après afin de minimiser les risques d’infections. Concernant l’injection d’agent inflammatoire, l’animal pourrait ressentir une gêne au site d’injection. Des analgésiques lui seront immédiatement administrés dans son eau de boisson. Concernant l’intervention chirurgicale, un analgésiant sera administré à l’animal en amont de l’anesthésie et de la chirurgie. Une plaque thermo contrôlée sera utilisée pendant l’imagerie pour limiter la perte de chaleur corporelle.

Choix des espèces

La complexité du système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain. Toutes les souris utilisées seront d’âge adulte entre 6 et 16 semaines afin d’étudier un système immunitaire mature et proche de la réponse immunitaire humaine.

Régimes enrichis en graisse et en sucre, décalages répétés des cycles de lumière, sept jours en cage métabolique individuelle, tapis de course une heure par jour pendant jusqu'à deux mois, pompes osmotiques implantées sous anesthésie : le porteur classe presque toutes ces atteintes en nuisances légères. 14 128 souris vont être utilisées sur cinq ans, 8 896 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 5 232 dans des procédures modérées. Cet effectif est présenté comme le résultat d'une démarche de réduction qui "maximise les données obtenues de chaque animal" et évite "la production d'animaux inutiles". Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs muscles et conduire des analyses histologiques et moléculaires.

Objectifs

Notre mode de vie actuel se caractérise par une sédentarité accrue alors que paradoxalement notre alimentation est de plus en plus riche en graisses et en sucres. Ce paradoxe favorise le développement de l’obésité et des maladies associées telle que le diabète. L’obésité, qui touchait déjà 13% de la population mondiale en 2016 selon l’OMS, ne fait qu’augmenter et représente aujourd'hui un défi majeur de santé publique. L’horloge biologique est présente dans toutes les cellules de l’organisme et permet aux individus de s’adapter aux changements environnementaux récurrents comme l’alternance jour/nuit. De nombreuses fonctions de l’organisme sont soumises à des variations entre période d’activité (le jour) et période de sommeil (la nuit). L’altération de ce cycle liée au mode de vie d’un individu entraine donc en retour des dysfonctionnements de son organisme. Par exemple, de multiples études mettent en évidence un risque significativement augmenté de développer une obésité, du diabète ou une maladie inflammatoire chez les personnes travaillant en horaires décalés. Le muscle, en plus d’être indispensable à la locomotion, est aussi un organe qui a la particularité d’avoir la capacité à se régénérer suite à des dommages causés par un exercice intensif ou une blessure. Il est également connu comme étant un acteur majeur de la gestion du glucose dans notre organisme. L’obésité et le diabète sont associées à des défauts de régénération de ce muscle. Ces pathologies entrainent une perte de masse musculaire conduisant à une augmentation des troubles métaboliques ainsi qu’à une perte de mobilité. Le maintien du processus de réparation musculaire chez ces patients est donc essentiel. Ce projet nous permettra de comprendre les processus de réparation musculaire au cours du développement de l’obésité et ses complications, et de préciser la contribution de l’horloge biologique dans ce contexte. A cette fin, les souris seront soumises à des régimes enrichis en graisse et/ou en sucre et subiront une variation dans les temps d’éclairage afin de mimer ce que vivent les individus travaillant en horaires décalés. Suite à cela, nous étudierons différents paramètres métaboliques et musculaires comme la capacité de régénération, d'exercice ainsi que les phénomènes d’atrophie musculaire.

Bénéfices attendus

Le muscle reste peu étudié alors qu’il est impliqué dans de plusieurs pathologies telles que les myopathies, la perte de masse musculaire liée à l'âge ou le diabète de type 2, dont plus de 350 millions de personnes sont atteintes à travers le monde. Notre projet va permettre d’identifier les mécanismes régulés par l’horloge biologique impliqués dans les processus de réparation musculaire lors de pathologies comme l’obésité et les maladies métaboliques. A plus long terme, ce projet permettra le développement de stratégies thérapeutiques visant à moduler l’horloge biologique afin de préserver la fonction musculaire lors de pathologies métaboliques.

Procédures

Un groupe de souris sauvages sera soumis à une restriction d’accès à l’alimentation de 12 semaines nécessitant 1 prélèvement sanguin (durée

Impact sur les animaux

Certaines procédures peuvent engendrer du stress : douleurs liées à la biopsie à l’oreille pour le génotypage ainsi que le marquage avec une bague (courte durée et léger), injections intramusculaire d’un composé chimique (modérée) ; Stress métabolique suite à une alimentation enrichie en graisses et en sucres (léger) ; stress lié à une mise à jeûn des animaux pendant 4 à 12h (léger); stress lié à une altération environnementale de l'horloge réalisée par des avances ou retards de phase dans l'éclairage de la cage ou de la pièce d'hébergement pour mimer un décalage horaire (léger) ; stress lié à un exercice physique des souris sur un tapis roulant ou dans un système de roues (léger).

Devenir

A l'issue de toutes les procédures, les animaux seront euthanasiés afin de récuperer des tissus en vue de réaliser des analyses histologiques et moléculaires supplémentaires, lesquelles nous fourniront des informations cruciales sur le role de l'horloge biologique sur la fonction et l'homéostasie du muscle squelettique au cours des pathologies métaboliques.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer différents aspects de l'horloge biologique sur la physiopathologie du muscle squelettique dans un contexte de désordres métaboliques qui mettent en jeu une communication inter-organes. Pour répondre à cette problématique, il sera utilisé des modèles de souris génétiquement modifiés pour des gènes clefs de l'horloge, mais également des procédures d'altération environnementale de l’horloge via des modifications des rythmes d'alimentations et des cycles lumière/obscurité. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité avec le développement d’approches de physiologies intégrées. Le laboratoire est néanmoins conscient de l’aspect nécessaire de recourir à des méthodes alternatives quand cela est possible. Ainsi pour un certain nombre d’études cellulaires et moléculaires ne nécessitant pas de modèles animaux, nous utiliserons différents modèles cellulaires tels que les C2C12 (myoblastes murins) ainsi que lignées de macrophages afin d'étudier les interactions intercellulaires se produisant lors de la régénération musculaire.

Réduction

Le nombre total d’animaux concernant les procédures de l’ensemble des protocoles de notre laboratoire sur les 5 ans à venir est estimé à 14128. Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui peut limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. La réduction du nombre d'animaux utilisés peut être obtenue par trois moyens principaux : 1. Optimisation des élevages : Éviter la production d'animaux inutiles. 2. Optimisation des groupes expérimentaux : Une prévision du nombre d’animaux total nécessaire par groupe sera réalisée pour respecter le principe des 3R à l’aide du site : https://eda.nc3rs.org.uk/experimental-design-group. 3. Formation adéquate : Assurer une bonne formation des personnes manipulant les animaux pour maîtriser les gestes techniques et minimiser le stress des animaux. La maîtrise technique permet de réduire la variabilité inter-animale et, par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires pour confirmer statistiquement un effet biologique.

Raffinement

La stabulation se fait dans un environnement non anxiogène regroupant des conditions favorables à leur bien-être qui incluent une température régulée à 22°C +/- 2°C, 2 à 6 souris par cage, une alternance lumière/obscurité de 12h/12h (sauf procédure spécifique), de la nourriture et de l'eau ad libitum (sauf procédure spécifique comprenant le régime alimentaire), ainsi qu'un enrichissement de la cage avec des abris et des matériaux pour la confection de nids. Les animaux sont vérifiés quotidiennement et un registre de bien-être animal est tenu afin d'effectuer un suivi des conditions d'hébergement. Lors de la mise sous régime des souris, la fréquence de change de la litière et de la cage est de deux fois par semaine. L’utilisation de techniques non invasives, des produits anesthésiques et analgésiques optimaux, et la dextérité du personnel contribuent à réduire le stress des animaux durant l’expérimentation. La définition précise des points limites précoces associés à chaque procédure, ainsi qu’une surveillance pendant tout le protocole permettront de limiter l’apparition d’une souffrance ou d’une atteinte de l’état général de l’animal. En cas d’atteinte de ces points limites, les animaux seront sortis de l’étude et seront mis à mort.

Choix des espèces

La souris offre de nombreux avantages pour la recherche en métabolisme et physiologie. Elles ont un temps de génération relativement court et, selon la souche, peuvent développer des pathologies telles que l'obésité, l'insulino-résistance et la stéatose hépatique, avec des caractéristiques similaires à celles observées chez l'homme. De plus, cette espèce permet de réaliser des manipulations spécifiques, comme des gains ou pertes de fonction des gènes de l'horloge dans différents types cellulaires intervenant dans la régénération musculaire, afin de mieux comprendre leur action. Il existe également des données de la littérature identifiant les gènes régulés par l'horloge dans les muscles squelettiques chez la souris. Cela nous permettra de réduire le nombre d'animaux utilisés en comparant nos données avec ces dernières. Dans la plupart des expérimentations, les souris seront utilisées à l’âge adulte : de 2 mois à 12 mois. Etant donné que l'ensemble des procédures réalisées concerne le métabolisme, il est nécessaire d'utiliser des souris adultes (càd 2 mois minimum et en dehors de la courbe de croissance). Par ailleurs, les protocoles ont été validés (publications) au sein du laboratoire sur des souris adultes (de 2 à 12 mois) et ce, en accord avec les 3R.