Procédures légères

Des femelles gestantes subissent une chirurgie de quarante-cinq minutes pour que leurs embryons, à 14,5 jours de développement, reçoivent une injection puis une électroporation destinées à faire naître une tumeur cérébrale. 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 128 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 16 un niveau modéré. Les souriceaux sont tués à cinq ou vingt jours de vie pour analyser les propriétés électriques de leurs tumeurs et comprendre comment les connexions entre neurones et cellules cancéreuses provoquent l'épilepsie. Le porteur affirme qu'aucun symptôme n'est attendu, les signes cliniques apparaissant après la date prévue de prélèvement, et ne justifie pas l'effectif, se bornant à indiquer que "les effectifs seront déterminés" avec des tests statistiques adaptés.

Objectifs

Le cerveau est composé de differents types de cellules et la mise en place de connexions entre elles au cours du développement embryonaire est indispensable à son bon fonctionnement. L’altération de ces connexions est à l’origine de l‘épilepsie dans des pathologies cancéreuses. L’objectif de se projet est de comprendre comment les tumeurs se dévellopent et comment les connexions entre neurones et cellules cancéreuses induisent de l’epilepsie.

Bénéfices attendus

Le but de cette étude est d’identifier de nouvelles options thérapeutiques pour les patients atteints de certaines tumeurs cérébrales et souffrant d'épilepsie. Ce type d’épilepsie est souvent reistant aux traitements existants. Donc, la découverte de nouveaux mécanismes dans ces tumeurs peut fournir de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Chirugie avec analgésie et anesthésie – 45 min, une fois. Injection sous-cutanées, 30 sec, cinq fois. Inj intra-cerebrale, 5 sec, une fois.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut être source de douleur et de stress. Dans le modèle de tumeur cérébrale, les symptômes apparaissent après le délai fixé pour le prélèvement des tissus, de sorte qu'aucun symptôme n'est attendu.

Devenir

Tous les animaux seront utilisés pour le prélèvement d'organes et l'analyse phénotypique.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de différents types de cellules au cours d'une période embryonnaire spécifique, ce qui ne peut être fait qu'avec des animaux.

Réduction

Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés

Raffinement

Nous veillerons en continu au bien-être des animaux par l’utilisation d’analgésiques et d’anesthésiques lors de la procédure opératoire et par un enrichissement de leur environnement dans les cages d’hébergement.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le fonctionnement des circuits neuronaux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. Des femelles adultes gestantes âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées pour l'électroporation d'embryons. Les embryons sont électroporés à E14.5 et seront utilisés pour le prélèvement de tissus à l'âge postnatal 5 ou 20 afin d'étudier les caractéristiques électrophysiologiques des néoplasmes à deux stades du développement tumoral.

Injectés trois jours de suite dans l'abdomen avec des hydrocarbures aromatiques polycycliques associés aux particules de suie, 112 rats passent ensuite par dix échocardiographies de vingt minutes, une IRM de trente à quarante-cinq minutes et un cathétérisme cardiaque terminal. 72 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 40 d'un niveau léger, et tous sont tués pour prélever poumons, aorte et cœur. Le porteur attend une atteinte cardiaque dès l'injection, avec accumulation de tissu non contractile et baisse de la contractilité, et suit les animaux jusqu'à 180 jours. Sa grille déclenche la mise à mort au-delà de 20 % de perte de poids ou d'un score cumulé supérieur à 4, qui additionne poil ébouriffé, posture anormale, immobilité et automutilation.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de développer une stratégie intégrée visant à identifier et étudier le potentiel bioactif de mélanges complexes de polluants environnementaux émis lors de procédés de combustion et susceptibles d’induire des effets respiratoires et cardiovasculaires. Ce projet se focalisera sur une famille de polluants environnementaux ubiquistes, les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) et leurs dérivés oxygénés (oxy-HAP) associés aux particules de carbone suie.

Bénéfices attendus

L’ensemble de cette étude in vivo permettra de mettre en évidence la prédictivité du biotest et d’apporter de nouvelles connaissances sur les effets chroniques d’expositions à faibles doses de mélanges de HAP.

Procédures

Les animaux subiront des injections IP lors des injection qui durée 10 secondes (avec la contention de l'animal vigile ) pendant 3 jours consecutif puis une échocgraphie cardique d'une durée de 10* 20 minutes, une irm d'une durée de 30-45 minutes et la fonction cardiaque sera également évaluée par cathétérisme cardiaque en phase terminal d'une durée de 20-30 minutes avec prlévement d'organe a la fin de la procédures .

Impact sur les animaux

Nous supposont une atteinte cardique sur l'animal du a la toxicité intrinseque de la molécule injecter des que l'animal a recut la molécule . L'atteinte cardiaque correspond à une accumulation de tissue non-contractile et une dysfunctionnement des mitochondries. Ces deux effets induiront (probablement) une diminution de la relaxation cardiaques. L'atteinte entraine une diminution de la contractibilité cardiaque .

Devenir

Le projet nécessite des prélévements d'organes vitaux pour chaque procédure.

Remplacement

Dans l’objectif de remplacer l’expérimentation animale, nous vérifions dans ce projet l’intérêt de mesurer la bioaccessibilité in vitro, pour estimer une biodisponibilité par inhalation in vivo. Le volet in vivo faisant l’objet de cette saisine permettra de fournir des indications sur la prédictivité de méthodes in vitro.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, nous réaliserons un criblage cellulaire à l’aide de cultures pour choisir le mélange de molécules à tester (fraction bioaccessible) ce qui limite considérablement le nombre d’animaux à utiliser. Nous limitons les prélèvements tissulaires qui ne se feront qu’à un seul temps avec un suivi de la fonction cardiaque de façon non invasive pour nous guider dans la date de mise à mort, avec une durée maximale de suivi de 180 jours. Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=12 sont nécessaires pour des évaluations fonctionnelles telles que l’échocardiographie. L’analyse répétée en échocardiographie / IRM sur le même animal au cours d’une étude permet également de diminuer le nombre d’animaux par groupe nécessaire pour démontrer un effet significatif. Nous utiliserons un nombre limité d’animaux afin de mettre au point tous les marqueurs biologiques envisagés. Les organes d’intérêt sont les poumons, l’aorte et le cœur mais d’autres organes seront prélevés pour constituer une banque de tissus pouvant être analysés ultérieurement (foie ; intestins ; reins).. Les tests statistiques utilisés seront: Pour la fonction cardiaque par échographie . Pour l'hémodynamique invasive, Test paramétrique.

Raffinement

Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 4 animaux par cages avec de l’enrichissement (Tunel,Kraft Paper). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation de deux semaines après réception des rats sera maintenue avant tout début de protocole. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Notre grille d’évaluation du bien-être animal se décompose en : A) changement du poids corporel 0. Normal 1. Perte de poids

Choix des espèces

Le rat Wistar adulte est par excellence l’espèce utilisée dans la plupart des études toxicologiques dont il existe au sein du consortium des données historiques. Rats Wistar adultes de 225-250 g âgés d’environ 50 jours en début de protocole. L'évaluation toxicologique des molécules à tester sera effectuée sur des rats adultes s'assurant ainsi d'une maturité des systèmes de défense mis en jeu.

Contraintes de courir sur un tapis roulant sous stimulations électriques, jusqu'à cinquante par séance, 90 souris subissent aussi un test de tolérance au glucose avec injection dans l'abdomen et scarification de la queue. 42 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 48 d'un niveau léger, et toutes sont tuées pour prélever six organes chacune. Le gène étudié n'est jamais nommé dans le résumé, désigné seulement comme un facteur de transcription induit par l'exercice et par le glucose. Le porteur qualifie la stimulation électrique de désagréable sans être douloureuse, et affirme que l'eau sucrée n'induit aucun stress, la stéatose hépatique qu'elle provoque étant selon lui asymptomatique.

Objectifs

La sédentarité est un facteur de risque pour de nombreuses pathologies, et l’activité physique s’impose de plus en plus comme un moyen de prévenir et/ou de contribuer à guérir des pathologies telles que les maladies métaboliques (diabète, stéatose hépatique non alcoolique ou ‘‘maladie du soda’’), et les cancers. Le muscle squelettique capte l'essentiel du glucose sanguin après un repas, c'est donc un organe clé dans le contrôle de l’homéostasie glucidique. Cette captation de glucose dépend du type de muscle (glycolytique ou oxydatif), elle est augmentée par l’exercice physique alors qu’elle est altérée dans le cas de maladies métaboliques comme diabète et l’obésité. Le projet de recherche a pour but de déterminer le rôle d’un gène induit par l’exercice physique et le glucose dans la performance physique, le métabolisme musculaire et l’homéostasie métabolique de l’organisme.

Bénéfices attendus

Ce projet est pleinement justifié d'un point de vue scientifique et respecte la règle des 3R. Il a pour but d'étudier le rôle d'un gène dont l'expression varie au cours de la journée, dont l'expression est augmentée par l'exercice physique et par le glucose, et qui joue un rôle dans le métabolisme glucidique et lipidique et dans la physiologie du muscle squelettique. Ce projet devrait permettre d’évaluer le rôle de ce gène musculaire dans la performance physique en fonction du temps de la journée, et d’identifier les gènes régulés par l’augmentation de l’expression de ce gène, soit lors de l’exercice physique, soit lors d'un régime sucré dans différents muscles glycolytiques et/ou oxydatifs. La physiologie musculaire jouant un rôle important dans l'homéostasie métabolique systémique, ce projet permettra également de déterminer le rôle de ce gène musculaire dans la régulation de la glycémie., Sur la base des résultats obtenus, nous pourrons étendre le projet à l’étude des voies de régulation et des processus métaboliques les plus affectés par la délétion de ce gène dans le muscle squelettique.

Procédures

Pour le test de performance physique, les souris reçoivent des stimulations électriques de l'intensité la plus faible. Pour le test de tolérance au glucose, durée 2h, chaque souris subit une injection intrapéritonéale de glucose au début du test et une seule scarification à la queue pour prélever une goutte de sang.

Impact sur les animaux

Il y a peu d’effets indésirables concernant le test de performance physique car il sera effectué pendant la phase active nocturne des souris. L'intensité de la stimulation électrique utilisée pour contraindre les souris à courir est la plus faible. Elle est désagréable mais n'induit pas de douleur. En ce qui concerne le challenge nutritionnel, l’ajout de glucose-fructose dans l’eau de boisson conduit à une prise de poids modérée ainsi qu’à une stéatose hépatique une résistance à l’insuline asymptomatiques et n'induit donc aucun stress ni aucune douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes

Remplacement

Nous avons utilisé un modèle cellulaire de myotubes (cellules C2C12) pour montrer que l’expression du facteur de transcription d'intérêt est induite rapidement et fortement par le glucose. De plus nous collaborons avec d'autres équipes afin d’analyser les fibres musculaires isolées et d’établir un modèle mathématique multi-échelles d’organisation et de fonctionnement des muscles.

Réduction

Nous prélevons 4 muscles (EDL, gastrocnemius, soleus, tibialis antérieur) ainsi que d’autres organes impliqués dans l’homéostasie métabolique (foie, tissu adipeux) chez chaque souris et à partir de ces différents organes nous allons réaliser une analyse transcriptomique, et une analyse des fibres musculaires. Comme nous prélevons 6 tissus/organes à partir de chaque souris, nous réduisons le nombre d'animaux par 6. Une collection d’échantillons d’ARN sera constituée et réutilisable dans le cadre du prolongement de ce projet ou pour d’autres projets. Les données brutes de transcriptomique seront déposées dans un entrepôt de données publiques (ENA, EBI). Les effectifs sont élaborés à partir d'expériences antérieures d'une autre équipe de recherche avec laquelle nous collaborons. Nous utiliserons ensuite des tests non paramétriques pour analyser les résultats.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnement enrichi varié (dôme, briquette en bois, frizzoti pour nidification) , en groupes sociaux et en accord avec la réglementation en vigueur. Le suivi sanitaire effectué chaque jour ouvré par les animaliers permet de déceler tout signe de souffrance ou d’angoisse. En amont de chaque procédure, des dispositions (habituation) sont prises pour minimiser tout stress aux animaux. Pour limiter le stress lié à l'exercice physique sur tapis roulant, une habituation de 10 minutes au tapis roulant sera réalisée 3 fois par semaine la semaine précédant le début du protocole. La 1ère session d'habituation consiste en une habituation à l'environnement (les souris se déplacent librement sur la ligne du tapis roulant, mise en route du tapis à très faible vitesse (les souris se déplacent en marchant). Les souris incapables de courir ne seront pas incluses dans la procédure. Nous réaliserons les séances d'entrainement et d'habituation en pendant la phase d’activité nocturne des souris. . Points limites : Lors du test de performance physique, si la souris ne court pas spontanément, mais uniquement sous la contrainte de stimulations répétées,nous arrêterons ces stimulations lorsque le nombre de 50 sera atteint. Toutefois, si la souris refuse de courir malgré la stimulation, l'expérience sera immédiatement stoppée et la souris sera considérée comme étant dans le groupe contrôleL’ajout de glucose-fructose n’induit pas de stress car les souris ont une appétence naturelle pour le sucré. Aucune souffrance n’est attendue par cette procédure qui induit une stéatose hépatique connue pour être asymptomatique chez l’homme et l’animal. Avant le test de tolérance au glucose, les souris seront régulièrement manipulées pour éviter le stress au moment du test. La mesure de la glycémie aux temps 0, 15, 30 ,60 et 120 min, se fait par dépôt d’une 1 goutte de sang sur une électrode et analyse avec un glucomètre (Abbott). La goutte de sang est obtenue par scarification de l’extrémité de la queue. Pendant la durée du test, la cicatrisation est incomplète, il n’est donc pas nécessaire de répéter le geste à chaque mesure de glycémie. Point limite : si la souris perd du poids (>10%), si elle a un comportement anormal (prostrée), elle sera euthanasiée.

Choix des espèces

1- La souris est le seul modèle chez lequel des mutants du gène d'intérêt peuvent être générés. 2- Elle est très utilisée dans les études fondamentales sur le métabolisme et permet de faire des analyses physiologiques. Le gène étudié est conservé chez l’humain. Les échantillons permettent d’obtenir assez de matériel pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Des travaux antérieurs de notre équipe et les données in vivo de la littérature sont obtenus sur des souris et les modèles génétiques des mutants de ce gène, ce qui permet de faire des comparaisons indispensables et de ne pas répéter certaines expériences. 3-Nous utilisons la souris C57Bl6J car la régulation du métabolisme est similaire chez la souris et l'humain et la souche C57Bl6J est prédisposée au maladies métaboliques. les souris seront âgées de 2-4 mois au début du challenge exercice physique car c'est à cet âge que les résultats montrant une diminution de l'endurance ont été générés. les souris seront âgées de 6 à 10 semaines au début du challenge hyperglucidique car c'est à cet âge que nous avons montré que la délétion de ce facteur de transcription hépatique aggravait la stéatose hépatique.

Mises à jeun six heures, injectées à l'insuline, gavées cinq jours sur sept pendant vingt-huit jours, piquées huit fois à la queue pour mesurer leur glycémie, 1 664 souris enchaînent les épreuves d'un protocole sur le syndrome de Noonan. S'y ajoutent une irradiation, une greffe de moelle osseuse sous anesthésie, 48 heures isolées en cage de calorimétrie, un test de force par traction de la queue et des tests d'équilibre et de démarche. 1 184 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 480 d'un niveau léger, et le porteur prévoit que certaines lignées créées développent des tumeurs, sources de douleur et de perte de poids. Sur ce qu'il advient d'elles, le résumé tient en une ligne, toutes sont tuées, sans un mot sur ce qui est prélevé ni pourquoi.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre la physiopathologie du syndrome de Noonan (SN), une maladie génétique relativement fréquente principalement causée par des mutations sur le gène codant la proteine tyrosine phosphatase SHP2, qui causent une trop forte activation de cette protéine. Les patients présentent de multiples atteintes développementales (malformations du cœur, du crâne, du squelette, retard de croissance), mais aussi des troubles communément retrouvés chez l’individu âgé dans la population générale : syndrome métabolique, ostéoporose, cancers du sang, inflammation systémique, faiblesse musculaire. A l’appui de ces observations cliniques, de premières données in vitro révèlent un phénomène de vieillissement accéléré (appelé sénescence) dans des cellules exprimant des formes mutées de SHP2. De même, un modèle de la maladie développé chez la souris, en mutant le gène codant SHP2 pour introduire la mutation responsable de la maladie chez l’Homme, présente ce même vieillissement dans ses tissus dès son plus jeune âge. Ces données suggèrent que l’hyperactivation de SHP2 associée au SN pourrait provoquer un phénotype de vieillissement précoce dont nous souhaitons élucider les mécanismes, et qu’en miroir, l’inhibition de SHP2 pourrait freiner le développement de maladies liées à l’âge. Les objectifs du projet sont donc - de caractériser un modèle murin du SN du point de vue des pathologies liées à l’âge et de la longévité. - d’identifier les mécanismes responsables de ce phénotype, en explorant le rôle de la sénescence, des cellules du système immunitaires et de certaines hormones, dont on sait déjà qu’elles présentent des anomalies dans le SN. - d’évaluer si l’inhibition de SHP2 permet d’améliorer les pathologies liées à l’âge.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre la physiopathologie du SN afin de proposer des stratégies thérapeutiques et un suivi adapté aux patients. Au-delà des maladies rares, ce projet pourrait permettre d’identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans le développement des pathologies liées à l’âge.

Procédures

-La mise à jeun des animaux pendant 6h pour normaliser la glycémie. -L’injection d’insuline et la contention associée sont réalisées une fois, durée max 15s. -Le gavage et la contention associée (durée

Impact sur les animaux

-Effets indésirables liées à l’établissement de nouvelles lignées : Certaines lignées générées dans le cadre de ce projet pourraient développer des tumeurs ce qui peut être source de douleur et de perte de poids mais pourra être anticipé par le suivi de l’expression précoce d’un marqueur fluorescent dans les cellules cancéreuses. -La mise à jeun des animaux représente un stress. -L’injection d’insuline et la contention associée sont source d’inconfort et de douleur légère au point d’injection. -Le gavage et la contention associée (durée

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés

Remplacement

Le syndrome de Noonan (SN) est une maladie génétique pour laquelle les patients portent dans toutes leurs cellules une mutation dite « gain-de-fonction » sur le gène codant pour SHP2, c’est-à-dire qui rend la protéine plus active. Les souris modèles de cette maladie développent les principaux symptômes de la maladie et représentent en ce sens le meilleur modèle d’étude de cette pathologie. Ce projet vise à mieux comprendre la physiopathologie du SN au regard du développement de pathologies liées à l’âge, ce qui nécessite un modèle intégré permettant une étude à l'échelle de l'organisme entier prenant en compte notamment des échanges hormonaux, du dialogue inter-organe et la contribution de cellules sanguines. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche. Les procédures expérimentales présentées à l’appui de ce projet ne peuvent donc pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Toutefois, des tests in vitro sur cellules en culture ont été préalablement réalisés pour limiter au maximum l'expérimentation sur l'animal.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes questions scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant à la fois sur les données bibliographiques et sur des études préliminaires déjà réalisées par le porteur du projet au cours des précédents projets. Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène, des groupes de 8 animaux seront nécessaires afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Pour les suivis tout au long de la vie des animaux, 20% d’animaux supplémentaires seront prévus pour pallier des pertes d’animaux en cours de protocole. Dans un souci de réduction, le projet a été designé afin de réaliser plusieurs expériences sur les mêmes groupes dès lors qu’elles ne sont pas susceptibles d’interférer les unes avec les autres. Les tissus et organes prélevés seront collectés afin de pouvoir réaliser différents types d’analyses.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (igloo, frisure, papier) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause de bagarres ou pour certaines expériences). Les cages sont passées en revue quotidiennement et les animaux sont observés en détail au moins 2 fois par semaine pour repérer les blessures éventuelles, un comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal, maigreur, problème de dentition), et pesés 1 fois par semaine. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale et un analgésique sera utilisé en parallèle de ces procédures pour minimiser toute douleur.Les points limites sont: émaciation ou perte de poids > 20% en moins d’une semaine, hypothermie, cumul de signes de souffrance (prostration, poil hirsute, dos rond, perte d'activité, ou tout autre signe clinique jugé par le technicien expérimenté comme indiquant un état de souffrance auquel nous ne serions pas en mesure de remédier dans les 24h) atteignant un scoring >9. Ceux-ci permettront d’écarter précocement les animaux du protocole ou de les mettre à mort immédiatement en fonction de l’intensité des comportements observés et donc du niveau de souffrance.Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience.

Choix des espèces

Les modèles murins utilisés dans ce projet représentent les seuls modèles de mammifères génétiquement modifiés pour reproduire la maladie humaine SN. De plus, les souris représentent un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques, endocriniennes et cardiaques. Pour la caractérisation d’un éventuel phénotype dommageable des lignées, les animaux seront suivis dès la période de croissance (3-8 semaines). Le reste des expériences, s’agissant de suivre des pathologies liées à l’âge, sera réalisé sur des animaux adultes de 3 à 24 mois.

Les souris dont la douleur ne cède pas au traitement analgésique sont tuées, l'atteinte d'un point limite entraînant l'arrêt du protocole. 1 680 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélever leur sang et leurs organes. Les modèles de vascularite rénale et pulmonaire qui leur sont imposés peuvent provoquer une insuffisance rénale, une gêne respiratoire, un affaiblissement général et une perte de poids, et chaque souris subit selon le protocole des injections dans le péritoine à l'état vigile, trois injections derrière l'œil sous anesthésie, une instillation dans le nez et jusqu'à huit heures en cage métabolique. Les retombées annoncées tiennent à des molécules ciblant deux récepteurs, déjà en développement pour d'autres maladies, dont le porteur écrit qu'elles pourraient ouvrir des perspectives dans les vascularites.

Objectifs

Les vascularites, maladies inflammatoires des vaisseaux sanguins, représentent un groupe hétérogène de maladies systémiques avec des mécanismes physiopathologiques distincts et des stratégies thérapeutiques distinctes. Les vascularites sont classées selon la taille des vaisseaux affectés et peuvent conduire à l’altération d’autres organes tels que les poumons et les reins. Ces pathologies se caractérisent par la présence d’un infiltrat inflammatoire, composé particulièrement de cellules immunitaires, qui viennent envahir la paroi aortique, entraînant un remodelage de cette dernière pouvant aller jusqu’à l‘occlusion du vaisseau. Une meilleure compréhension des facteurs impliqués dans la régulation des cellules inflammatoires et aortiques est indispensable. Les objectifs du projet est d’étudier le rôle de deux récepteurs présents à la surface des cellules immunitaires, les monocytes/macrophages, et leur modulation au cours des maladies inflammatoires. Les modèles murins de maladies inflammatoires étudiés seront des modèles de vascularites rénales, pulmonaires et des gros vaisseaux, et un modèle de réponse inflammatoire systémique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence l’implication potentielle de deux récepteurs membranaires présents à la surface des monocytes/macrophages dans la physiopathologie de maladies inflammatoires, notamment les vascularites affectant les vaisseaux de gros et petit calibre, entraînant l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Des molécules venant cibler ces récepteurs sont en cours de développement dans d’autres pathologies, et les travaux réalisés pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans les vascularites.

Procédures

Prélèvement à la queue (1fois 30sec) sur souris vigile, une injection intra-péritonéale (10 secondes, nombre d'injections variant selon le protocole), une injection rétro-orbotaire sous anesthésie (15 secondes, 3fois), une instillation intranasale sous anesthésie (1fois), une injection intraveineuse (45sec, nombre d'injections variable selon le protocole), un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie (45 sec). Cages métaboliques : inférieur à 8h avec accès à l'eau.

Impact sur les animaux

Les différents modèles peuvent induire un affaiblissement général de l’animal, asthénie, perte de poids, insuffisance rénale (modèle de glomérulonéphrite et vascularite rénal), gène pulmonaire (modèle de vascularite pulmonaire). L’ensemble des modèles peut induire des douleurs de courtes durées et peu intenses liées aux injections. Enfin, un stress chez les animaux peut survenir subissant des contentions et manipulations répétées.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever le sang et les organes pour y réaliser des analyses cytologiques et histologiques.

Remplacement

Les vascularites et maladies systémiques impliquent des réponses immunitaires complexes au sein de divers organes. Actuellement, les modèles in vitro ne permettent pas de reproduire finement l’environnement physiopathologique dans lequel la réponse immunitaire est mise en jeu. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de la physiopathologie de ces maladies observées chez l’Homme. Les systèmes et protocoles d'imagerie ont été optimisés et caractérisés sur des objets physiques de forme, géométrie, composition connus permettant ainsi de comparer images obtenues et réalité, avant de passer chez l'animal.

Réduction

Les paramètres expérimentaux ont été définis selon des études déjà publiées (temps de traitment, doses et voies d’administration). Nous avons déterminé un nombre d’animaux restreint au maximum, de sorte à obtenir des résultats permettant d'obtenir la puissance statistique nécessaire pour y ttirer des conclusions biologiquement pertinentes. Pour chacune des expériences nous avons maximisé les prélèvements et analyses biologiques. Les méthodes d'imagerie étant non invasives et non douloureuses, les animaux pourront être suivis au cours temps et les paramètres étudiés seront mesurés à chaque passage pour chaque animal. Des analyses statistiques seront effectuées sur chacune des expériences.

Raffinement

Les injections intra-péritonéales seront réalisées sur animal vigile tandis que les injections rétro-orbitaires et pulmonaires seront réalisées sur animal anesthésié et posé sur un tapis chauffant pour le confort de l’animal. Pour les injections répétées nous alternerons les points d’injections afin de maintenir le confort de l’animal. Une évaluation générale de l’animal, basée sur son apparence physique et comportemental, sera faite grâce à l'établissement de points limites. Le poids corporel sera relevé tous les 3 jours pour les traitements inférieurs à 10 jours et 1 fois par semaine pour ceux supérieurs à 10 jours. Les animaux seront élevés dans des cages enrichies et regroupés en groupe sociaux pour éviter tout isolement. Le personnel qualifié assure un suivi quotidien et tout comportement anormal sera reporté au responsable du projet. L’atteinte d’un point limite établi entrainera une mise à mort anticipée de l’animal et l'arrêt du protocole. Nous aurons recours à de l’imagerie non invasive afin de monitorer les lésions inflammatoires dans le cas d’apparition de vascularites spontanées, et de pouvoir suivre l’évolution de ces modèles de la manière la moins invasive possible. Pour toutes les analyses d'imagerie, les animaux seront sous anesthésie générale. Les examens d'imagerie au centre du projet sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste ou fluorescent. Les animaux seront surveillés tout au long de l’expérience afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance, des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur, les manipulations seront arrêtées et les animaux mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle animal nous permet de réaliser des expériences de physiopathologie d’inflammation vasculaire et systémique (induit ou spontané) de mammifère en prenant en compte l’ensemble des paramètres physiologiques existant in vivo. Les analyses in vitro ou in sillico ne sont pas relevantes en ce qui concerne l’inflammation vasculaire et systémique car trop de paramètres physiologiques entrent en jeu. Les pathologies induites décrites précédemment font l’objet de protocoles publiés.