Procédures légères

Pour comparer des voies d'injection d'un vecteur de thérapie génique contre la sclérose latérale amyotrophique, 1 134 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré, toutes tuées entre 9 et 22 semaines d'âge. Une biopsie de queue vers dix jours détermine le génotype, puis une partie des animaux reçoit entre 7 et 12 semaines une ou deux injections dans la veine, les ventricules cérébraux, la grande citerne ou la moelle épinière, interventions de vingt à cent dix minutes sous anesthésie. Le porteur décrit ensuite des démangeaisons au niveau des sutures, une sensibilité des oreilles due aux barres du cadre chirurgical, des douleurs après l'opération et une appréhension des animaux. Un arbre décisionnel score l'expression faciale, la structure du nid, les vocalisations et la perte de poids, et si la douleur persiste malgré l'analgésie les souris sont mises à mort.

Objectifs

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative progressive mortelle qui affecte les neurones moteurs supérieurs et inférieurs du cerveau et de la moelle épinière. La dégénérescence des motoneurones entraîne une atrophie et une sclérose musculaires qui se traduisent par une perte progressive de la capacité de parler, de manger, de bouger et de respirer. Il s’agit d’une maladie au pronostic sombre, dont l’issue est fatale après trois à cinq ans d’évolution en moyenne. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe aujourd’hui aucun traitement capable de lutter de façon efficace la progression de cette maladie. Le développement de nouvelles approches thérapeutiques est essentiel pour permettre la prise en charge des patients atteints de cette maladie. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouve la thérapie génique, dont l’objectif est de délivrer aux cellules un gène à action thérapeutique (transgène) qui exprime une protéine d'intérêt pour la maladie. Ce transgène est transporté dans les cellules grâce à un vecteur viral dont l’enveloppe (capside) permet de cibler plus ou moins spécifiquement certains types cellulaires. Le projet “ Optimisation de l’expression d’un transgène par modulation de la (des) voie(s) d’administration et de la capside. Evaluation de l’effet thérapeutique en vue d’une application en thérapie génique pour la Sclérose Latérale Amyotrophique » a pour but de compléter une étude en testant de nouvelles conditions d’administration du transgène. Les injections combinées envisagées dans cette étude pourraient permettre une meilleure distribution du transgène dans l’organisme et donc ainsi une meilleure efficacité thérapeutique tout en diminuant la dose injectée à chaque site réduisant ainsi le risque potentiel de toxicité. Dans un premier temps, nous vérifierons la fonctionnalité et la non-toxicité de nos constructions sur des animaux contrôles. Dans un second temps, nous testerons et comparerons différentes stratégies d’administration du transgène (voie(s) d’administration x capside) sur des animaux modèles de la maladie afin de déterminer la stratégie qui conduit à la meilleure efficacité thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de réaliser une étude cruciale dans le cadre du développement d’un traitement curatif pour les patients atteints de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), maladie neurodégénérative mortelle pour laquelle aucun traitement n’existe aujourd’hui. Le projet décrit permettra de déterminer la stratégie thérapeutique optimale (voie(s) d’administration et capside) pour le traitement testé, c’est-à-dire la stratégie qui conduit à la meilleure efficacité thérapeutique, sur la base de l’analyse des signes neuropathologiques. Cette étude permettra d’obtenir des résultats indispensables pour la poursuite du développement du traitement envisagé pour la SLA.

Procédures

Une biopsie de l’extrémité de la queue sera réalisée sur les animaux produits autour de 10 jours, afin de déterminer la présence de la maladie (animaux vigiles - durée : 1 seconde). Pour une partie des animaux, une injection sera réalisée entre 7 et 12 semaines d’âge (injection simple : intraveineuse, dans les ventricules du cerveau, dans la grande citerne (cavité située à l'arrière de la tête entre le crâne et la première vertèbre) ou au niveau de la moelle épinière entre les vertèbres, ou encore injection combinée dans la moelle épinière et cerveau ou ventricules du cerveau ou grande citerne ou injection combinée intraveineuse et grande citerne ou moelle épinière ou ventricules du cerveau). Ces injections ont des durées comprises entre 20 et 110 min et sont réalisées sur animal anesthésié et analgésié. Afin d’éviter la douleur en post-chirurgie, ces animaux reçoivent une prise en charge analgésique au cours des 48 heures suivant la chirurgie. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure par une méthode règlementaire.

Impact sur les animaux

Deux types de nuisances peuvent subvenir lors de notre étude : 1) des nuisances directement liées au développement de la maladie chez la souche utilisée (très peu probables) et 2) des nuisances induites par nos procédures. Les nuisances inhérentes au modèle utilisé sont très peu probables (non observées par le fournisseur de la lignée). Il pourrait s’agir d’une faiblesse musculaire voire de l’apparition progressive d’une paralysie. Les nuisances induites par nos procédures sont les suivantes : une légère et brève douleur de l’extrémité distale de la queue au moment du prélèvement pour le génotypage, une sensibilité au niveau des oreilles suite à l’utilisation des barres d’oreilles (appareil chirurgical), des démangeaisons au niveau des sutures, une angoisse ou appréhension après les procédures chirurgicales, des douleurs post-opératoires ainsi que des risques anesthésiques (stress thermique, risque cardio-respiratoire, etc.).

Devenir

Les souris inclues dans les différentes procédures seront euthanasiées entre 9 et 22 semaines d’âge, pour les différentes études histologiques et biomoleculaires. Les animaux produits qui ne seront pas inclus dans les études (génotype incompatible avec la bonne réalisation du projet), seront euthanasiés de même que les reproducteurs à l'issue de la période de reproduction.

Remplacement

Le développement de thérapies pour la Sclérose Latérale Amyotrophique est essentielle car actuellement, aucun traitement ne permet de lutter efficacement contre la progression de cette maladie au pronostique sombre. Les premières étapes du projet (validation et raffinement de la thérapie développée) ont été réalisées sur des modèles in vitro (lignées cellulaires) et ex-vivo (cellules de patients). Cependant, ce type de modèle ne permet pas de réaliser l’ensemble des étapes nécessaires au développement du traitement. En particulier, la sélection des conditions d’administration optimales du traitement requiert l’utilisation d’animaux, afin d’évaluer la biodistribution du traitement dans l’organisme et son efficacité thérapeutique au niveau des différentes régions atteintes. Toutefois, nous continuons d’utiliser nos modèles in vitro et ex-vivo pour tous les aspects du projet auxquels ces modèles peuvent répondre (analyse de l’impact du design de la construction sur l’expression du transgène et sélection du design optimal, analyse du mécanisme d’action du transgène…).

Réduction

Le nombre total d’animaux nécessaires pour l’ensemble du projet est 1134. Les effectifs des différentes études correspondent aux effectifs minimaux d’animaux nécessaires pour une comparaison de moyennes entre les différents groupes. Ces effectifs ont été calculés grâce à une analyse a priori réalisée à l’aide d’un logiciel statistique adapté. Les études seront réalisées après vérification de la fonctionnalité et de la non-toxicité des constructions sur un nombre restreint d’animaux contrôles (expérience pilote), évitant l’injection d’un grand nombre d’animaux avec une construction non fonctionnelle ou toxique. De plus, les analyses des études seront réalisées au fur et à mesures, et les résultats obtenus pour certaines de ces études conditionneront la réalisation d'autres études. Cette stratégie permettra de réduire le nombre total d’animaux utilisés pour le projet.

Raffinement

Nos souris suivent les protocoles d’hébergement établis par la responsable et le personnel de l'animalerie. Les animaux sont hébergés en groupe de 5 maximum et jamais isolés (sauf cas exceptionnel, traitement particulier suite à une blessure ou agression). Ils bénéficient d’un enrichissement dans la cage (maisonnette et matériaux pour confection du nid). La pièce d’hébergement a un accès restreint afin de limiter le bruit et les perturbations dues à la présence humaine. Un examen des animaux sera effectué quotidiennement par le personnel de l’animalerie, permettant de s’assurer du bien-être des animaux. Toute anomalie [aspect ou comportement anormal, blessure ou apparition inattendue des symptômes de la maladie (i.e. début de paralysie)] sera signalée au responsable du projet. En cas de signalement, de l’alimentation sera ajoutée directement dans la cage ainsi que de l’hydrogel pour permettre à l’animal de continuer à s’alimenter et s’hydrater correctement et un contrôle approfondi et une pesée seront réalisés quotidiennement par la personne en charge du projet jusqu’à résolution de l’anomalie. Les animaux seront également pesés toutes les semaines. Des protocoles d’anesthésie et d’analgésie, définis et validés par une équipe vétérinaire, seront mis en place pour les différentes procédures. Un suivi renforcé des animaux sera réalisé en post-chirurgie : l’état de la cicatrisation, l’aspect du poil, l’expression faciale, la structure du nid, l’activité locomotrice, les vocalisations ainsi que la perte de poids seront scorées de manière à guider la prise en charge d’une douleur potentielle, grâce à un arbre décisionnel validé par notre vétérinaire. Un traitement analgésique sera administré en cas de signe de douleur. Si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance inutile. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis. Les animaux seront immédiatement euthanasiés par inhalation de dioxyde de carbone si un point limite est atteint.

Choix des espèces

Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèles. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la Sclérose Latérale Amyotrophique permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie et donc d'être utilisés dans des études d'efficacité thérapeutique. Une biopsie de la queue sera prélevée sur les animaux produits autour de dix jours d'âge pour réaliser un test permettant de vérifier la présence de la maladie. Certains animaux seront injectés entre 7 et 12 semaines d’âge (début de l’apparition des signes neuropathologiques), et euthanasiés entre 2 à 10 semaines après injection (soit, 5 mois d’âge maximum) pour réaliser les analyses qui permettront de déterminer la stratégie thérapeutique optimale pour soigner ces animaux, et in fine les patients.

464 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré, 304 tuées pour prélever cerveau, foie, intestins et reins, 96 gardées vivantes pour produire d'autres souris transgéniques. 176 mères subissent cinq prises de sang à la queue après deux heures de jeûne, 48 d'entre elles deux injections de glucose et d'insuline suivies chacune de huit prélèvements, puis 48 heures en cage individuelle pour mesurer leur dépense énergétique. 256 souriceaux subissent une biopsie de la queue et un tatouage de la première phalange entre cinq et sept jours, et 64 d'entre eux une chirurgie terminale. Le porteur affirme que seule une étude chez "l'animal entier" permet d'atteindre l'objectif et qu'aucune méthode de remplacement ne peut être employée, dans un projet dont le premier acte consiste à rendre des mères prédiabétiques par un régime hypercalorique.

Objectifs

L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante qui ne peut être attribuée uniquement aux modifications individuelles du régime. Un développement anormal des régions du cerveau impliquées dans la régulation du poids, pourrait participer à l’apparition de ces pathologies. Le développement de ces régions prend place en période périnatale et est affecté par un environnement maternel obèse et/ou diabétique. Chez la souris, un régime maternel hypercalorique induit chez les descendants des altérations du développement du cerveau et du métabolisme énergétique. La production intestinale de glucose est capable de transmettre des signaux au cerveau en réponse à l’alimentation. La production intestinale de glucose est fortement induite dans les dix premiers jours suivants la naissance, puis décroit progressivement jusqu’au sevrage. La production intestinale de glucose pourrait donc moduler le développement du cerveau spécifiquement dans cette période. Chez l’adulte, l’activation de la production intestinale de glucose a des effets anti-diabète et anti-obésité. Notre hypothèse est qu’une activation de la production intestinale de glucose en période périnatale chez des souris nées de mères nourries avec un régime hypercalorique permettrait de contrecarrer les effets délétères de ce régime sur le métabolisme et le développement du cerveau. Pour vérifier cette hypothèse, nous comparerons les effets d’une activation de la production intestinale de glucose en période périnatale chez des petits nés de mères nourries en régime normal ou hypercalorique sur : 1/ le développement du cerveau, 2/ leur métabolisme à l’âge adulte. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU 1/2 et EU 2/2).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre les effets de programmation d’un régime maternel hypercalorique (induisant une légère résistance à l’insuline) sur le développement cérébral et sur le métabolisme de la descendance mâle et femelle et de déterminer si l’activation de la production intestinale de glucose peut être une cible nutritionnelle préventive efficace pour éviter et/ou limiter ces effets négatifs.

Procédures

176 souris mères subiront 5 prélèvements de sang à la queue pendant la période d’accouplement, de gestation et de lactation (de 30 secondes chacun) après 2h de jeûne. 48 souris mères subiront deux injections (une injection de glucose et une injection d’insuline, espacées d’une semaine) lors des tests servant à l’analyse métabolique. Après chaque injection, les souris auront 7 prélèvements d’une goutte de sang (durée de 3 secondes chacun) et un prélèvement de quelques dizaines de microlitres (30 secondes). Les tests seront réalisés à l’EU 1/2. Une mesure de la composition corporelle des 48 mères sera réalisée chez l’animal éveillé par un analyseur dédié. La mesure n’engendre pas de souffrance particulière, elle est rapide (2 minutes) et non invasive. La mesure de la dépense énergétique se fait, de manière non-invasive et sur 48 heures (mesure des échanges gazeux, de la prise alimentaire et hydrique et de l’activité spontanée). Ce suivi des mères depuis la période d’accouplement et jusqu’au sevrage permettra de caractériser leurs statuts hormonal et métabolique. Ces 2 mesures seront réalisées à l’EU 2/2. 256 souriceaux descendants subiront une biopsie de l’extrémité de la queue (inférieure à 1mm) à l’aide de ciseaux de microchirurgie, par un technicien expérimenté afin d’établir le génotype de l’animal (EU1/2). Parmi ces derniers, 64 souris subiront une chirurgie terminale suite à une injection d’analgésique et d’anesthésique (10 secondes chacune) afin de prélever les organes. Cette procédure servira aux analyses au niveau du cerveau (EU1/2). Les autres descendants (192 animaux) subiront 3 prélèvements de sang à la queue (30 secondes chacun) à 3, 5 et 11 semaines d’âge qui permettront le dosage des hormones régulant le taux de glucose sanguin et l’appétit (EU1/2). Ces animaux subiront 4 tests pour l’analyse de leur métabolisme glucidique qui évolue avec l’âge : 2 tests à 7 semaines d’âge puis 2 tests à 14 semaines. Les 2 tests, espacés d’une semaine sur les mêmes animaux, nécessitent deux injections. Après chaque injection, les souris auront 7 prélèvements d’une goutte de sang (3 secondes chacun) et un prélèvement plus important (30 secondes). De plus, dans des conditions identiques aux mères, leur métabolisme énergétique sera étudié par une mesure de composition corporelle chez l’animal éveillé (par un analyseur dédié sans engendrer de souffrance particulière, temps moyen de 2 minutes) et par la mesure de la dépense énergétique sur 48 heures (EU2/2).

Impact sur les animaux

Le régime hypercalorique entraine une prise de poids et une résistance à l’insuline (caractéristique d’un état prédiabétique) au bout de 8 semaines mais ne provoque pas de diabète avant 16 semaines. Les mères ainsi que les descendants qui subiront l’analyse métabolique recevront, lors de deux tests, une injection (soit de glucose ou d’insuline) réalisée par notre personnel qualifié, ce qui assurer la réussite de l’injection et limite les irritations. L’injection d’insuline est susceptible de causer une hypoglycémie. La mesure de la composition corporelle est réalisée sous contention et engendre donc un léger stress. La mesure de la dépense énergétique se fait dans des cages individuelles pendant 48 heures, ce qui peut engendrer un stress. Les nouveau-nés subiront une très petite biopsie du bout de la queue (moins de 1 mm) pour déterminer le génotype, qui sera réalisée entre 5 et 7 jours, en même temps que l’identification par tatouage de la première phalange, ce qui peut engendrer une légère douleur.

Devenir

Les 64 souriceaux seront mis à mort afin d’analyser le développement du cerveau. 48 mères et 192 descendants adultes (240 animaux en total) seront mis à mort afin de collecter les organes tels que le foie, les intestins et les reins permettant l’analyse en biologie moléculaire de la production de glucose par ces 3 organes. Les 96 animaux replacés (64 mères et 32 pères sous régime standard) serviront à produire d’autres animaux transgéniques pour l’établissement utilisateur EU 1/2. Les 64 mères ayant reçu un hypercalorique pendant 8 à 12 semaines développent un léger état prédiabétique qui peut s’aggraver à long terme. Leur maintien en vie dans ces conditions n’est donc pas souhaitable. Elles seront mises à mort une fois que leurs petits seront sevrés.

Remplacement

La production intestinale de glucose contrôle le cerveau via un relais nerveux. La détection, la transmission et l’intégration de ce signal sont réalisées par les connections nerveuses entre l’intestin et le cerveau. Ce projet nécessite de conserver ces communications inter-organes et sera donc réalisé in vivo dans des modèles de souris transgéniques surexprimant la production intestinale de glucose.

Réduction

Le nombre maximal d’animaux utilisés a été estimé à 464 souris sur une période de 5 ans. Le nombre de mères nécessaires par groupe a été calculé au plus juste afin d’optimiser les naissances, particulièrement pour obtenir une production suffisante à la formation de groupes bénéficiant d’un environnement maternel homogène, condition nécessaire pour les études de l’environnement périnatal. Le nombre de souris utilisées pour chaque expérience a été calculé au plus juste par des méthodes statistiques et à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept : Soit au maximum 12 souris par groupe. Notre personnel qualifié, permet de standardiser nos expérimentations afin de diminuer les sources extérieures de variabilité. A la fin de chaque procédure, des analyses statistiques adéquates seront réalisées. Si aucune différence n’est observée entre les individus mâles et femelles, les données seront regroupées pour augmenter le nombre d’échantillons. Dans un objectif de réduction du nombre de femelles reproductrices, à 3 jours, les portées seront équilibrées à 6 ou 7 petits. Les petits excédents par mère seront « adoptés » par les mères ayant un nombre inférieur. Les souriceaux obtenus en surplus de la quantité requise pour les procédures de ce projet seront élevés dans l’établissement utilisateur et utilisés dans des protocoles expérimentaux ultérieurs. Enfin, cette étude sera réalisée chez des descendants défiés ou non à un régime hypercalorique à l’âge adulte. La réalisation du dernier lot du projet est conditionnée aux résultats des lots précédents et ne sera peut-être pas effectuée.

Raffinement

Les souris sont hébergées par groupes, en milieu enrichi (frisottis, maison en carton, coton). Elles sont surveillées quotidiennement, et pesées au moins 2 fois par semaine. Dans le cas de toute modification physique ou comportementale, la surveillance sera accentuée. Si l’animal ne parvient pas à se rétablir, la mise à mort est envisagée pour raison éthique. Pour raffiner les reproductions et les adoptions croisées, les femelles seront synchronisées pour leur reproduction, en ajoutant de la litière de mâle souillée dans leurs cages, avant le démarrage des accouplements. Lors des prélèvements de sang à la queue, l’incision du bout de la queue n’est réalisée qu’une seule fois après application d’un analgésique local. Lors de la prise de sang, l’animal est libre de ses mouvements sur la grille de la cage et n’a pas besoin d’être maintenu. Les souris seront transportées dans des cages de transport, placées dans un double sac fermé permettant de conserver le confinement et en véhicule climatisé, de l’établissement 1/2 vers l’établissement 2/2. La mesure de composition corporelle sera réalisée chez l’animal éveillé. A l’issue de la mesure, les animaux seront replacés dans leur cage d’origine. La mesure de la composition corporelle est réalisée sous contention et engendre donc un léger stress. Pour éviter que celui-ci perturbe la mesure de dépense énergétique, un délai de 24h sera laissé avant son évaluation. Le système utilisé permet une mesure non-invasive des échanges gazeux respiratoires, de la prise alimentaire et hydrique et de l’activité spontanée des animaux. Afin d’habituer les souris aux conditions de mesure, elles seront placées dans les cages individuelles 24h en conservant une partie de leur litière et l’enrichissement utilisé dans leur cage d’hébergement. A la fin de la période d’enregistrement, les souris seront remises dans leur cage d’origine avec un enrichissement renforcé. Le stress de l’isolement semble très modéré car au vu des protocoles réalisés sur la plateforme, les animaux remis dans leur cage d’origine après les mesures ne présentent pas de troubles de comportement (bagarre, isolement).

Choix des espèces

Le rôle de la production endogène de glucose par le foie et l’intestin sur le métabolisme glucidique et énergétique a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Nos études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. De plus, seule une étude chez l’animal entier incluant la complexité des mécanismes physiologiques mis en jeu lors du développement de maladies métaboliques, peut permettre d’atteindre l’objectif de ce projet. Aucune méthode de remplacement ne peut donc être employée. Dans ce projet, nous étudierons l’impact de la production intestinale du glucose sur le développement cérébral qui prend place pendant les trois semaines qui suivent la naissance. Nous utiliserons donc des animaux au stade précoce (21 jours après la naissance). La résistance à l’insuline se développe avec l’âge chez les souris. Il est donc nécessaire d’avoir une analyse des paramètres biologiques des individus à plusieurs stades de la vie. Nous analyserons ces 2 paramètres à 7 semaines (période de puberté) ainsi qu’à 14 semaines d’âge (stade adulte).

346 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré, chacune pesée et mesurée trois fois par semaine pendant un protocole qui peut durer trente-deux semaines. À dix jours, les souriceaux reçoivent sous anesthésie une injection intramusculaire dans une patte arrière, qui déclenche une tumeur des tissus mous près de l'articulation. Toutes sont tuées à la fin, celles qui portent la tumeur pour la récolter, celles qui ne conviennent pas au modèle parce qu'elles ne peuvent, écrit le porteur, être ni réutilisées ni replacées, et les dernières pour éviter qu'une tumeur apparaisse tardivement. Le bénéfice annoncé se limite à une meilleure compréhension du rôle d'une protéine, face à des tumeurs laissées croître jusqu'à sept mois dans la patte de souris nées de croisements organisés pour ce modèle.

Objectifs

Les cancers des tissus mous sont des tumeurs malignes très agressives ciblant principalement une population jeune (adolescents et jeunes adultes). Ces tumeurs se développent proche des articulations (genoux) le plus souvent. Le taux de survie à 5 ans est inférieur à 50% et de plus les traitements sont très peu efficaces avec une forte résistance aux chimiothérapies et radiothérapies. C’est pour cela que le développement d’un traitement fonctionnel en fait un enjeu majeur de recherche actuellement. De plus, si la chirurgie reste l’option la plus adoptée lorsque les tumeurs sont résécables, les rechutes et/ou le développement de métastases sont assez récurrentes. L'objectif principal de ce projet est d’étudier le rôle d’une protéine d’intérêt ainsi que son mécanisme d’action sur la croissance tumorale de ces tumeurs en la supprimant ou en la marquant par fluorescence afin de suivre son expression tout au long du développement des tumeurs.

Bénéfices attendus

L'hypothèse de ce travail est que la protéine étudiée joue un rôle dans le développement des cancers des tissus mous. Ceci est basé sur l'évaluation de l'expression de cette protéine ciblée dans les tumeurs de patients atteints de cette maladie. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du rôle de cette protéine cible sur le développement tumoral de ce type de cancer mais aussi de son mécanisme d’action.

Procédures

Toutes les souris prévues dans le protocole subiront 3 fois par semaine : prises de poids + mesures des tailles des tumeurs (manipulation totale/souris = 3minutes environ) pendant toute la durée du protocole (maximum 32 semaines). Mais aussi une seule injection intra-musculaire, sous anesthésie et anti-douleurs, dans une seule patte arrière (manipulation totale/souris = 10minutes environ) en début de protocole afin d’induire le développement des tumeurs chez les souris.

Impact sur les animaux

Toutes les souris prévues dans le protocole subiront différentes manipulations chaque semaine pouvant engendrer un stress pour des prises de poids et le suivi de la croissance tumorale. Les souris subiront également une injection unique à 10 jours, dans le muscle de la patte, pour induire les tumeurs. Ces nuisances sont diminuées par la mise en place de précautions spécifiques à chaque geste. En particulier, l’injection intramusculaire sera faite sous anesthésie et avec des antidouleurs si nécessaire.

Devenir

Nous effectuerons des croisements spécifiques afin d’obtenir les modèles de souris requis dans ce protocole. Nous garderons celles correspondant à notre modèle d’intérêt, les souris ne pouvant être utilisées dans la suite de l’étude seront mises à mort (souris génétiquement modifiées non réutilisables et non replaçables). Pour la suite du protocole, tous les animaux porteurs de tumeurs seront mis à mort en fin de procédure expérimentale selon les critères décrits dans le projet afin de pouvoir récolter les tumeurs pour des analyses biologiques. Les animaux non porteurs ne pourront pas être réutilisés et devront également être mis à mort afin d'éviter un développement de tumeurs de manière tardive.

Remplacement

Les cancers des tissus mous nous intéressent pour la diversité des cellules qui les composent ainsi que toutes les interactions entre elles = microenvironnement tumoral. Ces éléments sont nécessaires à la compréhension de l’impact de notre protéine d’intérêt. D’après les publications scientifiques, cette diversité n’est pas retrouvée dans les cultures cellulaires (qui contiennent en général un nombre très limité de types cellulaire différents) mais uniquement dans les tumeurs chez la souris où l’on retrouve un microenvironnement tumoral complet avec tous les types cellulaires comme les cellules cancéreuses, les cellules immunitaires, les cellules des tissus touchés par ce type de cancer.

Réduction

Nous testerons d’abord le développent des tumeurs sur un nombre limité de souris divisé en 2 groupes permettant de voir directement si notre protéine est impliquée dans le développement et afin de s’assurer que le modèle se développe comme défini par nos collaborateurs qui utilisent ces lignées de souris. Le nombre de souris par groupe a été défini selon des tests statistiques. Si les résultats sont concluants un seul groupe d’une nouvelle lignée de souris sera utilisé, nous permettant de visualiser la protéine au cours du développement des tumeurs (nous ne regarderons que 3 stades de développement, précoce intermédiaire et tardif). Toutes les souris issues de nos croisements seront utilisées indépendemment du sexe. 2 lots sont prévus lors du test de développement tumoral du modèle mais 1 seul sera utilisé si celui-ci est concluant.

Raffinement

Les souris ont une période d’habituation aux expérimentateurs qui vont suivre le protocole. Les souris seront élevées et hébergées par groupes, avec un milieu enrichi pour améliorer leur bien-être (maison en carton, coton). Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux (pesées, mesure de la croissance tumorale etc.) plusieurs fois par semaine permettra la recherche de tout signe de souffrance. La manipulation des souris à l’âge précoce de 10 jours sera effectuée avec précaution pour limiter le stress de la séparation avec la mère. Des points limites adaptés sont mis en place au-delà desquels, si aucun moyen de correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort. L’injection et les mesures de croissance tumorale sont réalisées par du personnel qualifié afin de réduire au maximum le temps de manipulation et le stress des animaux avec au besoin anesthésie et anti-douleurs adaptées.

Choix des espèces

La souris sera le modèle dans ce protocole, nous utiliserons des souriceaux mâles et femelles à 10 jours pour induire la formation de tumeurs d’une manière proche à ce type de tumeurs chez l’Homme, puis nous suivrons cet avancement au stade adulte chez les mêmes individus. La souris est utilisée car elle permet de maintenir la diversité cellulaire dans les tumeurs qui est nécessaire à l’étude de notre protéine d’intérêt. De plus cette protéine n'est pas exprimée dans toutes les espèces mais on retrouve une forte ressemblance entre la forme humaine et murine, justifiant encore l'usage des souris. En dernier lieu, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils destinés à l'analyse des tumeurs qui n'existent pas tous pour d'autres espèces que l'homme et la souris.

Immunisées par trois injections d'antigène à 15 à 21 jours d'intervalle, cinq au plus si leur taux d'anticorps reste trop faible, et soumises à trois prises de sang sans anesthésie, 310 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Dans quelques cas, les souris génétiquement modifiées pour produire des anticorps de type humain subissent une biopsie à 10 jours d'âge pour leur génotypage. Toutes sont tuées à l'issue pour le prélèvement des cellules immunitaires de leur rate ou de leurs ganglions, base de banques d'anticorps contre la syphilis, le paludisme et les virus Nipah et Hendra. Le porteur écrit que les injections répétées d'adjuvant "peuvent entrainer une rougeur ou irritation au point d'injection", effet qu'il dit rare, puis que les adjuvants utilisés sont "dépourvus d'effet indésirable".

Objectifs

L’un des développements les plus intéressants dans le domaine des thérapies est la génération d’anticorps humains pour les utiliser ensuite comme pistes de traitements dans de nombreuses indications cliniques, et particulièrement dans le domaine des vaccins. La Syphilis, le paludisme et l’infection au Nipah/Hendra sont des maladies aux conséquences lourdes dans de nombreux pays et continuent d’être parmi les défis de santé les plus importants. Le développement de vaccins, soit comme mode de prévention (Syphilis, Malaria) soit comme traitement en réponse à une pandémie (Nipah) constituerait une avancée majeure. L’objectif est de fournir de nouveaux anticorps monoclonaux humains contre des antigènes d’intérêt bien identifiés. Ce projet décrit les étapes à mettre en place pour disposer des cellules lymphoïdes secrétant les anticorps d’intérêt chez la souris, après immunisation de ces souris par les antigènes pré-identifiés. L’utilisation de souris génétiquement altérées permet de garantir la spécificité « humaine » des anticorps produits.

Bénéfices attendus

Le bénéfice à court terme est de disposer de cellules murines lymphoïdes secrétant des anticorps humanisés d’intérêt pour des applications thérapeutiques. Le bénéfice à plus long terme, est de disposer de solutions thérapeutiques (anticorps, vaccins) contre la Syphilis, la Malaria, ainsi que les virus Nipah-Hendra.

Procédures

3 injections préférentiellement par voie SC, les voies IP ou IM se font en dernier recours selon la nature de l’antigène, espacées de 15 à 21 jours. Pendant la période d’immunisation des prélèvements de sang de 150µL sont effectués (5 jours avant la première administration puis une semaine après la première et deuxième administration, soit au maximum 3 prélèvements sur animal vigile). Les prélèvements sanguins en cours d’étude sont réalisés sur animaux vigiles à la veine saphène, ou à la veine submandibulaire. Sur la durée totale de l’étude vivo (50 à 60 jours maximum), le volume de sang prélevé en une fois représente au maximum 10% du volume sanguin circulant. La durée de récupération entre chaque prélèvement sera de 12 à 14 jours. Dans quelques cas, le génotypage des souris génétiquement altérées, est effectué de façon invasive (biopsie tissulaire pratiquée à 10 jours d’âge).

Impact sur les animaux

La manipulation répétée de l’animal vigile pour les administrations ou prélèvements sanguins entraine un inconfort léger de courte durée. Les injections répétées d’adjuvant, parfois nécessaire pour stimuler la réponse immunitaire, peuvent entrainer une rougeur ou irritation au point d’injection, effet rarement observé avec les adjuvants utilisés. L’administration d’un antigène peut, très rarement, entrainer une réaction immunitaire exacerbée. Dans quelques cas, le génotypage des souris génétiquement altérées peut être effectué par une méthode invasive .

Devenir

Les animaux sont euthanasiés pour les prélèvements d’organes nécessaires à l’atteinte des objectifs de l’étude (récupération des cellules immunitaires).

Remplacement

Il existe des alternatives non animales pour produire des anticorps d’intérêt déjà caractérisés, mais à ce jour la phase vivo reste nécessaire à la création de clones de cellules compétentes pour de nouveaux anticorps. Elle permet en effet d’obtenir une très grande diversité d’anticorps qui seront ensuite triés, caractérisés par les méthodes alternatives pour générer les meilleurs.

Réduction

Le nombre d’animaux a été spécifiquement adapté pour chaque programme de recherche afin de limiter au maximum le nombre d’animaux. En effet les méthodes employées sont optimisées. Pour un antigène donné, un petit nombre d’animaux suffit à générer un grand nombre de cellules permettant la constitution d’une banque d’anticorps. Cependant il peut exister une plus ou moins grande variabilité de la réponse immunitaire d’un animal à l’autre. Cette variabilité est évaluée par le titrage des anticorps à partir de prélèvements d’échantillons sanguins au cours de l’immunisation. Si les titres d’anticorps sont trop faibles, il sera ajouté une ou deux administrations d’antigène afin d’en augmenter la production, sans avoir recours à des animaux supplémentaires.

Raffinement

Tous les antigènes administrés sont purifiés et caractérisés avant administration. Les adjuvants utilisés sont dépourvus d’effet indésirable, limitant considérablement le risque de réaction au site d’injection. Pour diminuer le stress lié à certaines injections, le geste technique sera réalisé sous anesthésie gazeuse. L’utilisation de cages équipées de système automatisé permettra d’améliorer la surveillance des animaux afin de mettre en place très rapidement les actions pour la prise en charge vétérinaire. Lors de l’observation de comportement agressif il sera ajouté de l’enrichissement au milieu d’hébergement.

Choix des espèces

L’animal utilisé est la souris immunocompétente car l’objectif est de générer des anticorps monoclonaux. L’utilisation de souris génétiquement altérées est prévue pour garantir la spécificité « humaine » des anticorps produits. Pour un antigène donné, un petit nombre d’animaux suffit à générer, à partir de la rate ou des ganglions lymphatiques, un grand nombre de cellules immunes B permettant la constitution d’une banque importante d’anticorps garantissant l’identification de candidats. Sachant que la réponse immunitaire est dépendante de l’âge, les études de génération d’anticorps monoclonaux seront réalisées sur des animaux âgés de 7-15 semaines pour garantir une réponse immunitaire optimale.

2 095 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 600 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une fibrose du foie leur est imposée par trois voies, une lignée génétiquement modifiée, une chirurgie abdominale de quinze à vingt minutes, ou des injections répétées dans l'abdomen sur animal vigile, avant jusqu'à six expositions au plasma froid espacées de trois à cinq jours. Le porteur indique qu'à un stade tardif ces modèles conduisent tous à une défaillance hépatique pouvant provoquer un ictère et, dans les cas les plus graves, la mort, et que le plasma appliqué sur la peau peut causer des brûlures superficielles allant jusqu'à la nécrose. L'effet antifibrosant recherché reste une hypothèse à tester, quand l'atteinte du foie, elle, est provoquée d'emblée, et le porteur conclut qu'il n'est "pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier".

Objectifs

La fibrose hépatique est un processus de cicatrisation anormal du foie, où le tissu sain est remplacé par une matrice extracellulaire rigide et dysfonctionnelle. Cela survient après une lésion chronique du foie, entraînant la transformation des fibroblastes en myofibroblastes qui sont les principales cellules à l’origine de la fibrose. La fibrose hépatique est la cause directe d'environ un demi-million de décès par an dans le monde. En outre, elle alimente la gravité d'autres maladies chroniques du foie, y compris le cancer primitif du foie. À ce jour, les options thérapeutiques visant à restaurer l'homéostasie du foie fibreux ne sont pas satisfaisantes, et restent un enjeu médical majeur. Le plasma froid atmosphérique (PFA), également connu sous le nom de gaz faiblement ionisé, représente une stratégie thérapeutique innovante pour traiter la fibrose. En effet la production de composés chimiques par le PFA entraine un stress de la cellule. Ainsi, nous émettons l'hypothèse selon laquelle le PFA pourrait restaurer un fonctionnement tissulaire normal par différents mécanismes i) en modulant la fonction des cellules impliquées dans la progression de la fibrose et ii) en modifiant la structure des protéines du tissu fibrotique. Les objectifs sont de tester l’efficacité anti-fibrosante du PFA et de mieux comprendre les mécanismes d’action du PFA, en particulier sur le phénotype des cellules pro-fibrosantes et sur les composants de la MEC, dans des modèles précliniques de fibrose hépatique. La caractérisation des échantillons sera réalisée par des approches multiples de biologie moléculaire et cellulaire.

Bénéfices attendus

La fibrose hépatique est la cause directe d'environ un demi-million de décès par an dans le monde. En outre, elle alimente la gravité d'autres maladies chroniques du foie, y compris le cancer primitif du foie. À ce jour, les options thérapeutiques visant à restaurer l'homéostasie du foie fibreux ne sont pas satisfaisantes, et restent un enjeu médical majeur. Dans son ensemble, ce projet est de tester dans différents modèles expérimentaux murins, l’effet du plasma froid atmosphérique (PFA) sur le foie fibreux. Les bénéfices attendus sont de démontrer un effet anti-fibrosant du plasma froid atmosphérique dans 3 modèles bien décrits de fibrose hépatique représentatifs de la maladie humaine. Si l’effet anti-fibrosant s’avérait efficace, ce projet pourrait permettre de développer un nouvel outil thérapeutique anti-fibrosant applicable en santé humaine dans le cadre des maladies hépatiques fibrosantes. Au-delà de la fibrose, les PFA pourraient jouer un rôle important dans le développement de nouvelles applications médicales. Par exemple, les résultats pourraient orienter la création de nouvelles thérapies pour la cicatrisation des plaies, le traitement du cancer et l'ingénierie tissulaire.

Procédures

Le modèle génétiquement modifié utilisé développe spontanément une fibrose qui restent néanmoins asymptomatiques d’un point de vue phénotypique. Le modèle chirurgical implique une chirurgie abdominale effectuée sous anesthésie et analgésie pré et post opératoire. La chirurgie est d’une durée 15 à 20 minutes pas animal. Enfin, le modèle chimique implique des injections régulières au niveau de l’abdomen (intra-péritonéale). Ces injections sont effectuées sur animal vigile par simple contention et ne dure que quelques secondes par animal (moins de 30 secondes). Pour les traitements au plasma froid, les souris seront anesthésiées et seront exposés soit par application locale au niveau cutanée, soit par injection au niveau de l’abdomen (intra-péritonéale). Ces traitements ne devraient pas excéder quelques minutes et pourront être appliqués jusqu’à 6 fois maximum avec un intervalle de 3 à 5 jours entre chaque traitement. A l’issue des traitements, les animaux seront anesthésies et analgésiés puis seront soumis à un prélèvement sanguin précédant l’euthanasie. Ce prélèvement est strictement nécessaire pour les analyses à effectuer et ne durera pas plus de 5 minutes entre de début de l’anesthésie et l’euthanasie de l’animal.

Impact sur les animaux

La principale contrainte concerne le développement des pathologies du foie induites génétiquement, chirurgicalement, ou chimiquement. A un stade tardif, ces modèles conduisent tous à une pathologie/défaillance hépatique pouvant induire un ictère (jaunissement) et dans les cas les plus graves peuvent conduire au décès. L’induction de ces pathologies est malheureusement strictement nécessaire pour mener à bien ce projet et tester la thérapie par plasma froid. Le modèle génétiquement modifié développe spontanément une fibrose qui restent néanmoins asymptomatiques d’un point de vue phénotypique. Le modèle chirurgical implique une chirurgie abdominale qui engendre donc des nuisances liées à l’anesthésie (stress thermique, risque d’arrêt cardio-respiratoire, etc.) et à la chirurgie elle-même (douleurs post-opératoires malgré la prise en charge réalisée, inflammation locale, risque de dessiccation de la plaie, etc.). Enfin, le modèle chimique implique des injections régulières au niveau de l’abdomen pouvant être source de stress en raison de la contention et d’une douleur de courte durée lors de l’introduction de l’aiguille. Le traitement par plasma froid devrait quant à lui réduire les effets liés au développement des pathologies du foie étudiées. Cependant, l’utilisation de ce gaz faiblement ionisé appliqué directement sur la peau de l’animal peut générer des brûlures superficielles et un assèchement de la peau pouvant aller jusqu’à la nécrose dans les cas les plus extrême (peu probable). Pour les traitements administrés par injection au niveau de l’abdomen les nuisances pourraient être un éventuel durcissement abdominal, inflammation, etc.). Les traitements seront effectués sous anesthésie et impliqueront donc également les contraintes/risques liées à l’anesthésie elle-même (stress thermique, risque d’arrêt cardio-respiratoire, etc.). Enfin, le prélèvement sanguin effectué avant l’euthanasie sous anesthésie et analgésique pourra induire un stress au moment de l’induction de l’anesthésie. Ce prélèvement sera effectué́ juste avant l’euthanasie de l’animal (pas de réveil).

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires. Une première partie dans le cadre du maintien des lignées sera euthanasiés en fin de période reproductive sans réalisation de prélèvement. Une seconde partie euthanasiée afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact « biologique » des différents traitements, en utilisant les différents marqueurs de progression de la pathologie.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement et l’évaluation de thérapies innovantes anti-fibrosantes. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans les pathologies hépatiques, telle que la fibrose qui peut évoluer vers la cirrhose, puis le cancer. Le modèle animal est donc indispensable dans le cadre de ce projet.

Réduction

Le projet impliquera un total de 2095 animaux. Nous avons calculé le nombre minimal d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités entre animaux et entre procédures d’isolement cellulaire nécessaire, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Autant que faire se peut, nous nous efforcerons d’isoler plusieurs types cellulaires à partir des mêmes animaux. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Les souris utilisées pour une partie des analyses biologiques seront les mêmes animaux que ceux utilisés pour les tests comportementaux. Par ailleurs, une analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

L’ensemble des procédures réalisées au cours de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.) quand cela est compatible avec les expériences. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi, etc.). De plus, la lignée transgénique utilisée est déjà bien caractérisée et connue de l’équipe, et les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : Les cellules en culture ne permettent pas d'appréhender le processus de fibrogenèse hépatique dans sa globalité. Aussi, la souris est utilisée pour mimer la fibrose hépatique avec des caractéristiques de la maladies proches de celles observées chez l’homme. Plusieurs modèles animaux de fibrose hépatiques existent chez la souris récapitulant les différentes formes observées chez l’homme. Nous utiliserons un modèle génétiquement modifie qui développent de manière spontanée des lésions hépatiques. Nous utiliserons également des souris commerciales et induirons chirurgicalement ou chimiquement des modèles de fibrose validé par la communauté scientifique. Justification des stades : Les souris seront utilisées à l'âge adulte/jeune adulte : - 4-8 semaines pour les animaux transgéniques - 6-8 semaines pour les animaux commerciaux dont 1-2 semaines d’acclimatation. Nous n'utilisons pas d'animaux trop vieux afin de nous affranchir des modifications des fonctions hépatiques dues à l'âge et qui pourraient interférer avec nos résultats.