Procédures légères

Une souris qui convulse est tuée sur le champ, et la prostration ou les tremblements déclenchent aussi l'arrêt immédiat du protocole. 2 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dont 1 200 fœtus sortis un par un de la corne utérine et décapités, et 720 souris porteuses d'un phénotype dommageable dont le porteur indique que 10 % meurent avant trois mois et environ 30 % avant quatre mois, de crises d'épilepsie spontanées. Une partie subit une ouverture de la cage thoracique sous anesthésie profonde pour une perfusion intracardiaque de fixateur, opération de trente minutes menée sans réveil. Ces souris ne sont produites que pour l'analyse post-mortem, aucune autre procédure expérimentale n'étant prévue, et le projet se ramène à fabriquer des individus atteints pour prélever leur cerveau.

Objectifs

Le but de ce projet est d’analyser les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sont impactés dans un syndrome neurodéveloppemental avec retard mental, autisme, déficit moteur et épilepsie. Le gène déficitaire dans ce syndrome est exprimé dans le cerveau au cours du développement et chez l’adulte. Les modèles que nous étudions présentent une inactivation soit d’une copie, soit des deux copies du gène spécifiquement dans une population de neurones, les neurones produisant le neurotransmetteur GABA qui est le principal neurotransmetteur inhibiteur dans le cerveau. Cette approche nous a permis de montrer que la plupart des symptômes associés au syndrome dont l’épilepsie et les troubles autistiques étaient liés à l’inactivation du gène dans cette population neuronale. L’inactivation des deux copies du gène nous permet de comprendre le rôle de ce gène dans les neurones GABAergiques au cours du développement. Le but ici est maintenant de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sont impactés dans ces modèles en regardant quelles sont les sous-populations de neurones GABAergiques affectées par des études immunohistologiques et les voies moléculaires dérégulées grâce à des études moléculaires. Les animaux de cette étude sont uniquement dédiés à de l’analyse post-mortem et ne font pas l’objet d’autres procédures expérimentales. Ils font l’objet d’une demande d’autorisation de projet pour phénotype dommageable. Le modèle avec inactivation d’une copie du gène présente des épilepsies spontanées qui se déclarent à partir de 6-8 semaines tandis que le modèle avec inactivation des deux copies du gène entraine une absence de formation d’une structure du cerveau appelée striatum servant à l’exécution des mouvements. L’absence de striatum entraine des spasmes musculaires à la naissance et le décès des petits dans les premiers jours de vie. Les études sur ce modèle ne concernent donc que les foetus dans le dernier tiers de développement (à partir de 15 jours de développement embryonnaire) et jusqu’au jour de naissance, c’est-à-dire avant que le phénotype dommageable ne s’exprime.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de permettre la production de souris et de fœtus pour 2 modèles murins impliqués dans le syndrome neurodéveloppemental avec retard mental, autisme, déficit moteur et épilepsie. Ces 2 modèles présentent des phénotypes dommageables dont la caractérisation nous permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques à l’origine des troubles du neurodéveloppement associés à cette pathologie.

Procédures

Une partie des souris subissent une chirurgie sans réveil pour pouvoir fixer le cerveau de manière optimale. Pour cela, une anesthésie profonde est couplée à un anti-douleur. La procédure consiste en un acte chirurgical avec une ouverture de la cage thoracique et perfusion par voie intracardique d'un agent de fixation. La procédure dure environ 30 minutes et n'est réalisée qu'une seule fois par souris, celle-ci étant sans réveil.

Impact sur les animaux

Des épilepsies apparaissent chez certains animaux dont une copie du gène a été inactivée dans les neurones GABAergiques à partir de l’âge de 6-8 semaines. Ces crises se caractérisent par des myoclonies (secousses musculaires localisées au niveau des vibrisses, de la face, des oreilles et des membres antérieurs) ainsi que des crises tonico-cloniques (une course intense, une perte d’équilibre et une chute sur le flanc accompagnée de myoclonies généralisées pendant quelques secondes). Ces crises sont généralement indolores car il y a perte de connaissance. Si la crise est forte, certaines souris peuvent aller jusqu’à la crise tonique qui se manifeste par une hypertonie des quatre membres de la souris tendus en direction de l’appendice caudal. Cette dernière peut s’accompagner de la mort de l’animal.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure car leur cerveau est prélevé pour des analyses moléculaires et histologiques

Remplacement

Pour les études concernant le cerveau, il n'existe à l'heure actuelle pas d'alternative à l'utilisation des animaux. Les organoïdes cérébraux, censés mimer la structure et les fonctions principales du cerveau, n’ont pas la capacité de répliquer toutes les structures et réseaux neuraux d’un cerveau adulte. Il n'existe donc pas encore de modèle de cerveau in vitro ou autre permettant de réaliser les analyses qui sont faites dans ce projet.

Réduction

Pour chaque étude, les effectifs ont été calculés afin d'avoir un nombre minimal d'animaux d’intéret (n=6 individus par sexe et âge) tout en ayant des résultats scientifiquement et statistiquement interprétables. Nous prévoyons de produire 10 lots par an sur 5 ans, soit 12 x 10 x 5 = 600 animaux au phénotype dommageable. Nous prévoyons des animaux supplémentaires pour compenser la perte de certains animaux lors de crises épileptiques. En effet, nous avons observé qu’environ 10% des souris décèdent lors des trois premiers mois et ~30% avant 4 mois). Basé sur une estimation de la moitié des animaux qui seront sacrifiés avant l'âge de 3 mois et l'autre après, nous aurons besoin de produire 120 animaux en plus, ce qui donne un total de 600 + 120 = 720 animaux . Nous produirons aussi des mâles au phénotype dommageable pour de nouveaux accouplements. Sachant que nous perdons environ 30% de ces mâles avant l’âge de 4 mois et que certains mâles ont du mal à se reproduire, nous estimons devoir produire en continu 6 animaux en âge de se reproduire. A cela, nous devons ajouter le même nombre de femelles qui seront aussi produites en même temps. Nous produirons donc 6 animaux x 2 sexes x 4 trimestres x 5 ans = 240 animaux. Pour les analyses des foetus, nous prévoyons de produire 10 lots par an sur 5 ans, soit 12 x 2 génotypes x 10 x 5 = 1200 foetus. Nous utiliserons donc au maximum 2160 animaux.

Raffinement

L'état général et le comportement des souris est suivi quotidiennement par l'animalier: examen de l’apparence de l’animal, de l'état du pelage, de la coloration des muqueuses, évaluation de l'état de souillure de l'arrière-train, analyse visuelle de la respiration. Le premier signe d'alerte sera une perte de poids, un arrière-train souillé et un pelage mal entretenu qui entraînera une surveillance accrue (niveau 1). Le second signe d'alerte sera la prostration (et/ou des tremblements) qui entraînera un arrêt immédiat du protocole et l'euthanasie de l'animal (niveau 3). Certains animaux avec inactivation d'une copie du gène d'intérêt pouvant présenter des crises convulsives spontanées à n’importe quel moment à partir de l’âge de 6-8 semaines. Cependant, les crises ayant tendance à apparaitre après stimulation, elles peuvent se produire lors de la manipulation de l’animal. Afin d'éviter au mieux le stress pouvant provoquer une crise chez ces animaux, ceux-ci seront manipulés avec un tunnel lors des changes de cages. Si nous observons une souris qui convulse, celle-ci sera euthanasiée. Les souris avec inactivation des deux copies du gène d'intérêt développent des spasmes musculaires (dystonie) peu après leur naissance et meurent pendant les premiers jours de vie. Ces animaux sont prélevés et mis à mort avant que le phénotype dommageable n’apparaisse. Les foetus seront sortis de la corne utérine un par un et euthanasiés par décapitation directement afin de réduire au minimum le stress lié à cette sortie. 

Choix des espèces

Cette étude vise à comprendre le rôle du gène d'intérêt dans le développement et le fonctionnement des neurones inhibiteurs GABAergiques. L’utilisation d’un modèle d’inactivation conditionnelle permet d’étudier l’impact spécifique de ce gène dans ces neurones. Cette étude requiert un modèle animal suffisamment proche de l’homme tel que la souris. Les animaux sont utilisés à différents stades pré- et postnatals : E15.5-E18.5, avant sevrage (1-12 jours) juvénile (3-6 semaines), adulte (2-4 mois). Les études nécessitent de comprendre le développement dès le stade embryonnaire et jusqu’à l’établissement de la pathologie à l’âge adulte.

Tuées à la fin du protocole pour que leurs organes soient prélevés et la quantité de produit mesurée organe par organe, 424 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une ou deux injections dans une veine ou directement dans le cerveau, cette dernière voie demandant jusqu'à une heure de préparation en cadre stéréotaxique et pouvant provoquer des douleurs, des saignements et des dommages cérébraux irréversibles. S'y ajoutent des séances de micro-scanner et d'imagerie optique sous anesthésie générale, jusqu'à deux par jour les trois premiers jours puis une par jour jusqu'au septième. Le porteur affirme qu'aucun modèle de remplacement ne permet d'évaluer la biodistribution d'un produit dans un "organisme entier" vivant, et n'envisage de garder en vie que "la ou les souris background" si cela s'avère possible.

Objectifs

D’après l’Organisation Mondiale de la Santé, la schizophrénie, la sclérose en plaque et la maladie de Charcot touche 24 millions, 1,8 millions et 500 000 personnes dans le monde respectivement. Afin de mieux comprendre les maladies neurologiques, psychiatriques ou auto immunes (comme la schizophrénie, la sclérose en plaque ou la maladie de Charcot (également appelée sclérose en plaque amyotrophique)) qui sont des maladies multifactorielles et ainsi développer de nouveaux médicaments thérapeutiques. Dans le cas de la sclérose en plaque et la maladie de Charcot, il n’existe à ce jour aucun traitement permettant de guérir la maladie. Pour la sclérose en plaque, les traitements actuels permettent seulement d’éviter les récidives des poussées et de freiner la progression de la maladie. De nouvelles recherches ont démontré l’implication de protéines rétrovirales endogènes (de la famille des rétrovirus endogènes humain gamarétroviraux HERV) dans le développement de la maladie. Ces protéines sont retrouvées dans le sang, le cerveau et /ou le liquide céphalo rachidien de patients atteints de sclérose en plaque ; cette protéine a même été retrouvée dans certains cas de Covid long. C’est pourquoi ces protéines rétrovirales endogènes semblent être un facteur clé à étudier dans le cas de sclérose en plaque mais probablement dans le cas d’autres maladies neurologiques, psychiatriques ou auto immunes. L’objectif de ce projet est de développer des anticorps ciblant ces protéines rétrovirales endogènes. Les anticorps peuvent êtres couplées a des fluorochromes ou rendu bioluminescent afin de suivre leur biodistribution. Plusieurs voies d’administration seront testés au cours de ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera dans un premier temps à avoir une meilleure compréhension de la biodistribution d’anticorps marqués et/ou de produits afin de définir la voie d’injection la plus pertinente puis dans un deuxième temps aux développements de nouveaux médicaments dans le cas de maladies neurologiques, psychiatriques ou auto-immunes et éventuellement à leur mise sur le marché dans le but de proposer de nouveaux médicaments thérapeutiques.

Procédures

Les animaux recevront une ou deux injections soit par voie intraveineuse ou par voie intracérébrale en respectant les volumes d’injections recommandés. Les injections par voie intraveineuse pourront être fait sur animal vigile et seront réalisées en quelques secondes (temps inférieur à 1 minute). Les injections par voie intraveineuse réalisées sous anesthésies et en comptant l’anesthésie dure environ 5 minutes. Les injections intracérébrales peuvent durer jusqu’à 10 minutes. Plus l’injection dans le cerveau est lente et mieux c’est pour l’animal. La chirurgie donc du placement de la souris dans le cadre stéréotaxique et la préparation à l'injection cela dure entre 30 minutes à maximum 1 heure par animal. Des examens micro scanner ou d’imagerie optique pourront être réalisés sous anesthésie générale. Un examen micro-scanner peut aller jusqu’à 20 minutes, celui de fluorescence est d’en moyenne 5 minutes, la fréquence des examens sera de maximum 2 acquisitions par jour les 3 premiers jours puis 1 acquisition par jour jusqu’au 7e jour.

Impact sur les animaux

Les animaux seront manipulés régulièrement pour différents actes avec ou sans anesthésie susceptibles d’induire un stress : pesées, injections par voie intraveineuse et acquisition d’imagerie optique. Les injections intracérébrales sont susceptibles d’induire des douleurs voire des saignements pouvant induire des dommages irréversibles dans le cerveau. Différents signes cliniques pourront être observés tels qu’une perte de poids, des troubles neurologiques ou des signes liés à la douleur. Une prise en charge analgésique avant et après injection sera donc réalisée. Des mesures spécifiques seront prise pour cette voie d’injection. Les animaux pourront présenter des réactions différentes selon les produits testés et selon les voies d’administration choisies pouvant entrainer l’apparition de signes cliniques (pertes de poids liées aux éventuelles anesthésies voire inflammation du site d’injection).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole pour pouvoir réaliser des prélèvements d’organe et réaliser une quantification des produits par organe grâce à de l'imagerie optique ex-vivo ou par d’autres techniques in vitro. Si possible, la ou les souris background pourront être gardées en vie.

Remplacement

A l’heure actuelle il n’existe aucun modèle de remplacement permettant d’évaluer la biodistribution d’un produit dans un organisme entier vivant (modélisation d’une situation clinique), le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire.

Réduction

L’utilisation de produits rendu fluorescent ou bioluminescent vont permettre de suivre au cours du temps la biodistribution du produit par imagerie médicale sur les mêmes animaux et donc de diminuer le nombre d’animaux utiles au projet. Une étude pilote pourra être réalisée sur un nombre limité d’animaux (2 ou 3 par groupe) pour vérifier la détection in vivo des molécules marquées et s’assurer que la technique d’injection intracérébrale n’entraine pas de signes cliniques incompatible avec l’étude. L’étude principale pourra être réalisée si lors de l’étude pilote, 90% des animaux ne présentent pas de paralysie ou lésions cérébrale incompatible avec la poursuite de l’étude (c’est-à-dire sur une étude pilote de 7 souris, 0 ou 1 souris morte est un go pour démarrer l’étude pilote) et si la molécule marquée à un niveau suffisant pour être détectable et mesurable in vivo. Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables en réalisant des tests statistiques permettant d’étudier la biodistribution des produits testés, des groupes contenant un nombre de souris suffisant seront réalisés.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 7 jours minimum sera respectée. Les animaux seront hébergés en cage de manière collective durant toute la durée de l’étude. Sauf pour les animaux ayant subi une chirurgie, ces animaux pourront être herbergés seuls les 24 à 48h suivant la chirurgie (ou plus si nécessaire) (le temps nécessaire pour que la plaie soit cicatrisée et éviter que les souris s'arrachent et/ou se rongent les fils de suture). Selon les études les animaux background pourront être hébergés collectivement ou individuellement.

Choix des espèces

Le modèle souris a été choisi pour : -Sa taille réduit permettant l’utilisation de technique d’imagerie optique corps entier, -Car il s’agit d’une espèce couramment utilisée pour étudier la biodistribution en expérimentation animale et permettant de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés) -des souris sans poils pourront être privilégiés car l’absence de poils permet d’augmenter la sensibilité de détection de la fluorescence. Des souris de minimum 5 semaines seront utilisées au cours de ce projet (stade jeune adulte) afin de s’affranchir de la période de forte croissance de l’animal et d’avoir des animaux présentant un poids d’environ 20g

652 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie est irradiée aux rayons gamma ou à un faisceau d'ions lourds, une autre reçoit une irradiation à dose létale qui détruit son système sanguin et dont la mort survient en 11 à 15 jours sans greffe, une autre encore est stérilisée par un composé reprotoxique avant de recevoir une greffe de cellules souches testiculaires ou de moelle osseuse. Les données doivent servir à estimer les risques encourus par les astronautes lors de vols dans l'espace profond, sur la fertilité masculine, le système sanguin et le cerveau, et à améliorer la composition des capsules, des vêtements et du régime alimentaire des équipages. Sur le remplacement, le porteur indique que les cultures de cellules souches ne reproduisent ni la quiescence, ni les régulations hormonales, ni la réponse inflammatoire, et que seule la greffe chez un receveur vivant démontre le caractère "souche" d'une cellule.

Objectifs

Les vols spatiaux autour de la Terre ont des effets sur la santé qui ne peuvent être extrapolés aux séjours de longue durée dans l'espace profond. La Terre protège du rayonnement cosmique, un mélange complexe de radiations dont les éléments les plus toxiques sont les ions lourds. Des irradiations X ou photons répétées à faibles doses accélèrent le vieillissement et augmentent le risque de cancers. Mais il est impossible de transposer leurs effets aux faisceaux d'ions lourds plus toxiques pour les cellules. Ce projet vise à examiner les conséquences d'expositions à faibles doses sur la fertilité masculine (production de sperme), le système sanguin (risques de cancer) et le cerveau (dysfonctionnements). En l'absence de données, les risques encourus par les astronautes peuvent être analysés chez la souris adulte. Les effets des ions lourds seront comparés à ceux après irradiation obtenus dans la première partie du projet. Ces effets ne peuvent être identifiés dans des cultures de cellules qui ne reproduisent ni les régulations hormonales, ni les réponses inflammatoires, ni les interactions entre types cellulaires. Pour minimiser le nombre de souris, des tissus d'un même animal (testicules, moelle osseuse et cerveau) seront prélevés. L'accent est mis sur les cellules souches, présentes tout au long de la vie et essentielles à la production de cellules matures telles que les cellules sanguines et les spermatozoïdes, ainsi qu'au maintien du système nerveux. L'étude comprend des expériences de greffes afin d'examiner la capacité des cellules souches irradiées, testiculaires et hématopoïétiques, à produire respectivement des spermatozoïdes ou à induire des cancers chez les souris receveuses. Après immunohistologie des cerveaux irradiés, une reconstruction 3D permettra de visualiser et quantifier la production de neurones, les interactions cellulaires et l’inflammation afin d’améliorer la compréhension des disfonctionnements cérébraux observés. Différents prélèvements de sang et de tissus seront réalisés sur les souris euthanasiées pour mettre en évidence des différences entre souris irradiées et non irradiées via des dosages biochimiques, le suivi de marqueurs de stress, et l'analyse de l’expression géniques dans les tissus d'intérêt. Les procédures se dérouleront sous anesthésie et des antalgiques sont prévus avant et après les interventions. Une grille de suivi des points limites permettra de minimiser le stress et/ou la douleur chez les animaux greffés.

Bénéfices attendus

- L'analyse in vivo des effets de faibles doses d'irradiation reste délicate. Pour les radiations, des effets dégénératifs et cancérigènes ont été démontrés, mais les mécanismes moléculaires impliqués ne sont pas totalement élucidés. L'analyse comparée des cellules souches de 3 tissus soumis à des irradiations de natures différentes apportera des éléments de réponse complémentaires. - Il n'y a pas actuellement de données sur l'innocuité de l'exposition aux ions lourds à faible dose sur les cellules souches testiculaires. Ce travail permettra d'établir si elles conservent à moyen terme leurs propriétés de production de spermatozoïdes. Leur capacité à restaurer une spermatogenèse après exposition à un faisceau 56Fe sera un argument positif en faveur du maintien d'une fertilité masculine normale dans l'espace. Ces données préliminaires permettront d'analyser ensuite le risque héréditaire potentiel (génétique et/ou épigénétique) sur la descendance. - Une analyse immunohistologique en 3D des cerveaux des animaux irradiés permettra de préciser les types de cellules nerveuses altérées et l'influence de la réponse inflammatoire dans les disfonctionnements cognitifs. - Des expériences de greffes de cellules souches hématopoïétiques irradiées (impliquées dans la production des cellules sanguines) dans des animaux receveurs sains permettront de confirmer ou infirmer leur rôle dans le développement de leucémies - Pour chaque type de cellules souches, les analyses d'expression génique permettront de déterminer s'il existe ou non une signature spécifique des faisceaux de forte énergie par rapport aux irradiations de faible énergie, en fonction de la dose. Ces données serviront de base aux études ultérieures des effets d'une exposition chronique à de faibles doses de radiations, plus proche de la réalité mais techniquement impossible actuellement. Elles devraient permettre également d'améliorer les mesures de protection des équipages (composition des capsules, vêtements, régime alimentaire).

Procédures

Des groupes de souris mâles seront exposés une seule fois à des rayons gamma ou à un faisceau d'ions lourds et d'autres ne seront pas exposés (contrôle). Les conditions d’irradiation (en groupe, à l'obscurité avec bruit limité et sur une courte durée inférieure à10 min) induisent peu de stress et les doses d'exposition ne sont pas associées à de la douleur. Les souris réintègrent pour 7 jours leurs cages d'origine et font l'objet d'une surveillance régulière avant d'être euthanasiées. Les animaux receveurs sont préalablement stérilisés par injection d'un composé reprotoxique, suivi 24h après d'une greffe de moëlle osseuse pour maintenir leur système sanguin. Après 1 mois, les cellules souches testiculaires fluorescentes sont greffées (anesthésie chimique et durée 20 minutes). Deux mois plus tard, les testicules des receveurs euthanasiés sont prélevés et analysés pour déterminer la présence de spermatozoïdes fluorescents. Le système sanguin des souris receveuses est éliminé par une seule irradiation à forte dose et de la moëlle osseuse est greffée 24 h après (durée moins de 10 min). Les cellules souches des donneurs sont greffées 24 h après sous anesthésie gazeuse par une transfusion d’une durée de 5 min. Les animaux receveurs seront euthanasiés 4 mois plus tard pour permettre le prélèvement de tissus et organes et leur analyse.

Impact sur les animaux

- Le stress généré par la séance d'irradiation. De plus pour les souris irradiées à fort dose (dose létale, la mort est attendue entre 11 et 15 jours en absence de régénération du système sanguin. Signes préalables de souffrance : des problèmes oculaires, des dermatites, une perte de poids, une prostration, un pelage terne ou des vocalisations anormales. - La greffe hématopoïétique peut échouer chez les animaux traités par l'agent reprotoxique : perte de poids, prostration, vocalisation anormale. Après la transplantation de cellules testiculaires, ces animaux sont observés quotidiennement (sur 7 jours) afin de détecter la présence éventuelle de lésions cutanées, de réactions inflammatoires (suppuration), de signes de douleur ou de stress (poils hérissés, dos vouté, vocalisation anormale), et de signes d’infection. - Les différentes injections d'anti douleurs et anesthésiques peuvent également stresser les souris.

Devenir

Les animaux irradiés et contrôles non irradiés seront euthanasiés après 5 jours, pour permettre le prélèvement de tissus en vue d'analyses cellulaires ou génétiques, ou de greffes pour ceux exprimant la protéine fluorescente. Ces expériences sont destinées à déterminer les effets induits par l'irradiation : lésions dans l'ADN non réparées, mort cellulaire, arrêt de la multiplication des cellules et réduction des capacités de régénération des cellules souches. Les animaux receveurs de greffes intratesticulaires seront euthanasiés après 2 mois pour déterminer si les cellules fluorescentes greffées ont permis la régénération d’une spermatogenèse fonctionnelle (production de gamètes). Les animaux receveurs de greffes hématopoïétiques seront euthanasiés après 4 mois pour prélever et analyser leur moelle osseuse. En absence de production de cellules sanguines fonctionnelles à partir des cellules greffées, le décès des receveurs survient habituellement dans les 2 semaines suivant la greffe. Dès la détection de signes cliniques de souffrance, les animaux seront euthanasiés; et leur moelle osseuse sera analysée.

Remplacement

1) Les modèles alternatifs de culture de cellules souches de souris ne permettent pas de modéliser leur microenvironnement en conditions physiologiques, ni de reproduire l'absence de multiplication (quiescence) d'une grande partie du stock de cellules souches. Ces modèles de substitution ne peuvent rendre compte des régulations hormonales, et de la réponse inflammatoire susceptible d'être induite après irradiation. L’utilisation d’un modèle animal reste ici nécessaire pour évaluer l’effet des radiations sur un organisme. (2) La validation ultime du caractère "souche" des cellules ne peut être établie que par transplantation (greffe) de cellules chez un receveur, qui est le seul moyen de démontrer la capacité d'une cellule à restaurer une différenciation normale (propriété des cellules souches) en conditions physiologiques et assurer une régénération tissulaire.

Réduction

Les irradiations "corps entier" associées à l’étude de 3 tissus d’un même animal permettent de limiter notablement le nombre d’animaux impliqués dans ce projet. Un programme de modélisation prenant en compte les différents paramètres importants de l’expérience est utilisé pour estimer la taille des groupes expérimentaux. Il offre le meilleur ratio de probabilité de réussite dans la comparaison de groupes de petits effectifs par des tests statistiques classiques.

Raffinement

L’irradiation corps entier n’induit pas de de stress particulier, car elle est de courte durée et réalisée en groupe. Les animaux bénéficient de conditions d'hébergement enrichies (Tunnel, coton pour la nidification) et sont maintenus par paires. Des protocoles d’anesthésie/ analgésie sont en place pour minimiser la douleur. Un suivi hebdomadaire sera effectué et en cas de signes de souffrance (d’après une grille d’évaluation de l’état général) le vétérinaire sera alerté. Un traitement symptomatique pourra être mis en place, puis une euthanasie sera pratiquée si aucune amélioration n'est observée.

Choix des espèces

La souris est le modèle mammifère le plus fréquemment utilisé à cause de ses similarités anatomiques, physiologiques et génétiques avec l’Homme. Animal de petite taille, son temps générationnel est court. C'est également un modèle de référence en radiobiologie. Les membres des équipages exposés au rayonnement cosmique sont des adultes, donc les souris seront âgées de 8 à 12 semaines. L'étude de la spermatogenèse implique que l'ensemble des animaux soient des souris mâles. Les astronautes exposés au rayonnement cosmique sont des adultes, donc les souris seront âgées de 2 à 3 mois . Les animaux receveurs destinés aux procédures 2 et 3 auront de 7 à 9 semaines pour tenir compte des chronologies expérimentales (délai de stérilisation : 1 mois; analyse post greffe : 2 à 3 mois pour la spermatogenèse, 2 à 4 mois pour l'hématopoïese).

3 036 souris boivent une eau chargée en fongicides ou en résidus de plastique, les femelles un à deux mois avant la reproduction puis pendant la gestation et l'allaitement, leur descendance dès la vie utérine et jusqu'au jour de sa mise à mort. 752 jeunes et 752 souris âgées passent des tests d'interaction sociale et d'activité, 128 femelles gestantes subissent une chirurgie de 30 à 45 minutes pour électroporer de l'ADN dans le cerveau de leurs embryons, et 92 souris reçoivent un médicament de l'hyperactivité pour confirmer qu'elles en présentent les signes. Toutes sont tuées, tissus prélevés pour y chercher des marqueurs de pathologies neurodéveloppementales ou neurodégénératives. Le porteur affirme n'avoir observé ni douleur ni souffrance aux doses réglementaires autorisées dans l'eau potable, et place le bénéfice attendu dans une révision éventuelle de cette réglementation.

Objectifs

Les objectifs du projet de recherche sont d'étudier les effets de certains polluants fréquemment détectés dans notre environnement sur le neurodéveloppement et le vieillissement. Nous nous interessons à différents polluants: - les fongicides, très largement utilisés pour le traitement de la vigne et pour préserver les fruits de la moisissure grise après récolte. Des études scientifiques ont d’ailleurs révélé que des résidus de fongicides font partie des pesticides les plus fréquemment détectés dans l’alimentation française. Récemment, ces résidus ont été retrouvés dans les petits pots destinés à l'alimentation des bébés, mais aussi dans l'air et dans l'eau. Nous avons montré précédemment que l'exposition à 3 fongicides à la dose reglementaire, autorisée dans l'eau potable, aggrave les marqueurs de la maladie d'Alzheimer dans un modèle de souris génétiquement modifié. Notre objectif est donc d'étudier l'impact de ces composés sur le neurodevelopppement, puis au cours du vieillissement chez la souris. Notre hypothèse est que ces composés pourraient induire des altérations moléculaires lors du développement du cerveau conduisant à des défauts de comportements, voire à un phénotype de type autistique, caractéristique des pathologies neurodéveloppementales. De la même manière, nous nous intéressons aussi à 3 types de résidus plastiques : -les PET (polyethylène téréphthalate), les PVC (polychlorure de vinyle) et les PS (polystyrène) présents dans les emballages alimentaires. Des résidus type "nanoplastiques" contaminent directement les aliments ou l'eau des bouteilles. Par ailleurs, les "microplastiques" issus de la dégradation de déchets plastiques de plus grande taille, envahissent les océans et les eaux de surface type lacs ou rivières, et sont une voie d'entrée dans la chaine alimentaire. Leurs impacts sur l'environnement et la santé sont préoccupants. Notre objectif est d'étudier leurs effets sur le neurodéveloppement et le vieillissement.

Bénéfices attendus

Le projet aura des bénéfices sur la santé humaine : - identification des polluants perturbant le neurodéveloppement et le vieillissement (au niveau moléculaire, cellulaire et phénotypique). - les expositions utilisées dans notre modèle correspondent aux doses réglementaires à ne pas dépasser dans l'eau potable ou à faibles doses, en fonction des résultats obtenus, une révision de la réglementation actuelle pourrait être envisagée - si les animaux développent des phénotypes spécifiques de certaines pathologies (autisme, Parkinson, Alzheimer,TDAH), ces données permettraient d'expliquer en partie l'étiologie de ces maladies et de proposer des méthodes préventives.

Procédures

Les nuisances subies par les animaux sont les suivantes : 1) Exposition des animaux, femelles gestantes et progénitures, aux polluants environnementaux dans l’eau de boisson. Les femelles sont exposées entre 1-2 mois avant la reproduction et pendant toute la durée de la gestation, lactation, jusqu’au sevrage des petits. La progéniture est exposée in utéro, pendant la lactation, et jusqu’à leur date d’euthanasie. Nombre total d’animaux exposés dans l’étude : 3036. 2) Analyse de la morphologie de la progéniture, et tests d'observation et de comportements chez des animaux jeunes. Ces tests comportementaux sur la progéniture seront effectués dès 3 jours post-natal jusqu'à 3 mois. La durée est variable selon le test: entre 1 min pour les tests d'observation du phénotype, et jusqu'à 3 séances consécutives de 10 min pour les tests d'interactions sociales. Ces tests sont non-invasifs. Nombre d'animaux = 752. 3) Tests de comportements chez des animaux âgés à 3, 6, 9 et 12 mois. Les animaux ont 1 séance de 10 min par jour pendant 3 à 5 jours selon le test. Ces tests sont non invasifs. Nombre d'animaux = 752 animaux. 4) Des résultats préliminaires ont montré que les animaux exposés à certains polluants développent un comportement type trouble déficitaire de l’attention et hyperactivité (TDAH). Il existe un traitement médicamenteux chez l’humain pour traiter le TDAH, et notre objectif est d’administrer ce médicament aux souris afin de les soigner. Cela permettra de confirmer que les animaux ont bien un phénotype TDAH. Dans ce but, les souris subiront deux injections, une injection par test de comportement, mesurant soit l’activité locomotrice, soit l’impulsivité. Ces tests sont non invasifs et durent entre 5 min et 1h30. Nombre d'animaux = 92 animaux.5) Chirurgie sur des femelles gestantes pour marquer les cerveaux des embryons avec de l’ADN. Cette intervention va induire la production de protéines fluorescentes pour visualiser les cellules du cerveau en développement. La nuisance va durer le temps de l’intervention chirugicale, entre 30-45 min selon le nombre d'embryons à électroporer par femelle, et la durée du rétablissement des femelles opérées (7 jours). Nombre d'animaux = 768 (dont 128 femelles opérées).

Impact sur les animaux

D'après nos études conduites chez des souris adultes génétiquement modifiées (modèle Alzheimer) traitées aux fongicides pendant 11 mois, aux doses réglementaires autorisées dans l'eau potable, nous n'avons pas observé de douleurs, souffrance, perte de poids, stress, consécutives au traitement. De même, chez les souriceaux préalablement exposés aux polluants pendant la gestation, aux doses réglementaires autorisées dans l'eau potable, et analysés à 3 jours post-natal, nous n'avons pas observé d'anomalies morphologiques, de douleur ou de souffrance induites par l'exposition aux fongicides. Les nuisances attendues pour le traitement par les composés aux doses indiquées sont légères. Pour les chirurgies, les nuisances attendues sont des nuisances post-opératoires de classe modérée : douleurs, saignement suspect, mobilité (prostration éventuelle), aspect du pelage (terne, hérissé), éventuelle inflammation abdominale, infection ou problème de délivrance.

Devenir

A l'issue des 5 interventions décrites ci-dessus en 5.6.1, tous les animaux (3036) seront euthanasiés et les tissus prélevés pour analyser les marqueurs de pathologies neurodéveloppementales ou neurodégénératives.

Remplacement

Nous avons déjà étudié les effets des fongicides sur des modèles cellulaires. Nos travaux ont montré que les fongicides ciblés dans ce projet sont toxiques pour les cultures de neurones à de faibles concentrations. Nous étudions également les effets des fongicides sur les cellules souches issues de patients Alzheimer. Pour les différents plastiques, nous avons montré dans des études in vitro, qu'ils favorisaient la formation d'aggrégats de protéines. Toutefois, étudier les effets de ces polluants sur la cognition et le comportement, en lien avec des pathologies de type autisme ou des maladies neurodégénératives, telles que Alzheimer, nécéssite d'avoir recours à un modèle plus complexe telle que la souris.

Réduction

Pour ce projet nous envisageons d'utiliser 3036 souris sur la durée du projet, réparties en 5 procédures. Nous procéderons par étapes, avec des études pilotes avec un faible nombre d'animaux avant de générer l'ensemble des expériences prévues. D'autre part, les études sur le PVC et PET seront réalisées ultérieurement après les études sur le PS. Le nombre d'animaux adéquat a été calculé grâce à un logiciel permettant d'avoir des analyses robustes. Nous avons également tenu compte de notre expertise de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en en gardant un nombre suffisant d'animaux pour ne pas compromettre la validité statistique des expériences qui seront menées. Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées.

Raffinement

Les industriels ne sont pas tenus de faire des tests de toxicité avec les fongicides à la dose maximale autorisée dans l’eau potable par l’Union Européenne et dose utilisée dans l’étude, ni pour les résidus de plastiques, car à ces faibles doses, il n'est pas attendu de toxicité. D'après nos résultats obtenus sur les fongicides, et à ces doses, il n’est pas attendu de souffrance chez l’animal. Les animaux (5/cages) seront hébergés sous surveillance quotidienne, dans un milieu enrichi, avec un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson, avec ou sans polluants. Si les points limites adaptés à nos expérimentations sont atteints lors de l’expérimentation les souris seront euthanasiées. Concernant les souris qui subissent une chirurgie: l’acte chirurgical est réalisé de préférence le matin pour suivre le réveil des animaux pendant la journée et s’assurer de l’absence de complications post-opératoires. Les femelles seront anesthésiées pendant la chirugie. En post-opératoire un analgésique sera administré pour éviter la douleur. Les souris sont surveillées régulièrement pendant la période post-opératoire. Concernant les points limites pour les femelles électroporées, une grille de suivi adaptée sera mise en place avec 5 critères notés de 0 (bon) à 5 (mauvais). Si le score se situe entre 0 et 9, l'animal est considéré bien portant, entre 10 et 12, une surveillance augmentée est mise en place, et au delà de 12, l'animal est euthanasié. Cette décision est prise par le personnel formé qui réalisera la procédure.

Choix des espèces

Dans les modèles d'expositions aux polluants environnementaux pendant la gestation, la souris représente un modèle de choix, pour les raisons suivantes: - ce sont des mammifères donc le mode de transmission des polluants via le placenta et le lait est similaire à l'humain; - la reproduction et la gestation sont relativement rapides ce qui permet de générer les groupes nécessaires à l'étude assez rapidement; - le nombre de petits par portée est élevé, ce qui permet d'avoir une robustesse dans nos études comportementales, de prendre en compte le sexe dans les groupes et d'avoir des échantillons en nombre suffisant pour les analyses biochimiques et histologiques; - des études précédentes sur l'exposition aux polluants ont permis de mettre en évidence des modèles d'autisme et de TDAH chez la souris. Les souris sont donc un bon modèle de pathologies neuro-développementales et de vieillissement, c'est pourquoi nous privilégions les souris sauvages dans ce projet. Les mères seront traitées avec les polluants avant l'accouplement (1 ou 2 mois selon le polluant), puis pendant l'accouplement et la gestation. Elles seront en permanence sous traitement à la concentration résiduelle, comme c'est le cas de la population humaine exposée chroniquement aux polluants tout au long de leur vie. Les petits issus de ces portées seront soumis aux polluants à faibles doses pendant le développement (stade foetal), pendant la lactation et jusqu'à la date d'euthanasie prévue des animaux.

5 334 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 5 001 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 333 un niveau modéré. Les souriceaux subissent un tatouage des coussinets et une biopsie de la queue, les femelles gestantes une ouverture de l'abdomen de quarante-cinq minutes sous anesthésie, leurs embryons une injection intracérébrale, et d'autres souris une thoracotomie suivie d'une injection intracardiaque. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, étendre les connaissances sur le rôle des neurones transitoires dans le développement du cortex et la survenue de crises d'épilepsie. Sur la réduction, le porteur écrit que les effectifs découlent d'une approche statistique et de ses travaux antérieurs, sans avancer un seul chiffre pour justifier les 5 334 souris.

Objectifs

Notre projet a pour objectif de mieux comprendre les bases moléculaire et cellulaire de la génération et la mort des cellules tansitoires du cortex. Nous voulons également explorer les conséquences de l'absence d'un type neuronal sur la formation cortex cérébral et leur potentiel implication dans l'apparition de l'épilepsie.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est d’étendre nos connaissances sur la physiologie des neurones transitoires et quel est leur rôle dans le développement du cortex cérébral et la survenance de crise d’épilepsies.

Procédures

Les souriceaux des lignées subiront un tatouage des coussinets des phalanges et une biopsie à la queue pendant une contention de quelques secondes. Les femelles gestantes subiront une injection intrapéritonéale ou une intervention chirurgicale de 45 minutes sous anesthésie générale, comprenant une ouverture de l'abdomen et des points de sutures, puis une injection sous cutanées sous anesthésie d'une durée de deux minutes une fois par jours pendant 3 jours. Les embryons subiront une injection intra-cérébrale d'une durée de 5 secondes. Des animaux subiront une anesthésie générale suivie d'une thoracotomie et d'une injection intracardiaque de pendant 20 minutes.

Impact sur les animaux

La biopsie à la queue provoque une douleur. Les injections peuvent induire une douleur légère et brève. Les actes chirurgicaux des procédures peuvent entrainer une souffrance si elle est mal prise en charge par le traitement analgésique. Les étapes d’anesthésie et de contention peuvent également provoquer un stress chez l’animal.

Devenir

Tous les animaux de la procédure 1 sont mis à mort à l'issue de la procédure 1 exceptés 63 souriceaux qui seront utilisés dans les procédures 2, 3 et 4. Tous les animaux des procédures 2,3 et 4 sont mis à mort à l'issue de la procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques et génétiques.

Remplacement

Les questions scientifiques que nous nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur des cerveaux prélevés sur des embryons. Il s’agit ici d’études sur le développement et le fonctionnement du cortex cérébral, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère. Aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique, ainsi que par nos expériences antérieures sur ce type d’études de modèles animaux. L’analyse statistique sera réalisée par un test statistique adéquat.

Raffinement

Tous les animaux vivent en groupes familiaux ou sociaux dans un environnement enrichi avec eau et nourriture illimitées. Lors de la chirurgie, les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésieés et reçoivent des injections d'analgésiques avant et après l'opération. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation de la santé des animaux est mise en place. Une injection d'analgésique ou la mise à mort de l'animal est envisagée en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement et le fonctionnement du système nerveux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. En effet, seuls les mammifères présentent un néocortex organisé en 6 couches inversées. De plus, nous disposons de modèles génétiques murins permettant de répondre à nos questions scientifiques. Pour le marquage et la biopsie, les souriceaux ont entre 5 et 10 jours, âge auquel on peut tatouer les coussinets des phalanges. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. L'expérimentation de la procédure 3 est menée sur des embryons au jour de développement E10.5 qui correspond à la fenêtre d’expression de notre gène d’intérêt. Les jours de développement E14.5 et E18.5 puis les jours postnataux P1, P5, P10, P25 et P90 nous permettent de suivre la génération et la migration de nos neurones d’intérêt puis d’observer leur disparition après la naissance et les conséquences éventuelles à long terme de l'absence de notre gène d'intérêt.

Enfermés seuls en cage grillagée pendant neuf jours pour que leurs fientes soient collectées individuellement, 224 poulets de chair mâles Ross 308 sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 184 sont tués, dont les 144 placés en cage individuelle, envoyés à l'équarrissage parce qu'ils ont ingéré un marqueur ou des enzymes non autorisées en Europe, et 40 poulets surnuméraires repartent dans le circuit de consommation. Le projet mesure la digestibilité d'aliments enrichis en xylanases, des enzymes destinées à valoriser des matières premières fibreuses dans l'alimentation des volailles. Le porteur reconnaît que ce confinement peut provoquer prostration et boiteries et que les poulets peuvent ressentir de la frustration, et présente comme enrichissement une ficelle par cage.

Objectifs

Parmi les matières premières utilisées pour la formulation des aliments pour poulets, certaines d’entre elles, très intéressantes pour leur apport en énergie, contiennent également des fibres, dont les parois cellulaires sont indigestibles pour cette espèce animale. Les parois cellulaires végétales encapsulent le contenu cellulaire, réduisant la disponibilité des nutriments (acides aminés, phosphore, …) et augmentent également la viscosité de l’aliment, conduisant à une moindre digestion jusqu’à l’iléum. Les xylanases sont des enzymes capables de dégrader les parois cellulaires ; leur utilisation permet donc d’améliorer la digestibilité des aliments contenant des fibres. L'objectif de ce projet est l’évaluation de la digestibilité des aliments chez le poulet mâle Ross 308 en croissance par l’incorporation de nouvelles xylanases, non enregistrées en Union Européenne, pour lesquelles doivent être établies des mesures de digestibilité de l’énergie et de la protéine. Les digestibilités permises par ces xylanases pourront également être comparées à celles de xylanases disponibles sur le marché européen.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la sélection de nouvelles xylanases permettant d’améliorer la digestibilité de régimes alimentaires riches en fibres pour les poulets/volailles. Cette solution permettra de diversifier les sources de matières premières dans les aliments.

Procédures

En démarrage, de J0 (jour de l’éclosion) à J15, 8 aliments avec ou sans enzyme seront distribués. En croissance, de J15 à J23, 8 aliments avec ou sans enzyme avec marqueur seront distribués. De J15 à J23, les poulets seront soumis à un hébergement en cages individuelles sur une durée maximale de 9 jours, permettant une collecte individuelle des fientes (d’une durée de 4 jours) nécessaire aux évaluations de digestibilité.

Impact sur les animaux

Le confinement des animaux dans des compartiments de surface réduite pendant la période en cage individuelle de 9 jours peut être à l’origine de réactions physiologiques ou comportementales au stress (morbidité, prostration,…). Les animaux peuvent ressentir un sentiment de frustration d’être logé en cage individuelle. Le logement sur grillage pourra entrainer dans de rares cas des boiteries. L’incorporation du marqueur et de l’enzyme dans les aliments ne présente pas de nuisances pour les animaux.

Devenir

A la fin de l’essai, les 144 animaux en cage individuelle seront euthanasiés puis envoyés à l’équarrissage, car ils auront consommé un marqueur, ce qui ne leur permet pas d’entrer dans le circuit de consommation. De plus, certains animaux auront consommé des enzymes non enregistrées en Europe, ce qui ne leur permet pas d’entrer dans le circuit de consommation. Les animaux surnuméraires élevés au sol et n’ayant pas consommé d’enzyme non enregistrée en Europe ni de marqueur seront remis dans le circuit de consommation.

Remplacement

Des études préalables d’évaluation de différentes souches de nouvelles xylanases ont été réalisées in vitro, afin de sélectionner les souches les plus efficaces, dans ces conditions. L’évaluation de la digestibilité des aliments supplémentés avec ces enzymes n’a encore jamais été réalisée. L’effet d’une xylanase dans un aliment pour poulet sur sa digestibilité est la résultante d’une série de mécanismes et régulations physiologiques (digestives, métaboliques, endocrinologiques) interagissant entre elles. La complexité de ces interactions ne permet donc pas d'utiliser des modèles alternatifs comme la modélisation ou la mise en place d'études in vitro.

Réduction

Les animaux choisis seront issus du même parquet de reproducteurs, et seront tous des mâles, afin de limiter la variabilité individuelle. En effet, le sexe fait partie des variables indépendantes qui peuvent influencer la digestibilité des nutriments. La méthode de référence en Europe pour la détermination de la digestibilité de l’énergie en volaille est basée sur l’utilisation de poulets mâles. Le nombre de répétitions (de mesures de digestibilité) est estimé à 18 par groupe expérimental, avec 8 groupes au total. En effet, la mise en cage individuelle permet de récupérer 144 échantillons de fientes, soit 18 échantillons de fientes par traitement expérimental. Il y a donc 18 répétitions de digestibilité par traitement. Ceci correspond au nombre de répétitions nécessaires pour obtenir : - une différence significative de 1.56 point en digestibilité de la protéine, avec un coefficient de variation de 2% sur ce paramètre, en prenant en compte une valeur seuil de significativité de 5%, - une différence significative de 71.6 kcal en digestibilité de l’énergie (énergie métabolisable apparente), avec un coefficient de variation de 2.2% sur ce paramètre, en prenant en compte une valeur seuil de significativité de 5%. La distribution des données sera évaluée selon des diagrammes en boite à moustache afin d’identifier les données aberrantes. Après élimination des données aberrantes, les données zootechniques seront soumises à des analyses statistiques.

Raffinement

L’état de santé des animaux sera vérifié quotidiennement par les techniciens animaliers de l’établissement utilisateur. Des points limites stricts et définis à l’avance seront appliqués tout au long du projet. Chaque cage disposera d’une ficelle, afin que les animaux puissent la manipuler. Les poulets ont la possibilité de se voir, de s’entendre et d’émettre des vocalises.

Choix des espèces

L’espèce choisie pour la réalisation du projet est le poulet car les phénomènes physiologiques (digestifs, métaboliques, endocrinologiques) étudiés dans le cadre de ce projet lui sont spécifiques. Les animaux seront utilisés du jour de l’éclosion jusqu’à 23 jours d’âge. Ils pèseront environ 42g à leur arrivée, et environ 1,4 kg à 23 jours. Le projet porte sur l'évaluation de la digestibilité chez le poulet en croissance, autrement dit chez le poulet âgé de quelques semaines.

Injectés une seule fois dans le cerveau à la naissance, sous hypothermie provoquée sur une plaque métallique refroidie, les souriceaux d'une lignée modèle de la maladie de Pompe sont ensuite saignés une fois par mois pendant un, trois ou dix-huit mois. Leur force musculaire est évaluée jusqu'à quatre fois sur dix-huit mois, pendant que la myopathie s'installe : dos arqué, écartement des membres postérieurs, dandinement à la marche. 660 souris vont être utilisées, 525 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 135 d'un niveau léger. Toutes sont tuées à la fin, leurs tissus prélevés pour mesurer le sucre accumulé et l'expression de l'enzyme manquante, chez les traitées comme chez les non traitées.

Objectifs

Le but de ce projet est de développer un médicament pour traiter la forme infantile de la maladie de Pompe. Cette maladie rare d’origine génétique touche les muscles qui permettent le mouvement (en premier lieu les muscles des hanches et des cuisses), les muscles respiratoires et cardiaques ainsi que le système nerveux. Elle toucherait entre 5 000 et 10 000 personnes dans le monde. D’après le registre français de la maladie de Pompe, il y aurait autour de 200 personnes atteintes en France. À l'origine de cette maladie, une enzyme déficiente, appelée alpha-glucosidase acide (GAA), qui ne joue pas son rôle et provoque l'accumulation pathologique de sucre dans les cellules et leur déterioration progressive. Il existe plusieurs formes de maladie de Pompe selon l’âge d’apparition des symptômes: la forme infantile de la maladie de Pompe est la plus sévère. S'ils ne sont pas traités, les bébés, atteints d’une forte faiblesse musculaire dès la naissance, meurent généralement aucours de leur première année. Un traitement, qui consiste en une injection toutes les deux semaines d'une enzyme de synthèse, est actuellement disponible mais il ne soigne pas la maladie, il ralentit son développement. De plus, son efficacité est réduite au cours du temps et une partie des patients développent une forte réaction immunitaire. Avec ce traitement, la durée de vie des malades est d'environ 7 ans. C’est pourquoi il est plus que nécessaire de développer des nouveaux médicaments plus efficaces. Pour cela, la thérapie génique est un outil prometteur. Pour traiter efficacement ces nouveau-nés, nous devons corriger les organes affectés par l'accumulation du sucre (les différents muscles, le cerveau, la moelle épinière). Notre projet vise à développer des outils de thérapie génique efficaces pour cibler et corriger ces tissus et valider leur potentiel thérapeutique sur un modèle animal de le maladie de Pompe, ici il s'agit de la souris Pompe.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à proposer une alternative thérapeutique efficace à long-terme pour corriger les muscles et le système nerveux dans la maladie de Pompe. La thérapie génique consiste à corriger le défaut génétique et de traiter la maladie en une seule et unique injection. Un traitement efficace permettra de limiter l’accumulation du sucre dans les muscles et dans le sytème nerveux, et ainsi empêcher le développement de la myoptahie et prévenir l’apparition des symptômes neurologiques et cognitifs. Nos travaux sont des preuves de concept qui visent à être traduites en clinique dans un futur proche.

Procédures

Des nuisances seront liées (i) à l'injection des traitements experimentaux : stress lié à la manipulation, douleur de la piqure (une seule injection, environ 100 µL de produit); (ii) aux prélèvements de sang : stress lié à la manipulation, douleur de la piqure (prélèvement 1x par mois pendant 1, 3 ou 18 mois, de 50-100 µL); (iii) aux évaluations de la force musculaire : stress lié à la manipulation (maximum 4x sur 18 mois, environ 1 minute par test); (iv) liées à l'euthanasie : stress lié à la manipulation (x1). Chaque geste (injections, prélèvements, etc.) durera moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Des stress liés à la manipulation et à l’injection/prélèvements sont attendu sur les souris. Sur les souris malades, des effets indésirables liés à la progression de la maladie chez les souris agées de plus de 8 mois (légère cambrure de la colonne vertébrale, léger écartement des membres postérieurs, dandinement lors de la marche (début à l’âge de 8-9 mois), dos arqué, fréquent écartement des membres postérieurs (apparition à l’âge de 9-11 mois). À noter que l’injection du traitement devrait empêcher l’apparition de ces symptômes et maintenir la force musculaire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés, par une méthode réglementaire, à la fin des études. Des prélèvements de différents tissus seront réalisés afin de mesurer le niveau d'expression de notre protéine GAA ainsi que le niveau d’évolution de la maladie (baisse de sucre dans les tissus (muscles, cerveau, etc.) des souris traitées comparé aux souris non traitées).

Remplacement

Le modèle animal ne peut pas être substitué car nous avons besoin d'un organisme vivant entier pour étudier certains paramètres physiopathologiques: la correction des symptomes principaux (normalisation de la taille du coeur, réduction de taux de sucre dans l'ensemble des organes, restauration de la force musculaire), les réactions immunitaires, le passage du produit thérapeutique vers le cerveau, etc.

Réduction

Les candidats médicaments que nous testerons ont été préalablement validés sur modèles cellulaires. Le nombre d’animaux utilisé sera le minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientiquement et statistiquement fiables. Pour le garantir, nous avons utilisés une approche statistique. Le résultats de ces calculs ont montré que 5 ou 6 souris/groupe, selon les procédures et le paramètre biologique mesuré pour répondre à la problématique posée, doivent être utilisés dans le projet.

Raffinement

Une période d'acclimatation d’environ une semaine avant inclusion en PE, sera réalisé afin que les souris s'adaptent à leur nouvel environnement. Pour les PE sur souris non sevrées, les mères gestantes seront transférées en zone d'expérimentation, afin qu'elles s'adaptent aux nouvelles conditions avant la naissance des petits. Le nombre de males par cage sera limité à 5 souris afin de limiter les bagarres, et potentielles blessures. Si toutefois des bagarres sont constatées, les males agressifs seront séparés. Les prélèvements de sang seront réalisés au niveau de la veine mandibulaire sur des souris préalablement anesthésiées à l'isoflurane. La douleur générée par l’injection intracérébroventriculaire à la naissance sera prévenue par l’induction d’hypothermie (forme d’anesthésie appropriée pour des petits animaux jusqu’à l’âge de 5 jours et lors d'une procédure chirurgicale inférieure à 5 minutes). Ces expérimentations ne dépasseront pas le degré de douleur modéré. Une plaque d'aluminium sera refroidie en la plaçant sur de la glace. Un chiffon sec sera disposé sur la plaque, les souris seront placées dessus environ 5 minutes. Les souris seront gardées sur un coussin chauffant avant et après l’injection. L’euthanasie sera réalisée, par dislocation cervicale, sur souris préalablement anesthésiées à l'isoflurane. Le sacrifice sera précédé d’une injection par voie intrapéritonéale de deux anesthésiques (5 ml/kg de poids) la kétamine et la xylazine. Points limites du modèle : les souris Gaa développent une myopathie progressive. Ces signes d'atteinte musculaire sont observés généralement à partir de 6 mois. Nous attribuons un score de signes cliniques basé sur la littérature : Degré 1 : légère cambrure convexe de la colonne vertébrale, léger écartement des membres postérieurs, dandinement lors de la marche (vers 8 mois). Degré 2 : Dos arqué, légère atrophie des muscles du dos, fréquent écartement des membres postérieurs (vers 9 mois). Dès l'apparition des symptômes de degré 1, des actions seront mise en place afin de limiter des efforts musculaires (alimentation au sol). Une pesée sera réalisée 1x par semaine et si une perte de poids de plus de 10 % est constatée, du DietGel sera ajouté dans la cage. Si la perte de poids persiste et devient trop importante (>20 %), la souris sera euthanasiée. Si une souris développe des symptômes de degrés 2, elle sera euthanasiée.

Choix des espèces

Le model souris de la maladie de Pompe est un excellent moyen de déterminer l’efficacité thérapeutique d'un produit puisqu'il présente des symptomes proches de ceux observés chez l’homme : même défaut enzymatique, accumulation de sucre dans les muscles, coeur et système nerveux, diminution de la force musculaire et peut développer une réaction immunitaire. La litterature démontre qu’il est possible de corriger ses symptômes par thérapie génique, mais de nombreuses optimisations sont nécessaires pour traiter les plus jeunes individus. C'est pourquoi dans ce projet nous testerons nos candidats thérapeutiques chez des souris adultes et chez des souriceaux (entre 0 jours et 20 jours).

Quarante-deux souris femelles adultes subissent des gavages dans l'estomac chaque semaine pendant un mois, sur animal vigile, et des prélèvements de sang hebdomadaires. Les souriceaux de 48 portées sont tatoués, reçoivent des gouttelettes de probiotiques dans la bouche chaque jour pendant dix à quatorze jours, puis sont prélevés régulièrement jusqu'à leur 140e jour de vie. 234 souris en tout, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur range les mises à mort parmi des nuisances qu'il qualifie de limitées, aux côtés des pesées et des séparations mère-portée. Les mères sont tuées après le sevrage, leur microbiote n'étant plus comparable à cause de la coprophagie, et les souriceaux le sont pour accéder à leur contenu intestinal.

Objectifs

La production par le foie d’oxyde de triméthylamine à partir du triméthylamine synthétisé par le microbiote intestinal est associée au développement de l’athérosclérose (AS), une maladie cardiovasculaire qui constitue la première cause de mortalité dans le monde. En vue de prévenir cette pathologie, ce projet a pour but d’établir si une modulation néonatale du microbiote visant à diminuer la production de ces composés contrecarrerait le développement de l’AS chez les souris. La période néonatale, au cours de laquelle le microbiote intestinal se constitue étant plus adaptée à sa modification, nous testerons, chez les souriceaux, l’efficacité de différents micro-organismes pour atténuer durablement les productions de ces composés tout au long de la vie de l’animal et réduire le développement de la plaque d’athérosclérose à l’âge adulte. Pour maximiser nos chances de succès, nous comparerons 2 périodes néonatales et procéderons en 3 étapes : 1) présélection, parmi les 6 microorganismes retenus après tests in vitro, de 2 souches de microorganismes capables de réduire in vivo, chez la souris adulte, les concentrations de ces composés; 2) sélection parmi ces 2 souches de celle qui sera la plus efficace chez les souriceaux, pour moduler la production de ces composés tout au long de la vie de l’animal, et 3) vérification, dans un modèle de souriceau spécifiquement dédié à l’étude de l’AS, de la capacité de la souche retenue à réduire le développement de la maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’argumenter le développement de suppléments ou de stratégies dédiés à la prévention de l’athérosclérose via la modulation du microbiote intestinal. En outre, si le modèle animal développé permet un réel contrôle des concentrations circulantes en oxyde de trimethylamine, il augmentera les possibilités d’élucidation des répercussions physiopathologiques de ce composé qui semblent aujourd’hui pertinentes dans de nombreuses pathologies outre les maladies cardiovasculaires.

Procédures

Les 42 souris femelles adultes utilisées dans la procédure 1 seront soumises pendant 4 semaines à des gavages intrastomaccaux hebdomadaires réalisés sur animaux vigiles (2mn /gavage) et à des prélevements sanguins hebdomadaires (5min/prélèvement). Les souriceaux des 36 portées utilisées dans la procédure 2 et les souriceaux des 12 portées utilisées dans la procédure 3 seront tatoués (1 min). Ils recevront (via le dépôt de goutelletes dans la bouche) les suspensions de microorganismes probiotiques quotidiennement (5min) pendant 10 à 14 jours (selon leur allotissement) et eront soumis de façon hebdomadaire jusqu’à leurs 60e jour de vie, puis de façon bimensuelle jusqu’à leur 140e jour de vie, à des prélèvements de selles et des prélèvements sanguins (5min au total).

Impact sur les animaux

Pour les souris incluses dans ce projet, les nuisances induites par la procédure seront limitées au stress généré par les séparations mères/portées ponctuelles (< 15min/j) et par la manipulation lors de leurs pesées (< 2min/j), supplémentations par gavage (souris adultes) ou « biberonnage » (souriceaux) (< 3min/j) et mises à mort. Le traitement antibiotique qui sera administré ne devrait entraîner aucun effet indésirable spécifique puisque déjà utilisé dans des travaux antérieurs chez la souris.

Devenir

Compte tenu de l’influence connue du nombre de gestations vécues sur la physiologie et le comportement maternel et surtout du fait de la coprophagie qui peut induire une colonisation des souris allaitantes par les microorganismes administrés aux descendants, induisant ainsi une non comparabilité des microbiotes chez les mères en fin de 1ère lactation, les souris utilisées pour générer les portées pour les procédures 2 et 3 ne peuvent pas être réutilisées dans nos expérimentations animales et seront mises à mort une fois leurs souriceaux sevrés. De même, du fait de l’influence établie du microbiote intestinal sur la physiologie de l’hôte, les supplémentations en probiotiques appliquées empêchent toute réutilisation ultérieures des souriceaux, même une fois devenus adultes . En outre, la focalisation sur la période néonatale, période au cours de laquelle la récolte de selles est quasiment impossible , requiert un accès direct aux contenus intestinaux, ce qui rend la mise à mort inévitable. Il est à souligner que pour les procédures 2 et 3 dans lesquelles l’individu statistique indépendant correspond à la portée, l’utilisation à deux stades de développement des 144 et 48 (respectivement) souriceaux mâles et femelles valorisera au mieux les animaux obtenus à la mise bas.

Remplacement

Aucun des modèles in vitro existant ne permet de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques microbiens, hépatiques et immunitaires mis en jeu dans la formation de la plaque d’athérosclérose. Pour d’atteindre les objectifs de ce projet, l’étude in vivo est donc irremplaçable.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé en tenant compte du principe de réduction, des nombres d’individus statistiques nécessaires ainsi que des risques de non fécondation des souris ou d’obtention de portées naturelles de taille insuffisante. Le nombre d’individus statistiques (n=6) a été déterminé par calcul d’effectif à partir de données issues de souris adultes. La procédure n°1 repose sur le traitement de souris adultes, chacune constituant un individu statistique. De ce fait, 42 souris âgées de 6 à 8 semaines seront commandées afin de permettre la comparaison de groupes de 6 individus supplémentés avec 6 souches de microorganismes différentes en référence à un groupe non supplémenté. La procédure n°2 concerne des souriceaux allaités, l’individu statistique indépendant correspond donc à la portée. Ainsi, 38 souris saillies de l’avant-veille seront commandées afin de garantir l’obtention de 36 portées de 4 souriceaux (2 mâles et 2 femelles) qui seront réparties, pour chaque période néonatale testée, entre les 2 groupes expérimentaux et le groupe contrôle. L’utilisation à 2 stades de développement (1 souriceau de chaque sexe pour chaque portée en fin de supplémentation et au 60e jour de vie) des 144 souriceaux mâles et femelles issus de ces portées valorisera l'ensemble des animaux conservés à la mise bas. La procédure n°3 concerne également des souriceaux allaités, l’individu statistique indépendant correspond à nouveau à la portée. Dans ce cas, les souris prédisposées à l'atherosclerose n'etant pas commercialisées gestantes, nous accouplerons des souris mâles (4) et femelles (12) adultes, âgées de 8 semaines afin d‘obtenir 12 portées de 4 souriceaux (2 mâles et 2 femelles) qui seront réparties entre le groupe expérimental et le groupe contrôle. Vingt-quatre des 48 souriceaux seront mis à mort à l’issue des supplémentations et les 24 autres à la 25e semaine de vie.

Raffinement

Le stress généré par chacune des procédures - en particulier par les gavages intra-stomacaux et par la manipulation et le « biberonnage » des portées- sera limité du fait de leur mise en oeuvre, rapide mais sans brusquerie, par un personnel compétent et entraîné, dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale et des recommandations relatives aux volumes administrable par voie orale. En outre, l’usage de tapis chauffants sur lequels les portées séparées de leurs mères seront placées, l’enrichissement des cages à l’aide de frisottis pour le nid et de tunnels et l’hébergement par 3 pendant les périodes hors reproduction contribueront à minimiser le stress des mères et des souriceaux. L’absence de nuisance durable sur le bien-être animal sera néanmoins vérifiée par observation des animaux lors des visites qui seront effectuées quotidiennement, y compris le week-end. L’évaluation de l’état des animaux conditionnera les éventuelles décisions d’administration d’analgésique dans le cas d’observation de signes attestant d’une souffrance (dos vouté, ventre rétracté, facies contracté, agressivité, vocalisation).

Choix des espèces

La souris est choisie comme modèle d'étude car cette espèce animale est très utilisée pour l’étude des maladies cardiovasculaires. Ce modèle présente en outre l’intérêt d’être omnivore, de présenter un développement rapide adapté aux études de répercussions à long terme de traitements néonataux, et d’héberger un microbiote intestinal qui s’établit au cours des premières semaines de vie. De plus nos travaux antérieurs nous ont permis aux personnels impliqués dans ce projet d’acquérir une bonne maitrise de ce modèle. L’utilisation de souriceaux allaités dans 2 des 3 procédures permet à la fois de maximiser nos chances de moduler le microbiote intestinal qui s'assemble à cet âge et de mimer la situation humaine puisque le risque de développer l’athérosclérose à l'âge adulte apparaît en partie programmé au début de la vie.