Procédures légères

Porteuses d'une mutation du gène de la dysferline qui dégrade progressivement leurs muscles, 222 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection locorégionale de virus porteur d'une mini-dysferline sous anesthésie gazeuse de dix minutes, puis passent chaque mois un test de force musculaire de cinq minutes, jusqu'à l'âge de douze mois. Le porteur affirme que la myopathie n'aura qu'un impact histologique, aucun animal n'étant gardé au-delà de l'âge où les signes cliniques apparaissent. Sur les 222 souris comptées, 126 entrent dans les groupes expérimentaux et les 96 autres relèvent de l'élevage de la lignée.

Objectifs

Les dysferlinopathies sont un groupe de maladies musculaires rares et héréditaires caractérisées par des mutations dans le gène de la dysferline, ce qui entraîne une altération de la fonction de cette protéine. Les atteintes cliniques dans les dysferlinopathies incluent généralement : - une faiblesse musculaire progressive. Cette faiblesse affecte principalement les muscles des membres, en particulier les épaules, les hanches et les cuisses. - une perte de la force et de la fonction musculaire : Avec la progression de la maladie, les patients peuvent éprouver une diminution de la force musculaire, ce qui entraîne des difficultés à effectuer des activités quotidiennes telles que monter les escaliers, se lever d'une chaise, ou porter des objets lourds. - une dystrophie musculaire : La dégénérescence progressive des muscles peut conduire à une dystrophie musculaire, caractérisée par une perte de masse musculaire et une détérioration de la structure des fibres musculaires. Ces atteintes cliniques peuvent varier en gravité d'un individu à l'autre. Les souris présentant une mutation dans le gène de la dysferline présentent une atteinte musculaire très progressive avec un impact clinique pour l'animal au-delà de 13 mois. Au cours d'un projet antérieur, nous avons testé une approche thérapeutique par injection intramusculaire d'un AAV (adeno associated virus) codant pour une mini dysferline fonctionnelle (protéine plus courte que la forme normale mais ayant conservée sa fonction). Ces traitements ont permis d'améliorer le phénotype histologique du modèle murin Ce nouveau projet, a pour objectif de tester l'efficacité de cette thérapie génique par administration par voie loco-régionale.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce travail seront principalement pour les patients atteints de ce type de myopathie. En effet si notre hypothèse s’avère valide la thérapie génique va pouvoir éviter la dégénérescence des fibres musculaires observée chez les patients et offrir une thérapie potentielle.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule injection locorégionale sous anesthésie générale gazeuse. La durée de cette anesthésie est de l’ordre de 10 minutes. Ils seront également soumis une fois par mois à un test de force musculaire ("grip test") ce test durera 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés au cours de ce projet vont développer une atteinte musculaire progressive ayant surtout un impact histologique puisqu'aucun animal ne sera gardé au délà de l'âge auquel la myopathie clinique se déclare.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures car nous prélèverons les échantillons nécessaires pour notre étude.

Remplacement

Les techniques in vitro ne peuvent être utilisées qu’afin de voir un effet à l’échelle cellulaire de l’administration de la mini-dysferline. La récupération fonctionnelle permise par l’administration de cette mini-dysferline ne peut être explorée que sur des modèles vivants. Les premières étapes de notre projet ont démontré que cette approche était fonctionnelle nous devons maintenant étendre cette étude à des injections loco-régionale. Malheureusement, l’approche thérapeutique envisagée ne peut pas éviter un essai sur un modèle in vivo.

Réduction

Afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet, nous utiliserons une approche statistique qui nous a permis de définir que nous aurons besoin d'au moins 9 souris par groupe expérimental. Afin de faire face à d’éventuelles pertes d’animaux ou incidents techniques, nous avons augmenté ce nombre de 15%, nous arrivons à un total de 10 souris par groupe maximum, pour les souris traitées sur un an ce nombre est légèrement augmenté pour pallier les pertes, nous aurons donc 12 souris soit au total 126 souris. En prenant en compte les souris pour l’élevage ce nombre atteint 222 souris.souris

Raffinement

Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Les animaux seront hébergés par groupe de 5. L’environnement sera enrichi en fonction des préférences des animaux à l’aide de bandelettes de kraft ou de dômes en carton. Les animaux seront hébergés seul lors de la procédure mais avec un double enrichissement (dôme et/ou roue). La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contentionà faible stress (mains en coupelles et tunnels). Les procédures seront réalsiées avec un protocole d'anesthésie et d'analgésie adaptées. Le modèle que nous allons utiliser a été caractérisé d’un point de vue phénotypique. Nous connaissons l’âge d’apparition de signe de souffrance ou de détresse qui est très tardif. Nous allons étudier les animaux avant l’apparition des phénotypes. Les points limites nous permettront de limiter au strict minimum l’apparition de souffrance. Des approches thérapeutiques seront mises en places dès les premiers signes d'inconfort des animaux.

Choix des espèces

L’anatomie et la fonction des muscles squelettiques sont proches des muscles humains. Les souris génétiquement modifiées sont de bons modèles d’étude des atteintes du système neuromusculaire, de leurs physiopathologies et de leurs causes génétiques. Afin d'étudier l'évolution naturelle de la pathologie, les animaux seront étudiés de l'âge de 1 mois jusqu'à l'âge de 12 mois.

Chaque souris est immobilisée huit fois pour un test d'agrippement, gavée sept jours d'affilée à l'âge de huit mois, puis privée d'un quart de son volume sanguin juste avant d'être tuée. 288 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour analyses moléculaires et histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. La lignée a été construite pour supprimer dès la naissance une protéine servant à fabriquer les micro-ARN dans les fibres musculaires, ce qui produit vers huit mois une faiblesse musculaire et une inflammation. Le porteur classe la contention, les gavages répétés et la ponction sanguine comme un "stress léger de courte durée", et renvoie l'apport pour l'humain à une meilleure compréhension future des myopathies inflammatoires.

Objectifs

Les micro-ARN (miRNA) sont de petites molécules qui régulent l'expression des gènes en empêchant certains ARN messagers de produire des protéines. Ils jouent un rôle crucial dans de nombreux processus biologiques, comme le développement et la réponse aux maladies. Dans le muscle squelettique, la quantité de micro-ARN (miRNA) change avec l'exercice physique et les maladies musculaires, suggérant qu'ils régulent les fonctions musculaires. Un modèle murin, où la protéine d’étude (nécessaire à la synthèse des miRNA : impliqués dans l'inactivation et la régulation de l'ARN) est supprimée à l'âge adulte, ne montre pas de réduction des miRNA. Notre équipe a créé un modèle où cette protéine est supprimée dès la naissance, réduisant fortement les miRNA dans les muscles dès 3 semaines. L'étude de la force musculaire, de la créatine kinase sanguine (marqueur de lésions musculaires) et de l'histologie musculaire chez ces souris nous aidera à comprendre le rôle de ces régulateurs dans la physiologie des muscles squelettiques chez l’Homme.

Bénéfices attendus

L’absence de modèle animal viable présentant une diminution de la quantité de microARN (miRNA) dans la cellule musculaire squelettique a empêché l’étude du rôle des miRNA de la myofibre après la naissance. Notre équipe a pu mettre au point une lignée de souris chez qui l’expression de la protéine d’intérêt est éteinte dans la myofibre après la naissance. Nos données préliminaires ont montré que ces souris présentent une diminution importante de la quantité de miRNA dans les muscles squelettiques dès l’âge de 3 semaines, indiquant que ce modèle peut être utilisé pour étudier le rôle des miRNA de la myofibre après la naissance. Ces souris d’études âgées de 3 semaines présentaient une force et une histologie musculaire semblable aux souris contrôles du même âge. Au cours de notre étude préliminaire, nous avions suivi un groupe de souris d’étude sur une période d’un an. La masse corporelle des souris d’étude était semblable à celle des souris contrôles pendant toute la durée du suivie. Entre deux et huit mois après la naissance, la force musculaire des souris contrôles avait augmentée de 15% alors que celle des souris d’étude était restée inchangée. Les analyses histologiques ont montré des infiltrats de cellules inflammatoires dans les muscles squelettiques et une internalisation du noyau des myofibres chez ces souris âgées de 8 mois. Ces données mettent en évidence que, après la naissance, les miRNA de la myofibre pourraient avoir un rôle dans le maintien de la structure de la myofibre et/ou un rôle anti-inflammatoire. L’étude des muscles des souris d’étude nous permettra de comprendre le rôle des miRNA de la cellule musculaire. En plus d’améliorer les connaissances sur la physiologie musculaire, ces données pourraient, à terme, améliorer la compréhension des maladies inflammatoires du muscle squelettique telles que les myopathies inflammatoires.

Procédures

La force musculaire des animaux sera mesurée tous les mois par test d’agrippement, soit 8 fois au long de la vie de l’animal, ce test nécessite une contention de 15 secondes pour l’identification de l’individu, la force de chaque animal sera mesurée en triplicat, soit une manipulation totale de 2 minutes par individu et par test. Les animaux seront gavés à l’âge de 8 mois pendant 7 jours, le gavage nécessite une contention de 30 secondes. Les animaux vigiles, c’est-à-dire non anesthésiés, seront soumis à un prélèvement sanguin. Cette procédure ne nécessite pas de contention de plus de 30 secondes. Le prélèvement sera réalisé une seule fois, via la veine temporale superficielle, juste avant la mise à mort des animaux, et représentera 25% de leur volume sanguin corporel.

Impact sur les animaux

Une étude préliminaire avait mis en évidence une faiblesse musculaire modérée chez les souris d’étude. A 8 mois, les souris seront gavées quotidiennement durant 7 jours. Le prélèvement sanguin au niveau de la veine temporale superficielle nécessite la contention de l'animal. Les actes sont effectués sur animal vigile, la contention génère un stress léger de courte durée, la répétition de gavages peut entrainer une irritation et le prélèvement sanguin peuvent générer un stress, ces actes sont donc considérés comme modérés.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux expérimentaux seront mis à mort pour réaliser des analyses moléculaires et histologiques.

Remplacement

Pour comprendre le rôle des miRNA de la myofibre dans la physiologie du muscle squelettique, le recours à un organisme entier est nécessaire. Le muscle squelettique est composé de plusieurs types de cellules, et pas uniquement de myofibre, et il n’existe actuellement aucun système in vitro qui permettrait de modéliser l’interaction entre la myofibre et les autres types cellulaires. L’utilisation d’un modèle in vivo est donc nécessaire.

Réduction

Le laboratoire a l'expertise nécessaire pour réaliser des expériences avec peu de souris, tout en garantissant des résultats fiables. Pour étudier le rôle des miRNA dans le développement musculaire après la naissance, nous comparerons des souris d’étude sans miRNA dans leurs muscles à des souris normales. Nous examinerons leur force musculaire, le taux de marqueur de dommage musculaire dans le sang et analyserons les muscles au microscope pour voir la taille des fibres musculaires et détecter des signes de dommage ou d'inflammation. Nous réaliserons aussi des analyses pour comprendre les changements au niveau moléculaire. Les souris seront étudiées à différentes étapes de leur développement : à 4 semaines, 2 mois et 8 mois. Nos études préliminaires ont montré une inflammation musculaire chez les souris d’étude, et cette inflammation varie entre les mâles et les femelles. Pour comparer correctement les mâles et les femelles, il faut assez de souris dans chaque groupe. Comme nos premières données montrent que l'absence de miRNA n'affecte que légèrement la force musculaire, nous aurons besoin de 48 souris par groupe (24 mâles et 24 femelles) pour obtenir des résultats significatifs.

Raffinement

Notre équipe maîtrise toutes les procédures expérimentales de ce projet. Le bien-être des souris sera constamment surveillé et toute souffrance ou angoisse sera immédiatement discutée avec les responsables du bien-être animal pour prendre des mesures correctives. La démarche des souris sera surveillée pour s'assurer qu'elles se déplacent normalement, sans boitement. Nous suivrons aussi leur posture, tonus, comportement, pelage et poids. Nos données préliminaires montrent que les souris d’étude âgées de 2 à 8 mois n'ont pas de difficultés à se déplacer, manger ou boire. Si la mobilité est affectée, de la nourriture en gel sera ajoutée dans la cage. Le traitement d’une semaine est bien toléré sans effets indésirables attendus. Les prélèvements sanguins, ne dépassant pas 25% du volume total, seront effectués juste avant la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Pour identifier le rôle des miRNA de la myofibre dans la physiologie musculaire, il est impossible d’utiliser des modèles cellulaires : seul un organisme entier permet d’évaluer la fonction musculaire et d’étudier les dialogues entre la myofibre et les autres types de cellules présents dans le muscle. Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel nous disposons de tous les outils moléculaires nécessaires pour mener à bien cette étude. La souris présente un intérêt particulier du fait de sa facilité de manipulation, par exemple pour évaluer sa force musculaire, ainsi du fait de sa similarité avec l’Homme tant au niveau histologique qu’au niveau génétique (99% du génome commun avec l’Homme). Pour comprendre le rôle des miRNA dans la physiologie musculaire après la naissance, nous utiliserons des souris âgées de 3 semaines à 8 mois. En effet, le développement post-natal de la souris se décompose en 3 phases : la souris jeune (4 semaines), la souris jeune adulte après la puberté (2 mois), et la souris adulte (8 mois). Les mêmes analyses seront réalisées à ces trois stades de développement de la souris.

Trente bars communs seront tués pour récupérer les marques implantées dans leur corps, quatre-vingt-dix autres gardés en vie et susceptibles d'être réutilisés. Ces 120 poissons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des stagiaires aux gestes techniques. Chaque animal subit en une seule séance un marquage intramusculaire, une prise de sang et un prélèvement d'écailles et de nageoire, ou une chirurgie d'implantation, ou encore une stimulation hormonale suivie d'une collecte d'ovocytes ou de gamètes. Le porteur écrit que ni mannequin ni animal mort ne conviennent, l'observation de l'endormissement et du réveil faisant partie de la formation, et conclut qu'il n'existe "pas d'alternatives non animales" pour ces ateliers.

Objectifs

Les projets scientifiques menés au sein de l'établissement nécessitent que les intervenants habilités à la conception ou à la réalisation de procédures expérimentales, qu’ils soient titulaires, étudiants ou partenaires, aient acquis la maitrise des gestes techniques courants, en amont des expérimentations. Ces ateliers techniques seront réalisés dans le cadre de l’acquisition ou du développement des compétences individuelles, conformément aux exigences requises, et seront délivrés par des experts de ces techniques à des groupes de 5 stagiaires maximum.

Bénéfices attendus

Ces ateliers techniques sont nécessaires pour toutes les personnes habilitées à concevoir ou réaliser des procédures expérimentales qui seront amenées à pratiquer des gestes techniques récurrents. Une bonne maîtrise des techniques appliquées sur les poissons réduit les nuisances conséquentes à un geste mal réalisé, optimise le temps de réalisation des procédures, et assure une meilleure reproductibilité des résultats attendus.

Procédures

Un premier lot de 6 poissons sera soumis à un marquage intramusculaire, à une prise de sang, à un prélèvement d'écailles et à deux prélèvements de tissu selon deux méthodes différentes. L'ensemble de ces gestes ne sera pratiqué qu'une seule fois et durera moins de trois minutes. Un deuxième lot composé de 6 femelles et de 6 mâles sera soumis à une évaluation du stade de maturation et à une collecte d'ovocytes pour les femelles, et à une collecte des gamètes pour les mâles. Ces gestes ne seront pratiqués qu'une seule fois et ne dureront que quelques minutes au total. Un troisième lot de 6 poissons sera soumis à une chirurgie pour l'implantation d'une marque interne. Un marquage externe sera également effectué. Ces deux gestes ne seront effectués qu'une seule fois et dureront moins de cinq minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont limitées et sont (1) le stress des poissons lors des manipulations, (2) une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de la prise de sang, lors de la stimulation hormonale des femelles, et lors du marquage intramusculaire, (3) une lésion bénigne engendrée par le prélèvement de l’extrémité d’une nageoire et d’écailles, (4) une incision lors du marquage interne liée à la chirurgie et à la suture après implant. Les effets indésirables sont également limités et peuvent être consécutifs à une mauvaise réalisation du geste enseigné, et être caractérisés par une reprise partielle de la mobilité après anesthésie. Les animaux seront surveillés scrupuleusement tout au long des procédures, par les stagiaires mais également par leur encadrant. Les gestes techniques hors chirurgie sont réalisés en moins de trois minutes. La chirurgie sera réalisée en moins de cinq minutes.

Devenir

18 poissons par an (90 sur la durée du projet) sont gardés en vie et seront susceptibles d'être réutilisés. 6 poissons par an (30 sur la durée du projet) seront euthanasiés afin de récupérer le matériel implanté.

Remplacement

Ces formations, sous forme d’ateliers pratiques, sont destinées à acquérir la dextérité de gestes techniques pratiqués de manière récurrente dans des projets de recherche. Chaque atelier est précédé d'un cours théorique détaillé, des supports illustrés sont fournis aux stagiaires. Des enregistrements vidéos seront réalisés dès la première session de formation pour servir de support pédagogique aux sessions suivantes. La sédation et l'anesthésie des poissons font parties intégrantes de la formation, l'observation du comportement des animaux étant essentielle dans les phases d'endormissement et de réveil, il est donc indispensable que ces ateliers techniques soient réalisés sur des poissons vivants. L'utilisation de mannequins ou d'animaux morts n'étant pas envisageable, il n’y a pas d’alternatives non animales pour délivrer ces enseignements techniques.

Réduction

Le nombre minimal d’individus est de 1 poisson par stagiaire, et 1 poisson pour l’enseignant, par atelier. Pour chaque procédure, il sera exécuté l'ensemble des gestes techniques sur chaque poisson. Un cours théorique préliminaire aura pour intérêt d’aborder de manière exhaustive la technique enseignée avant la mise en pratique.

Raffinement

Tout sera mis en place dans le cadre des formations pour limiter la souffrance et le stress des animaux. Le protocole de manipulation et d’anesthésie est optimisé et parfaitement maîtrisé par l’enseignant, les gestes techniques hors chirurgie sont réalisés en moins de trois minutes, même en condition de formation de stagiaires, et la chirurgie sera réalisée en moins de cinq minutes. Les animaux seront surveillés scrupuleusement tout au long des procédures, par les stagiaires mais également par leur encadrant, ainsi que durant la phase de réveil. Après complète récupération, les poissons seront replacés en condition d’élevage standard avec une surveillance quotidienne durant deux semaines pour s’assurer de leur bien-être.

Choix des espèces

Le bar commun (Dicentrarchus labrax) est un modèle de poisson marin d’aquaculture dont la physiologie et l'élevage sont parfaitement connus et maitrisés. Tous les animaux utilisés seront des individus juvéniles ou adultes. Pour la procédure de marquage intramusculaire, de prise de sang, de biopsie de nageoire et de prélèvement d’écailles, le poids des poissons sera compris entre 100 g (juvénile) et 500 g (adulte). Pour la procédure de contrôle de maturation, collecte d’ovocytes et collecte de gamètes, les poissons seront âgés d’au moins 2 ans et leur poids sera d’au moins 2000 g . Pour le marquage interne, le poids des poissons sera d’au moins 400 g, cette taille permettant le placement des marques.

Jusqu'à quarante minutes d'exposition à des températures atteignant 46 °C, et des mesures respiratoires de douze heures la nuit : 764 mésanges charbonnières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes relâchées dans leur milieu d'origine. Les prises de sang durent trois à cinq minutes, les mesures de métabolisme jusqu'à deux heures en journée. L'objet du projet est de tester si les oiseaux des villes, déjà exposés à l'îlot de chaleur urbain, seraient pré-adaptés au réchauffement climatique. Le porteur retient la mésange charbonnière parce qu'elle niche dans les nichoirs, se comporte bien en captivité et se laisse manipuler sans abandonner sa nichée, et parce que la généalogie des individus suivis est connue.

Objectifs

En écologie évolutive, le changement climatique et l'urbanisation sont surtout étudiés séparément. Pourtant l’effet d'îlot de chaleur urbain constitue un défi supplémentaire pour des organismes déjà confrontés au changement climatique, en particulier durant les événements climatiques extrêmes (ex. vagues de chaleur). La chaleur accrue en ville représente de ce fait un théâtre d’étude unique pour les scientifiques cherchant à comprendre comment les organismes s’adaptent (ou non) au réchauffement. Ce projet vise à comprendre et à prévoir l'impact des effets interactifs du changement climatique et de l'urbanisation sur l’évolution et la dynamique des populations en utilisant une espèce modèle en écologie évolutive : la mésange charbonnière. L’objectif des expériences décrites ici est de comparer les adaptations physiologiques (depuis les phénotypes jusqu’aux gènes) aux variations de température chez les oiseaux des forêts et des villes, et de tester l'hypothèse selon laquelle les organismes vivant en ville pourraient être pré-adaptés au réchauffement climatique parce qu'ils sont exposés à l'effet d'îlot de chaleur urbain. Le projet permettra une meilleure compréhension de la façon dont l'environnement urbain peut façonner l'adaptation des oiseaux au changement climatique.

Bénéfices attendus

Le suivi à long terme permet d’étudier de façon pérenne les populations de mésanges charbonnières. Couplé avec une démarche expérimentale, l’analyse des données issues de ce programme permet une compréhension fine des capacités de réponse des organismes aux changements de leur environnement. Nous envisageons que le projet apporte des réponses sur les adaptations des mésanges charbonnières aux pressions anthropiques. L’étude inédite de l’élévation des températures sur des traits physiologiques et comportementaux pourra être menée dans l’expérience unique de jardin commun. Les mésanges charbonnières se comportent bien en captivité et nichent facilement dans les nichoirs quel que soit l’habitat. Ainsi, cette espèce commune est adaptée aux questions qui sont posées.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prises de sang ou à des mesures de métabolisme (consommation d'oxygène, rejet de CO2, et évaporation d'eau par la respiration). Les prises de sang ne durent que maximum 3 à 5 minutes. Les mesures de métabolisme sont opérées durant un maximum de 2 heures (la journée) dont entre 15 et 40min à des températures élevées (jusqu'à 46°C) ou 12 heures (la nuit, pendant que les animaux dorment).

Impact sur les animaux

Les nuisances possibles sont les évènements de capture qui mèneront à du dérangement, ainsi que les manipulations visant à identifier les animaux (baguage, mesures morphométriques et de comportement), et à quantifier leurs adaptations physiologiques à la température. Une douleur peut être attendue lors des prises de sang, causée par l'introduction d'une aiguille effectuée conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les prises de sang ne dépasseront jamais les quantités recommandées pour un animal de cette taille. L'exposition brève à des températures élevées peut générer un inconfort transitoire, mais les mesures de respirométrie seront faites sous surveillance constante des oiseaux. L'objectif de l'étude étant de mettre en parallèle des mesures physiologiques avec des comportements exprimés la plupart du temps en milieu naturel (y compris des mesures de reproduction postérieures à nos mesures physiologiques), les résultats ne pourront être pertinents que si les animaux n'ont subi ni stress aigu, ni effets indésirables. Enfin, toutes les manipulations seront effectuées par des manipulateurs formés et sûrs de leurs gestes.

Devenir

Tous les oiseaux seront libérés dans leur milieu naturel d'origine après chaque procédure.

Remplacement

Il s’agit ici de recherche scientifique fondamentale sur des animaux sauvages, et en particulier de leurs physiologies et comportements naturels. Il n’est pas possible de pouvoir déduire ces mécanismes sans recourir à des animaux vivants et à de l’expérimentation.

Réduction

Les protocoles ont été pensés de façon à utiliser un nombre restreint d’individus pour donner des résultats statistiquement adéquats. Ces nombres sont choisis en s’appuyant sur des expériences précédentes et de la littérature scientifique. Les nombres limités d’oiseaux impliqués sont aussi permis grâce à leurs utilisations pour la mesure de plusieurs traits phénotypiques. En effet les mesures physiologiques sont connues pour présenter une variabilité inter-individuelle importante nécessitant des tailles d'échantillon en conséquence. La mesure de traits multiples sur chaque oiseau que nous envisageons a justement pour but d'expliquer cette variabilité et de permettre de limiter les tailles d'échantillons. A titre d'exemple, dans le jardin commun nous élèverons 120 poussins issus de 2 villes, 2 types d'habitat et des 2 sexes, ce qui revient à une taille d'échantillon de 15 individus par groupe.

Raffinement

Les expérimentateurs ne manipuleront jamais seuls, permettant de réduire les risques de nuisance due aux manipulations et favorisant l'entraide. Les expérimentateurs sont formés de façon à avoir des gestes assurés et permettant de faire les manipulations le plus rapidement et calmement possible. Les opérateurs sont régulièrement ré-entrainés aux gestes adéquats. Les oiseaux en captivité seront maintenus dans des espaces prévus et enrichis (e.g. volières de grande taille avec végétation naturelle et de nombreux perchoirs), leur fournissant des conditions de vie semi-naturelle. Tous les protocoles sont pensés pour réduire au maximum les nuisances et le stress des animaux, d'autant plus qu'un intérêt scientifique majeur du projet tient au suivi ultérieur en populations naturelles (paramètres démographiques et reproducteurs) des oiseaux qui auront été mesurés.

Choix des espèces

Mésange charbonnière (Parus major) Les mésanges nichent facilement dans des nichoirs et la manipulation de leurs poussins ainsi que la capture des individus n'entrainent aucun abandon de nichées. Nos recherches sur le long terme sur les mésanges nous offrent une opportunité unique de mesurer les traits d’intérêts sur des oiseaux dont toute la généalogie est connue, ce qui permet notamment d’envisager des analyses de génétique quantitative pour estimer l’hérédité des caractères. Par ailleurs, ce modèle d’étude est unique car il permet de travailler à la fois en populations naturelles et à l’aide d’expérimentations en conditions contrôlées au laboratoire. Aucun modèle théorique ne peut remplacer l’étude des oiseaux dans la nature pour répondre aux questions posées. - Oiseaux sauvages : Les prélèvements, prises de sang et respirométrie sont faits sur des oiseaux adultes. Les oiseaux ne sont pas capturés durant certaines phases sensibles de la reproduction, c’est-à-dire durant l’incubation, et durant la fin de l’élevage des poussins. Les poussins ne font l'objet que de mesures morphométriques. - Oiseaux captifs : Les prélèvements, prises de sang et respirométrie sont faits sur des oiseaux adultes. Les seules manipulations sur les poussins seront des prises biométriques pour étudier leurs croissances durant l’élevage.

2 760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune buvant pendant quatre mois une eau additionnée des molécules testées, puis nageant dans la piscine de Morris quatre fois par jour pendant cinq jours. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger à modéré. S'y ajoutent deux séjours de deux jours et deux nuits en cage individuelle munie d'une roue, pour mesurer l'activité de souris que le porteur décrit comme apathiques. Ces souris portent des mutations qui provoquent un déficit cognitif et des troubles de la mémoire s'aggravant avec l'âge, et le bénéfice annoncé, une future utilisation de ces molécules dans le traitement clinique de la maladie d'Alzheimer, reste au conditionnel.

Objectifs

Les patients atteints de la maladie d’Alzheimer (MA) présentent dans leur cerveau des aggrégats protéiques toxiques que sont d'une part les dégénérescences neurofibrillaires composée de protéine Tau et les plaques sénilescomposées en majorité du peptide amyloïde (Ab). Selon l'hypothèse amyloïde, l'Ab serait le principal responsable des dysfonctionnements liés à la MA or nos résultats montrent que son précurseur, le fragment C99 contribue aussi à la pathologie. Au laboratoire, nous avons mis en évidence une accumulation très précoce de ce fragment dans le cerveau de souris modèle de la MA ce qui conduit à des dysfonctionnements cellulaires et contribue à un deficit cognitif. En plus de la pathologie liée au peptide Ab et au fragment C99, l'aggrégation de la protéine Tau observée dans les cerveaux des patients Alzheimer conduit à un dysfunctionnement synaptique. De manière interéssante, de nouvelles molécules sont capables de diminuer à la fois la pathologie liée à Tau et celle liée à l'Ab. L'objectif de ce projet est d'explorer l'effet de ces nouvelles molécules sur la pathologie liée au fragment C99 dans plusieurs modèles murins de la MA.

Bénéfices attendus

Ces nouvelles molécules ont été décrites comme améliorant le déficit cognitif des souris en réduisant à la fois la pathologie liée à la protéine Tau et celle liée au peptide Ab. Ce projet a pour but non seulement de confirmer l'effet de ces nouvelles molécules sur un nouveau modèle murin de maladie d'Alzheimer combinant à la fois la pathologie Tau et celle d'Ab mais aussi d'étudier spécifiquement l'effet de ces molécules sur la pathologie liée au fragment C99. Ce projet de recherche fondamentale devrait apporter des informations importantes sur les mécanismes moléculaires que pourraient cibler ces molécules et déterminer si ces molécules sont capables de restaurer des phénotypes pathologiques liés au fragment C99. Il devrait également fournir des perspectives cruciales pour une future utilisation de ces molécules dans le traitement clinique de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Les animaux subiront au plus 3 interventions: 1-Le traitement par une administration des molécules dans l'eau de boisson pendant 4 mois. 2-Les mesures d'activité et de distance parcourue dans la roue dans des cages métaboliques : pour chaque souris 2 passages sont prévus avant et après le traitement pendant 2jours et 2nuits consécutives. 3-Le test de mémoire qui consiste en 5 jours d'apprentissage avec 4 essais par jour d'une minute, 2 tests d'une minute 24h et 72h après le dernier jour d'apprentissage et un test visible comportant 3 essais d'une minute le même jour .

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet ont un phénotype dommageable avec un déficit cognitif, des défauts d’apprentissage et de mémorisation qui s’aggravent avec l’âge. Les molécules utilisées dans ce projet ont déja été administrées à des souris sauvages ou transgéniques pendant 4 mois à une concentration de 1mg/kg sans effet indésirable visible sur l'état physiologique des souris conservant un poids stable, une consommation d'eau et de nourriture stable et un comportement normal dans la cage. Au cours du test de la piscine de Morris, les souris sont contraintes à nager dans l’eau qui est un environnement stressant pour les souris mais la durée de chaque passage dans la piscine ne dure qu'une minute, 4 fois par jour pendant 5 jours durant la phase d'apprentissage et une minute pendant la phase de test. Les mesures d'activité dans les cages métaboliques consistent à isoler les souris dans des cages individuelles 2 jours et 2 nuits consécutifs pour comptabiliser les mouvements de chaque souris. Ce test peut éventuellement générer un léger état d’anxiété lié à l’isolement social mais nous estimons que la durée n'est pas suffisament longue pour avoir une quelconque conséquence pour le bien être des animaux. De plus cet isolement est compensé par la présence d'une roue dans la cage considérée comme un enrichissement de l'environnement. Pour les analyses histologiques, certaines souris seront profondément anesthésiés et pour éviter toute douleur à l'animal, avant toute intervention, la profondeur de l'anesthésie sera vérifiée au préalable par l'absence de réaction de l'animal au pincement de la membrane inter-digitale.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mises à mort afin de récupérer leur cerveau et effectuer les analyses biochimiques et histologiques nécéssaire au projet scientifique.

Remplacement

Les expériences de comportement de souris telles que la piscine de Morris ou les mesures d'activités ne peuvent malheureusement pas être remplacées par des expériences in vitro. Cependant toutes nos expériences biochimiques, immunohistologiques et nos analyses des mécanismes moléculaires sont étudiées en parallèle sur des modèles cellulaires exprimant les mêmes mutations ou le fragment C99.

Réduction

Nous utiliserons des tailles d’échantillons garantissant une puissance statistique suffisante tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés dans le respect éthique de la règle des 3R (remplacement, réduction et raffinement). Le nombre de souris pour chaque procédure est ainsi déterminé par une méthode statistique adaptée. Les tests de comportement que nous utilisons ont déjà été testés sur nos modèles de souris et nous avons déjà établi un protocole bien déterminé ce qui évitera de réaliser des expériences préliminaires de mise au point. Notre étude comportementale requière des groupes de 30 à 33 animaux minimum. Cependant, pour réduire le nombre d’animaux, quand cela est possible, les mêmes groupes de souris seront utilisés pour plusieurs test comportementaux et pour les analyses biochimiques et immunohistochimiques.

Raffinement

Nos modèles de souris sont utilisés en routine dans notre laboratoire et sont désormais très bien caractérisés et ont déjà fait l'objet de projet expérimentaux en 2014 et 2017. Ainsi pour chaque modèle, nous connaissons très bien la cinétique d'apparition et d'évolution de la pathologie pour déterminer les âges adéquats et pouvoir traiter nos souris en préventif (4 mois) ou en curatif (12mois). Pour évaluer au mieux le phénotype de type apathique des souris, nous utilisons des cages métaboliques munies d'une roue ce qui nous permet de mesurer leur activité dans la roue et ainsi d'évaluer au mieux le phénotype apathique. Pour atténuer au maximum le stress causé par le test de memoire pour lequel les souris sont contraintes de nager dans l'eau, une phase d’habituation sera réalisée avant le début du test. La température de l'eau utilisée permet un bon équilibre entre motivation et bien-être de l'animal et dès la sortie de l'eau, les souris seront séchées sur un papier absorbant et la cage placée sur un tapis chauffant. Pour limiter le stress, les souris sont hébergées dans des cages comportant une maisonnette ainsi que de la ouate favorisant la nidification. Pour définir le plus objectivement possible le bien être des souris et assurer au mieux leur survaillance tout au long de chaque procédure, nous utiliserons une grille de scores et nous nous référons aux points limites établis préalablement.

Choix des espèces

Pour déterminer in vivo si ces molécules sont bénéfiques dans le traitement contre la maladie d'Alzheimer au niveau comportemental, et pour étudier in vivo les mécanismes moléculaires impliqués dans l'effet bénéfique des molécules, nous sommes contraints d'utiliser des modèles de souris mimant la maladie et présentant des déficits cognitifs. Les données scientifiques générés dans ce projet seront cruciales pour une application thérapeutique future à un stade précoce de la maladie étant donné que le C99 intervient de manière beaucoup plus précoce que l'Ab dans la pathologie. En tenant compte de nos résulats antérieurs, nous avons choisi de tester l'effet des molécules à 2 âges : un âge précoce (2mois) pour voir si les molécules sont capables de retarder le comportement de type apathique; et un âge plus tardif (12mois) pour voir si les molécules sont capables de restaurer les déficits cognitifs et le retard d'apprentissage spatial présent à cet âge.

Injectées dans la veine de la queue, des cellules tumorales forment des tumeurs dans plusieurs organes chez 120 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit ensuite entre deux et cinq injections intrapéritonéales de cytokines et d'inhibiteurs, et jusqu'à trois tests d'agrippement consécutifs. L'objet déclaré est de comprendre comment les cytokines activent les cellules Natural Killer et ce qui régule cette activation, les retombées en santé humaine étant renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur écrit que le modèle est bien caractérisé, ce qui lui permet de limiter la souffrance des animaux, puis dans la phrase suivante que les tumeurs formées dans plusieurs organes sont source de souffrance pour l'animal.

Objectifs

Les cellules Natural Killer sont des cellules immunitaires spécialisées dans la lutte anti-tumorales. Elles peuvent être activées par des protéines appelées cytokines. L'objectif de ce projet est de mieux définir ce que permet l'activation par les cytokines lors d'une réponse antitumorale et de comprendre ce qui la régule. Dans un premier temps, nous étudierons l'effet d'un traitement cytokinique sur les cellules Natural Killer de différents organes. Dans un deuxième temps, nous étudierons l'impact de ce traitement sur la réponse antitumorale dépendante des cellules Natural Killer. Enfin, nous inhiberons un processus que nous supposons impliqué dans l’activation des cellules NK par les cytokines et nous mesurerons l'impact de cette inhibition sur la réponse antitumorale des cellules Natural Killer.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux définir la régulation de l’activité anti-tumorale des cellules Natural Killer. Etant donné le rôle de ces cellules dans la réponse anti-tumorale, ces résultats pourraient à terme conduire à des développements en santé humaine.

Procédures

Les animaux seront greffés avec les cellules tumorales par injection intraveineuse dans la veine de la queue (1 injection par souris, 1 minute). Elles recevront aussi les cytokines et les inhibiteurs de la voie que nous étudions par injection intrapéritonéale (entre 2 et 5 injections par souris, moins de 10 secondes par injection). Des tests d'aggripement (jusqu'à 3 tests consécutifs) seront effectués.

Impact sur les animaux

Le modèle est bien caractérisé, ce qui nous permet de limiter la souffrance des animaux. Lors d'une injection intraveineuse, les cellules injectées forment des tumeurs dans plusieurs organes, ce qui est source de souffrance pour l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Des expériences préliminaires sur des cellules Natural Killer en culture activées à l'aide des cytokines étudiées ont été effectuées. Elles ont mis en évidence une forte augmentation des fonctions antitumorales des cellules Natural Killer et une implication claire d'une voie de signalisation cellulaire dans ce processus. Ces modèles expérimentaux sont cependant limités, ne reproduisant qu’imparfaitement les conditions rencontrées in vivo, notamment la nécessaire migration au sein des organes infiltrés par la tumeur. Il est donc maintenant nécessaire de mettre en place un modèle animal.

Réduction

Des approches statistiques ont été choisies de façon a reduire le nombre d'animaux a minima pour avoir des résultats significatifs robustes. L'utilisation des animaux est optimisée par la réalisation d'analyses multiples sur différents organes d'un même animal. Lorsque cela est possible, la comparaison au sein d’une seule expérience des différentes conditions testées permettra de réduire 1) le nombre de souris utilisées et 2) la variation expérimentale inhérente à la réalisation d’expériences indépendantes. Enfin, les procédures se feront séquentiellement, le résultats des premières déterminant la conduite des suivantes.

Raffinement

Le modèle tumoral et les molécules utilisées sont bien definis et maitrisés par les expérimentateurs. Les animaux sont maintenus en groupes sociaux. Les animaux seront surveillés individuellement et quotidiennement afin de vérifier leur bon état général sur des critères de signes cliniques, d’aspect et de comportement. Des points limites sont bien définis pour éviter toute souffrance animale. Afin de faciliter l’accès à la nourriture et l’eau, des croquettes humidifiées seront déposés sur le sol de la cage aux stades terminaux de la pousse tumorale.

Choix des espèces

Les cellules Natural Killer ne sont présentes que chez les mammifères. Parmi ceux-ci, la souris est un modèle de choix. D'une part, et bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. D'autre part, la richesse des réactifs disponibles permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant dans notre projet. Des souris âgées de 8 à 28 semaines seront utilisées. En effet, c'est à partir de l'âge de 8 semaine que les souris ont un système immunitaire mature. D'autre part, la réponse anti-tumorale ne varie pas sur la tranche d'âge considérée. Nous serons de cette façon plus flexibles lors des commandes ou s'il est nécessaire de décaler le début d'une expérience, évitant ainsi la mise à mort d'animaux inutiles.

Deux heures d'anesthésie par mini-porc pour l'implantation, puis un suivi par IRM à un, trois, six et neuf mois et à un an : 840 souris, 750 rats et 84 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des matrices en polymères et des hydrogels leur sont implantés sous la peau ou dans une chambre d'ingénierie tissulaire, avec un prélèvement sanguin pendant la chirurgie, pour mettre au point une reconstruction du sein et de l'hypoderme destinée à remplacer implants en silicone et transferts de graisse. Le porteur annonce des risques de rejet, d'inflammation locale et de toxicité, et prévoit l'explantation ou la mise à mort selon la gravité de l'état de l'animal. Le choix des espèces tient à la ressemblance de leur peau avec la peau humaine et à leur taille, qui permet de tester plusieurs conditions sur un même individu.

Objectifs

Actuellement, les solutions cliniques pour la reconstruction des couches profondes de la peau et du sein à l'aide de tissu adipeux présentent des limitations significatives. Les procédures de transfert de graisse autologue peuvent entraîner des complications au site donneur et ne garantissent pas des résultats prévisibles. L'introduction de corps étrangers comme les implants mammaires en silicone comporte des risques potentiels pour la santé et nécessite une surveillance à long terme. Les approches de reconstruction cutanée après une atteinte profonde se concentrent sur l'utilisation de greffes de peau, négligeant l'hypoderme et limitant ainsi la reconstruction complète. Ce projet vise à développer une approche novatrice et biocompatible pour la régénération du tissu adipeux. Cette solution repose sur l'utilisation synergique d’une matrice en polymères et d'hydrogels cellularisés, offrant ainsi une alternative esthétique et fonctionnelle prometteuse pour les patient(e)s. Le premier objectif est d'évaluer la biocompatibilité des hydrogels utilisés dans cette approche. Il est essentiel de s'assurer que ces matériaux ne provoquent pas de réactions indésirables et qu'ils favorisent la régénération du tissu adipeux. Utilisant un modèle animal, nous chercherons à comprendre les interactions complexes entre les adipocytes, l'hydrogel, la matrice polymère, et l'organisme hôte. Cette étape est cruciale pour optimiser la compatibilité et l'intégration des matériaux dans le corps. Nous évaluerons également la possibilité d'utiliser des cellules souches humaines dans la combinaison hydrogel/matrice, en utilisant un modèle de souris immunodéprimées. Cette approche permettra de simuler au mieux les conditions humaines et d'évaluer l'efficacité de la régénération tissulaire. Afin d’étudier l’influence des matériaux sur un modèle de rongeur qui permet de tester des matériaux de taille moyenne, le rat sera employé pour une première comparaison des différentes combinaisons. Une fois la meilleure combinaison hydrogel/matrice sélectionnée, nous réaliserons des tests sur le porc, un modèle animal plus proche de l'homme en termes de physiologie et de composition cutanée. Cette étape sera cruciale pour valider l'efficacité clinique. Ce projet est porteur d'un potentiel majeur pour l'innovation en chirurgie plastique et reconstructrice, et il pourrait révolutionner les pratiques à l'échelle mondiale.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche vise à déterminer les combinaisons optimales d'hydrogels et de matrices pour la régénération du tissu adipeux, avec des implications majeures à la fois sur le plan clinique et scientifique. Il offre la possibilité d'améliorer considérablement les options de reconstruction mammaire et cutanée actuellement disponibles, en limitant les inconvénients des méthodes traditionnelles et en garantissant une meilleure biocompatibilité et performance.

Procédures

Ce projet se déroule en plusieurs étapes. Après une période d'acclimatation d'au moins une semaine, tous les animaux (840 souris, 750 rats et 84 mini-porcs) seront anesthésiés par inhalation (15 minutes pour les rongeurs et 1 heure pour les mini-porcs). Pour les rats, le pelage sera tondu dans les zones d'implantation (10 secondes). Pour tous les animaux, les zones d'implantation seront désinfectées à l'aide d'un désinfectant (10 secondes). Pour la procédure ayant pour but d'évaluer la biocompatibilité des hydrogels, une injection en sous-cutanée sera effectuée (10 min, 130 souris et 130 rats). Pour obtenir un tissu adipeux vascularisé reconstruit, une combinaison de chambres d'ingénierie tissulaire (pour la reconstruction du sein, 250 souris, 250 rats, 80 porcs) ou de matrices 3D (pour la reconstruction de l'hypoderme, 250 souris, 250 rats, 24 porcs) sera associée à des hydrogels cellules ou à de la graisse (durée totale de l'anesthésie : 30 minutes par rongeur ou 2 heures par mini-porc). Pendant la chirurgie, un prélèvement sanguin sera effectué. Afin d’avoir un applicatif clinique, il est nécessaire d’évaluer si la cryopréservation des construits permet d’obtenir la même performance que des construits préparés extemporanément, de ce fait 150 souris et 130 rats seront implantées avec des construits ayant bénéficié de différentes méthodes de cryopréservation. Toutefois, la procédure appliquée à ces animaux est identique à celles expliquées précédemment. Pour les souris et les rats, un essai de survie cellulaire in vivo sera suivi longitudinalement par bioluminescence. À cette fin, les animaux seront placés sous anesthésie gazeuse (10 minutes). Pour les rats et les porcs (utilisant une chambre d'ingénierie tissulaire pour la reconstruction du sein), le suivi longitudinal de la croissance du lambeau sera effectué par IRM à 1, 3, 6, 9 mois et 1 an après l'implantation. Pour cela, les animaux seront sous anesthésie gazeuse (durée de la procédure : 30 minutes par animal).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pouvant être constatés sont une irritation ou une inflammation locale à proximité du matériau, des risques de rejet ou de toxicité locale et systémique. Afin de limiter les risques, de nombreuses expériences in vitro ont été effectuées, ne montrant pas de signe de toxicité. De plus, des mesures sont mises en place et les animaux feront l’objet d’une vigilance quotidienne et rigoureuse pour détecter tout signe de souffrance ou d’approchement de point limite. Un contrôle du site opératoire sera réalisé lors de chaque visite quotidienne. La prise pondérale sera évaluée deux fois par semaine. Un traitement antidouleur sera administré, et si nécessaire, des mesures telles que l'explantation ou la mise à mort de l'animal seront envisagées en fonction de la gravité de son état.

Devenir

Du fait de notre protocole, nos animaux ne peuvent pas être replacés. Il est nécessaire de mettre à mort nos animaux pour réaliser nos prélèvements histologiques.

Remplacement

Nous avons employé une variété de techniques in vitro pour évaluer l'impact de nos polymères sur le destin des cellules, y compris leur survie et leur différenciation ainsi que sur l'angiogenèse en utilisant la membrane chorioallantoïque de poulet comme modèle. Toutefois, afin de déterminer pleinement les performances de nos biomatériaux en matière de régénération tissulaire, il est impératif de procéder à des essais in vivo. Ces expériences permettront de prendre en compte la complexité d'un système physiologique réel, incluant notamment les réponses inflammatoires, la formation de tissu cicatriciel, et les processus naturels de guérison. Les études in vivo nous fourniront ainsi des données cruciales pour optimiser notre technique avant de franchir l'étape des études cliniques.

Réduction

Une étude pilote sera réalisée dans un premier temps afin de vérifier que les conditions expérimentales choisies sont adéquates. Les études in vitro précédemment réalisées ont démontré l’efficacité des différents polymères résorbables quant à leur influence sur la survie et la prolifération cellulaire ainsi que sur la différenciation adipocytaire. Elles ont permis une sélection des polymères permettant le maintien des adipocytes et favorisant la néovascularisation. Elles ont également pu donner une idée du temps de résorption des polymères dans un liquide physiologique reconstitué à 37°C. Les expériences seront réalisées de manière séquentielle, ce qui permettra de limiter le nombre de répétition en fonction des résultats des groupes précédents. En fonction des résultats, les tests statistiques adéquats seront utilisés pour analyser les résultats.

Raffinement

Afin de limiter au minimum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 5 animaux par cage pour les souris et en hébergement unique pour les rats et les mini-pigs. Cet environnement est enrichi (balle pour le mini-pig par exemple) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés de 7 à 10 jours dans leur salle d’hébergement. Les animaux seront manipulés individuellement avant la mise en place de l’expérimentation et dans une pièce séparée des autres animaux afin réduire leurs stress et angoisse. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés avant toute procédure pouvant provoquer un stress, une angoisse ou une souffrance. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement, de manière à pouvoir détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou d’angoisse. En cas de souffrance (modification de l’apparence, prostration, poil hérissé, perte de poids…), un traitement analgésique sera envisagé. Des points limites adaptés pour chaque procédure seront définis avant l’expérimentation et dans le cas où ceux-ci seraient atteints ou que le traitement analgésique n’aurait pas d’effet, les animaux seront mis à mort selon la méthode définie (avec anesthésie au préalable). La mise à mort sera réalisée à distance des autres animaux.

Choix des espèces

Le porc et le rat sont des espèces appropriées pour étudier les processus de régénération de la peau car les structures anatomiques et physiologiques de leurs peaux sont celles qui ressemblent le plus à celle des humains. Le rat est un animal que nous avons fréquemment utilisé dans nos études précédentes et dont le modèle est maitrisé. De plus, notre équipe maîtrise maintenant la levée des lambeaux chez ces espèces pour nos modèles de régénération du sein. La taille du porc et du rat nous permet de tester plusieurs conditions sur un seul animal et ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Notre intérêt s’est porté sur les souris standards, immunodéprimées utilisées dans une étude de reconstruction de la peau humaine et humanisées qui permettent d’évaluer le comportement de cellules/tissus humains en présence de nos biomatériaux. Les souris sont âgées de 8 semaines et pesant 20 à 23 grammes afin que les souris aient atteint leur maturité sexuelle. Utiliser des souris matures permet d'avoir une taille adéquate pour réaliser l'implantation. Les rats adultes sont agêes de 15 semaines minimum afin d'avoir une réserve de graisse sous-cutanée suffisante pour réaliser les implantations et permettre de tester plusieurs conditions expérimentales sur un même animal. Pour les porcs, nous utiliserons deux types d'animaux : des porcs 45 à 55kg pour la reconstruction de la peau afin d’éviter d’avoir un hypoderme trop épais (car la zone à reconstruire serait trop importante et peu représentative d’un hypoderme humain) et des porcs de 70 kg pour la reconstruction du sein afin que la taille de l’animal soit compatible avec l’implantation de chambre équivalente à celle que l’on pourrait implanter chez l’humain.