Procédures légères

96 souris exposées au chlordécone, pendant la gestation ou à l'âge adulte, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leur système nerveux central. Quarante-huit d'entre elles passent une heure d'imagerie cérébrale sous anesthésie, avec six minutes de stimulation visuelle et trente-cinq minutes de stimulation pharmacologique par injection. Les quarante-huit autres enchaînent trois tests répétés jusqu'à six fois, motricité fine, olfaction après seize heures de privation de nourriture, puis anxiété et motricité générale, le projet se répartissant sur deux établissements avec un transport entre les deux. Le porteur écrit que les modalités d'exposition sont "présumées ne pas induire d'effets indésirables", et que des organoïdes existent mais ne sont "pas encore développés au laboratoire".

Objectifs

Le chlordécone est un insecticide organochloré utilisé aux Antilles pour lutter contre le charançon noir, un insecte ravageant les bananeraies. Compte tenu notamment de sa neurotoxicité à des doses élevées cet insecticide a été interdit dans les années 90. Malheureusement, cet insecticide est très persistant et a contaminé durablement l’environnement, les animaux et la population Antillaise. Pour l’heure les effets neurologiques éventuels d’une exposition à long terme sont mal connus. Toutefois, plusieurs éléments suggérant un effet délétère existent, notamment sur le neuro-développement chez les jeunes garçons nés de mères exposées. De plus, l’heptachlore, un autre insecticide organochloré à l’origine d’une contamination environnementale et humaine à Hawaï a un effet délétère chez la souris dans les régions du cerveau atteintes lors de la maladie de Parkinson et a été associé à des lésions cérébrales chez l’homme. L’objectif scientifique du projet est l’étude de l’effet sur la viabilité et la physiologie des neurones du système nerveux central chez des souris après une exposition au chlordécone par voie alimentaire chez la souris adulte d’une part et d’autre part après une exposition au chlordécone au cours de la période foeto-maternelle. Il s’agit d’un projet multisite qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

La finalité de ces approches est d’évaluer un lien potentiel entre une exposition au chlordécone et le déclenchement ou l’accélération de la maladie de Parkinson et de documenter les évènements physiopathologiques associés à ce mode d’exposition.

Procédures

Dans l’établissement utilisateur 2 : l’Imagerie cérébrale est réalisée une fois sur 48 animaux : elle est réalisée sous anestésie générale. La procédure complète dure environ 1 heure et comprends 6 minutes de stimulation visuelle et 35 minutes de stimulation pharmacologique via une injection intra-péritonélae. Dans l’établissement utilisateur 1 : les 48 autres animaux sont soumis à trois tests comportementaux : le premier test mesurant la motricité fine dure 10 minutes et est répété 6 fois (3 habituations et 3 tests) ou 2 fois (1 habituation et 1 test) selon le groupe d’étude, le second test évaluant les capacités d’olfaction dure 10 minutes (après une privation de nourriture de 16 heures) et est répété 2 fois ou 1 fois selon le groupe d’étude et le dernier test mesurant l’anxiété et la motricité générale dure 15 minutes et est répété 3 fois ou 1 fois selon le groupe d’étude.

Impact sur les animaux

Une procédure expérimentale similaire a déjà été mise en oeuvre au laboratoire sur une durée de 4 mois mais à l’aide d’une exposition par injection intrapéritonéale et aucun signe de souffrance n’a été détecté, pas de perte de poids ni de décès chez les souris mâles exposées. Les modalités d’exposition sont présumées ne pas induir d’effets indésirables. L’ensemble des interventions sont susceptibles d’engendrer des nuisances de classes légères aux animaux : -Les tests comportementaux peuvent potentiellement induir un stress pour les animaux -Les perfusions intra-cardiaque représentent un risque de souffrance lors de l’injection des produits anésthésiants -Le transport des animaux vers le second etablissement utilisateur peut induir un stress -L’anesthésie, la contention et la stimulation chimique lors de la réalisation de l’imagerie cérébrale peuvent induir à la fois un stress de l’animal et de la souffrance

Devenir

L'objectif de ce projet est l'étude de l'effet neurotoxique du chlordécone, pour ce faire il est nécessaire d'euthanasier les animaux afin de disposer du système nerveux central.

Remplacement

A ce jour, le remplacement complet de ce modèle d’étude n’est pas envisageable. Il existe des modèles d’étude utilisant des lignées de cellules neuronales mais ces derniers ne permettent pas d’étudier l’effet d’une exposition sur les interconnexions neurales ou l’impact sur les cellules gliales. Des travaux plus récent proposent l’utilisation d’organoïdes, ces approches sont prometteuses mais pas encore dévelopées au laboratoire.

Réduction

Le nombre de souris est réduit jusqu’au nombre d’animaux minimal permettant d’attendre des résultats statistiquement significatifs dans les différentes approches proposées.

Raffinement

Conformément aux exigences de raffinement, les expérimentations ont été optimisées afin de réduire la douleur au minimum, les animaux sont suivis quotidiennement et hébergés dans un environnement enrichi. En début de procédure, à la réception des animaux au laboratoire, un temps d’acclimatation d’environ 2 semaines est respecter. Un temps d’acclimatation est également respecté lors du transfert des animaux dans le second établissement utilisateur. Pour les animaux soumis aux tests comportementaux une étape d’habituation est également prévue. De plus, le personnel est attentif à la planification de ces tests afin de ne pas soliciter plus de 3 fois les animaux dans la même semaine. Cette alimentation supplémentée en Chlordécone n’a jamais été utilisée dans notre laboratoire en conséquence la quantité de nourriture ingérée par cage chaque semaine sera monitorée en plus du suivi du poids des animaux afin d’identifier le plus tôt possible un défaut d’appétence des croquettes

Choix des espèces

Les souris utilisées sont des souris conventionnelles C57Bl/6, cette lignée de souris est fréquemment utilisée dans les études du système dopaminergique. En effet, la physiologie de cette population neuronale est proche de celle de l’espèce humaine et la taille de sa population autorise des dénombrements précis. Par ailleurs cette lignée a déjà été utilisée dans notre laboratoire, nous pourrons ainsi comparer les résultats obtenus avec nos premiers résultats après deux et quatre mois d’exposition par injection intra-péritonéale. Le projet prévoit d’utiliser des souris adultes à l’âge de 2 mois au début du protocole d’exposition, ceci nous permettra de comparer les résultats de cette voie d'exposition avec notre projet précédent dans lequel les souris avaient subi une exposition similaire mais par voie intrapéritonéale. Le deuxième groupe d'animaux est constitué de souris exposées tout au long de la période de gestation et maintenues soit jusqu’à la fin de la période de sevrage soit jusqu'à l'âge de 2 mois. Cette partie du projet permettra d'obtenir des données quant à l'effet d'une exposition au chlordécone au cours de cette période du dévellopement.

Cinq jours d'injections consécutives, puis une injection par semaine : 60 souris reçoivent du tamoxifène pour éteindre un gène de l'hémoglobine dans leur colon, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur qualifie le produit injecté de "non irritant et non toxique", et décrit dans le même RNT les douleurs liées aux injections, l'irritation possible due au solvant huileux et le stress des contentions répétées. Il ajoute des diarrhées et une perte de poids possibles, liées au phénotype des animaux, et prévoit la mise à mort de celles qui atteignent un point limite. Toutes sont tuées à des temps échelonnés, pour analyser leur colon et le microbiote de leurs selles.

Objectifs

La muqueuse du colon est tapissée de cellules qui ont besoin d’une grande quantité d’oxygène pour exercer leurs fonctions. Dans le colon on retrouve aussi un grand nombre de bactéries jouant un rôle important dans la digestion des fibres alimentaires. Un certain nombre de ces bactéries sont tuées par l’oxygène. Il y a donc un gradient d’oxygène entre la muqueuse colique (la paroi du tissus) et la lumière colique (l’intérieur du colon). La manière dont ce gradient est généré n’a pas encore été élucidé. Chez tous les mammifères, l’oxygène est transporté dans le corps via le sang grâce à l’hémoglobine. Nous avons découvert que l’hémoglobine se trouve également dans les cellules de la muqueuse colique. Sur cette constatation, nous émettons l’hypothèse que les cellules de la muqueuse colique capture l’oxygène grâce à l’hémoglobine afin d’empêcher sa fuite vers la lumière colique préservant ainsi les bactéries sensibles à l’oxygène. L’objectif général est de comprendre comment fonctionne le gradient d’oxygène dans le colon c’est-à-dire comment l’oxygène nécessaire aux cellules épithéliales est capturé par celles-ci de façon à ne pas tuer certaines bactéries présentes dans l’intestin.

Bénéfices attendus

Le microbiote du colon est important pour la digestion. Tout processus qui perturbe ce microbiote peut être la cause de différentes pathologies comme des troubles digestifs allant de la simple diarrhée passagère aux maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) en passant par le syndrome du côlon irritable. Et depuis quelques années, différentes études ont également montré qu’il pouvait être à l’origine de cancers, diabète, obésité, anxiété… Ces travaux ont pour but de montrer la relation entre la respiration des cellules du colon et son impact sur le microbiote.

Procédures

Un lot d’animaux sera réparti en 6 groupes, un produit non irritant et non toxique sera injecté aux animaux vigiles sur 5 jours consécutifs puis seulement 1 fois par semaine. Les animaux seront ensuite mis à mort à différent temps pour analyses post-mortem.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues seront celles liées à des injections 5 jours consécutifs ; douleurs liées aux injections elles-mêmes, irritation possible liée au solvant huileux et stress lié aux contentions répétées Par ailleurs, des diarrhées et perte de poids liées au phénotype des animaux pourront éventuellement être observées

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Il a été développé dans le laboratoire des modèles cellulaires en trois dimensions que l’on appelle « organoïdes ». Ces modèles cellulaires sont obtenus à partir de la muqueuse colique de souris. Ils peuvent être gardés en culture et l’on peut faire agir sur ces organoïdes différents réactifs permettant d’étudier le rôle de l’hémoglobine dans les cellules les constituant. Nous utilisons en priorité ce modèle par rapport à l’expérimentation in vivo. Des tests préliminaires sur ces modèles ont permis de montrer l’impact qu’entraine une diminution de l’hémoglobine sur la respiration des cellules coliques. Toutefois, ces études in vitro doivent être complétées par une analyse in vivo pour étudier l’ensemble du processus dans un organisme intégré (notamment l’impact de la modification de la respiration des cellules épithéliales coliques sur les bactéries présentes dans les selles).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est ajusté au plus bas mais compatible avec l’obtention de résultats statistiquement fiables. Tous les animaux, quel que soit leur génotype et leur sexe seront utilisés, ce qui permet d’avoir à la fois des animaux contrôles et des animaux d’intérêts. Pour réduire la variabilité de l'échantillon, nous utiliserons autant que possible des compagnons de portée.

Raffinement

L’ensemble des animaux sera surveillé tous les jours pendant les injections de Tamoxifène. Une surveillance supplémentaire sera faite lors des week-ends si et seulement si des signes précoces de détresse (diarrhée, perte de poids …) sont observés. Une grille de score a été établie afin d’évaluer de manière objective l’état des animaux et des points limites ont été définis. En cas d’atteinte d’un point-limite, les animaux seront mis à mort Injection de solutés en cas de déshydratation et administration d’un antidiarrhéique en cas de symptômes.

Choix des espèces

La souris de laboratoire est largement utilisée en biologie car ce modèle apporte plusieurs avantages : la maîtrise de son élevage, sa reproduction facile et rapide qui permet l’obtention de cohortes d’animaux d’un génotype approprié, la relative facilitée de modification génétique. Par ailleurs, la souris est très proche de l'Homme au niveau génétique. La connaissance du génome murin et l’existence de nombreuses lignées génétiquement modifiées permettant d’étudier la fonction des gènes dans les différents tissus en font un très bon modèle , notamment pour étudier l’impact sur le microbiote.

Moins de trente secondes, un poinçon dans le pavillon de l'oreille, une fois par animal : c'est le seul geste décrit pour 37 400 souris et 1 430 rats, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet s'intitule "Évaluation et suivi du bien-être animal" et sert à héberger, croiser et produire des lignées génétiquement modifiées pour le compte de chercheurs extérieurs à l'établissement. Une partie des animaux part vers d'autres établissements pour y être expérimentée, une autre reste pour l'élevage, et le porteur indique que les surnuméraires, ceux dont le génotype ne sert pas aux croisements et les reproducteurs dont la fécondité baisse avec l'âge sont mis à mort. Les lignées concernées sont immunodéficientes, hémophiles ou porteuses d'un phénotype qui n'apparaît qu'avec l'âge, ces dernières étant expédiées ailleurs ou tuées avant que la tumeur ou la dystrophie musculaire ne se déclare.

Objectifs

Un phénotype est considéré comme dommageable si les animaux de la lignée sont susceptibles de ressentir, du fait de l’altération génétique, une douleur, une détresse, une souffrance ou un préjudice durable équivalents ou supérieurs à ceux causés par l'introduction d'une aiguille effectuée conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Aussi, toutes lignées avec un phénotype dommageable même s’il ne s’exprime pas dans des conditions qui permettent d’éviter son expression chez les animaux hébergés doivent être encadrées par une autorisation de projet. Notre établissement héberge différentes lignées de souris et de rats génétiquement altérées pour le compte de chercheurs externes au laboratoire et donc selon les projets, l’unité peut accueillir ou produire des lignées à phénotype dommageable. Ce projet a deux objectifs : - L’évaluation du bien-être animal par la mise en place d’une procédure d’identification et de caractérisation d’un phénotype dommageable (procédure 1). - Mise en place de raffinement afin que le phénotype ne s’exprime pas au sein de l’établissement, on parle ici de phénotype dommageable potentiel non exprimé dans nos conditions d’élevage (procédure 2). PROCÉDURE 1 Evaluation du bien-être animal, cette procédure s’applique à : 1. La réception d’une nouvelle lignée. 2. La création d’une nouvelle lignée par croisement entre deux lignées génétiquement altérées. Les animaux seront suivis avec la grille d’évaluation du bien-être animal au moins une fois par semaine. Suite à cette évaluation, les lignées seront classées comme suit : - lignée à phénotype NON DOMMAGEABLE ; - lignée à phénotype DOMMAGEABLE NON EXPRIMÉ, ces animaux entrent dans la procédure 2 ; - lignée à phénotype DOMMAGEABLE EXPRIMÉ, nécessité d’une DAP spécifique pour la prise en charge de ces animaux. PROCÉDURE 2 Cette procédure ne concerne que les lignées qui à l’issue de la procédure 1 de ce projet ont été identifiées comme lignée à phénotype dommageable non exprimé. Plusieurs types de lignées entrent dans cette catégorie : - les lignées immunodéficientes, - les lignées hémophiles, - les lignées pour lesquelles le phénotype dommageable ne s’exprime que pour un génotype donné, - et les lignées dont le phénotype dommageable apparait à un âge défini. Le but de cette procédure est de mettre en place une surveillance du bien-être de ces animaux afin de s’assurer que les raffinements mis en place permettent que le phénotype dommageable ne s’exprime pas.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est la détection et la prise en charge précoce d’un phénotype dommageable potentiel et par conséquent d’une éventuelle douleur pour éviter que cette dernière s'exprime. La procédure 1 permettra de définir et mettre en place une méthode générique d’évaluation du bien-être animal lors de la réception ou de la création par croisement de nouvelles lignées dans l’établissement. La procédure 2 permettra de gérer différents types de lignées ayant un phénotype dommageable potentiel mais non exprimé au sein de l’établissement avec des raffinements adaptés. Elle précise également les modalités de surveillance du bien-être de ces lignées afin de confirmer l’absence des nuisances. Ces deux procédures permettront ainsi d’élever différents modèles de souris ou de rat de chercheurs extérieurs à notre laboratoire pour les intégrer dans leurs projets de recherche avec les différents bénéfices précisés dans chaque projet d’utilisation (DAP spécifique).

Procédures

Une partie des animaux sera prélevée à l’oreille afin de réaliser le génotypage. Cette méthode consiste à prélever un petit échantillon de tissu sur la périphérie du pavillon de l’oreille où le tissu est le plus mince, à l’aide d’un poinçon ou d’un ciseau. Cette intervention n’est réalisée qu’une fois par animal et dure moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les lignées IMMUNODÉFICIENTES peuvent présenter différents niveaux de déficits immunitaires dont certains se traduisent en caractéristiques phénotypiques variées (développement des infections, baisse de fécondité, mortalité précoce, diarrhées, etc.). Ces animaux seront hébergés en isolateurs ou en portoirs ventilés, en conditions sanitaires de type « SOPF » (sans opportuniste, ni pathogène) qui permettent d’éviter les nuisances liées à l’immunodéficience. Les lignées HÉMOPHILES (déficientes pour des gènes codant pour les facteurs de coagulation) sont caractérisées par le temps de saignement prolongé uniquement en cas de section de la veine de la queue, qui ne sera pas pratiquée dans notre établissement pour éviter les nuisances. Ces animaux seront prélevés uniquement à l’oreille pour le génotypage et l'identification (un seul prélèvement), qui ne provoque pas de saignement prolongé sur ces lignées. Par ailleurs, le génotypage et l’identification ne seront pas systématiques puisqu’il s’agit de lignées maintenues à l’état homozygote. Nous prélèverons et identifierons ainsi uniquement les reproducteurs. D'autres caractéristiques possibles de ces lignées qui n'ont pas été observées dans nos conditions d'élevage sont : le saignement spontané pouvant entraîner un gonflement/hématome (joue, pattes postérieures) et la mort prématurée après des bagarres en raison d'hémorragies internes. Cependant, une attention particulière sera apportée en cas d'agressivité entre animaux et, si cela est constaté, les animaux seront suivis tous les jours avec la grille d'évaluation. Les lignées à phénotype TARDIF lié à l’âge (par exemple : développement de tumeurs ou de dystrophie musculaire entraînant dégénérescence progressive des muscles et une faiblesse musculaire) seront systématiquement expédiées pour expérimentation dans un autre établissement ou mises à mort avant occurrence de la nuisance. Les lignées à phénotype lié au GÉNOTYPE seront maintenues avec un schéma d’accouplement connu pour ne pas générer d’animaux au phénotype dommageable. Aucune nuisance n'est prévue lorsque l'élevage est effectué dans nos conditions d’hébergement. Néanmoins, dès qu’un animal présente un score = 1, la surveillance sera quotidienne et la vétérinaire et/ou la SBEA seront sollicités pour la mise en place de mesures supplémentaires de raffinement.

Devenir

Une partie des animaux portant le génotype d’intérêt sera expédiée dans d’autres établissements utilisateurs pour expérimentation. Une autre partie des animaux sera utilisée pour l’élevage ou l’expérimentation dans notre établissement. Les animaux utilisés pour l’élevage seront mis à mort si non nécessaires pour maintenir l’élevage (e.g. si génotype sans intérêt pour les schémas de croisements, surplus, ou si leur fécondité est réduite du fait de leur âge). Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d’évaluation seront mis à mort.

Remplacement

Les modèles de souris et de rats concernés par ce projet générique sont inscrits dans différents projets scientifiques extérieurs à notre laboratoire. Les porteurs de projets apporteront dans chacune de leurs DAP d'utilisation des précisions sur les alternatives non animales disponibles et expliqueront pourquoi elles ne peuvent pas être utilisées aux fins du projet.

Réduction

Nous mettons en place le nombre minimal d’accouplements nécessaires pour produire sur demande les lots expérimentaux pour chaque porteur de projet. Le but étant de limiter au maximum le nombre d’animaux et, si aucune expérimentation n’est planifiée, les lignées seront maintenues au minimum. La production des animaux sera ainsi planifiée et suivie par l’expérimentateur et les zootechniciens afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Le nombre de reproducteurs, le schéma de croisement et la durée d’accouplement seront définies en amont de la mise en place des croisements. Ces paramètres seront définis en fonction des objectifs et des différentes caractéristiques connues des lignées (fertilité des reproducteurs, viabilité de la descendance, nombre d’animaux/portée, ratio génotypes). Les lignées à phénotype dommageable potentiel lié au génotype seront maintenues avec un schéma d’accouplement connu pour ne pas générer d’animaux au phénotype dommageable. Les élevages seront suivis via les fichiers de l'élevage. Le nombre total d’animaux indiqué comprend les animaux pour accouplements et les animaux issus des accouplements et nécessaires pour l’expérimentation pour les projets scientifiques associés. Les chercheurs sont fortement conseillés de procéder au cryoarchivage de leurs lignées et de ne pas les garder sous forme respirant en fin de leurs projets expérimentaux. La SBEA prendra, le cas échéant, le contact avec le chercheur pour argumenter l’arrêt d’élevage et la cryoconservation de souche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages avec divers enrichissements. Pour les souris, elles sont hébergées en cage de type « II long » à 6 animaux maximum à partir du sevrage et à 4 animaux maximum au sevrage pour les cages de type « I long ». Pour les rats, ils sont hébergés en cage dite « 900 » à 2 animaux pour un poids individuel maximum de 600g ou à 3 maximum dans les cages dites « 1800 ». Les animaleries de notre unité ont un contrôle sanitaire périodique. Les animaux d’âge représentatif et de génotype pertinent seront suivis avec la grille d’évaluation et de surveillance du bien-être animal contenant des points limites précoces à minima une fois par semaine et ce jusqu'à leur mise à mort, décès ou l’envoi vers l’établissement utilisateur où sera réalisée l’expérimentation. Dans la procédure 2, en plus du suivi avec la grille de surveillance, des méthodes de raffinement spécifique au type de dommages potentiels seront mises en place pour éviter l’expression de ces phénotypes. Les lignées IMMUNODÉFICIENTES seront ainsi hébergées en isolateurs ou en portoirs ventilés, en conditions sanitaires de type « SOPF » (sans opportuniste, ni pathogène). Les lignées HÉMOPHILES seront prélevées uniquement à l’oreille pour le génotypage et l'identification (un seul prélèvement). Par ailleurs, le génotypage et l’identification ne seront pas systématiques puisqu’il s’agit de modifications en homozygote. Nous prélèverons et identifierons ainsi uniquement les reproducteurs. Une attention particulière sera apportée en cas d'agressivité entre animaux et, si cela est constaté, les animaux seront suivis tous les jours avec la grille d'évaluation. Par ailleurs, nous ne rassemblerons pas de mâles issus d'accouplements différents lors du sevrage pour limiter le risque de bagarres. Si nous devons le faire pour éviter d'isoler un mâle, nous rajouterons de l'enrichissement dans la cage et les animaux seront suivis tous les jours avec la grille d'évaluation. Les lignées à phénotype TARDIF lié à l’âge seront expédiées pour expérimentation dans un autre établissement ou mises à mort avant occurrence de la nuisance.

Choix des espèces

La souris et le rat sont parmi des modèles d'animaux les plus utilisés dans la recherche en raison de leurs nombreuses similitudes avec l’homme. De plus, le choix de ces modèles est dépendant des protocoles déjà existants et décrits dans la littérature permettant ainsi des échanges internationaux au sein de la communauté scientifique. Les justifications techniques et scientifiques détaillées pour chaque lignée utilisée seront apportées dans les projets « utilisateurs » (DAP spécifique). Une partie des animaux sera utilisée pour les croisements dès l’âge de deux mois et ce jusqu’à un âge où le taux de fécondité est maintenu stable selon la souche ou jusqu’au point précoce de l’expression d’un phénotype tardif. Une autre partie sera utilisée dans notre établissement ou envoyée dans d’autres établissements pour expérimentation selon l’âge d’utilisation dans de différents projets scientifiques ou avant l'expression d'un phénotype tardif lié à l’âge.

Dépourvues de système immunitaire par construction génétique, ces souris contractent facilement des infections, ce que le porteur qualifie lui-même de phénotype dommageable. 3 286 d'entre elles vont être élevées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, la seule opération prévue étant la mise en accouplement des géniteurs. Elles serviront ensuite à recevoir des greffes de tumeurs pulmonaires prélevées sur des patients, l'élevage sur place évitant d'acheter des animaux à des fournisseurs commerciaux. Le porteur écrit que les conditions d'hébergement "justifient, de notre point de vue le classement léger", et affirme ailleurs que ces mêmes conditions justifient "le classement modéré".

Objectifs

Le cancer du poumon est la première cause de décès par cancer dans le monde et la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques est un challenge majeur. A l’heure actuelle, des traitements existent, mais présentent des récidives quasi systématiques à moins de 5 ans. Notre équipe cherche à identifier une nouvelle cible thérapeutique dans les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC). Nous souhaitons utiliser une lignée murine spécifique, ne présentant pas de système immunitaire et ayant une bonne tolérance aux greffes. Ces animaux seraient utilisés pour nos modèles tumoraux puis traités avec différents inhibiteurs afin de vérifier leur effet thérapeutique. Afin de faciliter la gestion de ces projets, notamment pour les pièces opératoires humaines sans pour autant stocker de façon inutile des animaux provenant de sociétés commerciales, nous souhaitons mettre en place un élevage de ces souris afin de générer les animaux nécessaires à nos expérimentations.

Bénéfices attendus

Cet élevage nous permettra de disposer des animaux sur notre site de recherche afin de pouvoir implanter rapidement les tumeurs de patients obtenues après lobectomie. Ces animaux permettrons de répondre aux questions soulevées dans des autorisations précédement demandées et accordées; à savoir l'étude et le développement de thérapies dans le cancer bronchique.

Procédures

Dans cette DAP, seule la mise en accouplement des animaux géniteurs sera pratiquée. Aucune autre intervention n'aura lieu. Les animaux seront hébergés dans une zone exempt de pathogènes et opportunistes spécifiques. Les cages seront positionnées sur un portoir ventilé. En utilisant ce type de portoir, chaque cage peut être considérée comme une unité microbiologique. Des contrôles sanitaires seront réalisés trimestriellement, en alternant l'analyse des filtres d'unité de ventilation et celle des souris sentinelles. De telles conditions d'hébergement permettent d'empêcher le développement d'un phénotype dommageable chez les souris immunodéficientes et justifient, de notre point de vue le classement léger.

Impact sur les animaux

Les animaux immunodéprimés portent des mutations génétiques causant une perte partielle ou totale de leur système immunitaire entraînant un risque accru de contracter des infections ce qui constitue un phénotype dommageable. Une attention particulière sera portée à cela. Ainsi, ces animaux seront systématiquement manipulés sous atmosphère contrôlée et/ou dans des zones portant un statut sanitaire strict afin de ne pas les exposer à des pathogènes pouvant leur causer des infections.

Devenir

Ces animaux seront sujet à une utilisation continue. En effet, à l'issue de cette procédure, les animaux ainsi générés seront utilisés à des fins scientifiques afin de satisfaire les besoins expérimentaux liés aux projets disposant déjà d'une autorisation.

Remplacement

« Remplacer ». Nous avons remplacé dès que possible le modèle vivo par des modèles de cultures cellulaires. En effet, nous disposons au laboratoire de différentes lignées cellulaires provenant d’adénocarcinome humain sur lesquelles nous avons testé nos molécules d'intérêt. Nos résultats se sont montrés concluants et nous ont permis de déterminer les conditions adéquates d’administration (concentration, durée de traitement). Il nous reste à prouver leur efficacité sur tumeur en son site anatomique. Cette procédure expérimentale ne peut être remplacée par une autre stratégie ou procédure expérimentale n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et capable d’amener le même niveau d’information.

Réduction

« Réduire ». L’hétérogénéité apportée par le vivant, dues aux différences physiologiques propres à chacun, nécessite un nombre d’individus suffisamment grand afin d’apporter une puissance statistique forte. Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux tout en gardant en tête les objectifs scientifiques, nous nous rapprocherons d’un statisticien pour chaque projet afin d’évaluer le nombre d’animaux nécessaire. Nous exploiterons au maximum le potentiel de ces animaux (analyse et prélèvement multiples pour analyse moléculaire ex vivo). Les accouplements seront adaptés en fonction des besoins expérimentaux. Ils devront être mis en pause si les projets ne nécessitent pas d'animaux sur les temps à venir. Cela évitera la naissance d'animaux surnuméraires.

Raffinement

« Raffiner ». Les souris seront hébergées dans des cages d’une superficie supérieure à 500cm2. La litière est faite à base de copeaux de peuplier et le milieu est enrichi avec des bûchettes de bois et des frisottis. Nous porterons une attention particulière au bien-être des animaux et nous prendrons en charge la contrainte que les animaux subissent au cours des procédures expérimentales par l'administration d'analgésique lorsque cela se montrera nécessaire. Les animaux seront hébergés dans une zone exempt de pathogènes et orpotunistes spécifiques. Des contrôles sanitaires sont réalisés régulièrement en alternant l’analyse des filtres d’unité de ventilation et celle des souris sentinelles. De telles conditions d’hébergement permettent d’empêcher le développement d’un phénotype dommageable chez les souris immunodéficientes et justifient de notre point de vue le classement modéré. Les animaux seront observés quotidiennement (y compris week-end et jours fériés)aussi fréquemment qu’il le faut. Si un signe clinique est observé, il fera l’objet de l’ouverture d’une fiche de suivi scorée. Si rien ne peut rapidement être fait pour soulager la souffrance de l’animal ou si l’un des signes cliniques est trop important, alors ils sera euthanasié.

Choix des espèces

Des modèles de souris développant des cancers bronchiques ont déjà été utilisés dans des études précliniques et se sont montrés être un bon modèle de la pathologie humaine tant sur le plan anatomopathologique que biomoléculaire. La greffe de cellules humaines entraine la nécessité de travailler sur un organisme immunodéficient afin d'exclure tout risque de rejet. D’un point de vue expérimental, nous attendrons que les souris aient au moins 6 semaines pour les utiliser. Ainsi, il s’agira d’animaux déjà adultes mais suffisamment jeunes pour que le processus de vieillissement n’impacte pas les courbes de survie. Nous utiliserons seulement des animaux de moins de 6 mois (jeunes) afin qu’ils récupèrent plus facilement après la chirurgie.

Immobilisées vigiles, la tête bloquée, piquées perpendiculairement à la veine mandibulaire pour deux ou trois gouttes de sang, 750 souris subissent une procédure d'un niveau de souffrance léger. Le prélèvement dure de cinq à vingt secondes et sert à vérifier des marqueurs de surface sur les cellules sanguines, pour trier des souris destinées à des greffes de moelle osseuse. Le porteur indique qu'environ 187 individus, ceux dont le génotype ne présente pas d'intérêt, seront mis à mort. Les 563 autres restent en vie, 60 pour maintenir la lignée et 503 pour alimenter des expérimentations ultérieures.

Objectifs

Production d’animaux congéniques utilisés dans des expériences de greffes de moelle osseuse pour l’étude de l’hématopoïèse normale et cancéreuse. La caractérisation génétique de ces animaux congéniques est réalisée par l’analyse de marqueurs spécifiques à la surface des cellules sanguines.

Bénéfices attendus

La caractérisation génétique des souris permet d’optimiser la gestion de l’élevage et de produire les animaux nécessaires pour les projets scientifiques pour l'étude de l'hématopoïèse normale et leucémique. La compréhension de ces mécanismes permet de développer des traitements thérapeutiques pour les leucémies humaines.

Procédures

Un seul prélèvement sanguin sera effectué à la veine mandibulaire comme suit. 750 souris vigiles sont immobilisées par une contention de base en s’assurant que la tête est bien immobilisée. Puis la veine mandibulaire est piquée perpendiculairement avec une aiguille. 2-3 gouttes de sang sont prélevées directement dans un tube de prélèvement. Le prélèvement dure entre 5 et 20 secondes. Puis une légère pression pour arrêter le saignement est effectuée avec un papier absorbant.

Impact sur les animaux

L’effet indésirable est la nuisance du prélèvement sanguin unique qui génère un stress et une douleur légère.

Devenir

Parmi les animaux de génotypes utiles soit 75% des souris correspondant à environ 563 animaux, 60 souris utiles seront replacées pour le maintien de la lignée et 503 souris seront utilisées pour les expérimentations en utilisation continue. Les animaux de génotype inutile seront mis à mort soit environ 25% des souris correspondant à environ 187 animaux.

Remplacement

Le prélèvement sanguin pour génotypage ne peut-être remplacer par un autre prélèvement car seules les cellules sanguines expriment le marqueur permettant de génotypage ces souris. Les souris de cet élevage sont générées et utilisées pour réaliser des expériences de greffes de cellules souches afin de tester leurs fonctions dans un individu à long terme (au moins 6 mois). A ma connaissance aucun système de culture in vitro, in silico ou ex-vivo ne permet de tester la fonction à long terme des cellules souches hématopoïétiques dans des conditions physiologiques identiques à celles d’un individu vivant (sans biais, ni stresse cellulaire pouvant altérer la fonction de dormance de ces cellules).

Réduction

Nous allons produire un nombre d’animaux en lien avec nos besoins (environ 150 animaux par an). Le nombre de cages de croissements pour générer les souris nécessaires à nos projets scientifiques est réduit au minimum requis.

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances liées aux prélèvements sanguins ceux-ci seront réalisés par un technicien animalier employant une méthodologie éprouvée, rapide, précise et standardisée. Pour rétablir la volémie des animaux vigils prélevés en sang, le même volume d'une solution saline physiologique (NaCl 0,9%) sera injectée à ces animaux en sous-cutané.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux modèles de choix facilement modifiables génétiquement et pour lesquels nous disposons d’un grand nombre d’outils moléculaires (ex : Anticorps, cytokines…) et permettant l’étude des cellules hématopoïétiques. Les animaux seront caractérisés le plus tôt possible vers l'âge de 4-5 semaines.

Un millimètre de queue coupé, une fois par animal, c'est la procédure appliquée à 84 330 souris et 3 000 rats, dans des actes déclarés d'un niveau de souffrance léger. Ce prélèvement sert au génotypage d'animaux génétiquement altérés produits pour la cancérologie, la cardiologie, la neurologie ou les maladies métaboliques, et l'établissement héberge aussi des lignées immunodéprimées. Le porteur écrit que les individus dont le génotype ne présente pas d'intérêt seront mis à mort et que les autres partiront vers d'autres projets, sans jamais indiquer quelle proportion est concernée. Il évoque des méthodes moins invasives, génotypage par la salive ou prélèvement par buvard sur les aérations, en les décrivant comme des pistes encore à l'étude.

Objectifs

Notre établissement utilisateur produit des animaux génétiquement altérés dédiés à la recherche scientifique dans divers domaines tel que la cancérologie, cardiologie, neurologie, maladies métaboliques etc. Pour cela, nous utilisons une méthode de prélèvement de queue pour la caractérisation génétique. De plus, nous hébergeons des lignées immunodéprimées pour certains projets expérimentaux.

Bénéfices attendus

Les lignées immunodéprimées ont pour objectif de répondre à des questions scientifiques dans le domaine de l’immuno-oncologie ou pour le maintien d’un statut sanitaire SPF avec les sentinelles. Le génotypage permet la caractérisation génétique des lignées génétiquement altérées avec (animaux immunodéprimés) ou sans phénotype dommageable pour optimiser la gestion des élevages et la production des animaux pour les projets scientifiques des différentes structures travailant dans notre animalerie (thématiques développées : cancérologie, digestif, cardiaque, osseux...).

Procédures

Prélèvement de queue (1mm), une seule fois.

Impact sur les animaux

La biopsie au niveau de la queue peut entrainer de la douleur et du stress chez l'animal. L’immunodépression fragilise les animaux d’un point de vu immunitaire, mais cela n’impacte pas leur bien être tant qu’ils sont maintenus dans des conditions d’hébergement adaptées.

Devenir

Les animaux sont prévus pour une utilisation continue dans divers projets scientifiques. La biopsie de queue permet le gnéotypage et en fonction des croisement effectués permettra d'identifier les animaux utiles aux études. Ceux dont le génotype ne serait pas d'intérêt seront mis à mort en sachant que les croisements sont réalisés de manière à optimiser au maximum la génération d'animaux à génotypes intéressants.

Remplacement

Jusqu’à présent la méthode de biopsie de queue était la plus efficace pour identifier génétiquement les animaux. Cependant nous réfléchissons à mettre en place des méthodes moins invasives tel que le génotypage via prélèvement de la salive. La difficulté d’une méthode non invasive est qu’elle doit être applicable à tous et implique d'avoir une méthode génotypage standard avec des kits commerciaux, ce qui n'est pas le cas dans toutes les équipes de recherche. Nécessité d’utilisation des animaux pour l’objectif de projets en immuno-oncologie. Concernant les sentinelles, nous sommes en cours de développement d’une méthode de prélèvement par buvard directement au niveau des aérations, ce qui nous affranchirai de l’utilisation des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé est basé sur les statistiques des années précédentes et en lien avec les différents besoins en fonction des projets scientifiques. Ce dernier reste suffisamment important pour pouvoir y inclure de futurs projets d’ici les 5 prochaines années. Néanmoins nous avons pu observer une baisse de production des animaux d’élevage depuis 2020. Nous réfléchissons à développer des méthodes de génotypage moins invasives tel que le prélèvement par la salive. Concernant les sentinelles, nous sommes en cours de développement d’une méthode alternative aux animaux de prélèvement par buvard directement au niveau des aérations, ce qui nous affranchirai de l’utilisation des animaux. Lorsqu’une lignée n’a plus d’intérêt scientifique à long terme, nous optons de plus en plus pour un arrêt de cette dernière et d’envisager une méthode de conservation autre tel que la cryoconservation.

Raffinement

La biopsie de queue est réalisée lors du baguage soit en vigile soit sous anesthésie générale. Cette méthode est approuvée, précise, rapide (quelques secondes), standardisée et réalisée par du personnel formé, ce qui limite les effets de stress et douleurs chez les animaux. L’anesthésie permet de favoriser la bonne pose de la bague et le prélèvement de queue dans un environnement plus confortable pour le manipulateur et l’animal. L’immunodépression fragilise les animaux d’un point de vu immunitaire, mais cela n’impacte pas leur bien être tant qu’ils sont maintenus dans des conditions d’hébergement adaptés avec un statut sanitaire stricte et une fréquence de change rapprochée. Dans toutes les préocédures des points limites précoces sont mis en place afin de minimiser au maximum la douleur des animaux.

Choix des espèces

Nous avons majoritairement des élevages de souris et un petit élevage de rats. Ces animaux sont utilisés en fonction des besoins pour les différents projets scientifiques. Les animaux restent à minima le temps du sevrage de ces deniers, soit 3 semaines (21jours), ils sortent ensuite en fonction des âges utilisés dans les projets pour lesquels ils sont produits. La biopsie de queue quand elle est nécessaire est réalisée entre 1 semaine et 3 semaines d'âge en fonction de l'âge auxquels les animaux seront utilisés dans les études ultérieures.

Treize prises de sang par cheval et deux injections d'un vaccin à cinq semaines d'intervalle : 15 chevaux adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet teste trois doses d'un candidat vaccin contre la peste équine, une maladie des équidés transmise par des moucherons, sur trois groupes de cinq chevaux. Les injections peuvent provoquer une légère douleur, un gonflement local et une hausse passagère de la température, les ponctions un hématome. Le porteur retient le cheval comme "l'espèce cible la plus sensible au virus", après des essais où la protection des souris vaccinées a été totale, et prévoit de garder les prélèvements comme "matériaux de référence" pour son laboratoire. Tous les chevaux sont gardés en vie, puis réutilisés pour d'autres activités de recherche.

Objectifs

La peste équine est une maladie des équidés causée par un virus figurant sur la liste des maladies à déclaration obligatoire de l'Organisation mondiale de la santé animale en raison de son taux de mortalité élevé (~95 %) chez les chevaux. Ce virus est endémique dans les zones tropicales et subtropicales d'Afrique, mais s'est propagé à plusieurs reprises hors de son habitat africain au 20eme siècle, provoquant de graves épidémies dans le bassin méditerranéen et en Europe et, plus récemment, jusqu'en Thaïlande. Le virus est transmis d’un animal à un autre par des moucherons piqueurs hématophages. Les facteurs liés au changement climatique (températures, vent) peuvent permettre l'introduction de ces vecteurs dans des régions jusqu’alors indemnes, et accroître le risque d’introduction du virus, comme cela a été montré pour les virus de la fièvre catarrhale du mouton (FCO) et de la maladie hémorragique épizootique (MHE), qui sont aussi vectorisés par les moucherons. La FCO et la MHE ont émergé en Europe et ré-émergent chaque année pendant la période d’activité de ces moucherons. Les mesures pour prévenir et traiter la peste équine restent limitées. Bien qu'un vaccin utilisant le virus de la peste équine atténué, c’est-à-dire non infectieux, soit disponible et utilisé en Afrique du Sud, il existe un potentiel de retour à la virulence, et son utilisation en Europe n’est pas approuvée. Le but de cette étude est de développer des vaccins innovants pour la peste équine. Ces vaccins sont constitués de protéines formant une nanostructure, sur laquelle sont greffés des antigènes. Les antigènes sont des molécules reconnues, comme par exemple des protéines, par l’organisme comme étant étrangères et contre lesquelles l’organisme va combattre en produisant des anticorps dirigés (immunisation). L’antigènes d’intérêt pour cette étude est la protéine virale VP2, connue pour induire une réponse immunitaire chez l’animal infecté et ainsi de protéger complétement l’animal vacciné d’une infection. Ces candidats vaccins ont été testés sur des souris sensibles à l’infection et la protection des souris vaccinées a été totale. L’objectif de ce projet est maintenant de tester ces candidats vaccins dans l’espèce cible la plus sensible au virus, qui est le cheval. Dans le but de déterminer la meilleure composition du vaccin permettant d’induire la meilleure production d’anticorps, 3 doses d’antigènes seront testées. Au total, 3 groupes de 5 chevaux feront l’objet de cette étude.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de déterminer si le candidat vaccin permet la production d’anticorps contre le virus de la peste équine jusqu’à 1 an après la vaccination et ainsi protéger les équidés lors d’une infection qui peut leurs être fatale. De plus, les prélèvements issus de cette expérimentation serviront de matériaux de référence pour les activités du laboratoire.

Procédures

Les chevaux recevront 2 injections du vaccin (1 minute) à 5 semaines d’intervalle. Au total, 13 prises de sang (2 minutes par prise de sang) seront réalisées par cheval lors de cette procédure.

Impact sur les animaux

Les chevaux peuvent ressentir une légère douleur lors des injections du vaccin et lors des prises de sang de contrôle. Il existe un risque très faible de formation d’hématome à la suite de la ponction veineuse. Un gonflement local au niveau du point d’injection du vaccin peut être observé ainsi qu’une augmentation transitoire de la température.

Devenir

Les chevaux seront tous gardés en vie et réutilisés pour d’autres activités de recherche.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle alternatif pour tester l’efficacité du vaccin pour la production des anticorps spécifiques sur l’espèce cible la plus sensible au virus : le cheval. Ce vaccin a été précédemment testé sur le modèle murin avec succès.

Réduction

Au total 15 chevaux seront utilisés pour cette procédure et répartis dans 3 groupes distincts (3 doses différentes de vaccins). Par lot, le nombre de chevaux a été fixé à 5. Le nombre de 5 chevaux par groupe nous permettra d’analyser les résultats obtenus au cours de cette procédure par des tests statistiques non paramètriques.

Raffinement

La vaccination sera réalisée par un vétérinaire et les prélèvements sanguins seront réalisés par du personnel expérimenté avec une contention légère (tenue au licol) par un animalier familier au sein de leur groupe pour limiter le stress. Un vétérinaire, praticien hospitalier spécialisé en médecine équine, sera présent lors de la primo vaccination et du rappel et restera sur site pendant les 24 heures suivantes, pouvant ainsi intervenir en cas de nécessité. Il sera également contacté en première intention en cas d’effets indésirables pendant toute l’expérimentation. Puis les animaux seront suivis les 5 jours suivant chaque injection du vaccin avec notamment une prise la température rectale des animaux matin et soir, un suivi visuel au niveau du point d’injection et un relevé de toutes postures / comportement anormal (perte d’appétit, abattement, difficulté à baisser l’encolure). Les animaux seront hébergés en groupe en stabulation avec une alimentation 100 % fourrage durant les 5 jours suivant les injections de vaccin et au pâturage en groupe le reste du temps. Si un effet indésirable devait survenir, la prise en charge sera assurée par le vétérinaire et serait la suivante : - injection en urgence de cortico-stéroides et d’adrénaline en cas d’anaphylaxie (réaction quasi-immédiate avec difficulté cardio-respiratoire, sudation, douleur abdominale, tremblements…), - injection de corticoïdes, s’il s’agit d’une réaction de type allergique (démangeaison, chaleur au point d’inoculation, gonflement voire abcès), - des soins locaux seront réalisés en cas d’inflammation marquée, - et des anti-inflammatoires oraux seront administrés en cas de douleur. Les posologies appliquées seront celles recommandées par le vétérinaire. L’expérimentation serait alors arrêtée.

Choix des espèces

La peste équine est un virus d’importance sanitaire dans les populations équines. L’espèce cible pour ce candidat vaccin est donc le cheval. Pour cette étude, des animaux adultes seront inclus afin qu’ils aient un système immunitaire mature pour une production optimale d'anticorps.