Procédures légères

Jusqu'à trois gestes par animal, une contention pouvant durer une minute entre les mains d'un débutant, un tatouage aux phalanges et des anesthésies allant jusqu'à 45 minutes : 950 souris et 140 rats vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Le projet ne vise aucune production de connaissance. Il fait répéter des gestes techniques à des personnels peu ou pas expérimentés et sert à valider des protocoles anesthésiques, avec les réveils précoces ou tardifs que le porteur anticipe. Ce sont des animaux dits de réforme, disponibles dans l'établissement faute d'être entrés dans un protocole de recherche, mis à mort après chaque procédure pour ne pas leur faire subir plusieurs sessions d'entraînement.

Objectifs

Tous les utilisateurs d’animaux à des fins scientifiques se doivent de maitriser les gestes techniques afin de s’assurer du bien être animal et réduire le nombre d’animaux utilisés lors de leurs projets expérimentaux. La formation initiale et les formations continues doivent être complétées par un entrainement aux différents gestes qui vont être réalisés lors des procédures. Le présent projet a pour but de lister certains gestes techniques réalisés sur des animaux de réforme dans le cadre d’apprentissage ou de training. Par ailleurs, l’anesthésie et l’analgésie font partie de nombreux projets et sont essentiels au raffinement des procédures, autant pour le bien-être des animaux que pour la cohérence des résultats obtenus. La validation de différents protocoles anesthésiques est également un objectif de ce projet

Bénéfices attendus

Le projet permettra d’assurer une maitrise des gestes techniques réalisés par tous les utilisateurs de la zootechnie afin que ceux-ci puissent travailler en autonomie et dans le respect de la réglementation relative aux compétences des personnels. Ces formations permettront de s’assurer du bien être des animaux lors des procédures. Ces bonnes pratiques diminueront également le biais dans les protocoles expérimentaux lié au stress ou à la douleur de l’animal. La validation de différents protocoles anesthésiques permettra d’adapter au mieux les molécules utilisées pour une plus grande sécurité de l’animal, en regard des attendus du projets.

Procédures

Les animaux, vigiles ou anesthésiés, pourront subir diverses administrations, injections, prélèvements sanguins ainsi qu’un tatouage aux phalanges. 3 gestes maximum seront réalisés sur chaque animal, la durée étant variable selon le degré de formation du stagiaire. Pour les animaux vigiles, la contention de l'animal par un personnel peu expérimenté peut aller jusqu'à 60 secondes. Une fois la contention réalisée ou sur animal anesthésié, les injections et administrations sont réalisées en moins de 15 secondes. Les injections et prélèvements sanguins plus techniques ne seront réalisés qu'une seule fois, sur animal anesthésié, et peuvent durer jusqu'à 60 secondes. La piqûre du tatouage dure moins de 5 secondes. Les animaux subiront également des injections pour la validation des protocoles anesthésiques et analgésiques (3 secondes) et pourront être anesthésiés jusqu'à 45 minutes..

Impact sur les animaux

Ce projet a pour but de former ou valider des gestes techniques sur des personnels peu ou pas expérimentés. Ces gestes mal maitrisés peuvent engendrer un stress ou une douleur chez l’animal : contention plus longue, injection hésitante, difficulté à trouver le site précis lors des injections/prélèvements veineux. Les tests anesthésiques pourront engendrer des réveils précoces ou au contraire tardifs, avec des effets secondaires plus ou moins marqués selon les molécules utilisées.

Devenir

Afin de ne pas multiplier le stress et la douleur des animaux ayant participé à 3 sessions de training, ils seront mis à mort après chaque procédure.

Remplacement

Pour l’apprentissage de l’approche de l’animal, de sa contention et des gestes techniques, les réactions comportementales de l’animal vigile, ainsi que les spécificités anatomiques propres à chaque individu et les caractéristiques hémodynamiques d’un animal vivant ne peuvent être reproduites par des méthodes alternatives (mannequin ou peluche). Les animaux vivants restent indispensables pour former les personnes les utilisant dans les mêmes conditions que lors de la réalisation du projet scientifique.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques, nous n’utiliserons que des animaux de réforme : ces derniers sont les animaux disponibles de notre établissement n’étant pas rentrés dans un protocole de recherche. Le nombre d’animaux sera également limité par participant. Pour les tests anesthésiques, la validation des protocoles nécessite un nombre limité d'animaux et ne fait pas l'objet de tests statistiques.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cages ventilées, selon les normes de la directive 2010/63/EU, avec un enrichissement dans chaque cage (parmi igloo, batônnets de bois, coton, sizzle nest), et un statut sanitaire contrôlé trimestriellement. Des méthodes alternatives à la préhension par la queue sont utilisées, les procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie quand cela est possible, et l’utilisation de tapis chauffants limite l’hypothermie lors des anesthésies. Les animaux utilisés sont choisis en bonne santé et sans phénotype dommageable. L’encadrement est réalisé par du personnel compétent, et l’état de santé des animaux contrôlé quotidiennement. Toute altération du bien-être (prostration, perte de poids, piloerection, blessures) des animaux réformés les écarte de toute utilisation de training.

Choix des espèces

Les équipes de recherche, pour la majorité, utilisent la souris comme modèle animal dans leurs projets expérimentaux. La zootechnie accueille donc principalement des souris et le personnel de la zootechnie ainsi que les utilisateurs sont amenés à travailler sur ce modèle. L’objectif de ce projet étant d’améliorer la méthodologie des gestes techniques, il apparait judicieux et indispensable de travailler sur la souris. Des manipulations sur rats sont également prévues dans le cas où des protocoles expérimentaux utilisent cette espèce. Les animaux seront utilisés en fonction de leur disponibilité. Le critère d’âge n’est pas restricif sur l’utilisation de ces animaux.

Pour savoir lesquels portent la bonne modification génétique, les rongeurs de 350 lignées élevées dans un même établissement sont génotypés un par un. 158 000 souris et 1 000 rats vont être utilisés sur cinq ans, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chacun subit, vigile, le prélèvement d'un fragment de 2 mm d'oreille ou de 1 mm de queue, cinq secondes de geste et jusqu'à trente secondes de contention. Ceux qui portent les modifications recherchées partent vers d'autres projets, les autres sont mis à mort, sans que le RNT indique combien d'animaux relèvent de ce second cas.

Objectifs

Les animaux génétiquement modifiés permettent la modélisation de plusieurs maladies humaines comme les cancers, les maladies auto-immunes… et sont donc indispensables en recherche fondamentale pour comprendre le fonctionnement et les causes de ces maladies. Les animaux génétiquement modifiés sont porteurs d’une ou de plusieurs modifications génétiques et leur gestion nécessite souvent la détermination de la variante du gène. Il est essentiel de connaitre quelles sont ces modifications génétiques pour utiliser les animaux d’intérêt dans les projets affiliés. Pour cela il est nécessaire de : - Réaliser un prélèvement de tissu sur des jeunes rongeurs (entre 10 et 21 jours) et rechercher la présence ou non des modifications génétiques transmises par leurs parents. L’objectif de ce projet est de caractériser génétiquement les 350 lignées de souris et de rats (génétiquement modifiées) élevées dans notre établissement utilisateur. Cette caractérisation permet une gestion optimale des différentes lignées utilisées par la suite dans les différents projets scientifiques. La méthode de prélèvement de tissus choisie permet d’obtenir des résultats fiables concernant l’analyse des échantillons prélevés, tout en garantissant le bien-être des animaux. De plus, cette méthode de prélèvement de tissus convient aux exigences de la structure.

Bénéfices attendus

Les rongeurs génétiquement modifiés sont élevés dans le but d’inclure des modifications génétiques particulières. Il est essentiel de connaitre quelles sont ces modifications génétiques pour utiliser uniquement les animaux d’intérêt dans les projets scientifiques affiliés. Les animaux génétiquement modifiés permettent la modélisation de plusieurs maladies humaines comme les cancers, les maladies auto-immunes… et sont donc indispensables en recherche fondamentale pour mieux comprendre les causes de ces maladies. Connaitre et comprendre le fonctionnement d’une maladie est essentiel pour développer des traitements ou des thérapies efficaces, agissant sur la cause et non les effets. À long terme, l'approfondissement des connaissances en recherche fondamentale et la compréhension des mécanismes des maladies étudiées permettra la mise en place de nouvelles thérapies. Les bénéfices escomptés seront ensuite l’amélioration des conditions de vie des patients atteints de ces maladies d’intérêt.

Procédures

Pour prélever un morceau de tissus des animaux afin de déterminer les modifications génétiques, le prélèvement d’un fragment de tissu à l’oreille (2 mm) ou dans de rares cas à la queue (1mm) des animaux sera réalisé. Cela sera effectué une seule fois, sur animal vigile, pour une durée courte de 5 secondes. Le prélèvement génère une douleur légère. La préhension de l’animal pour ce geste dure 30 secondes maximum.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de tissus nécessite de contentionner l’animal, ce qui peut induire un stress transitoire de courte durée chez les animaux. Ces gestes, réalisés une seule fois peuvent causer de la douleur légère et de l’inconfort chez l’animal. Dans de rares cas, si les animaux sont âgés de plus de 21 jours pour le prélèvement de tissus, alors ils seront anesthésiés par une anesthésie gazeuse.

Devenir

Les animaux comportant les modifications génétiques d’intérêt seront utilisés pour les projets scientifiques validés en parallèle. À l’inverse, les animaux ne comportant pas les modifications génétiques d’intérêt seront mis à mort selon une méthode réglementaire.

Remplacement

Les projets nécessitant des souris ou rats sont préalablement étudiés pour procéder à du remplacement. Pour chaque projet, il est justifié que les méthodes alternatives ou substitutives ne sont pas possibles pour modéliser la pathologie d’intérêt. Les méthodes alternatives pour le prélèvement de tissus ne sont pas adaptées aux besoins de notre structure.

Réduction

Le prélèvement de tissus ne se fait que sur les animaux pour lesquels il est essentiel de connaitre les modifications génétiques. Ce nombre a été calculé sur ce qui a été réalisé les 3 dernières années et extrapolé sur les 5 prochaines années. Connaitre ces modifications génétiques permet d’appliquer les procédures expérimentales uniquement aux animaux concernés. Lorsqu’il est possible de réunir les élevages pour plusieurs projets différents, tout est mis en œuvre pour diminuer la production d’animaux et de ce fait, diminuer le nombre d’animaux pour lesquels il faut réaliser l’identification et le prélèvement de tissus. Les accouplements sont gérés de façon à limiter le nombre d’animaux surnuméraires.

Raffinement

Le prélèvement de tissus est réalisé à des stades de développement précis pour que ces gestes soient indolores pour l’animal. Le prélèvement d’un fragment de tissu est réalisé à l’aide d’outils régulièrement nettoyés et stérilisés, spécifique pour réaliser ce genre de prélèvement. Dans de rares cas où les animaux sont âgés de plus de 21 jours pour le prélèvement de tissus, ils seront préalablement anesthésiés par anesthésie gazeuse. La méthode de prélèvement de tissus provoque moins d’inconfort chez l’animal que la précédente méthode utilisée dans notre établissement utilisateur.

Choix des espèces

Les souris et rats permettent le développement de modèles génétiquement modifiés pertinents pour les différentes thématiques de recherche de notre établissement utilisateur (immunologie, infectiologie, neurologie…). Les animaux seront utilisés seront de jeunes rongeurs, selon les recommandations d’âge pour les gestes réalisés (prélèvement de tissus à l’oreille ou à la queue) entre 10 et 21 jours de vie.

415 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Les femelles gestantes reçoivent une injection sous contention de moins de trente secondes, puis sont mises à mort deux heures plus tard pour que leurs fœtus soient prélevés et tués à leur tour, entre le quatorzième et le dix-huitième jour de gestation. Le porteur annonce des pistes pour "mieux diagnostiquer (et éventuellement traiter)" des pathologies du testicule ou l'infertilité humaine, l'objet immédiat étant de comparer la prolifération cellulaire dans le testicule de fœtus normaux et mutants. Il conclut que l'emploi de la souris est "indispensable" et que le remplacement in vitro est "impossible".

Objectifs

La vitamine A est essentielle au développement embryonnaire de tous les mammifères mais son rôle reste à définir dans les différents tissus. Les cellules dans lesquelles la vitamine A doit agir fabriquent des enzymes, qui transforment la vitamine A en un métabolite actif qui active des récepteurs nucléaires pour relayer son effet biologique. Les cellules dans lesquelles la vitamine A ne doit pas agir fabriquent d’autres enzymes, qui dégradent ce métabolite. Afin de comprendre le rôle de la vitamine A dans la formation du testicule chez la souris, nous devons comparer la prolifération des cellules entre des fœtus normaux et des foetus porteurs de mutations dans les gènes codant les enzymes qui transforment et qui dégradent la vitamine A, ainsi que dans les gènes codant les récepteurs nucléaires, aux étapes clés de la formation du testicule (entre les jours 14.5 et 18.5 post-fécondation).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de comprendre l’action de la vitamine A et de ses récepteurs nucléaires dans la prolifération des cellules constitutives de testicule. En découvrant comment la vitamine A agit sur cet évènement chez la souris, nous obtiendrons des pistes pour mieux diagnostiquer (et éventuellement traiter) des pathologies du testicule ou des cas d'infertilité chez l’Homme, qui sont en augmentation constante dans le monde.

Procédures

Chaque souris femelle gestante reçoit une injection de subtance lors d’une contention simple qui dure moins de 30 secondes. Elle est ensuite euthanasiée. Les fœtus sont isolés et euthanasiés.

Impact sur les animaux

La nuisance subie par les femelles gestantes est limitée à la contention pour l’administration par injection d’une substance permettant de mesurer la prolifération des cellules. Celle méthode est utilisée en routine au laboratoire et nous possédons l’expertise requise. L’administration de la substance entraîne une douleur équivalente à celle de l’introduction d’une aiguille sous la peau. Les femelles gestantes et les foetus sont ensuite euthanasiés de sorte qu'ils ne souffrent pas.

Devenir

Toutes les femelles gestantes sont euthanasiées pour permettre le prélèvement des fœtus. Elles ne peuvent pas être gardées en vie, réutilisées, adoptées ou replacées. Tous les fœtus prélevés sont euthanasiés pour les analyses moleculaires ou sur coupes histologiques. Ils ne peuvent pas être gardés en vie, réutilisés, adoptés ou replacés.

Remplacement

Le testicule est formé de diverses cellules qui ont toutes un rôle essentiel pour la différenciation des cellules germinales. A l’heure actuelle, nous ne sommes pas capables de reproduire in vitro les conditions nécessaires à la formation d’un testicule. En effet, les techniques de culture cellulaire ne permettent pas d'appréhender le développement dynamique du testicule, qui nécessite vascularisation, contexte tridimensionnel et interactions entre les cellules. Par conséquent, l'emploi d’un modèle animal comme la souris récapitulant toutes les étapes complexes de ce processus de développement, est indispensable. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.

Réduction

La stratégie des accouplements fait en sorte que des contrôles, des mutants simples et des mutants doubles sont obtenus dans les mêmes portées. Relever les jours d’accouplement permet d’anticiper la date de mise à mort des femelles gestantes et de prévoir les dissections des fœtus. Utiliser à la fois les fœtus mâles et les fœtus femelles est impossible, puisque nous étudions le testicule. Les nombres de fœtus requis sont calculés au plus juste pour satisfaire aux exigences en matière de qualité des résultats obtenus et à la robustesse de leur validité statistique. Dès que le nombre de fœtus requis pour un stade donné est atteint, les prélèvements à ce stade donné sont arrêtés. De plus, dans la mesure où chaque stade est planifié l’un après l’autre, du plus précode (14.5 jours post-fécondation) au plus tardif (18.5 jours post-fécondation), si l’analyse d’un stade révèle qu’il n’est pas nécessaire d’étudier le stade suivant, alors le projet est arrêté.

Raffinement

Les étapes expérimentales mises en œuvre engendrent une douleur équivalente à celle de l’introduction d’une aiguille sous la peau. La qualité de la contention permet de limiter le stress imposé à l’animal par la procédure. Le personnel est formé à cet effet. Les solutions sont amenées à la température ambiante pour limiter l’inconfort de la femelle. Le bien-être des animaux est surveillé tous les jours et toute altération du comportement (souffrance, angoisse) est immédiatement discutée avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) pour prendre les mesures correctives nécessaires (soins, euthanasie, le cas échéant). Les animaux seront hébergés par deux ou par trois dans des cages comportant différents types d’enrichissement tels qu’un tunnel de transfert et des fibres pour la construction d’un nid afin de leur permettre d'exercer les activités spécifiques à leur espèce.

Choix des espèces

De par sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques et physiologiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, la souris est un excellent modèle pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Par ailleurs, le développement embryonnaire normal du testicule est décrit très en détail ce qui en fait un modèle de choix. Nous utilisons une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée. Tous les modèles génétiquement modifiés permettant d’étudier la fonction des gènes d'intérêt dans le testicule fœtal des souris sont déjà à notre disposition. Les femelles gestantes reçoivent la subtance permettant de mesurer la proliferation des cellules 2 heures avant leur euthanasie. Elles sont euthanasiées à différents moments du dernier tiers de la gestation, de sorte que la période de développement du testicule fœtal qui nous intéresse soit couverte: de 14.5 jours post-fécondation (période de différenciation des cellules somatique terminée et démarrage de l’entrée en quiescence des cellules germinales), à 18.5 jours post-fécondation (architecture du testicule et quiescence des cellules germinales établies).

Les souris homozygotes de cette lignée développent à partir de quatre mois une cardiomyopathie qui évolue en insuffisance cardiaque vers sept mois, accompagnée d'une cyphose, d'une atteinte des muscles squelettiques et d'une perte d'environ 20 % de leur poids. 980 souris vont être utilisées pour entretenir cet élevage, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, 106 d'entre elles subissant une biopsie de queue pour génotypage. Le porteur indique que les animaux sont mis à mort systématiquement à l'âge de sept mois, pour limiter la contrainte de ce phénotype qu'il qualifie lui-même de dommageable. Les reproducteurs sont tués en fin de période de reproduction pour prélèvement d'organes, les souriceaux alimentant les projets de l'équipe déjà en cours ou à venir.

Objectifs

Le but de ce projet est d’entretenir une lignée transgénique de souris, modèle murin d’une pathologie neuromusculaire héréditaire. Cette pathologie est une maladie rare et à l’heure actuelle il n’existe pas de thérapie curative pour les patients. Cette lignée générée par notre équipe est un outil essentiel pour approfondir nos connaissances sur la physiopathologie et le développement de thérapies innovantes pour cette pathologie. Cette lignée, n’est pas commercialisée et n’est donc pas disponible en dehors de notre établissement utilisateur. Ce projet permettra le maintient de cette lignée, pour fournir les animaux, pour ce projet et pour les autres projets de l’équipe déjà en cours et approuvés par le ministère ou à venir qui feront l’objet d’un dépôt de dossier afin d’obtenir les autorisations nécessaires.

Bénéfices attendus

Le bénéfice premier de projet est de maintenir notre lignée de souris transgénique en évitant la dérive génotypique afin de fournir des animaux pour les projets en cours ou à venir de l’équipe. Cette production d’animaux permettra de fournir des lots expérimentaux qui seront utilisés pour mettre en évidence des nouveaux mécanismes de signalisation moléculaire impliqués dans le développement d’une pathologie neuromusculaire héréditaire ou de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. On estime la prévalence de cette pathologie est environ 1 à 2 cas pour 100 000 personnes dans la population générale, les futurs traitements pourraient donc bénéficier à plusieurs milliers de personnes.

Procédures

Une biopsie de queue d’environ un millimètre sera réalisée sur une partie des animaux (106) pour lesquels une identification génétique est nécessaire. Le phénotype dommageable des souris homozygotes débute à 4 mois avec l’apparition progressive d’une cardiomyopathie dilatée d’abord légère et qui évolue vers 7 mois en insuffisance cardiaque. Cette progression de l’atteinte cardiaque est corrélée à une atteinte progressive et moins sévère des muscles squelettique de type oxydatif, l’apparition d’une cyphose légère et une perte de poids d’environ 20 pour cent par rapport au poids de l’animal à 4 mois (environ 20 g). Ce phénotype réduit l’espérance de vie des animaux.

Impact sur les animaux

Le phénotype dommageable des souris homozygotes débute à 4 mois avec l’apparition progressive d’une cardiomyopathie dilatée d’abord légère et qui évolue vers 7 mois en insuffisance cardiaque. Cette progression de l’atteinte cardiaque est corrélée à une atteinte progressive et moins sévère des muscles squelettique de type oxydatif, l’apparition d’une cyphose légère et une perte de poids d’environ 20 pour cent par rapport au poids de l’animal à 4 mois (environ 20 g). Ce phénotype réduit l’espérance de vie des animaux. La biopsie pour le génotypage d’une partie des animaux qui constitue une nuisance (douleur et stress) de courte durée.

Devenir

Les animaux reproducteurs seront euthanasiés en fin de période reproductive pour prélèvement d'organe. Les souriceaux issus des accouplements serviront d’une part comme animaux reproducteurs, et d’autre part ils serviront en utilisation continue au sein des projets de recherche en cours ou à venir préalablement autorisés

Remplacement

Nous sommes toujours dépendant de l’utilisation de modèles animaux car les questions que nous abordons, ne peuvent pas être abordées uniquement avec des modelées cellulaires. Effectivement, les cardiomyocytes ayant atteint un état de différenciation terminale ne se divise pas et ne peuvent pas être maintenues en cultures. Il est par conséquent impossible d’en dériver une lignée cellulaire stable. D'autre part, les quelques modèles cellulaires existant ne reproduisent pas les conditions physiologiques spécifiques des cellules cardiaques. Ils seront toutefois utilisés pour tester certaine de nos hypothèses qui ne nécessitent pas de modèle animal.

Réduction

Pour n’utiliser que le nombre d’animaux nécessaire à ce projet (980), nous avons recourt au service d’un biostatisticien pour nous épauler dans l’élaboration de notre plan expérimental. Le nombre d’animaux inclus dans ce projet est évalué à partir de la connaissance et l’expérience approfondie de l’investigateur principale en matière d’entretien de lignée de souris. Le nombre d’accouplement par an et par génotype est évalué en fonction de la durée d’un accouplement, le temps moyen entre deux portés, du nombre de portées moyen par femelle, la taille moyenne d’une portée (sevrée), du taux de sevrage, du taux de mortalité, du sexe ratio, de génotype ratio, de l’indice de reproductivité.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, 6 par cage maximum pour les cages après sevrage, jusqu'à 15 (souriceaux et reproducteur) pour les cages de reproduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire au maximum toute douleur, souffrance ou angoisse que pourraient subir les animaux: enrichissement du milieu (lanières de papier Kraft, maisons en carton), acclimatation d'une semaine avant toute manipulation, hébergement en groupe, formation technique des utilisateurs. L’isolement des animaux est évité au maximum, cependant il est possible que certains animaux se retrouvent isolés de manière imprévue (seul mâle d’une portée, animal arrivé seul d’un fournisseur, agression entre congénères, dernier animal dans la cage…). Dans ce cas, l’animal bénéficiera d’un enrichissement supplémentaire dans sa cage. Afin de réduire la contrainte liée au phénotype dommageable, une fiche de scoring est utilisée pour suivre l’évolution du phénotype et les animaux sont mise à mort systématiquement à l’âge de 7 mois.

Choix des espèces

La souris est l’animal choisi pour ce projet en raison des similitudes de son système cardiovasculaire et musculaire avec celui des humains et de l’existence d’une lignée génétiquement modifiée portant responsable à l’état homozygote d'une pathologieneuromusculaire. Cette mutation est aussi présente dans notre modèle cellulaire iPS que nous pouvons dériver en cardiomyocyte ou en myoblaste, ce qui rend comparable les résultats obtenus dans les deux modèles d’études. De plus, la souris est le modèle animal le plus utilisé dans ce champ de recherche, permettant ainsi des comparaisons avec d’autres études ou d’utiliser les résultats d’autres études afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les animaux seront utilisés à maturité sexuelle entre 3 et 6 mois avant l'apparition des stymptomes dommageables et entre 5 et 7 jours de vie pour les biopsies caudales pour génotypage.

Pour installer dans l'établissement un modèle de décollement de la rétine, 1 600 lapins, 1 600 rats et 1 600 souris vont être utilisés dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. Le décollement est provoqué par une injection sous la rétine, suivie d'examens oculaires hebdomadaires, d'instillations quotidiennes, d'injections dans l'œil une à deux fois par semaine et de prises de sang. Le porteur affirme que le décollement de rétine n'est pas douloureux chez l'être humain et transpose ce constat aux autres animaux, tout en indiquant que l'œil injecté subira une altération permanente de la vision. Les animaux qui suivent la procédure entière sont tués pour analyse des tissus, les autres, environ 10 %, sont gardés en vie et réutilisés dans une autre procédure.

Objectifs

La rétine est un tissu photo sensible nécessaire à la vision. Elle tapisse l’intérieur de l’œil, reçoit les informations lumineuses, les transforme en signaux nerveux et les transmet au cerveau. Certains troubles de la vision peuvent être dus à un décollement de rétine. Les causes du décollement rétinien peuvent être variées (myopie, opérations de la cataracte, diabète, tumeurs de l’œil, forte inflammation, vieillissement des structures de l’œil, un coup porté à l’œil, ou encore hérédité…). Le mécanisme impliqué est le plus souvent une accumulation de liquide sous la rétine, qui pénètre par des trous ou des déchirures de la rétine. Lors de ce décollement la rétine est séparée physiquement de son support, si cette séparation persiste les cellules de la rétine meurent, la zone décollée ne fonctionne plus. Sans traitement par l’ophtalmologiste le décollement s’étend, pouvant ainsi entrainer des lésions irréversibles de la rétine et même la cécité. L’objectif de ce projet est de mettre en place dans l’établissement utilisateur, un modèle de décollement rétinien chez les rongeurs et le lapin, afin de tester des traitements qui vont permettre la survie de la rétine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de participer à la recherche de nouveaux traitements neuroprotecteurs de la rétine dans les cas de décollement rétiniens.

Procédures

Le déclenchement du modèle expérimental est dû à une injection sous rétinienne. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques (imagerie, observations au biomicroscope, électrorétinogramme) réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes et se produit une fois par semaine Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour. Les injections peuvent être quotidiennes pendant une durée d’une semaine. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leur fréquence est limitée, une à deux fois par semaine. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt.

Impact sur les animaux

Les maladies neurodégénératives de la rétine et les décollements ne sont pas douloureux chez l'homme, et par transposition chez l’animal. Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, la pathologie devrait entrainer une altération permanente de la vision sur l'œil ayant reçu l'injection. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale, seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Les animaux n’ayant pas reçu la totalité de la procédure expérimentale (estimé à environ 10%) pourront être gardés en vie et réutilisés dans une autre procédure, après avis du vétérinaire si besoin.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse ...) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques, chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. La possibilité d'induire les deux yeux sera étudiée pour limiter le nombre d'animal en étude si cela est compatible avec le mode de traitement. L'induction de la pathologie dans l'œil entraine une altération partielle et permanente de la vision, nous avons déjà expérimenté ce modèle dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés par deux au minimum en première intention, avec enrichissement à ronger et un abri pour les rongeurs plateforme pour les lapins. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction de la quantité et des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux.