Procédures légères

Greffées de cellules tumorales sur le flanc puis injectées de cellules immunitaires humaines, 2 018 souris immunodéficientes reçoivent jusqu'à trois injections sous-cutanées en trois semaines, huit injections intrapéritonéales ou intraveineuses en quatre semaines, et deux à quatre prélèvements sanguins par voie rétro-orbitale ou jugulaire sous anesthésie. 90 relèvent d'un niveau de souffrance léger, 1 928 d'un niveau modéré. Le porteur indique que le transfert de cellules immunitaires humaines peut déclencher une maladie du greffon contre l'hôte, avec perte d'appétit, difficulté à boire, atteintes cutanées et prostration, et que six anticorps bispécifiques seront comparés sur trois cibles tumorales avant que les trois meilleurs soient retenus. Toutes sont tuées en fin de procédure, l'évaluation chez l'animal étant présentée comme le passage obligé vers la demande d'essai clinique.

Objectifs

Le développement de traitement anti-cancéreux comporte une phase de développement préclinique permettant de sélectionner le candidat le plus efficace et le moins toxique. Cette phase a pour but de bien caractériser le mécanisme d’action du candidat médicament et de valider son efficacité et son absence de toxicité. Notre projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des tumeurs solides. Nos médicaments sont des anticorps particuliers qui peuvent reconnaître en même temps les cellules cancéreuses et certaines cellules du système immunitaire qui peuvent tuer les cellules cancéreuses. Ces cellules immunitaires, une fois activées par notre médicament, peuvent alors tuer uniquement les cellules cancéreuses. Une pré-evaluation de nos candidats médicaments a déjà été réalisée dans de nombreuses études in vitro et ex vivo (sur des tumeurs fraîches issues de patients notamment). Ceci nous a permis de pré-sélectionner 6 candidats (couvrant 3 cibles tumorales différentes) et de restreindre au maximum le recours à des modèles animaux. L’objectif maintenant est de démontrer l’efficacité de ces candidats chez l’animal, ainsi que de caractériser au mieux leur mécanisme d’action in vivo, nécessaire pour réaliser de futures études cliniques chez l’homme. Le meilleur candidat pour chacune des 3 cibles sera sélectionné, sur la base de son efficacité, dans différents modèles tumoraux, puis sera évalué en combinaison avec d’autres médicaments anti-cancéreux déjà existant. Ces études précliniques chez l’animal sont très importantes car elles serviront à demander l’autorisation d’essai clinique chez l’homme. Nos 3 meilleurs candidats médicaments pourront être utilisés dans le traitement du cancer du poumon, du foie, du colon, de l’estomac, des ovaires ou du sein.

Bénéfices attendus

La démonstration du mécanisme d'action de notre approche in vivo est une phase essentielle dans l'évaluation préclinique de nos candidats médicaments. A l'issue de cette étude, 3 candidats médicaments pourront faire l'objet d'études cliniques chez l'homme pour le traitement de tumeurs solides. Cette thérapie innovante pourrait notamment bénéficier à des patients en seconde ligne de traitement, après une rechute à la suite des traitements conventionnels de première ligne, dans différents types de cancers. De plus, aucun modèle in vivo démontrant ce mécanisme d'action n'a été décrit jusqu’à présent dans la littérature. Les données générées pourront bénéficier à court-terme à la communauté scientifique, au travers de la publication des résultats obtenus avec ce modèle d’étude.

Procédures

Dans ce projet, les études seront réalisées sur des souris immunodéficientes, injectées avec des cellules immunitaires humaines (en accord avec notre mécanisme d’action). Pour les gestes techniques tels que l’identification des animaux (10 secondes par animal) ou des injections sous-cutanées, intra-veineuse et intra-péritonéales (15-30 secondes par injection), l’animal reste vigile et est maintenu sous contention manuelle. - Injection sous-cutanée : 3 maximum (1 à 2 par semaine réparties sur 3 semaines) - Injection intra-péritonéale ou intraveineuse : 8 maximum (2 fois par semaine pendant 4 semaines) Des prélèvements sanguins eux seront effectués par voie rétro-orbitale ou intraveineuse (Jugulaire) sur animaux anesthésiés (par isoflurane gazeux 4 %) à raison de 2 à 4 prélèvements de 50 µL sur 2 semaines (20-30 secondes par prélèvement/animal). Le sang sera recueilli dans un tube adapté et analysé au laboratoire

Impact sur les animaux

Certains animaux pourraient subir un inconfort ou une angoisse liée à la manipulation ou aux prises de sang. Une partie des animaux subiront la greffe de cellules tumorales qui aboutira au développement d’une masse tumorale sur le flanc des souris, susceptible d’occasionner une gêne. Certains animaux seront également injectés avec des cellules immunitaires humaines et des cytokines humaines qui pourraient entraîner une maladie du greffon contre l’hôte (GVHD = Graft-versus-Host Disease). Cela pourrait se manifester par une détérioration de l’état de santé de l’animal (par exemple perte d’appétit, difficulté à boire, atteinte cutané ou prostration).

Devenir

Les souris seront mis à mort en fin de procédure expérimentale et des prélèvements post-mortem pourront être réalisés.

Remplacement

Des alternatives à l’évaluation chez l’animal, in vitro et ex vivo ont été explorées, comme des cocultures de lignées de cellules tumorales avec des cellules immunitaires in vitro, des modèles organoïdes 3D ou des essais ex vivo sur tumeurs fraîches de patients. Ceci a permis de sélectionner les candidats médicaments sur des modèles pertinentss en limitant le recours aux animaux. Ces méthodes alternatives ont montré une grande efficacité de notre mécanisme d’action et ont permis de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour les études de pharmacocinétique et d’efficacité anti-tumorale in vivo. En effet, l’essai clinique d’un nouveau traitement chez les patients nécessite une évaluation préalable de l’efficacité et de la dose tolérée sur des animaux, conformément à la directive 2001/20/CE.

Réduction

Ces études sont menées avec des analyses statistiques afin de s'assurer de la significativité statistique des résultats obtenus en fonction du nombre de souris par groupe et du nombre de groupes. Le nombre de souris dans chaque groupe et le nombre de groupes sont importants pour ces analyses. Par exemple, nous utilisons 3 souris par groupe pour certaines études et entre 8 et 10 pour d'autres lorsque nous avons besoin de faire des analyses plus poussées afin de garantir la fiabilité des résultats. C'est le cas notamment pour les analyses de la taille des tumeurs car il existe de fortes différences naturelles entre les souris et cette augmentation du nombre d’animaux nous aide à obtenir des résultats interprétables et précis

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnementà statut sanitaire controlé et spécifique où les conditions sanitaires sont rigoureusement surveillées pour minimiser les risques de contamination et assurer la santé des animaux de laboratoire. A leur arrivée, les animaux seront acclimatés pendant une semaine à 2 semaines après réception, avant le début des études, afin qu’ils se familiarisent à leur nouvel environnement. Les animaux bénéficient de raffinement tels que des carrés de coton, maisonnettes en carton, ou encore batonnets à ronger. Le bien-être des animaux sera évalué quotidiennement. Pour les animaux porteurs de tumeur, l’aspect et la taille des tumeurs seront également évalués 2 fois par semaine. Les animaux seront mis à mort dès l’atteinte de points limites.

Choix des espèces

Les études réglementaires requièrent un modèle rongeur et un modèle non-rongeur pour les études de toxicité et de pharmacocinétique. Dans ce projet, nous utiliserons exclusivement la souris comme modèle de petit rongeur pour des études pharmacocinétiques et des études d'efficacités. En effet, la souris est un modèle de choix pour ce type d'études car la majorité des modèles tumoraux sont développés chez la souris et plusieurs modèles de souris immunodéprimées sont disponibles. C'est également un modèle de mammifère dont le profil pharmacocinétique permet une utilisation préclinique. Les animaux seront des jeunes adultes agés de 6 semaines. A cet âge, les animaux sont matures et supportent mieux le transport de l'élevage jusqu'à l'animalerie, ainsi que l'anesthésie. Les animaux plus âgés ne sont pas souhaités car la présence de graisse peut entrainer une modification de la distribution de notre molécule et induire plus de variabilité.

14 400 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, chacune subissant au moins un prélèvement sanguin et, pour une partie d'entre elles, un gavage quotidien pendant sept ou quatorze jours d'affilée. 8 460 relèvent d'un niveau de souffrance léger, 5 940 d'un niveau modéré. Les souris reçoivent du bêta-glucane extrait de la paroi de Candida albicans puis sont infectées par des agents pathogènes qui provoquent poil hérissé, mobilité réduite et perte de poids au bout de sept jours, l'objectif étant de mesurer combien de temps dure la protection conférée par cet entraînement de l'immunité innée. Le porteur qualifie le recours à l'expérimentation animale d'"indispensable" au motif que ses propres travaux in vitro sur cellules humaines n'expliquent toujours pas comment le mécanisme fonctionne "à l'intérieur".

Objectifs

Le système immunitaire des mammifères comprend l’immunité innée et adaptative. L’immunité adaptative n’est plus la seule capable de mémoire ; en effet les cellules de l’immunité innée peuvent répondre plus efficacement à une infection si une agression immunologique a déjà eu lieu auparavant. C’est le « training » des cellules innées, ou entraînement. Nos études du training chez l’humain in vitro ont établi les mécanismes cellulaires impliqués, mais peu de données sont disponibles in vivo. Candida albicans (C. albicans) est une levure commensale des muqueuses à l’origine d’infections locales bégnines, mais également invasives et mortelles dans le cas d’immunodépressions. Ce microorganisme est d’une importance majeure pour l’étude du training, car il induit la protection : une injection d’une faible dose de C. albicans permet une meilleure résistance des souris à une infection sérieuse ultérieure. Le polysaccharide ß-glucan de la paroi de C. albicans est le médiateur du training et de la protection. Le ß-glucan est un sucre facilement isolable de la paroi des levures et non toxique. Nous avons établi que la protection est induite par injection intrapéritonéale de ß-glucan. Il est possible qu’une longue supplémentation orale puisse également protéger. La mémoire immunologique innée est non-spécifique et protège contre un pathogène distinct du premier agent infectieux rencontré. L’objectif scientifique de ce projet se décompose en cinq parties : - Peut-on induire un entrainement avec une approche simplifiée et une formulation du ß-glucan permettant dans le futur des nouvelles voies d’administration ? - Quelle est la durée pendant laquelle le training par ß-glucan est efficace face à une seconde infection ? - Quels acteurs de l’immunité innée sont affectés par le training ? Les souris sont protégées contre des infections locales, systémiques, fongiques, bactériennes ; les facteurs impliqués doivent donc être polyréactifs et largement distribués dans l’hôte. - Quels sont les évènements clés induits suite à l’introduction du ß-glucan dans l’hôte ? Identifier ses effets précoces clés permettront d’envisager d’autre voie d’administrations pertinentes. - La supplémentation orale en ß-glucan pendant deux semaines protège les souris contre une infection. Cette approche serait applicable à l’homme, mais la durée de la supplémentation peut-elle être réduite ?

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer la formulation de la molécule étudiée, les mécanismes et la longévité du training et de la protection face à des infections fongiques et bactériennes diverses, donnant une base solide de travail pour de futures études fondamentales (mécanismes voies d’administration) et cliniques (traitement préventif/combinatoire). Ces données seront obtenues pour les méthodes de training établies et publiées mais aussi avec une nouvelle formulation de la molécule étudiée et enfin une nouvelle méthode par voie orale, qui représente des approches adaptables à l’homme. Notre étude apportera également des nouvelles données cruciales sur les mécanismes physiologiques qui permettent à la molécule étudiée de protéger l’hôte contre différentes infections. Les acteurs immunitaires précoces et tardifs du training de l’immunité innée seront identifiés de manière plus complète, et la dynamique du training sera établie in vivo.

Procédures

Certains animaux auront selon les procédures: - une ou deux injections intrapéritonéale (quelques secondes) - une injection intraveineuse (1 minute) sous anesthésie gazeuse - une inoculation orale (deux minutes) tous les jours pendant 7 ou 14 jours Tous les animaux auront un prélèvement sanguin (quelques secondes) une seule fois

Impact sur les animaux

Une nuisance légère de courte durée sans incidence significative sur le bien-être ou l’état général des animaux sera associée au gavage et aux injection intrapéritonéale et intraveineuse. Les dommages escomptés dans ces expériences sont liés à l’objectif visant à comprendre les mécanismes induisant une protection contre des agents infectieux. Des agents infectieux de classe 2 seront inoculés aux souris et induiront des signes cliniques d’infection (poil hérissé, mobilité réduite, perte de poids) après 7 jours d’infections.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car nous devrons prélever en fin de procédures certains organes vitaux pour analyse.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est indispensable, car bien que nous ayons largement étudié in vitro les mécanismes de mémoire de l’immunité innée avec des cultures de cellules humaines, nous ne comprenons toujours pas comment cela fonctionne « à l’intérieur », dans la vie réelle, ce qui est essentiel pour envisager des traitements préventifs/curatifs. De plus, comprendre les mécanismes in vivo d’entraînement nécessite l’utilisation de mammifères au système immunitaire inné complexe (inné et adaptatif, multiples cellules hématopoïétiques, origine embryonnaire et moelle osseuse), ce qui exclut l’utilisation d’insectes possédant un seul type cellulaire et dépourvus de système immunitaire adaptatif et de moelle osseuse. Ce travail viendra renforcer les connaissances acquises in vitro.

Réduction

Le nombre de souris nécessaires à ce projet est évalué à 14400 sur 5 ans. Ce nombre a été déterminé après consultation d’une biostatisticienne et analyses statistiques préalables permettant de déterminer à partir de combien de sujets une mesure est exploitable scientifiquement, et ce dans le souci de n’utiliser que le strict nécessaire d’individus tout en récupérant le maximum d’information par animal. Nous observons une protection tant chez les femelles que chez les mâles. Afin de réduire le nombre d’individus tout en maintenant une mesure exploitable scientifiquement, nos expériences seront principalement menées sur des femelles dans la continuité des travaux similaires publiés pour ce type d’étude, mais les résultats clés seront confirmés chez les mâles. Dans le cas spécifique de la durée de la protection induite par le training, des temps de plus en plus longs seront testés entre l’inoculum protecteur et l’inoculum infectieux. Dès que la protection sera perdue, les expériences incluant des temps encore plus longs seront annulées afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire à notre étude. De même, dans le cas spécifique de l’étude de la formulation soluble de l’inoculum protecteur, si celui-ci ne présente pas les effets protecteurs escomptes, il sera exclu des autres procédures afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire à notre étude.

Raffinement

Le suivi des animaux selon une liste de signes cliniques permettra d’attribuer un score quantitatif de bien-être des animaux tel que décrit par la SBEA. Des aides alimentaires (type gel hydrique) et une réhydratation sous-cutanée avec de la solution saline seront mises en place au besoin. Si un animal dépasse le score limite, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle souris a été décrit dans la littérature et est le seul existant pour étudier l’entraînement de l’immunité. De plus les souris présentent des procédures expérimentales mieux codifiées par rapport à d’autres rongeurs, de multiples outils existent et les expérimentateurs ont de l’expérience sur ces animaux. Les souris utilisées seront adultes, entre 7 et 11 semaines d’âge. Le choix de ce stade de développement permet d’avoir des souris dont le système immunitaire est complètement développé, à savoir une hématopoïèse adulte et des macrophages résidents dans les tissus pleinement développés.

Une biopsie d'oreille au sevrage, puis pour une partie des femelles l'ablation des ovaires sous anesthésie : 2 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 000 d'entre elles et modéré pour 1 200. Les femelles opérées à six semaines sont tuées six semaines plus tard, après un prélèvement de sang réalisé sous anesthésie, sans réveil. Le projet cherche des cibles pharmacologiques contre l'ostéoporose en invalidant des protéines des ostéoclastes, les cellules qui dégradent l'os. Le porteur écrit qu'aucun ou peu d'effets indésirables sont attendus, tout en décrivant une douleur modérée de deux à trois jours après l'ablation des ovaires, un risque d'hypothermie, de déshydratation et d'infection de la cicatrice.

Objectifs

Les os subissent un remodelage constant tout au long de notre vie. Ce remodelage est un processus complexe qui implique l’action coordonnée de deux types de cellules : les ostéoblastes qui fabriquent la matrice osseuse, et les ostéoclastes qui dégradent l’os. Avec l’âge et dans certaines maladies inflammatoires, l’activité des ostéoclastes domine et l’os devient plus fragile. C’est le cas de l'ostéoporose qui affecte des centaines de milliers de personnes en France. Les traitements actuels affectent la viabilité des ostéoclastes, ce qui a malheureusement des effets néfastes sur les ostéoblastes et donc la formation de l’os. Dans ce contexte, il est impératif de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui régissent la perte osseuse et d'identifier des facteurs spécifiques aux ostéoclastes, qui pourraient représenter de nouvelles cibles pharmacologiques pour traiter l’ostéoporose. Nous utilisons des souris avec des mutations pour étudier in vivo les conséquences de l’invalidation des protéines candidates sur la formation des ostéoclastes et le développement des os en condition normale et aussi dans le contexte d’une perte osseuse induite par une ovariectomie qui mime la ménopause par la chute des oestrogènes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de : (i) caractériser le rôle de protéines candidates susceptibles de réguler la formation des ostéoclastes et leur activité de dégradation de l'os ; (ii) mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent le développement de l'os ; (iii) valider le nouveau concept consistant à cibler la formation et/ou la fonction des ostéoclastes tout en préservant leur viabilité et, par conséquent, la formation osseuse par les ostéoblastes, plutôt que l'induction de la mort des ostéoclastes par les traitemenst actuels ; (iv) identifier de nouveaux points d'intervention thérapeutique.

Procédures

Les prélèvements sur animaux vigiles sont limités uniquement à une biopsie pratiquée sur l'oreille (moins de 2 minutes) au moment du sevrage, afin de déterminer le génotype des animaux. Nous prélevons un échantillon de sang (moins de 5 minutes) sous anesthésie générale juste avant la mise à mort des animaux sans phase de réveil. La souris ovariectomisée reste le modèle de référence pour l'ostéoporose post-ménopausique induite par la chute des estrogènes. Nous procédons à l'ablation des ovaires par chirurgie (moins de 20 minutes) sur des souris femelles âgées de 6 semaines. Les animaux contrôles sont également opérés mais sans ablation des ovaires. Le phénotype osseux est examiné 6 semaines après la chirurgie.

Impact sur les animaux

Le prélèvement d'une biopsie et la pose d'une bague à l'oreille sont susceptibles de générer une douleur d'intensité légère qui peut durer au maximum 1 à 2 heures. Acun voire peu d'effets indésirables sont attendus sur les animaux. Parfois de légères altérations de l'aspect de l'oreille peuvent être observés avec les signes d'une inflammation locale et transitoire. Le prélèvement de sang, bien que réalisé sous anesthésie générale des animaux qui sont ensuite mis à mort sans phase de réveil, peut toutefois s'accompagner d'une douleur d'intensité légère. La profondeur de l'anesthésie et de l'analgésie est vérifiée régulièrement par l'absence complète de réflexes en réponse au pincement de la patte. La chirurgie nécessaire à l'ovariectomie sont susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse chez les animaux. Ces nuisances d'intensité modérée peuvent s'étendre jusqu'à 2-3 jours après la chirurgie. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale avec une analgésie en phases pré- et post-operatoires. Les souris présentent alors un risque d’hypothermie et de déshydratation, c’est pour cela qu’elles sont maintenues sur tapis chauffant pendant toute la durée de la chirurgie et qu’elles recoivent de la solution saline tiède toutes les heures. Après la chirurgie, un risque d'infection au niveau de la cicatrise étant possible, les animaux sont suivis quotidiennement jusqu’à la cicatrisation de la plaie selon la grille de scoring.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure visant à analyser le phénotype osseux en condition normale et aussi dans le contexte d’une perte osseuse induite par une ovariectomie.

Remplacement

Notre projet vise à caractériser les processus moléculaires qui orchestrent la formation des ostéoclastes et le développement des os en condition normale et aussi dans le contexte d’une perte osseuse induite par une ovariectomie. Notre étude nécessite l'interaction de divers organes et systèmes biologiques que l'on retrouve uniquement chez les animaux vivants et qui ne sont pas reproductibles in vitro.

Réduction

Chaque protocole a été basé sur un examen attentif des possibilités réductrices et une étude approfondie de la littérature. Notre équipe possède un grand savoir-faire en expérimentation animale, ce qui garantira que le nombre d'animaux utilisés dans les études sera maintenu au minimum, tout en préservant la puissance statistique pour garantir des conclusions interprétables. En fonction des résultats obtenus à certaines étapes clés du projet, nous poursuivons ou arrêtons certaines expériences pour ne réaliser sur les animaux vivants que les expériences indispensables.

Raffinement

Tous les animaux reçoivennt les soins vétérinaires nécessaires et appropriés pour minimiser leur inconfort. Ils sont manipulés avec ménagement et calme, et par du personnel compétent, pour réduire leur stress. Ils ne sont jamais isolés dans une cage au cours de la procédure et bénéficiront d’un environnement enrichi (tuyau, cubes de bois). La chirurgie nécessaire à l'ovariectomie est susceptible de générer de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse chez les animaux. Cette étape est réalisée sous anesthésie générale avec une analgésie en phases pré- et post-opératoires. Les animaux sont suivis quotidiennement après l’opération. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux sont pris en compte à chaque observation grâce à une grille de scoring détaillée. Les animaux observés en détresse ou présentant des signes de souffrance sont immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris constitue le modèle de choix pour réaliser notre étude en raison de : (i) la facilité à mettre en oeuvre la manipulation génétique ; (ii) la littérature abondante concernant des études similaires pour éviter des expérimentations inutiles ; (iii) l'excellente caractérisation des fonds génétiques ; (iv) le fort degré de convergence des paramètres osseux chez l'homme et chez la souris ; et (v) la bonne caractérisation du modèle d’ostéoporose induite par une ovariectomie. Nous utilisons les souris à 12 semaines d'âge pour évaluer le phénotype osseux au stade adulte. La croissance et la maturation relativement rapides des souris se poursuivant jusqu'à environ 10-12 semaines d'âge, cela nous permet d'analyser les défauts osseux accumulés au cours du développement et de s'affranchir d'éventuelles manifestations d'effets liés à l'âge. Les conséquences de l'ovariectomie sur l'activité des ostéoclastes se manifestent par une dégradation osseuse qui est visible dans un délai de 5-6 semaines. Ainsi, la chirurgie pour l'ablation des ovaires est réalisée à 6 semaines d'âge et le phénotype osseux est analysé 6 semaines plus tard, c'est à dire à 12 semaines d'âge également.

Une souris qui montre des signes comportementaux de douleur importante est mise à mort. 672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 576 d'entre elles et léger pour 96. L'ablation des ovaires ou des testicules puis la pose d'un implant hormonal sous la peau concernent 576 souris, et 480 subissent sept prélèvements de sang à la queue à quinze minutes d'intervalle, à deux reprises. Le porteur affirme qu'il n'existe "aucune stratégie de remplacement" pour étudier l'action d'un récepteur aux œstrogènes sur le métabolisme et la prolifération cellulaire.

Objectifs

Les œstrogènes, et principalement le 17β-estradiol (E2), jouent un rôle crucial dans la physiologie de la reproduction. Leur administration après la ménopause confère aussi des bénéfices fonctionnels (symptômes du climatère), osseuse, cardiovasculaire et métabolique. Cependant, les effets des œstrogènes sur d’autres tissus (foie, sein) s’avèrent néfastes et une optimisation du Traitement Hormonal de la ménopause (HT) reste un enjeu majeur pour la santé de la femme. Le récepteur aux œstrogènes alpha (ERa), le principal récepteur des œstrogènes chez les mammifères, a des actions nucléaires et membranaires mais le rôle des actions membranaires restent inconnu dans la protection métabolique et les effets prolifératifs des oestrogènes. Ce projet a donc pour objectifs : 1) d'analyser les effets métaboliques des effets membrnaires de ERa ; 2) étudier le rôle des effets membranaires de ERa dans la prolifération utérine et mammaire. De plus, sachant qu'il existe deux mutants des effets membranaires de ERa présentant des phénotypes différents selon la dose d'oestrogènes utilisés, il est nécessaire de comparer ces deux mutants, ainsi que de tester différentes dose d'oestrogènes représentant les différentes doses physiologiques retrouvées au cours du cycle oestral.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de déterminer le rôle des effets membranaires de ERa dans la prolifération et la protection métabolique oestrogeno-dépendante, ce qui pourrait avoir un impact thérapeutique significatif dans le traitement de la ménopause. En effet, cette signalisation oestrogénique représente un levier thérapeutique relevant pour limiter, prévenir et/ou traiter les dysfonctions métaboliques ainsi que le développement de certains cancers hormono-dépendants chez les femmes menopausées. Ainsi le bénéfice attendu de ce projet est d'améliorer le rapport bénéfice/risque du Traitement Hormonal de la ménopause.

Procédures

Certains animaux seront soumis à des interventions de classes légère à modérée: - Chirurgie de classe modérée : ovariectomie (incision de la peau et du péritoine) (10 à 20min) = 576 animaux -Chirurgie de classe modérée : pose de pellet hormonal en sous cutanée (incision de la peau) (5 à 10min) = 576 animaux - Prélèvements d’une goutte de sang à la veine caudale (test de tolérance au glucose et à l'insuline réalisé à une semaine d'intervalle ): 7 gouttes de sang seront prélevées par procédure à 15 min d'intervalle = 480 animaux

Impact sur les animaux

Les expérimentations réalisées dans ce projet sont peu invasives indolores (pesée, régime riche en lipides) ou de classe légère et modérée (jeûne, ovariectomie, orchidectomie, pose de pellet). Elles peuvent être associées aux nuisances suivantes : - Le régime riche en lipides peut induire une prise de poids pouvant gêner les déplacements. - Les prélèvement à la veine caudale peut générer du stress et une douleur légère. - La mise à jeun de 6h peut entrainer du stress. - L’ovariectomie, l’orchidectomie et la pose de pellet ont pour effet attendu une douleur modérée liée aux effets de la chirurgie soulagée par des analgésiques et un stress modéré lié aux manipulations. Pour réduire le stress des animaux lié aux manipulations, toute manipulation sera réalisée dans un environnement calme, et par un manipulateur qualifié pour limiter la durée de chaque manipulation. La douleur ou l’inconfort de l’animal sera évalué : si des signes comportementaux indiquent une douleur modérée, un morphinique sera administré à visée antalgique. Enfin, si des signes comportementaux indiquent une douleur ou un inconfort important, la souris sera mise à mort.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes et réaliser des analyses moléculaires.

Remplacement

Les effets multiples des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques des oestrogènes. Alors qu'une approche in vitro est utilisée pour définir les mécanismes moléculaires de ces signalisations, l'étude des effets physio(patho)logiques des oestrogènes ne peut pas être modéliser in vitro. Ainsi il n'y a donc aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles pour l'étude des traitements oestrogéniques car cette partie du projet rentre dans le cadre de la mise au point d’un traitement de la ménopause et s’applique donc uniquement au sexe féminin. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs e. Les études statistiques antérieures ont montré que des groupes de 12 animaux étaient requis pour obtenir une distribution normale des mesures sur des paramètres physiologiques.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton, sizzlenest, battons et balle de boie) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie sont adaptées. Tout au long des procédures, les points limites adaptés et précis (décrits dans chaque procédure) sont quotidiennement surveillés permettant de mettre en application l'arbre décissionnel pouvant aboutir aux critères d'arrêt des souffrances. Cette décision sera prise par la personne en charge de la mise en oeuvre générale du projet dans l’EU et de sa conformité à l’autorisation de projet, en concertation avec la personne en charge du bien-être animal dans l’EU.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel a été générée l’invalidation génique du récepteur aux oestrogènes. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée après 8 semaines.

Certaines lignées de poissons zèbres utilisées portent des mutations qui les tuent vers dix à douze jours après la fécondation, et 28 % des poissons déficients pour certains gènes développent des tumeurs abdominales ou oculaires vers l'âge de huit mois. 1 560 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 080 d'entre eux et modéré pour 480. Le seul acte pratiqué sur animal vivant est le génotypage : anesthésie, amputation d'un morceau de nageoire caudale, puis 24 à 48 heures d'isolement en attendant le résultat, avec des douleurs post-amputation que le porteur situe à quelques heures. Tous les poissons finissent mis à mort pour prélever organes et échantillons, y compris les adultes d'élevage, remplacés tous les dix-huit à vingt-quatre mois.

Objectifs

Le projet a pour objectif l'étude de gènes connus pour leur implication dans des pathologies humaines comme les anomalies du développement et le cancer. Pour cela, le modèle poisson zèbre est utilisé comme modèle expérimental afin de replacer la fonction des gènes in vivo dans un organisme entier au cours du développement. Des poissons zèbres porteurs de mutations trouvées dans des maladies humaines seront générés afin de mieux comprendre la physiologie de ces pathologies et identifier des voies de traitement. Le poisson zèbre est un modèle qui possède de nombreuses caractéristiques intéressantes pour la modélisation des pathologies humaines. En particulier, (i) le poisson zèbre possède une large descendance, environ 200 œufs par femelle et par semaine qui offre une grande confiance dans les analyses statistiques ; (ii) l’homme et le poisson zèbre partagent de grandes similarités puisque 70% des protéines humaines et 82% des protéines impliquées dans des pathologies humaines ont un orthologue chez le poisson zèbre ; (iii) de nombreux processus cellulaires peuvent être observés chez le poisson zèbre en raison de la transparence des embryons ou chez des poissons adultes dépourvus de pigmentation ; (iv) les techniques de génétique inverse telles que la transgénèse ou l’édition du génome sont facilement applicables au poisson zèbre ; (v) le poisson zèbre absorbe les molécules qui sont dissoutes dans l’eau ; (vi) les pontes et le développement de l’embryon se font dans l’eau rendant les études du développement précoce non invasives.

Bénéfices attendus

Le projet à pour objectif la modélisation de pathologies humaines chez le poisson zèbre. À court terme, le projet permettra d’identifier certains mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans ces pathologies pour à plus long terme identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et tester des molécules pharmaceutiques. Les pathologies étudiées sont essentiellement des anomalies du développement, des maladies métaboliques et le cancer.

Procédures

Seul le génotypage des poissons lors de croisements d'individus hétérozygotes sera réalisé sur animaux vivants. Pour cela, l’ensemble des animaux issus de ce type de croisements (1080 poissons) seront placés un par un dans un bac contenant un anesthésique permettant de les endormir (pendant 2 à 3 minutes). Une fois anesthésiés, une biopsie de leur nageoire caudale sera réalisée (10 secondes). Les animaux seront ensuite placés dans un bac de réveil contenant un anti-douleur et observés pendant 24 à 48h. La durée totale de l’intervention est de 4 minutes suivies de 24 à 48h de surveillance. Durant la durée du génotypage, les poissons sont maintenus isolés et afin de réduire le stress lié à l’isolement, ils sont maintenus préférentiellement par couple un mâle/une femelle, ou si seuls, en présence d'objets en plastique afin de compenser l'absence de congénères. Les bacs qui contiennent les poissons isolés sont placés au voisinage les uns des autres afin que le contact visuel avec d’autres congénères soit toujours possible. La nageoire caudale se régénère totalement après 10 à 15 jours.

Impact sur les animaux

La procédure de génotypage sur des biopsies de la nageoire caudale peut induire des effets indésirables sur les poissons adultes. Le stress lié à la capture peut durer quelques secondes jusqu’à l’anesthésie ; les douleurs post-amputation peuvent durer quelques heures ; le stress lié au maintien des poissons isolés le temps d’obtenir les résultats du prélèvement peut s’étendre sur 48 heures. Le phénotype dommageable de certaines lignées génétiquement modifiées est responsable d’effets indésirables sur les animaux. Ces effets peuvent être une mort précoce avec une mort survenant vers 10-12 jours après la fécondation. Ces effets peuvent être le développement tumoral : 28% des poissons déficients pour certains gènes développent des tumeurs abdominales ou occulaires vers l’âge de 8 mois.

Devenir

Le projet nécessitant l’analyse des échantillons / organes issus des poissons, l’ensemble des animaux sera mis à mort.

Remplacement

L'étude de l'expression de gènes impliqués dans les anomalies du développement peut difficilement être modélisée in vitro ou in silico. De même, la tumorigenèse repose sur des mécanismes complexes ; prolifération, interactions cellules-cellules, interactions cellules-matrice extracellulaire, vascularisation, stimulation hormonale, action de cytokines, facteurs de croissance,... À ce jour, un tel degré de complexité ne peut être modélisé in vitro. Particulièrement, la capacité des tumeurs à attirer des vaisseaux sanguins ou à former des métastases ne peut être étudiée qu’en organisme complet. Le modèle poisson zèbre qui possède une fécondation et un développement externe permet l’étude des processus de manière non invasive et contribue à la réduction de l’utilisation des rongeurs en expériementation animale.

Réduction

Les connaissances de notre modèle et l’expérience acquise au sein de notre laboratoire nous a permis de réduire le nombre d’animaux nécessaires au minimum afin de maintenir notre élevage. Ce qui représente un total de 20 poissons (10 mâles et 10 femelles) par lignée sur une durée maximum de deux ans avant production d’une nouvelle génération. Un nombre inférieur altèrerait la cohésion sociale des individus de cette espèce conduisant à une augmentation de l’aggressivité et du mal-être des animaux. Ce nombre d’animaux permettra de maintenir l’élevage d’une lignée et de fournir les embryons et larves précoces nécessaires au projet. Les poissons sont maintenus entre un an et demi et deux ans avant la production d’une nouvelle génération. Pendant la transition entre l’ancienne et la nouvelle génération, qui dure approximativement 4 mois, une quarantaine d’individus sont maintenus en élevage (20 jeunes et 20 âgés) jusqu’à ce que nous soyons sûrs que la nouvelle génération produise une ponte de bonne qualité pour la suite de l’élevage (les animaux de l’ancienne génération sont alors mis à mort). Cette durée est un bon compromis qui laisse un temps suffisamment long entre les générations et réduit le nombre d’animaux d’élevage mais suffisamment court pour que la majorité des poissons ne présentent pas d’altérations liées au vieillissement. Une procédure de génotypage des lignées à partir d’embryons de 3 jours est progressivement mise en place afin de limiter le nombre d’animaux du génotype non désiré dans l’élevage.

Raffinement

Afin de limiter au maximum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, les poissons zèbres sont hébergés en animalerie conventionnelle, maintenus dans un environnement social adéquat et dans des conditions d’hébergement appropriées. L'enrichissement est assuré par : (i) L’utilisation d’un flux d’eau dynamique qui stimule la rhéotaxie, les appareils sensoriels et moteurs. (ii) L’apport journalier de nourriture vivante fournissant un enrichissement à court-terme en stimulant le comportement prédateur naturel des poissons zèbres. (iii) L’hébergement des poissons en groupe de 5 poissons / L. L’enrichissement social contribue à réduire l’anxiété et permet une meilleure récupération suite au stress. Pour des raisons expérimentales ou suspicion de maladie, des poissons peuvent être amenés à être maintenus isolés. Dans ces cas exceptionnels, les poissons seuls sont systématiquement maintenus en présence d’enrichissement de type plante en plastique et les aquariums placés au voisinage d’aquariums contenant d’autres poissons afin qu’un contact visuel avec d’autres congénères soit maintenu. Afin de protéger les animaux de toute forme de souffrance, une observation rigoureuse est réalisée deux fois par jour au moment des nourrissages selon des critères établis dans une feuille de score. L’atteinte d’un point limite ou d’un score établi entraînera la mise à mort de l’animal. Les points observés sont les suivants : - la charge pondérale des poissons - la perte d'appétit - l'amplitude respiratoire anormale (faible, forte ou incomplète) - la locomotion (nage chaotique, saccadée, en cercle), la flottabilité (changement d'occupation dans la colonne d'eau) et la position statique (déséquilibré) - l'aspect général des poissons (perte des couleurs, malformation, présence d'œdèmes, altération des nageoires) Dès l'apparition d'un de ces signes, les poissons sont observés plus particulièrement (et éventuellement isolés). En cas de persistance ou d'aggravation des signes, les poissons sont mis à mort.

Choix des espèces

Actuellement, de nombreux laboratoires à travers le monde utilisent le modèle poisson zèbre. En effet, de nombreux mécanismes de maladies humaines peuvent être élucidés rapidement grâce au poisson zèbre et la recherche menée avec ce modèle a aussi bien aidé à identifier des gènes causant des maladies humaines qu’à donner des informations précieuses du point de vue clinique. De plus, ce modèle répond particulièrement au principe des 3R permettant la réduction de l’utilisation des mammifères au laboratoire et l’expérimentation sur ses embryons n’est pas invasive, contrairement à celle menée sur les mammifères. La grande majorité des expérimentations se feront sur des embryons (0 à 72 heures après fécondation) ou sur des larves précoces (72 heures après fécondation à 12 jours après fécondation ; larves de moins de 6 mm). À ces stades, tous les organes sont mis en place. Les poissons adultes (plus de 3 mois après fécondation) seront utilisés pour maintenir les lignées et fournir les embryons et larves sur lesquels les analyses phénotypiques seront effectuées. Dans de rares cas, des prélèvements d’organes seront effectués sur des adultes préalablement mis à mort.

Irradiées onze minutes, ou en deux doses de 5 puis 4,5 grays à quelques heures d'intervalle, les souris receveuses reçoivent ensuite une greffe de cellules souches sanguines. 1 170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour isoler ces cellules, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 576 d'entre elles et modéré pour 594. L'objectif déclaré est de vérifier si un régime riche en graisses accélère le vieillissement du système sanguin. Le reste du protocole tient en une phrase, des injections intraveineuses et des prélèvements sanguins "comme décrit dans nos procédures", sans que soient précisés leur nombre ni leur fréquence, et la douleur possible après une greffe qui échoue n'est pas davantage détaillée.

Objectifs

Le système hématopoïétique vieillit avec l'âge, ce qui entraîne de nombreuses maladies liées à l'âge, comme les leucémies et autres. On ne sait pas si les signaux de stress subis précocement dans la vie donnent lieu à des phénotypes de vieillissement du système hématopoïétique. Notre objectif est donc de vérifier si un régime alimentaire riche en graisses, en tant que stress, donne lieu à de tels phénotypes.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous testerons si un régime riche en graisses entraîne le vieillissement du système hématopoïétique et nous découvrirons comment cela se produit au niveau moléculaire. Cela permettra d'identifier un mécanisme de vieillissement et pourrait donc offrir des moyens de lutter contre le vieillissement du système hématopoïétique et les maladies hématopoïétiques liées à l'âge.

Procédures

Les souris receveuses seront irradiées pendant 11 minutes dans un irradiateur X ou en utilisant 5 Gy le matin et une autre dose de 4,5 Gy après 4 à 6 heures. Les souris subiront des injections intraveineuses et des prélèvements sanguins comme décrit dans nos procédures.

Impact sur les animaux

La piqûre de l'aiguille pour le prélèvement de sang et l'injection i.v. chez les souris, au cours de la procédure 1, 2 ou 3, provoque une légère douleur de courte durée. Les souris ressentent une douleur lors de l'injection avec l'aiguille. Les souris peuvent également ressentir une douleur/blessure après l'irradiation en cas d'échec de la greffe. Faim/soif/malnutrition : sans objet, stress physique/thermique : sans objet, environnement inadapté (stabulation)/isolement : sans objet. Les souris seront surveillées et notées pour les aspects physiques tels que la perte de poids et l'apparence du site d'injection au moins deux fois par semaine, et les points limites de la grille d'observation seront respectés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure dans le but d’isoler et d’étudier les cellules souches hématopoïetiques.

Remplacement

Ce protocole étudie l'interaction entre différentes cellules, par exemple les cellules souches hématopoïétiques, et les cellules de leur microenvironnement, également connues sous le nom de cellules de niche.Cependant, il existe pas de système in vitro approprié pour étudier hématopoïèse qui soit comparable à un organisme de mammifères et qui permette d’établir une niche hématopoïétique dans laquelle les CSH peuvent rester quiescentes En réalité, les CSH en culture perdent progressivement leur phénotype quiescent. Seules certaines expériences peuvent être réalisées in vitro, telles que les essais de formation de colonies, et ce sont ces dernières qui seront utilisées. Par conséquent, les expériences in vivo sur des souris sont essentielles.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, chaque groupe contiendra le nombre minimum nécessaire pour la quantité de matériel nécessaire à l'expérience et pour obtenir des résultats statistiquement pertinents. Nous effectuerons 3 répétitions pour vérifier si la variation est significative. Si les deux premières expériences donnent le même résultat, la troisième expérience sera annulée pour réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les points limites de notre expérience seront définis sur la base de la grille d'observation mentionnée précédemment. Pour limiter la douleur résultant de la prise de sang, nous utiliserons un anesthésique. En ce qui concerne les transplantations, les souris irradiées feront l'objet d'une surveillance quotidienne pendant les deux premières semaines suivant l'irradiation, par la suite, la surveillance se fera deux fois par semaine. Nous administrons des antibiotiques aux souris.

Choix des espèces

La souris est le système idéal pour étudier l'hématopoïèse, car le système hématopoïétique est hautement conservé entre les souris et les humains. En outre, le vieillissement du système hématopoïétique est bien défini et l'approximation des âges pertinents entre l'homme et la souris est connue. Les animaux utilisés pour les experiences seront âgés de 2 à 4 mois males et females.