Procédures légères

Les souriceaux nouveau-nés sont endormis par le froid, dans un gant posé au contact indirect de la glace, puis tués. Sur les femelles gestantes, une ouverture de l'abdomen de 45 minutes sous anesthésie permet d'introduire du matériel génétique dans les embryons. 2 396 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance léger pour 1 344 d'entre elles et modéré pour 1 052, alors que le porteur affirme que les points limites sont respectés "de manière à éviter toute souffrance des animaux" et annonce dans le même document que certaines lignées présenteront peut-être une difficulté à se nourrir ou une absence de poche de lait dès la naissance. Toutes sont tuées, les surnuméraires nées avec le mauvais génotype, les femelles ayant porté les embryons manipulés, les souris dont le cerveau est prélevé pour analyse, et les mâles isolés pour les accouplements contrôlés qui ne peuvent plus réintégrer un groupe.

Objectifs

Le syndrome des mouvements miroirs congénitaux (MMC) induit chez le sujet un mouvement incontrôlé d'une main qui mime le mouvement volontaire réalisé par la main opposée. Les personnes présentant des mouvements miroirs ne sont pas capables d'effectuer des tâches motrices unimanuelles pures, comme écrire et ont des difficultés pour les tâches bimanuelles nécessitant un contrôle indépendant des deux mains, comme ouvrir un pot de confiture. Il s'agit d'une maladie génétique rare dans laquelle les mouvements miroirs sont la seule manifestation clinique. Trois gènes sont connus à ce jour pour être impliqués dans cette maladie mais leur rôle n'est pas clairement identifié. L’objectif de ce projet sera d'identifier le mécanisme par lequel ils influent sur l'apparition de cette pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra des avancées importantes dans la compréhension des mécanismes de mise en place des axones des neurones impliqués dans le contrôle des mouvements volontaires et des fonctions dans le système nerveux central d’une protéine impliquée dans la réparation de l’ADN (constitutant principal des chromosomes). A plus long terme et au-delà des connaissances fondamentales sur le développement du système permettant la réalisation des mouvements volontaires, nous espérons clarifier la pathogenèse des Mouvements en Miroir Congénitaux (MMC) et proposer de nouvelles hypothèses de travail pour la recherche clinique dans le champ des maladies du mouvement. En effet, l'étude de modèles animaux et cellulaires reproduisant les défauts génétiques impliqués dans les MMC clarifiera la pathogenèse de ce trouble. Cela est important car il n'existe actuellement aucun traitement, et certains patients ont une incapacité significative dans les activités de la vie quotidienne, des douleurs aux membres supérieurs, une inhibition psychosociale et une perte d'estime de soi en raison de la maladie. Enfin, l’étude des mutations Mouvements Mirroirs de la protéine connue pour son rôle dans la réparation de l’ADN pourrait également intéresser le domaine de la réparation de l'ADN et du cancer.

Procédures

Un prélèvement de l’extrémité de la queue sera réalisé sur animaux vigiles entre leur 7ème et leur 10ème jour de vie postnatale pour l'identification génétique. Ce geste sera réalisé une seule fois et n’excèdera pas 2 minutes par animal. Une chirurgie au niveau abdominale de femelles gestantes, suivie de l'introduction de matériel génétiques dans les embryons sera réalisée une seule fois. Cette procédure chirurgicale s'effectue sous analgésie et anesthésie gazeuse générale et n'exède pas 45 minutes. Les nouveau-nés recevront un antalgique avant d’être profondément endormis par hypothermie dans la glace (contact indirect) puis euthanasiés. Certains mâles seront isolés entre deux accouplements. Les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.

Impact sur les animaux

Lors de la génération des animaux expérimentaux, l’isolement des mâles pour la réalisation des accouplements contrôlés pourra générer un stress. Le prélèvement de l’extrémité de la queue, pour connaitre le patrimoine génétique des animaux, peut générer une légère et brève douleur. L’anesthésie par le froid chez les jeunes même sous analgésie pourra générer un stress. Les procédures de chirurgie peuvent provoquer une hypothermie pendant l'anesthésie et une douleur pendant 24/48h. Certains animaux des nouvelles lignées présenteront peut-être un phénotype dommageable soit à la naissance (difficulté à se nourrir, absence de poche de lait), soit concernant leur locomotion.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet soit parce que ce sont : i) des animaux surnuméraires (génération de mauvais génotypes pour avoir les animaux avec les génotypes d’intérêt pour notre étude), des femelles ayant généré des animaux expérimentaux (E16 ou animaux électroporés), iii) des animaux expérimentaux pour l’analyse de leur cerveau, ou enfin des mâles qui ont été isolés et ne peuvent donc plus réintégrer un groupe de mâles.

Remplacement

Les neurones impliqués dans ce syndrome et qui contrôlent les mouvements volontaires ont leur corps cellulaire dans le cortex et leur axone va jusque dans la moelle épinière. Pendant le développement, ces axones traversent de nombreuses régions du cerveau. Il n’est pas possible d’étudier un faisceau qui traverse d’aussi nombreuses régions dans des modèles de culture cellulaire. Une fois les acteurs déterminés, nous étudierons les mécanismes moléculaires à l’aide de modèles de cultures cellulaires pour limiter le nombre d’animaux utilisés.

Réduction

Le projet impliquera un total de 2396 animaux. Des expériences préliminaires ont permis d’estimer à 10 le nombre d’animaux par génotype (calcul de puissance) pour obtenir des résultats statistiquement concluants. La composition des groupes d'animaux a été optimisée en restreignant leur effectif tout en garantissant l'obtention de résultats statistiquement concluants. Par exemple dès que nous aurons obtenus le nombre de 10 petits par génotype et par âge dans une condition, nous n’effectuerons plus de nouveaux accouplements contrôlés. Pour réduire le nombre d’animaux dont l’expression des gènes d’intérêt aura été modifié, nous utiliserons la technique d’électroporation (au lieu de générer de nouveaux modèles murins).

Raffinement

Les animaux sont sous la supervision de zootechniciens soigneurs et du vétérinaire désigné. L’hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010/63/UE. Dans le cas des mâles isolés pour les accouplements contrôlés, des bâtonnets à ronger seront ajoutés à l'enrichissement déjà présent. Les souris seront observées quotidiennement. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Les portées des 5 nouvelles lignées seront surveillées plus spécifiquement dans les premiers jours postnataux (présence de lait dans l’estomac) et au moment de la mise en place de la locomotion (P12-P15) pour détecter un éventuel phénotype dommageable. Les petits présentant des signes cliniques seront systématiquement euthanasiés. Les 2 manipulations pour l’identification et le prélèvement de l’extrémité de la queue des animaux sont réalisées au même moment pour limiter le nombre de manipulation. Concernant la procédure chirugicale, les femelles ne sont séparées que le temps de la procédure et de la récupération post-opératoire. Pendant la chirurgie, l’animal est sous anesthésie générale et placé sous un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. L’animal reçoit une injection d’un analgésique et d’un anesthésique local pour prévenir la douleur pendant et après la chirurgie. Pendant l’opération, les yeux sont protégés par un gel ophtalmique. Les animaux sont placés dans une cage de réveil posée sur un tapis chauffant. Lorsque l’animal a récupéré, il réintégre sa cage d’origine. Son comportement est surveillé. Il reçoit une nouvelle dose d'analgésique 6 à 8h après son réveil. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience, notamment le jour de la mise bas afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation. Les nouveaux nés seront surveillés. En cas de rejet par la mère, ils seront euthanasiés. Les souriceaux endormis par le froid ne seront pas en contact direct avec la glace, ils seront dans un gant et recevront au préalable une injection d’analgésique.

Choix des espèces

Les souris sont des rongeurs, et comme les écureuils, elles utilisent leurs deux pattes avant pour effectuer des tâches complexes, comme manipuler de la nourriture. Les neurones qui contrôlent les mouvements volontaires fins chez les souris sont similaires à ceux que nous avons chez les humains. L’étude de ces neurones chez la souris représente un bon modèle pour mieux comprendre le syndrome des mouvements en miroir. Chez les souris, nous pouvons créer des modèles génétiques spéciaux qui nous permettent de comprendre comment certains gènes influencent certaines parties de leur cerveau. Ces modèles sont utiles car ils nous aident à éviter des mutations génétiques trop graves, tout en nous permettant d'analyser précisément comment un gène particulier fonctionne dans une région spécifique du cerveau. Dans cette étude, nous réaliserons des expériences d'injection chez l'embryon, au moment où les neurones qui contrôlent les mouvements volontaires fins sont produits dans le cerveau. En parallèle, des souris femelles ou mâles seront étudiées à 3 stades. Pendant la période embryonnaire, moment où les premiers axones du faisceau que nous étudions traversent des régions importantes du cerveau pour leur développement. Juste après la naissance l’âge où ces premiers axones traversent la ligne médiane et arrivent dans la moelle épinière. A l’âge adulte entre 3-4 mois. Les animaux reproducteurs auront entre 3 et 12 mois (maximum).

Trop faibles pour atteindre la nourriture placée en hauteur dans leur cage, les souris mâles privées de myotubularine développent une faiblesse musculaire généralisée qui gêne leurs déplacements. 850 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 798 d'entre elles et modéré pour 52. Elles subissent l'ablation d'un bout de queue pour génotypage, deux à six prélèvements de sang sous anesthésie, puis une perfusion intracardiaque qui les tue en moins d'une minute, pour chercher des anomalies du foie que les patients atteints de myopathie myotubulaire présentent dans 91 % des cas. Deux lignées sont utilisées, l'une privée de la protéine dans tout le corps et dont l'espérance de vie ne dépasse pas six à huit semaines, l'autre seulement dans le foie, retenue parce qu'elle vit assez longtemps pour laisser à l'atteinte hépatique le temps de se développer.

Objectifs

La myopathie myotubulaire est une maladie congénitale liée au chromosome X, affectant les garçons et caractérisée par une faiblesse musculaire généralisée et une insuffisance respiratoire. Les patients meurent prématurément dans les premières années de vie, généralement suite à un arrêt respiratoire. Cette myopathie est due à des mutations dans un gène exprimant une protéine, la myotubularine qui est présente dans l’ensemble du corps humain. Des maladies du foie et des voies biliaires ont notamment été reportées pour 91% des patients. Un modèle murin de la myopathie myotubulaire a été créé avec une absence d’expression de la protéine dans l’ensemble des tissus. De prime abord, il ne montre pas de signe apparent d’une dysfonction au niveau de la structure du foie. Cependant, des analyses plus approfondies doivent être réalisées pour détecter certaines anomalies du foie. De plus, l’espérance de vie de ces souris ne dépassant pas 6 à 8 semaines, à cause de leur insuffisance respiratoire, il est possible que la pathologie hépatique ne se soit pas suffisamment développée pour être détectable au niveau structurel. Nous disposons d’un autre modèle murin n’exprimant pas la myotubularine spécifiquement dans le foie qui nous permettra de caractériser la fonction hépatique sur une période plus longue, à différents âges, puisque l’espérance de vie de ces animaux ne sera pas affectée. Dans ce projet, nous souhaitons donc étudier les problèmes qui peuvent survenir dans le foie sur les deux modèles de souris et ce, par des analyses d’enzymes hépatiques, des analyses de la structure du foie et des analyses biologiques.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’identifier et de caractériser des atteintes hépatiques dans un modèle existant de la myopathie myotubulaire ou dans un nouveau modèle spécifique pour mieux comprendre la pathologie hépatique observée chez les patients. Cela permettrait également d’identifier de nouveaux candidats thérapeutiques pour lesquels nous pourrions à l’avenir vérifier leur efficacité chez la souris, pour à terme apporter une solution thérapeutique adaptée aux patients.

Procédures

Prélèvements de sang sur animaux vivants anesthésiés : environ 5 min par souris, 2 à 6 fois en fonction de l’âge à l’euthanasie. Injection intrapéritonéale d’anesthésiques et injection sous-cutanée d’analgésique pour certains groupes avant perfusion intracardiaque : moins de 1min, 1 fois pour ces deux types d’injection. Perfusion intracardiaque pour fixation des tissus : moins d’une minute avant la mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un prélèvement d’un bout de queue associé au tatouage, pour identification et génotypage. Les nuisances que le modèle n’exprimant pas la myotubularine dans l’ensemble des tissus peut rencontrer sont liées à l’absence de la protéine dans les muscles squelettiques. Les mâles développeront une faiblesse musculaire généralisée, ce qui rendra difficile leur déplacement et l’accès à la nourriture située dans la partie supérieure des cages. Les injections intra-péritonéales, sous-cutanées ou les prélèvements sanguins provoquent une douleur légère liée à la piqûre.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir prélever le foie qui nous permettra de caractériser son état, sa fonction, sa structure, et des altérations biomoléculaires. Tous les animaux reproducteurs servant au maintien des lignées seront euthanasiés lorsque la reproduction ne sera plus efficace.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est indispensable pour caractériser l’atteinte hépatique observée chez les patients tels que les défauts de localisation de certaines molécules dans les différents compartiments du foie (canal biliaire par exemple), les défauts de structure de ces compartiments, ou encore les défauts de composition de la bile. Les organoïdes de foie que l’on pourrait développer ne possèdent pas à ce jour toutes les caractéristiques du foie : ils ne possèdent pas les structures anatomiques spécifiques comme les canaux biliaires, et par conséquent également il n’y a pas de flux biliaire. Les modèles animaux sont donc nécessaires pour cette étude.

Réduction

Le nombre minimal d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été défini à l’aide de calculs statistiques pour pouvoir observer des différences entre les animaux sains et mutés ou pour maintenir les lignées le long du projet. Pour la caractérisation des souris porteuses de la mutation uniquement dans le foie, trois âges d’euthanasie sont définis : 3 mois, 6 mois et 12 mois. Si dès 3 mois, l’atteinte hépatique s’est développée, nous étudierons l’évolution jusqu’à 6 mois.Les animaux à 12 mois ne seront peut-être pas utilisés si l’atteinte hépatique s’est développée à 3 et 6 mois.

Raffinement

Afin de raffiner nos études, les animaux seront hébergés tout au long de l’étude dans des cages enrichies à l’aide de coton et de bâtons à ronger dans un environnement exempt d’organismes pathogènes. En cours de protocole, pour prévenir la douleur provoquée par le prélèvement sanguin par voie rétro-orbitale ou mandibulaire, les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse. Concernant les souris porteuses de la mutation dans l’ensemble des tissus, des observations attentives et des mesures de poids seront effectuées 3 fois par semaine, en plus de l’observation quotidienne des animaux. Un aliment hydratant et nourrissant sera de plus placé au sol dans la cage pour faciliter l’accès aux souris malades. Afin de réduire la souffrance et le stress de ces animaux, des points limites ont été établis.

Choix des espèces

Les souris porteuses de mutation dans le gène exprimant la myotubularine ont été choisies comme animaux modèles car ces animaux ont pu être modifiés génétiquement afin de présenter la délétion du gène responsable de la myopathie myotubulaire, de façon ubiquitaire ou spécifiquement dans le foie, ce qui en font les plus petits modèles animaux à caractériser pour la fonction hépatique. Les mâles n’exprimant pas la protéine dans l’ensemble des tissus ainsi que les animaux contrôles seront utilisés après sevrage, à l’âge de 3 semaines et seront euthanasiés à l’âge de 6 semaines. A ce stade, la pathologie s’est suffisamment développée pour permettre la caractérisation d’une éventuelle atteinte hépatique. Les animaux qui n’expriment pas la protéine dans le foie et les animaux contrôles, seront utilisés à partir de 2 mois et jusqu’à 3, 6 ou 12 mois pour observer une évolution des enzymes hépatiques dans le sang et laisser le temps aux souris de développer une atteinte hépatique que l’on caractérisera à partir de prélèvements post-mortem. Les animaux à 12 mois ne seront peut-être pas utilisés dans l’étude si l’atteinte hépatique s’est développée à 3 et 6 mois.

5 500 souris vont être utilisées, chacune recevant de trois à plus de quinze injections, et 5 280 d'entre elles portant une tumeur greffée sous anesthésie. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré pour 4 300 animaux, avec perte de poids, dos voûté, réactions allergiques pouvant aller jusqu'à la léthargie, et pour les survivantes suivies au-delà de quatre mois une anémie liée à l'atteinte des reins par la molécule radioactive. Toutes sont tuées, 3 350 lors d'une prise de sang terminale sous anesthésie. Le porteur commande 10 à 20 % de souris en plus pour couvrir les pertes, et indique que les animaux écartés des études sont le plus souvent utilisés pour entraîner le personnel.

Objectifs

Dans ce projet de radioimmunothérapie préciblée (PRIT), deux anticorps modifiés dirigés contre les cellules tumorales sont utilisés pour les pré-cibler et servent donc de vecteurs de ciblage. Une petite molécule chélatrice, contenant un radionucléide émettant des particules alpha, est ensuite utilisée comme vecteur de destruction des cellules cancéreuses. Cette approche en deux temps, plus spécifique que la radioimmunothérapie classique, évite d’irradier et ainsi d’endommager les cellules saines, tout en gardant un fort pouvoir de destruction des cellules cancéreuses. L'objectif principal du projet est d'évaluer la tolérabilité, la biodistribution et l’efficacité thérapeutique de ce traitement de radioimmunothérapie pré-ciblé dans différents modèles tumoraux et murins. Cet objectif n’est envisageable qu’après une phase d’optimisation des paramètres du traitement, comme par exemple l’évaluation de la dose injectée d’anticorps, de l’activité injectée de la molécule radioactive ou du temps d’attente entre les deux injections. Deux objectifs secondaires sont également visés lors de ce projet, le premier est de trouver d’éventuels partenaires thérapeutiques afin d’améliorer l’efficacité de ce traitement. Le second consiste à évaluer le potentiel thérapeutique du PRIT sur d’autres cibles thérapeutiques surexprimées à la surface d’autres cellules tumorales afin d’élargir le nombre de patiients pouvant bénéficier de ce traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet consiste à développer un nouveau traitement de radioimmunothérapie pré-ciblé utilisant le 212Pb. L’objectif final est donc le passage de ce traitement en phase 1 d’un essai clinique en 2025. Concernant le projet de recherche appliquée, il vise différents objectifs à court et long terme. À court terme, la biodistribution des différents composés, l’efficacité thérapeutique et la tolérabilité de ce nouveau traitement sont à évaluer. Pour ce faire, différentes études utilisant des souris seront réalisées (incluant une première phase d’optimisation du schéma thérapeutique). Ensuite, l’étude des mécanismes d’action est également à réaliser pour permettre une meilleure compréhension des phénomènes mis en jeu (effet direct des rayonnements ionisants, activation du système immunitaire...). Ceci permettra le test de nouvelles opportunités de combinaison basées sur une analyse rationnelle des mécanismes d’action, afin de moduler les réponses au traitement pour augmenter son efficacité/tolérabilité. Enfin ce traitement de radioimmunothérapie pré-ciblé peut également être dirigé contre d’autres cibles thérapeutiques que celle choisie pour ce projet. Ainsi, une phase d’évaluation de nouvelles cibles thérapeutiques sera également réalisée afin d’élargir le nombre de patients pouvant bénéficier de ce traitement extrêmement prometteur. A long terme, toutes ces études ont pour objectif final d’appuyer les dossiers de demande d’essais cliniques.

Procédures

Les gestes techniques réalisés sur les souris sont : inoculation sous-cutanée de cellules tumorales, implantation de cellules tumorales par chirurgie ou injection intraveineuse ou intrapéritonéale, traitement par injection intrapéritonéale ou intraveineuse, gavage ou prise de sang. L‘inoculation des cellules tumorales est réalisée sous anesthésie générale. Cela concerne 5280 souris. Les 10% des animaux restant (soit 220 souris) subissent l’injection intraveineuse ou intrapéritonéale des cellules tumorales en vigile. N.B. Dans de très rare cas, des animaux ne sont pas greffées avec des cellules tumorales dans le but de simplement évaluer la tolérabilité d’un traitement. Un protocole d’analgésique, pour diminuer la gêne et la douleur des souris au maximum lors de l’implantation des cellules tumorales par chirurgie, est réalisé toutes les 12h en injection sous-cutanée pendant 48h et débutant entre 30 min et 3h avant l’intervention chirurgicale associée à une mise à disposition dans l’eau de boisson. Cela représente 540 souris. Les injections intraveineuses, intrapéritonéales ou par gavage en vigile sont réalisées sur 100% des souris. Les souris reçoivent en général entre 3 et 9 injections de traitement (ou de solutions véhicules pour les groupes non traités) pouvant aller jusqu’à plus de 15 injections si le nombre de cycles de traitement est augmenté. Les prises de sang sont réalisées sous anesthésie en terminal (sans réveil) sur 3350 souris. Des prélèvements de sang répétés peuvent également être réalisés, sous anesthésie générale (de 3 à 10 prélèvements espacés d’une semaine à plusieurs mois) en respectant les volumes prélevés et le temps de rétablissement recommandé. Cela concerne 1070 souris.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, nous sommes amenés à réaliser plusieurs injections aux souris (cellules, traitements…), ce qui entraine la nuisance aux souris la plus importante. De plus, des anesthésies peuvent également être réalisées, générant un stress chez l’animal. Un léger stress lié aux manipulations est également observable mais est fortement diminué grâce à l’habituation mise en place au préalable. Cette demande étant un renouvellement, nous avons un retour d’expérience important sur les nuisances générées après notre traitement. Ce traitement peut engendrer de façon très transitoire certains effets indésirables (perte de poids et fatigue passagère le plus souvent démontrée par le dos vouté, poil négligé, baisse d'activité). Ces effets secondaires sont légers à modérés et transitoires. Un complément alimentaire en gel est ajouté pendant les 7 jours suivant l’injection de la molécule radioactive pour une meilleure récupération. Ce complément est maintenu si les souris présentent une perte de poids supérieure à 10% de leur poids initial. Dans le cas d’un suivi à très long terme des souris guéries (> à 120 jours post traitement), certains symptômes peuvent apparaitre (ex : anémie ou surconsommation d'eau). Cela serait lié à une diminution des fonctions rénales due à la voie d’élimination de la molécule radioactive via les reins. L’injection répétée d’anticorps humains peut engendrer des réactions immunitaires (type réaction allergique) chez la souris si celle-ci est immunocompétente. La réaction peut-être plus au moins forte : démangeaison, vasodilatation, somnolence pouvant allez jusqu'à la léthargie, gonflement de la face, etc. Ces réactions ne sont que transitoires (entre 5 minutes à 2h). Une surveillance accrue des souris est faite jusqu’au rétablissement complet de la souris. La déplétion au préalable des lymphocytes B ou le choix d’un modèle murin humanisé, ou immunodéprimé lorsque cela est possible, permettent d'éviter ce type de réactions. Le choix des souris immunocompétentes est fait que lorsque l’objectif de l’étude est l’analyse des mécaniques d’action ou d’une combinaison mettant en jeu le système immunitaire mais n’est pas fait de manière systématique sur ce projet.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet sont euthanasiés à la fin des études. Ce choix est justifié car l’adoption est impossible. En effet, les souris sont transgéniques et/ou immunodéficientes. De plus, dans la majorité des cas, elles sont porteuses d’une tumeur et/ou ont été injectées avec notre traitement. Certaines souris sont exclues d’une étude au moment de la création des groupes (développement tumoral ou poids non conforme aux autres animaux, problème de comportement, etc.). Ces souris peuvent être utilisées pour le maintien des compétences du personnel ou pour l’analyse d’organes ex vivo pouvant servir pour des analyses futures.

Remplacement

Tous les tests de mise au point des anticorps ont été réalisés par des tests in vitro. De plus, chaque étude in vivo est murement réfléchie et une alternative in vitro est envisagée le cas échéant. Par exemple, des tests réguliers de vérification sont faits en amont des études pour garantir le bon fonctionnement des anticorps et de la non-contamination des cellules tumorales utilisées. Cependant, l’étude d’un organisme complexe avec l’organisation biologique mimant un patient est indispensable dans le développement d’un radiopharmaceutique. C’est pour cela que le modèle murin a été choisi. Malheureusement aucune méthode de substitution n’est connue à ce jour.

Réduction

Basé sur des analyses statistiques, la comparaison de deux moyennes observées nécessite 10 souris/groupe pour obtenir une puissance statistique de 0.8 associé à un α de 0.05 (paramètres utilisés : moyenne 1 = 1500 mm3, moyenne 2 = 800 mm3, écart-type = 600 mm3). De plus, notre retour d’expérience nous permet de savoir que 10 souris/groupe permet d’obtenir des résultats statistiquement analysables. Ainsi, pour mettre en place des nouveaux modèles tumoraux ou évaluer la croissance tumorale (en fonction des traitements), un minimum de n=10 souris est généralement utilisée. Pour évaluer la biodistribution in vivo de la molécule radiomarquée, les expériences sont conçues en utilisant un nombre compris entre 3 et 6 souris par groupe. Le choix est fait en fonction d’expériences antérieures dans des études similaires, des résultats attendus ainsi que de l’objectif final de l’étude afin d’utiliser le nombre juste de souris. Pour chaque expérimentation une analyse au préalable pour définir le nombre de souris par groupe est réalisée en fonction des résultats attendus et de la puissance statistique souhaitée. L’analyse statistique à posteriori des données est automatisée et est effectuée à l’aide des logiciels spécifiques. Pour pallier à tout problème de perte de souris avant ou pendant les études (ex : malocclusion, blessures, perte de poids…), ou aux problèmes d’hétérogénéité de prise de greffe, des souris supplémentaires sont incluses dans les commandes de souris. Ce nombre de souris supplémentaires est défini en fonction de l’objectif des études et du retour d’expérience sur la lignée tumorale utilisée et est généralement de 10% avec un maximum de 20% lors d’utilisation de lignées tumorales avec un faible taux de prise de greffe ou un geste technique plus risqué pour les souris (ex : chirurgie). Ceci dans le but d’empêcher de recommencer une étude non analysable par manque de souris, pour être en accord avec la règle des 3R. Les souris exclues des études sont utilisées le plus souvent pour le maintien des compétences du personnel réalisant les expérimentations in vivo. Cela permet de réduire le nombre d’animaux commandé pour la formation du personnel et permet d’utiliser l’ensemble des souris à des fins scientifiques. Les souris exclues peuvent également être utilisées pour des prélèvements d’organes qui seront eux-mêmes utilisés pour différents tests in vitro et/ou mis en banque histologique pour une utilisation ultérieure.

Raffinement

Un minimum de 5 jours d’acclimatation est réalisé. Les animaux sont habitués à la manipulation, à la pesée, etc. Le lapse de temps entre l’inoculation des cellules tumorales et l’obtention de tumeurs de tailles suffisantes avant le début des traitements est également utilisé pour continuer l’habituation. Nous mettons différents éléments, à disposition dans les cages, permettant aux souris d’exprimer des comportements spécifiques à leur espèce (coton, pièce de bois, tunnel, maisonnette). Ces enrichissements peuvent être amenés à évoluer dans une optique d’amélioration continue et en fonction des situations (conflit, souche de souris plus sensible au stress, etc.). Des enrichissements supplémentaires sont également utilisés afin d’améliorer leur bien-être (graine de tournesol ou encore mezzanine). Des gestes simples mais indispensables sont également réalisés afin d’optimiser le confort des souris et de réduire le stress tels que : l’utilisation d’un gel pour le confort des yeux lors des anesthésies, la diffusion de musique classique via une radio installée dans la salle d’hébergement pour masquer les bruits environnants, un filtre rouge placé sur la fenêtre de la porte cachant la vision des souris sur l’extérieur (va-et-vient du personnel devant la porte), la température corporelle des souris est maintenue (tapis et lampe chauffante). Lors des chirurgies, un analgésique est utilisé en pré et post opératoire pour supprimer la douleur. Une fiche de score pour le suivi de l’état physique et comportemental de chaque animal est utilisée quotidiennement. Cette fiche permet de ne pas aller au-delà de nos critères de terminaison prédéfinis au début de l’étude expérimentale.

Choix des espèces

L'utilisation de la souris est justifiée par le développement de la biologie moléculaire qui a abouti à la création de nombreux modèles murins génétiquement modifiés, et par l'existence de lignées immunodéficientes (SCID, Athymique nue, etc.) qui autorisent la greffe de cellules tumorales humaines. Le séquençage complet du génome de la souris a démontré la proximité phylogénétique des souris et des hommes : 90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Le remplacement dans le génome du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées et ainsi de travailler sur des modèles très proches de ce que l'on pourrait voir chez l'homme. Nous utilisons des souris adultes ou en fin de développement pour nos expérimentations afin que leur système immunitaire soit mature. De plus nous avons besoins qu'elles soient assez jeunes pour un suivi à long terme, c'est pourquoi les souris intégrées aux études ont généralement 8 semaines. Cependant, l’utilisation de souris transgéniques nous contraint parfois à utiliser des souris plus jeunes car le nombre limité de ces souris ne nous permet pas d’avoir un lot du même âge pour débuter l’étude. De plus, nous essayons de recevoir les animaux de 6 à 15 jours avant le début de leur utilisation dans un protocole expérimental afin de réaliser l’acclimatation et l'habituation des souris.

2 496 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 2 424 d'entre elles. Une toxine leur est injectée dans les muscles des deux pattes arrière sous anesthésie afin de détruire le tissu, précédée de cinq injections dans l'abdomen. Après la lésion, le porteur ajoute du paracétamol dans l'eau de boisson pendant quarante-huit heures, une mesure dont il dit lui-même avoir mesuré un "très léger bénéfice" sur l'activité volontaire des animaux. Il présente la culture cellulaire comme un préalable systématique, puis conclut que l'expérimentation reste "indispensable" pour replacer les mécanismes dans la physiologie du muscle entier.

Objectifs

Le muscle strié squelettique adulte régénère après un dommage grâce aux propriétés des cellules souches musculaires qui communiquent avec d'autres cellules comme les cellules de l'immunité, les fibroblastes et les cellules des vaisseaux. La coordination dans l'espace et dans le temps de ces interactions est essentielle pour une bonne régénération. Les mécanismes moléculaires contrôlant ces interactions sont encore mal connus. Le projet vise à étudier ces interactions cellulaires et moléculaires en induisant une lésion musculaire pour suivre la réparation du muscle chez la souris adulte.

Bénéfices attendus

Les bénéfices premiers du projet sont d'apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes de la régénération musculaire. Ces données seront utiles dans le futur pour comprendre les défaillances du processus de régénération dans des conditions physiologiques ou pathologiques particulières (vieillissement, myopathies, diabète, etc.)

Procédures

Les souris sont soumises à des injections intrapéritonéales (30 secondes) (5 fois) et à l’induction d’une lésion musculaire via une injection intramusculaire bilatérale de toxine (sous anesthésie) (procédure de 5 minutes) (1 fois)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues incluent: - un stress lors de la contention pour les injections intrapéritonéale - un stress lors du gavage - un stress lors du déplacement dans la boite d'anesthésie - Une diminution transitoire de l'activité spontanée après l'induction de la blessure musculaire

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement des organes

Remplacement

Le laboratoire a une longue expérience des essais in vitro par la culture cellulaire. Les questions scientifiques sont d'abord validées in vitro avant d'aborder l'expérimentation animale. Celle-ci est néanmoins indispensable pour d'une part observer les mécanismes cellulaires et moléculaires ex vivo et d'autre part les intégrer dans la physiologie du tissu musculaire dans l'organisme.

Réduction

- L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. - Les deux muscles des deux pattes arrière sont utilisées afin de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés - les tissus et cellules des animaux sont réutilisés grâce à un système de banking dans le laboratoire

Raffinement

Le raffinement inclut une procédure afin de définir la meilleure voie d'administration du tamoxifène tout en conservant l'efficacité permettant l'analyse génomique. Le raffinement à la suite de l'induction de la lésion bilatérale inclut l'addition de paracétamol dans l'eau de boisson pour 48h à la suite d'une étude que nous avons menée montrant un très léger bénéfice du paracétamol sur l'activité volontaire des animaux (roue d'activité). Une anesthésie générale est réalisée pour l’induction de la lésion musculaire.

Choix des espèces

La souris a un système musculaire et un processus de régénération musculaire proches de ceux de l'homme. Les animaux utilisés sont à l'âge adulte (8-12 semaines).

Capturées par pêche à l'électricité, endormies dans un bain d'anesthésique puis maintenues sur le dos dans une gouttière, 3 000 anguilles européennes sont mesurées et pesées avant d'être remises à l'eau. Cent autres, piégées au verveux, subissent une ouverture de la paroi musculaire sous anesthésie générale pour l'implantation d'un émetteur acoustique, suture comprise, en moins de cinq minutes. L'espèce est classée en danger critique d'extinction et le projet vise à cartographier les habitats estuariens qui lui restent favorables, ce qui n'empêche pas de prévoir la mise à mort par surdose d'anesthésique et décapitation des individus qui ne récupèrent pas. Toutes les anguilles marquées sont relâchées à l'endroit exact de leur capture.

Objectifs

Bien que les vallées estuariennes constituent des zones clés pour la croissance de l’anguille européenne (classée en danger critique d’extinction par l’IUCN), il existe peu de connaissances sur la manière dont les anguilles utilisent les estuaires et les habitats latéraux (mares, marais, chenaux…). Ce projet a pour objectif d’évaluer l’accessibilité, la disponibilité et la fonctionnalité des habitats latéraux dans un grand estuaire pour soutenir la croissance des anguilles. Pour cela, il est proposé de mettre en place deux actions complémentaires. L’action 1 a pour but de caractériser la disponibilité et la fonctionnalité des habitats latéraux à l’échelle d’un estuaire (150 km de linéaire de berge), à partir de l’élaboration de modèles de distribution spatialisés et de l’évaluation de l’état physiologique des anguilles. Le prélèvement d’individus permettra d’évaluer la qualité des habitats en termes de croissance, de charge parasitaire, de régime trophique, de contamination, ou encore de ratio male/femelle. L’action 2 a pour but de quantifier les échanges à fine échelle spatiale au sein des habitats latéraux et avec cours principal, en suivant les trajectoires d’anguilles équipées d’émetteurs acoustiques sur un marais latéral de l’estuaire. Cette approche permettra de suivre les déplacements des anguilles avec une résolution spatio-temporelle suffisamment fine pour appréhender l’impact des mesures de gestion hydraulique et répondre à des problématiques de gestion opérationnelle, notamment vis-à-vis des niveaux d’eau et de la connectivité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence les secteurs géographiques actuellement favorables à l’établissement de l’anguille, mais également de simuler des scénarios de reconnexion hydraulique pour identifier les secteurs présentant un fort potentiel de restauration. A l’échelle de la vallée estuarienne, ces informations pourront constituer un cadre méthodologique important pour guider la réflexion sur la restauration des habitats de cette espèce et contribuer activement au dispositif de définition des priorités de restauration. De plus, l’approche en télémétrie acoustique permettra d’affiner la compréhension de l’utilisation des habitats latéraux en lien avec les pratiques de gestion et d’apporter des éléments pour guider la gestion hydraulique des marais vers des pratiques favorables à l’anguille européenne.

Procédures

Pour l’action 1, les anguilles seront capturées par pêche à l’électricité sur les habitats latéraux, puis anesthésiées pour être placées dans une gouttière spéciale où le poisson est maintenu sur le dos afin de réaliser des mesures (taille, poids) et de décrire l’état sanitaire externe (présence de lésions, parasites…). Pour l’action 2, les anguilles seront marquées chirurgicalement sous anesthésie générale. La paroi musculaire de l’individu à marquer est ouverte. L'incision est ensuite suturée avec du fil résorbable. L'acte de chirurgie en lui-même dure moins de 5 minutes par individu.

Impact sur les animaux

Pour l’action 1, la capture, la rétention et la manipulation pour effectuer la biométrie des individus pourra occasionner du stress pour les poissons. L’anesthésie peut vraisemblablement créer des perturbations du comportement de certains individus. Pour l’action 2, les anguilles seront capturées à l’aide de verveux (Filet de pêche conique monté sur des cercles en acier). Ces engins sont des pièges et non des filets, et disposent d’un volume assez conséquent dans lequel les poissons sont piégés. De plus, ces pièges sont relevés 2 fois par jour afin de réduire le stress d’une captivité prolongée. Malgré les précautions prises, un problème lors de l’insertion chirurgicale est toujours à envisager. Mais l’expérience de l’équipe et la robustesse de l’espèces (anguilles) nous amène à être très confiant sur l’absence d’effets létaux ou délétères lors du marquage. Sur les marquages précédents, aucune mortalité à court terme n’a jamais été observée sur cette espèce. De plus, sur les anguilles, des tests d’effet à plusieurs semaines ont déjà été réalisés et n’ont jamais montrés aucune mortalité ni effet délétère. Le marquage chirurgical sera réalisé sous anesthésie générale à la benzocaine, qui, dans l’état actuel des connaissances et bonnes pratiques vétérinaires, semble agir aussi comme analgésique chez les poissons

Devenir

Pour l’action 1, les anguilles capturées seront gardées en vie et relâchées dans le milieu naturel, à l'endroit précis de leurs captures, après avoir réalisé des mesures biométriques (N = 3000 maximum). Pour l’action 2, le principe est de suivre les animaux dans leur milieu naturel. Tous les animaux marqués (N = 100) seront replacés dans leur milieu naturel, à l'endroit précis de leurs captures.

Remplacement

Cette étude vise à comprendre l’utilisation des habitats latéraux par l’anguille en milieu naturel, il n’est donc pas possible de remplacer les animaux dans cette étude. Il n‘existe aucune méthode substitutive satisfaisante actuellement, notamment en modélisation, car cette espèce reste très peu connue. Les processus étudiés ne peuvent pas être simulés en laboratoire, avec des organismes de substitutions tels que des invertébrés.

Réduction

Pour l’action 1, la biométrie des anguilles concernera l’ensemble des individus capturés, soit 1500 individus par campagne au maximum, au regard des connaissances antérieures sur les abondances dans ce secteur. L’objectif est de caractériser l’état de la population d’anguille, en conséquence tous les individus capturés seront anesthésiés afin d’être mesurés. Pour l’action 2, deux lots de 50 anguilles seront marqués lors de deux années consécutives. Cet effectif de 100 individus est nécessaire afin de retracer les mouvements des anguilles sur une longue période (12 à 24 mois) et de refléter la variabilité saisonnière de l’utilisation des habitats. En effet, il est nécessaire de prendre en compte des pertes d’individus marqués liés à l’émigration naturelle des anguilles entre l’estuaire et les marais latéraux. Le nombre d’individus suivi peut donc être fortement réduit au cours du temps. Sur la base de notre expérience acquise lors des précédentes études en télémétrie acoustique, nous estimons que le suivi d’une 50ene d’individus au minimum par année permettra d’avoir une idée précise et robuste de l’utilisation du marais.

Raffinement

Pour l’action 1, les inventaires par pêche à l’électricité seront réalisés par des opérateurs habilités avec un matériel de dernière génération permettant de contrôler finement la tension délivrée dans le milieu (LR24 Smith-Root), dans le but de limiter au maximum l’impact sur les individus. La tension de sortie sera ajustée à la conductivité de l'eau selon les préconisations du constructeur (réglage automatique de l’appareil) afin d’assurer une bonne capacité de pêche et de permettre une récupération optimale des individus. Les mesures biométriques (taille, poids, état sanitaire, …) seront réalisées sous anesthésie. Afin de limiter ce stress, le nombre de poissons dans le bain d’anesthésiant ne dépassera pas 5 individus de manière simultanée, voire moins dans le cas de gros individus afin de ne pas dépasser 5% du volume. Si les individus ne sont pas endormis après 10 minutes de balnéation, la solution d’anesthésiant est renouvelée afin de palier le phénomène de dilution et d’utilisation par les individus. La manipulation des individus se fera avec épuisettes et gants, sur des appareils de mesures humidifiés et sera limité au strict nécessaire du protocole (généralement moins d’une minute de manipulation). Après la biométrie, les individus seront mis dans un vivier de réveil contenant de l’eau de la rivière oxygénée jusqu’à dissipation totale des effets de l’anesthésiant, puis remis à l’eau à l’endroit exact de la capture. L’euthanasie si nécessaire des anguilles sera réalisée par immersion dans une solution sur-dosée d’anesthésique, suivi d’une décapitation, afin d’entraîner la mort cérébrale effective de ces individus. Pour l’action 2, la capture se fera avec les engins les plus adaptés pour limiter les blessures des espèces concernées, ainsi que leur stress. Les pièges seront relevés deux fois par jour afin de limiter le temps de captivité. La pose de marque télémétrique s’effectuera sous anesthésie générale en balnéation et avec les mesures hygiéniques nécessaires, avec entretien par flux continu et ajustement si nécessaire de matière à maintenir la stabilité de l’anesthésie tout au long de l’intervention. Les animaux seront placés en réveil dans un bac d’eau oxygénée jusqu’à récupération complète avant relâche dans le milieu naturel. Après marquage, chaque individu est gardé dans un bac de réveil jusqu’à dissipation totale des effets de l’anesthésiant, puis remis à l’eau à l’endroit exact de la capture.

Choix des espèces

L’anguille européenne est une espèce animale en état critique d’extinction. Toutes les mesures visant à améliorer sa conservation et alléger les pressions subies par cette espèce doivent donc être mises en place de manière rapide. L’objectif du projet est d’évaluer l’état de la population d’un grand estuaire et de mettre en évidence les secteurs favorables à l’espèce pour favoriser leur accessibilité. Les connaissances apportées par ce projet permettront d’aider les gestionnaires des espaces naturels vers des pratiques favorables à l’anguille sur l’estuaire étudié, et plus largement sur les marais littoraux à l’échelle de la zone de répartition de l’anguille.

Un patch vaccinal maintenu quarante-huit heures par un bandage sur le dos rasé et dépilé, un laser qui altère la couche superficielle de l'épiderme, trois prélèvements sanguins au niveau de l'œil : 472 souris subissent ces actes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 464 d'entre elles. Une partie reçoit en plus quatre applications de staphylocoque doré sur la peau, tous les deux jours, qui provoquent une réaction inflammatoire. Toutes sont tuées à l'issue, le prélèvement des organes lymphoïdes et de la peau ne laissant, selon le porteur, aucune autre issue envisageable. Le choix de la souris tient à ce qu'elle est l'espèce la plus utilisée en immunologie et à la disponibilité commerciale des outils techniques et des lignées génétiquement modifiées.

Objectifs

La bactérie Staphyloccocus aureus, appelée plus communément staphylocoque doré, est une bactérie commensale qui colonise de façon permanente environ 30% de la population générale. Les principaux sites de colonisation sont les narines, les aisselles ainsi que de nombreuses surfaces muqueuses et cutanées. Dans la majorité des cas, l’organisme n’a pas de préjudices à la présence de cette bactérie. Cependant, certaines souches de staphylocoque doré présentent un pouvoir pathogène et se trouvent à l’origine de diverses maladies. Les infections à staphylocoque doré sont les causes les plus fréquentes d’infections de la peau et des tissus mous, avec une incidence de 70 à 80% des cas répertoriés. Les infections persistentes à staphylocoque doré sont également une cause très fréquente d’infections nosocomiales du sang, de pneumonie nosocomiale, d’endocardites ainsi que d’infections du site opératoire. Enfin, le portage de staphylocoque doré peut également être associé au développement de maladies inflammatoires de la peau telle que la dermatite atopique (DA). Dans l'optique de lutter contre les infections induites par le staphylocoque doré, et la survenue de possibles resistances antibiotiques, la vaccination présente une alternative pertinente. Elle offre notamment une capacité de protection identique contre les bactéries qui sont sensibles mais aussi résistantes aux antibiotiques. Malgré des tentatives et essais de diverses stratégies vaccinales, aucun vaccin dirigé contre le staphylocoque doré n’est actuellement disponible. Une nouvelle stratégie de vaccination par voie cutanée a montré récemment des résultats prometteurs dans un modèle expérimental pour induire une réponse immunitaire protectrice contre certaines infections virales. Ainsi, la mise au point d’un vaccin administrable par voie cutanée pourrait être une stratégie d’intérêt pour la prévention et le traitement des infections récurrentes de la peau et des tissus mous vis-à-vis du staphylocoque doré. Ce projet a donc pour objectif premier d'évaluer le pouvoir immunogène de plusieurs antigènes vaccinaux qui permettront la mise au point futur d'un vaccin contre les infections cutanées induites par le staphylocoque doré. Le second objectif visera à faire la preuve du bénéfice apportée par une méthode de vaccination par voie cutanée par rapport à une approche classique, dans lequel les antigènes vaccinaux sont injectés par voie intra-musculaire.

Bénéfices attendus

La vaccination cutanée est une approche pertinente pour induire une réponse immunitaire locale et permettre un contrôle des infections bactériennes, notamment à Staphylococcus aureus. La mise au point de nouvelles stratégies vaccinale délivrables par la voie des muqueuses (ici la peau) permettra de répondre aux problématiques liées à la récurrence des infections induite par le staphylocoque doré, et ainsi limiter l’usage massif d’antibiotiques et la résistance qui en découle. Cela permettra également d’endiguer/réduire les infections nosocomiales chez les patients porteurs de staphylocoque doré.

Procédures

Toutes les souris seront anesthésiées pour chaque geste soit par anesthésie gazeuse (5 à 10 minutes), soit par injection de produits anesthésiants (30 secondes). Certains animaux recevront sur la peau une suspension de staphylocoque doré, à raison de 4 fois, ceci tous les deux jours (application faite avec un coton tige imbibé dans la suspension, 5 secondes). D’autres animaux seront vaccinés en appliquant un patch contenant les antigènes vaccinaux (5 secondes) sur la peau du dos rasée (10 secondes) et dépilée (5 minutes). A noter que le patch est maintenu en place par la pose (1 minute) d’un bandage. Cette procédure sera reproduite une seconde fois, 14 jours plus tard. Dans certains cas, la peau rasée et dépilée sera, au préalable, exposée à un laser dermatologique (quelques secondes) afin d’altérer la couche superficielle de l’épiderme et favoriser la pénétration des antigènes vaccinaux contenus dans les patchs. D’autres animaux seront vaccinés en injectant (à l’aide d’une aiguille) les antigènes vaccinaux par voie intra-musculaire (50 microlitres de suspension, 5 secondes). Dans certaines procédures des prélèvements sanguins (à l’aide d’une aiguille, 100 microlites, 10 secondes) seront réalisés au niveau de l’œil des souris pour explorer la réponse immunitaire (anticorps, lymphocytes). Ils seront réalisés 3 fois, une fois tous les 14 jours.

Impact sur les animaux

Toutes les souris seront anesthésiées pour chaque geste soit par anesthésie gazeuse, soit par injection de produits anesthésiants. Ceci peut générer un stress chez l’animal. L’application d’une suspension de staphylocoque doré sur la peau des animaux entraine une réaction inflammatoire modérée du fait du pouvoir pro-inflammatoire des souches bactériennes utilisées. Cette réaction inflammatoire n’entraine pas de douleur évidente, mais un inconfort possible. La vaccination par patch n’entraine pas de souffrance des animaux. La pose de patch peut générer exceptionnellement des plaies ou des lésions superficielles au niveau de la peau. Le patch est maintenu en place par un bandage. Ce dispositif engendre un léger inconfort au réveil de l’animal mais aucune douleur. L’animal s’adapte à la présence du bandage au bout de 5 à 10 min lors du retour à la mobilité après anesthésie. Le retrait du patch au bout de 48h peut générer un stress mais pas de douleur. L’exposition à une laser dermatologique, qui a pour objectif d’altérer la couche supérieure de l’épiderme n’engendre pas de douleur, car celui-ci est calibré pour délivrer un rayonnement très peu puissant. Cette exposition n’engendre également pas de réaction inflammatoire, même s’il est possible qu’elle génère un léger inconfort. L’injection intra musculaire peut générer dans de rares cas une lésion traumatique. Les prélèvements sanguins réalisés pour explorer la réponse immunitaire sont susceptibles de diminuer très temporairement la volémie des animaux.

Devenir

Une mise à mort sera réalisée à l’issue des procédures du fait du prélèvement nécessaire d’organes vitaux (organes lymphoïdes, peau par exemple) ne permettant pas d’envisager une autre issue.

Remplacement

Un modèle utilisant uniquement des cellules isolées ne pourrait refléter toute la complexité de la réponse du système immunitaire contre les infections sévères au staphylocoque doré et les relations entre les cellules de l’immunité. L’utilisation d’un modèle murin est donc indispensable.

Réduction

Le calcul du nombre d’animaux par groupe a été réalisé afin de pouvoir mettre en évidence des différences significatives entre les groupes. Au cours de chaque expérience, de multiples analyses utilisant des techniques différentes seront réalisées sur les différents prélèvements afin de minimiser le nombre de souris utilisé.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre afin de limiter la souffrance des animaux et d'assurer leur bien-être. A leur arrivée dans l’animalerie, une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant le début de chaque procédure expérimentale. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. Une surveillance des animaux sera effectuée 5 jours/7 et nous attacherons une grande importance à l’apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Une grille d’évaluation spécifique sera effectuée pour le suivi de la peau jusqu'à la mise à mort. En cas d’apparition de lésions au niveau de la peau suite à la pose des patchs, une pommade cicatrisante sera appliquée afin de traiter les lésions. En cas de douleur ou d’inconfort trop important, une mise à mort anticipée des souris sera réalisée.

Choix des espèces

Les souris sont les animaux les plus utilisés en immunologie avec un large choix de solutions techniques dédiées disponibles commercialement et des modèles génétiquement modifiés sont d’ores et déjà disponibles. Il s'agit de jeunes adultes (8-12 semaines) dont le système immunitaire est à maturité.