Procédures légères
Etude préliminaire des effets systémiques d’une administration de Denosumab chez une femelle babouin olive
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
1 femelle babouin va être utilisée dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis maintenue en vie. Elle reçoit une injection sous-cutanée de Denosumab et trois prélèvements de sang sous anesthésie, à un mois d'intervalle, pour une étude pilote des effets de ce médicament de l'ostéoporose sur la fonction reproductrice femelle. Le porteur justifie le recours au primate par le fait que le modèle souris ne refléterait pas la signalisation en cause chez l'humain, et retient le babouin parce que son cycle est visible extérieurement. Il présente ce seul animal comme suffisant pour orienter des recherches ultérieures, sans test statistique.
Objectifs
Dans le squelette, certaine cellules osseuses expriment une protéine RANKL qui se lie et active un récepteur spécifique RANK. L’intéraction RANKL-RANK est contrôlée par un récepteur qui inhibe l’activation de RANK. Le système de signalisation RANKL est un régulateur reconnu de la santé osseuse, mais sa présence a été démontrée dans les gonades de souris et d'humains, et les données montrent que c'est un puissant régulateur de l'apoptose et de la prolifération des cellules germinales, de la production de spermatozoïdes et de leur motilité. Récemment, des études ont montré que ce système est également présent et actif dans la fonction reproductrice féminine (souris et humains). Chez les femmes suivant un traitement de fertilité, le RANKL était présent dans le liquide folliculaire et les niveaux de RANKL étaient liés au nombre de follicules matures et à la concentration des niveaux d’hormone anti-müllerienne (AMH). Les effets possibles du RANKL sur la fonction de reproduction peuvent avoir une importance clinique immédiate, étant donné que le Denosumab, un inhibiteur du RANKL, est un médicament existant et actuellement utilisé pour le traitement de l'ostéoporose. Cependant, les résultats des études chez la souris contrastent avec les données chez l'homme et le schéma d'expression du système de signalisation RANKL chez la souris ne reflète pas celui de l'homme. Cela limite l'utilisation de modèles murins pour étudier les effets du traitement par le denosumab sur les résultats reproductifs chez les femmes, d'où la nécessité d'étudier les effets de ce traitement chez les primates non humains. L'analyse de la séquence protéique du site cible du denosumab indique qu’il devrait être actif chez les babouins. En outre, en raison de leur similarité anatomique et physiologique avec l'homme, les babouins constituent un excellent modèle pour les études sur la reproduction et ont été largement utilisés pour étudier la fonction de reproduction chez la femme. Ainsi, les babouins peuvent constituer un modèle pour étudier les effets du traitement au Denosumab sur la fonction de reproduction afin d'essayer d'extrapoler ces effets à l'homme. Ce projet est une étude pilote permettant de valider l’espèce babouin (papio anubis) en tant que modèe pour étudier les effets du traitement Denosumab sur la reproduction féminine.
Bénéfices attendus
L'infertilité est un problème courant, qui touche jusqu'à 15 % des couples dans le monde. Actuellement, la plupart des couples infertiles sont traités par des techniques de reproduction assistée (TRA). Ce traitement est couronné de succès dans 70 % des cas, mais il est coûteux, invasif et associé à de ptoentiels effets secondaires chez la mère. De nouveaux traitements sont donc nécessaires pour lutter contre l'infertilité. Nos résultats préliminaires indiquent que le système de signalisation RANKL est présent et actif dans la fonction reproductive féminine, constituant ainsi une nouvelle cible pour le traitement de l'infertilité. Le denosumab, un inhibiteur du RANKL, est actuellement utilisé pour traiter l'ostéoporose, et la régulation du RANKL peut donc avoir une importance clinique immédiate. Cependant, les modèles murins ne sont que peu transposables à la condition humaine en ce qui concerne le rôle de RANKL dans la fonction de reproduction, d'où la nécessité d'un nouveau modèle. Le projet décrit fournira à court terme des informations précieuses sur l'applicabilité des babouins en tant qu'organismes modèles pour étudier les effets du traitement au Denosumab sur la fonction reproductrice féminine. Cela guidera par la suite le cadre et la structure des recherches à venir.
Procédures
La femelle babouin olive sera soumise à une injection sous-cutanée et 3 prélèvements sanguins sous anesthésie. Il y aura donc 3 anesthésies à 1 mois d'intervalle environ. Chaque anesthésie devrait durer entre 20 minutes et 30 minutes maximum, le prélèvement devrait durer moins de 5 minutes (volume collecté de 12 mL).
Impact sur les animaux
Stress lors de la capture. Anesthésie. Prélèvement sanguin (risque hématome). Effets secondaires du denosumab : douleurs ostéo articulaires ou musculosquelettiques rapportées fréquemment chez la femme ménopausée sous traitement chronique, de manière moins fréquente infection du tractus urinaire ou respiratoire, constipation, gêne abdominale ou éruption cutanée (aucun effet secondaire rapporté chez le macaque cynomolgus à 5 fois la dose administrée).
Devenir
L'animal sera maintenu en vie car les prélèvements ne sont pas invasifs ni douloureux.
Remplacement
Le denosumab est un médicament qui agit sur différents organes par des effets systémiques, une étude in vivo est donc nécessaire pour étudier ses effets sur la résorption osseuse et la reproduction féminine. Dans ce contexte, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants par des méthodes alternatives.
Réduction
Le médicament utilisé dans l'étude, le Denosumab, est un anticorps monoclonal humain qui se lie à la protéine humaine RANKL, et son efficacité n'a pas encore été testée chez les babouins. Tout d'abord, afin d'examiner la probabilité de la liaison Denosumab-RANKL, l'homologie de la séquence RANKL entre humains et babouins a été évaluée par une analyse d'alignement de la séquence protéique. Le site cible du Denosumab est homologue entre les deux espèces, ce qui suggère que le Denosumab peut inhiber l'activité du RANKL chez les babouins. La présente étude est une étude pilote, dans laquelle un seul babouin sera injecté. L'étude pilote fournira des connaissances précieuses sur l'effet du Denosumab chez les babouins et guidera la mise en place et la conception d'études futures, minimisant ainsi l'utilisation d'animaux. En outre, pour réduire le nombre d'animaux, le babouin injecté servira de contrôle. L'effet du Denosumab sera examiné en comparant les échantillons sanguins de base avec ceux prélevés après l'injection. On s'attend à ce que les marqueurs osseux soient fortement affectés par le traitement au Denosumab. Par conséquent, l'analyse d'un seul animal devrait être suffisante pour confirmer un effet clinique du denosumab chez les babouins. Aucun test statistique ne sera effectué. En outre, les échantillons de sang pourront être utilisés pour mesurer d'autres hormones d'intérêt telles que l'hormone anti-mullerienne et l'inhibine B, et donner ainsi une indication du nombre d'animaux nécessaires pour les études futures.
Raffinement
Les animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par le responsable du bien-être animal et validé par la structure en charge du bien-être animal. Concernant la capture, elle est toujours réalisée en privilégiant une méthode sans contention (ni chimique, ni physique). Elle consiste d’abord à isoler l’animal lors de son passage dans le tunnel de son hébergement. Une fois isolé dans le tunnel, l’animal est transféré dans une boite de transport accolée au tunnel puis transféré dans une zone d’isolement temporaire avec une cage à fond amovible. En cas d’échec de cette méthode, l’animal sera capturé par télé-anesthésie (fléchage). Les prélèvements de lait seront réalisés sous anesthésie chimique : les animaux seront sédatés par injection intramusculaire. Pendant toute l’anesthésie les individus seront surveillés et monitorés par les vétérinaires (i.e. ECG, Fréquence Cardiaque, Fréquence Respiratoire, Température rectale). Suite aux anesthésies, la femelle sera réveillée dans sa loge d’origine et réintroduite dans son groupe dès qu’elle est suffisament réveillée, selon la procédure validée par la structure du bien-être animal.
Choix des espèces
Les résultats des études chez la souris contrastent avec les données chez l'homme et le schéma d'expression du système de signalisation RANKL chez la souris ne reflète pas celui de l'homme. Cela limite l'utilisation de modèles murins pour étudier les effets du traitement par le denosumab sur les résultats reproductifs chez les femmes, d'où la nécessité d'étudier les effets de ce traitement chez les primates non humains. On sait que les marqueurs osseux sont affectés chez le macaque cynomolgus après injection de denosumab. Cependant cette espèce ne constitue pas forcément le modèle de choix dans le cadre de ce projet. En effet, ce protocole nécessite l'identification précise des stades du cycle reproductif afin d'effectuer l'injection et les prélèvements à des temps précis. Le suivi des cycles n'est possible chez le cynomolgus que par suivi hormonal (dosage sanguin) ou par frottis, ce qui nécessiterait des manipulations invasives et fréquentes. En revanche, le stade du cycle œstral peut être distingué visuellement chez les babouins femelles par des modifications anatomiques de la région périnéale. En outre, en raison de leur taille et leur similarité anatomique et physiologique avec l'Homme, les babouins constituent un excellent modèle pour les études sur la reproduction et ont été largement utilisés pour étudier la fonction de reproduction chez la femme. L'analyse de la séquence protéique du site cible du denosumab indique que le denosumab devrait être actif chez les babouins. . Ainsi, les babouins peuvent constituer un modèle pour étudier les effets du traitement au Denosumab sur la fonction de reproduction afin d'essayer d'extrapoler ces effets à l'homme. Le but de ce projet est d’étudier le rôle du RANKL dans la fonction reproductive féminine. L’animal sélectionné doit donc être une femelle mâture sexuellement et dans l’âge fertile/reproductif soit approximativement entre 6 ans et 25 ans.
Réponse de l’épithélium broncho-alvéolaire lors d’une irradiation du thorax entier chez la souris avec déplétion des cellules club par le naphtalène (NA)
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
820 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 500 d'entre elles. Elles reçoivent une irradiation du thorax entier à 20 Gy sous anesthésie et des injections répétées de naphtalène destinées à détruire un type de cellules pulmonaires, et sont gardées jusqu'à six mois, pour étudier la réponse de l'épithélium bronchiolique à la radiothérapie. Le porteur indique que cette irradiation entraîne à elle seule la mort de 35 % des animaux sur six mois et des difficultés respiratoires, l'absence des cellules ciblées pouvant aggraver les lésions. Il conclut que la réponse du tissu pulmonaire ne peut être appréhendée qu'in vivo, dans un système biologique intégré.
Objectifs
La qualité de la prise en charge thérapeutique du cancer inclut la qualité du contrôle tumoral mais également la qualité de vie des patients. La radiothérapie est très efficace mais génère néanmoins des séquelles. La réponse pulmonaire à la radiothérapie fait l’objet de publications, mettant en avant le rôle de plusieurs types cellulaires dans le développement des dommages de type inflammatoire ou fibreux post-irradiation. En revanche, très peu de données existent sur la réponse de l’épithélium bronchiolique. Lors d’un projet précédent, nous avons pu identifier un type cellulaire, les cellules club, comme candidat intéressant dans le développement de la fibrose au niveau du poumon. Les cellules club sont situées sur l’épithélium bronchiolique et sont impliquées dans la protection de l’épithélium bronchiolique et dans la détoxification pulmonaire. Elles sont également des cellules capables de se diviser et se différencier pour reconstruire l’épithélium endommagé. Cette protection passe entre autres par la synthèse et la sécrétion d’une substance particulière, l’utéroglobine. Une diminution de cette sécrétion ou une modification génétique impactant les gènes codant pour celle-ci ont été associés au développement de certaines pathologies comme la broncho-pneumopathie obstructive chronique. L’objectif du présent projet est donc d’utiliser un modèle dans lequel les cellules club sont éliminées afin de déterminer l’impact de ces cellules sur le développement des lésions pulmonaires après irradiation du thorax entier chez la souris. Cela est possible, de façon transitoire, par injection de naphtalène qui toxique pour les cellules club. Ce modèle, très utilisé, ne provoque pas de conséquence clinique notable chez les animaux. L’élimination des cellules club maintenue dans le temps peut être obtenue en répétant les injections tous les 3 à 4 jours. Une expérimentation préalable sera effectuée afin d’évaluer la toxicité éventuelle de ces injections répétées. Deux lignées de souris seront utilisées car elles ont des spécificités en lien avec le développement de lésions pulmonaires. Comparer ces deux lignées de souris pourrait nous permettre de comprendre quels sont les facteurs impliqués dans l’évolution des dommages pulmonaire depuis l’inflammation vers la fibrose, une notion importante dans la gestion clinique des séquelles des radiothérapies thoraciques.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension du rôle des cellules club dans la réponse aux rayonnements ionisants, et globalement de la réponse de l’épithélium bronchiolique, peut permettre d’améliorer l’index thérapeutique de la radiothérapie thoracique, en offrant des perspectives préventives ou thérapeutiques sur les lésions radiques pulmonaires.
Procédures
Selon les procédures et lots : • Irradiation 20 Gy, sous anesthésie (durée 10 min) • Injection intra-péritonéale sur animal vigile (unique ou répétée) jusqu’à 1 injection tous les 3 ou 4 jours pendant 4 semaines (soit 16 injections maximum) • Injections répétées de naphtalène/véhicule, 1 injection/semaine/4 semaines, sur animal vigile • Scanner sous anesthésie (8 min, max 3 fois) • Les animaux sont gardés au maximum 6 mois.
Impact sur les animaux
D’après le recul acquis au laboratoire, l’irradiation du thorax entier sur un irradiateur de type médical à une dose unique de 20 Gy entraine une mortalité de 35% des animaux sur une période de 6 mois. On peut s’attendre à une mortalité comparable suite à une irradiation sur un irradiateur guidé par l’image. L’absence de cellules club au moment de l’irradiation pourrait aggraver la sévérité des lésions. Les effets cliniques de l’irradiation thoracique sont essentiellement des difficultés respiratoires. Une injection unique de naphtalène n’a pas d’effet clinique notable. Les injections répétées de naphtalène peuvent générer de la fibrose péribronchique en 14 semaines, nous prévoyons d’injecter pendant 4 semaines seulement. Une expérimentation dédiée sera réalisée. La procédure complète ne sera mise en place que si cette expérimentation préalable ne démontre pas d’effet toxique notable.
Devenir
La collecte d’organes pour les analyses ultérieures (histologie, analyse génétique) nécessite l’euthanasie des animaux. Tous les prélèvements aux points d’étude 1 et 6 mois seront faits post-mortem. Les prélèvements concernent tous les animaux du projet.
Remplacement
La réponse globale du tissu pulmonaire aux rayonnements ionisants ne peut être appréhendée qu’in vivo, au sein d’un système biologique intégré.
Réduction
Les modèles d’expérimentation présentés pour l’étude des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Pour effectuer des tests statistiques, il est donc nécessaire d’avoir un minimum de 10 animaux pour chaque groupe irradié pour obtenir des résultats exploitables en fonction des analyses effectuées.
Raffinement
Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées aux procédures réalisées afin de limiter au minimum la souffrance animale (suivi des animaux, anesthésie pour les irradiations, hébergement en groupe avec enrichissement). Les souris sont suivies régulièrement et tout signe d’atteinte importante du bien-être animal (amaigrissement, immobilité, déshydratation importante, signes de détresse ou douleur, incapacité à se redresser lors du test de redressement) entrainera l’euthanasie anticipée.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé dans les études précliniques. C’est également l’espèce de référence utilisée au sein de notre laboratoire. Les précédents projets d’irradiation pulmonaire du laboratoire ont été menés sur souris. Les animaux seront utilisés entre 8 et 34 semaines, correspondant au stade adulte. Le stade adulte est choisi car la thématique de recherche concerne les séquelles des radiothérapies chez les adultes, les effets secondaires des tumeurs pédiatriques étant un domaine de recherche particulier.
Effet d’un probiotique et d’un postbiotique sur la santé, le microbiote, l’immunocompétence, le métabolisme et la croissance chez le poulet de chair.
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
320 poulets de chair vont être utilisé·es dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 88 tués pour prélèvements d'organes et 232 relâchés avec leurs congénères. Les poulets subissent des prises de sang à la veine de l'aile à vingt et un puis trente-cinq jours, pour évaluer l'effet d'un probiotique et d'un postbiotique sur leur croissance et leur microbiote en élevage conventionnel. Le porteur relie ces travaux à une réduction des intrants pharmaceutiques et à une amélioration du bien-être des animaux non-humains, bénéfices renvoyés au court et au long terme. Il affirme que l'espèce aviaire ne peut être remplacée par un modèle in vitro ou in silico pour rester représentatif des conditions d'élevage.
Objectifs
En élevage de poulet de chair, la santé intestinale est un élément clé du bien-être et des performances des animaux, et notamment de leur capacité à valoriser au mieux les nutriments. Les produits issus de fermentation comme les probiotiques (bactéries bénéfiques vivantes) et les postbiotiques (bactéries bénéfiques non viables et/ou leurs métabolites) ont montré des potentiels intéressants afin d’améliorer la santé intestinale et la valorisation alimentaire. Leurs modes d’action reposent beaucoup en théorie sur leurs interactions avec le microbiote et l’épithélium intestinal, mais ils restent en réalité mal documentés. Par ailleurs, l’évaluation en condition terrain est très peu documentée, or il a été montré une forte différence entre les microbiotes intestinaux de volailles élevées en fermes de celles élevées en station expérimentales. L’objectif du projet est d’évaluer les effets et d’investiguer les modes d’actions de probiotiques et de postbiotiques issus de lactobacilles chez le poulet de chair en condition d’élevage conventionnel. L’utilisation de ces derniers ayant montré la capacité à promouvoir la croissance de poulets de chair.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour enjeu l’amélioration de la santé des poulets en élevage par l’utilisations de solutions naturelles (probiotiques, postbiotiques), avec à la clé une réduction des intrants pharmaceutiques et une amélioration du bien-être des animaux. A l’issue du projet et à relativement court terme, l’identification des modes d’action des pro- et postbiotiques permettra de les utiliser de façon optimisée. D’un point de vue théorique, nous comprendrons mieux comment interagissent les probiotiques et postbiotiques avec le microbiote et le métabolisme de l’hôte dans l’élaboration des phénotypes exprimés par l’hôte (santé intestinale, croissance, immunocompétence). Après le projet, à plus long terme, l’identification de liens entre utilisation de probiotiques/postbiotiques, nutrition, santé, microbiote et immunocompétence permettra d’élaborer des stratégies d’études visant à promouvoir la santé, le bien-être et la croissance des poulets de chair.
Procédures
Une prise de sang à la veine alaire sera effectuée sur animaux vigiles, à raison de 32 animaux par groupe à 2 stades de croissance (J21 et j35). Les animaux prélevés ne seront pas les mêmes à chaque date. Un total de 320 poulets subira la procédure au cours de l’essai. Chaque prise de sang dure 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les prises de sang alaires pourront être une source de stress, en raison de la contention nécessaire et de la piqûre. Les prises de sang peuvent éventuellement engendrer des hématomes.
Devenir
A j35, 3 des 4 poulets par case des groupes T1, T2 et T3 échantillonnés pour les prises de sang seront euthanasiés afin de prélever des échantillons divers, les animaux non prélevés au cours de l’essai seront relâchés avec leurs congénères.
Remplacement
Compte-tenu de l’objectif du projet qui doit être représentatif des conditions d’élevage de poulets de chair standard, l’espèce aviaire ne peut être substituée par un modèle d’étude in vitro ou in silico.
Réduction
Concernant les mesures sanguines, l’unité statistique sera l’animal. Un nombre de 32 animaux par traitement doit permettre de mettre en évidence des différences. Ce nombre est nécessaire et suffisant pour pouvoir tirer des conclusions significatives et biologiquement pertinentes en tenant compte d’expériences précédentes dans un contexte similaire (essais terrain induisant une plus grande variabilité) et de la variabilité inter-individuelle attendue pour ces observations.
Raffinement
Les poussins sont élevés en groupe suivant les caractéristiques réglementaires d’un élevage conventionnel. En-sus, le bâtiment est équipé de fenêtres transparentes permettant l’entrée d’une luminosité naturelle. Les animaux auront la possibilité d’explorer et de gratter la litière (sol en terre battue). Ils auront également à disposition des perchoirs en carton qui seront disposés dans les parquets (1 module par parquet). Ils permettront aux animaux de se percher et de picorer le carton du module. De plus, les animaux soumis à la procédure prise de sang seront surveillés le jour même et le lendemain. Toute manifestation de symptômes persistants définis par un point limite (animal prostré pendant plus de 24h et ayant cessé de s’alimenter et de s’abreuver) entrainera le retrait de l’animal. Les animaux seront manipulés par des personnes qualifiées, notamment pour les prises de sang et euthanasies.
Choix des espèces
Notre étude vise, à terme, à promouvoir l’utilisation de solutions naturelles préventives non chimiques telles que pro- et postbiotiques chez le poulet d’élevage pour prévenir des désordres digestifs causés par les constituants des matières premières utilisées pour leur alimentation. Il est donc nécessaire d’effectuer nos expérimentations chez le poulet domestique , qui a des réponses spécifiques que nous devons prendre en compte. Les animaux seront élevés de 1 à 37j, âge classique d’abattage des poulets standards.
Travaux Pratiques de pharmacologie : étude des effets de molécules anti-hypertensives chez le rat mâle et femelle
- Enseignement supérieur
392 rats vont être utilisé·es dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie tuée à l'issue et 180 réutilisés dans d'autres protocoles. Les rats reçoivent des molécules antihypertensives par voie orale, subissent des mesures répétées de pression artérielle par contention en tube et des piqûres à la queue pour la glycémie, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des étudiants se destinant aux métiers de l'expérimentation animale. Les rats témoins sont tués en cours de séance pour une étude sur organe isolé, les autres à la fin. Le porteur affirme qu'il n'existe aucune méthode de remplacement permettant une formation technique équivalente sur l'animal vigile.
Objectifs
Cette séance de travaux pratiques (TP) chez le rat est destinée à des étudiants dont la formation peut conduire à des métiers en lien avec le domaine de l’expérimentation animale. Dans ce contexte, les étudiants doivent acquérir un savoir-faire pour participer aux essais chez l’animal vigile et être en mesure de réaliser entre autres les traitements et les observations cliniques des animaux afin de pouvoir candidater sur les postes proposés par les organismes publics ou privés de recherche et par les industriels. Cet enseignement pratique participe à une meilleure orientation de nos étudiants par la découverte concrète des exigences et responsabilités liées à l’utilisation de l’animal. Les objectifs pédagogiques de ces travaux pratiques sont de plusieurs ordres : - D’un point de vue pharmacologique : mettre en évidence les effets de différents médicaments sur le système cardiovasculaire (Pression artérielle et fréquence cardiaque chez le rat vigile - D’un point de vue éthique (raffinement) : montrer l’intérêt du renforcement positif aux étudiants en mettant en place un système de récompence chez les animaux ; mettre en pratique un système de mesure de la pression artérielle / fréquence cardiaque non invasif chez le rat - D’un point de vue expérimental chez l’animal : former à la réalisation d’une administration par voie orale chez le rat ; apprendre à utiliser le système de mesure de la pression artérielle / fréquence cardiaque au niveau de l’artère caudale chez le rat ; savoir recueillir des données expérimentales de façon exhaustive afin de répondre à l’objectif de l’étude (sensibilisation à la nécessité de préparer une étude afin d’en tirer les résultats attendus sans avoir besoin de les reproduire).
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’apprendre à nos étudiants à réaliser des expérimentations in vivo de pharmacologie. En effet, les enseignements de ce diplôme sont définis selon un programme pédagogique national. Les étudiants doivent acquérir 5 compétences durant leur formation, et notamment la compétence « mener des études à l’échelle du vivant ». En troisième année, la validation de cette compétence implique de savoir « Participer à l’évaluation de l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques ». Il est également précisé que la mise en pratique de l’étude des médicaments des grandes fonctions, dont les médicaments du système cardiovasculaire, se fait in vivo et/ou in vitro. Ainsi ce TP s’inscrit parfaitement dans ce cadre et les bénéfices attendus pour les étudiants seront les suivants : - consolidation de l’apprentissage de la manipulation des rats vigiles : contention, administration par voie orale, mesure de la pression artérielle / fréquence cardiaque - mise en oeuvre d’une étude en pharmacologie in vivo : constitution des lots d’animaux après randomisation, identification des animaux, utilisation d’un logiciel dédié, recueil de données et traçabilité, analyse et interprétation des résultats - mise en pratique des éléments vus en cours théoriques sur l’éthique en expérimentation animale, notamment mise en évidence du respect du bien-être des animaux au cours du TP. L’enseignant s’assure tout au long du TP du respect de l’éthique et interroge régulièrement les étudiants sur les éléments indispensables au respect des regles de bien-être animal dans ce TP.
Procédures
Les animaux pour l'entrainement à la voie orale suivront cette administration par voie orale 2 fois au maximum par animal (2 fois, car 2 séances d'entrainement par session). Les animaux du protocole expérimental seront soumis à trois interventions: 1. Injection par voie orale du véhicule ou molécules antihypertensives. L'administration par voie orale sera réalisée 2 fois maximum par animal (2 traitements car 2 séances d'étude par session). Chaque administration dure quelques secondes. 2. Mesure non invasive de la pression artérielle et de la fréquence cardiaque au niveau de la veine caudale. Cette mesure sera réalisée 4 à 8 fois par animal (réparties sur 2 jours consécutifs puis 2 jours après sur 2 jours consécutifs, 1 à 2 mesures par jours). En effet il arrive que les résultast obtenus ne soient pas exploitables, si l'animal bouge par exemple lors de la prise de mesure, dans ce cas une nouvelle prise de pression artéreille est réalisée à distance de la précédente dans la même demi-journée. Chaque mesure de pression artérielle/fréquence cardiaque dure environ 2 minutes et nécessite 7 minutes d'habituation pour sytabiliser la température de mesure. 3. Mesure de la glycémie après piqure au niveau de la veine caudale. Cette intervention sera réalisée 4 fois en 4 jours par animal et durera quelques secondes à chaque fois.
Impact sur les animaux
Les manipulations (contention, administration par voie orale, mesure de la pression artérielle et fréquence cardiaque) génèrent du stress chez les animaux. Le prélèvement d'une goutte de sang au niveau de la veine caudale entraîne une légère douleur.
Devenir
Tous les animaux ayant servi pour l'entraînement à la voie orale seront gardés en vie jusqu'à leur utilisation dans des protocoles hors champ, car cette procédure est légère. Pour la procédure expérimentale, les animaux du lot témoin seront mis à mort au cours des sessions de TP afin de réaliser une étude sur organe isolé. Les autres animaux seront mis à morts à la fin de chaque session. En effet, nous considérons que, bien que les gestes techniques effectués soient faiblement invasifs, le fait qu'ils soient effectués par des étudiants peut augmenter le stress des animaux. C'est pourquoi nous proposons que cette procédure soit considérée de gravité modérée. Dans ces conditions la mise à mort des animaux à la fin des séances est adaptée à la procédure. Les animaux surnumraires n'ayant pas été inclus dans l'étude pourront être utilisés pour des procédures hors champ.
Remplacement
Dans la formation de nos étudiants le programme pédagogique national prévoit, en pharmacologie, l’évaluation in vivo des effets de molécules de référence par la mise en œuvre de protocoles expérimentaux. Ce TP doit permettre d’illustrer les effets de traitements des pathologies cardiovasculaires et notamment la classe des médicaments ciblant le système adrénergique . Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode de remplacement permettant une formation appropriée de nos étudiants sur le plan technique (manipulation de l’animal vigile, administration des substances chez l’animal vigile, mesure de l'activité cardiovasculaire…). Toutefois, afin de favoriser l'apprentissage des étudiants et de limiter le nombre d'animaux d'entraînement ainsi que la durée de manipulation de ceux-ci, des vidéos présentant la réalisation des gestes techniques (préhension, contention, administration VO) leur seront présentées. De plus, les étudiants pourront au cours du TP s'entraîner à réaliser les injections en manipulant des seringues/sondes dédiées sur un support inerte.
Réduction
Ce TP aura lieu sur 2 sessions comportant chacune deux séances d'étude sur 3 jours de protocole, pour 12-15 étudiants par séance (annexes 2 et 3). Deux groupes de 15 étudiants maximum participeront à chaque session d'étude, pour un total de 52 étudiants par an. Pour chaque séance, chaque étudiant sera en charge du traitement et du suivi d’un animal. Pour chaque session, les 4 animaux témoins seront utilisés pour une séance d'étude d'organe isolé et ne seront donc pas réutilisés à la seconde séance d'étude. Les 8 à 11 animaux restant seront utilisés pour la séance d'étude suivante, avec 4 nouveaux animaux témoins (annexe 3). Le même nombre d'animaux sera utilisé pour la session suivante. Soit un total de 34 animaux + 3 animaux surnuméraires par session soit 34+3+3=40 animaux par an pour 52 étudiants et 200 animaux pour 5 ans pour 260 étudiants. A ces animaux s’ajoutent la première année les 12 animaux nécessaires à l’étude préliminaire soit 212 animaux au total. Une semaine avant la séance d'étude, les étudiants s'entraineront à la réalisation de la VO sur des rats issus du surplus d'élevage, à raison d’1 rat par étudiant. Ces rats serviront aussi pour l'apprentissage des étudiants de la seconde séance d'étude d'une même session. Ainsi pour une session de 26 étudiants en moyenne, il sera prévu 13 animaux+ 5 animaux surnuméraires, c'est-à-dire pour un an et deux sessions, un total de 26+10=36 rats par an et pour 52 étudiants. Ainsi au total sur 5 ans, 212 + (36 x 5)= 392 rats pour 260 étudiants.Ce chiffre sera bien évidemment indexé chaque année sur le nombre réel d’étudiants inscrits à notre formation. Afin de garantir une formation de qualité aux étudiants, il n’est pas possible de diminuer le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes socialement harmonieux et en présence d’un enrichissement comprenant au moins 2 éléments (tunnel en plastique noir, bâtonnet en bois et noix à ronger). Afin de limiter le stress des animaux lors de la manipulation, mais également lors de la mesure de la pression artérielle et fréquence cardiaque, qui s’effectue à l’aide de tubes à contention, les animaux seront habitués à la préhension/contention et à ces mesures quotidiennement pendant la semaine précédant le début des travaux pratiques. Cette habituation se fera via un système de récompense (pop corn, gâteau sec, vers séchés, mélange de fruits légumes et graines, mini-gouttes de yaourt séché, billes de céréales…). Tout animal présentant des signes de stress ou de maladie tels que: poil hérissé, stéréotypie, comportement agressif ou absence de prise de poids tel qu'attendu à l'âge de ces animaux ne sera pas inclus dans le TP. Enfin, le site de piqure pour le prélèvement de la goutte de sang (nécessaire à l'analyse de la glycémie) sera noté pour chaque rat et modifié à chaque mesure pour limiter la sensibililté.
Choix des espèces
Le rat est une espèce très souvent utilisée pour les études de pharmacologie. C'est notamment une espèce de choix pour l’étude de la fonction cardiaque, notamment en pharmacologie de sécurité. C'est donc un modèle de choix pour l'étude des effets de médicaments agissant sur la fonction cardiovasculaire. Pour voir l'effet des médicaments utilisés des animaux jeunes adultes sont couramment utilisés dans les essais de pharmacologie. Les animaux seront utilisés à deux stades différents en fonction du sexe: - 8 à 12 semaines pour les mâles - 14 à 18 semaines pour les femelles Ces stades sont choisis d'une part pour que les animaux aient un poids permettant l'utilisation des tubes de contention fournis dans le système de mesure de la pression artérielle et fréquence cardiaque et d'autre part afin que les mâles et femelles utilisés puissent provenir des mêmes portées de notre élevage. Quant aux animaux utilisés pour l'apprentissage de la voie orale, ils seront de tout âge (> 7 semaines) selon les disponibilités du surplus d'élevage.
Mise au point d’un dispositif expérimental externe et non-invasif pour la mesure de paramètres physiologiques chez la souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
72 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes réutilisées à l'issue. Rasées et anesthésiées à plusieurs reprises, elles sont équipées d'un textile connecté porté jusqu'à vingt-quatre heures, parfois isolées, pour mettre au point un dispositif de mesure cardiorespiratoire présenté comme une alternative aux capteurs implantés par chirurgie. Le porteur reconnaît que les souris peuvent chercher à retirer le dispositif et se blesser en se grattant, que l'isolement les stresse et que le rasage provoque hypothermie et inflammation. Il affirme que des modèles 3D précèdent la phase animale mais que le recours à la souris reste un "passage obligé" pour évaluer le comportement et la tolérance.
Objectifs
Lors d’études scientifiques, le bien-être des animaux peut être altéré par l’utilisation de dispositifs de mesure (électrocardiogramme, volume respiratoire), essentiel à la compréhension des fonctions physiologiques. Malgré leurs performances de mesure, ils nécessitent d’être implantés dans l’animal (par chirurgie) ou l’isolement des animaux. Outre les contraintes liées à leurs utilisations, (soins pré et post chirurgicaux,…) la chirurgie et l’isolement induisent des stress physiologiques pouvant altérer la qualité des résultats des études menées. Des dispositifs externes, développés chez les grands mammifères (singe, chien, porc…), permettent le recueil de données, sans chirurgie, sur des animaux éveillés et libres de leurs mouvements. Ces dispositifs ont permis l’amélioration du bien-être des animaux et contribuent à leur réutilisation et leur réduction dans les études. Grâce aux progrès de miniaturisation de la technologie, ces dispositifs ont été dernièrement adaptés aux petits mammifères de laboratoire (rat ou cochon d’inde), mais aucun dispositif de la sorte n’a été développé chez la souris notamment dû au challenge qu’elle représente (taille, comportement, manipulation…). Ce projet est initié pour aider les acteurs de la recherche à pallier cette situation dans les études nécessitant de mesurer des paramètres physiologiques chez la souris que ce soit pour évaluer les effets (bénéfiques ou néfastes) d’une molécule avant les premiers essais chez l’Homme ou comprendre les mécanismes de maladies et identifier de nouvelles pistes de traitements. L’objectif est de mettre au point un système chez la souris à partir d’un dispositif externe permettant la mesure de paramètres cardiorespiratoires dans le milieu d’hébergement habituel et avec ses congénères, sans chirurgie préalable. Un tel dispositif ayant pour seule contrainte le port d’un textile connecté, rend possible un suivi totalement indolore et plus respectueux des animaux. Ce dispositif participera à l’amélioration du bien-être des animaux et la qualité des résultats obtenus en permettant l’enregistrement de données plus pertinentes. Le projet se déroule comme suit : ● Des mesures morphométriques seront relevées afin de confectionner des prototypes du dispositif ● Des tests préliminaires des différentes formes de prototypes seront effectués sur des modèles 3D de souris Les prototypes seront évalués sur des animaux vivants, en conditions individuelles puis collectives et sur des durées progressives.
Bénéfices attendus
L’adaptation d’un dispositif de mesure externe à la souris, permettra de proposer aux acteurs de la recherche biomédicale (recherche fondamentale, appliquée, translationnelle…) un outil innovant d’investigation des paramètres physiologiques. Les bénéfices de ce projet sont donc : ● De remplacer les méthodes impliquant des actes de chirurgie (capteurs implantables) pour mesurer les paramètres physiologiques de l’espèce cible : la souris. Une alternative à ces méthodes permettra d’éviter le stress et la douleur ainsi qu’un suivi accru avant et après l’opération nécessitant des soins médicamenteux systématiques. Il permettra également le suivis de constantes physiologiques chez des animaux fragiles (génétiquement modifiés, modèle de maladie cardiaque et/ou respiratoire) ne supportant pas la chirurgie. ● D’améliorer les conditions d’hébergement lors du suivi, en rendant possible la mesure des paramètres physiologiques de l’animal directement dans sa cage d’hébergement, réduisant drastiquement le stress induit par l’isolement et permettant donc un suivi de ces paramètres sur une période longue. ● De collecter des données plus pertinentes ; le lien entre résultats et bien-être animal étant lié, l’amélioration des conditions de mesures physiologiques permettra des résultats plus précis et la diminution du nombre d’animaux utilisés dans les études.
Procédures
Les souris subiront une anesthésie de maximum 10 minutes pour effectuer différents gestes : ● Raccourcissement des griffes ● Tonte ou rasage ● Équipement ● Dé-équipement Spécifiquement pour la procédure d’évaluation des prototypes, les animaux seront maintenus jusqu’à 30 minutes sous anesthésie, afin de réaliser des mesures morphométriques pour alimenter la base de données, préalablement à l’équipement estimé, lui, à 10 minutes. Le temps total estimé est donc de 40 minutes. Les animaux pourront être amenés à être équipés plusieurs fois lors de chaque procédure selon leur comportement face aux différents prototypes. Par ailleurs l'anesthésie ne sera pratiquée que pour l’équipement et le dé-équipement des animaux soit 2 fois par jour et par individus. Lors de la procédure d’évaluation, les animaux seront équipés du dispositif pendant 90 minutes maximum. Avant la procédure de validation, les animaux seront équipés pendant 90 minutes le premier jour, et 150 minutes le deuxième jour, afin d’être habitués au dispositif. Lors de la procédure de validation, les animaux seront équipés pendant 3 heures maximum, en hébergement par 2 et par 4 individus. Puis ils seront équipés pendant 24 heures maximum (par 1, 2 ou 4 individus, en fonction des résultats de l’étape précédente) Au-delà de 2 jours sans équipement, les animaux seront ré-habitués au port du dispositif par un équipement de 150 minutes.
Impact sur les animaux
Une fois équipé du dispositif, il est possible que l’animal cherche à retirer son prototype. Ce phénomène qui a été décrit avec d’autres dispositifs externes et pour d'autres espèces, peut conduire à une irritation et des lésions dues à des grattages excessifs. Les animaux seront hébergés individuellement pour une durée limitée à 150 minutes. Si l’hébergement collectif est impossible lors de la phase de validation de 24h maximum, les individus subiront également un hébergement individuel. L’isolement d’individus peut provoquer un stress mais aucune donnée bibliographique ne présente la possibilité d’utiliser un dispositif externe chez la souris, en hébergement collectif. Afin de permettre la pose optimale de capteurs et d’assurer le maintien du dispositif sur l’animal, en amont de l’expérience, les souris seront soit rasées soit tondues. Le rasage de l’animal peut entraîner une légère hypothermie et une inflammation locale.
Devenir
À l’issue de ces procédures légères, à condition que leur santé et leur bien-être ne soient pas compromis, tous les animaux pourront être réutilisés dans d’autres projets, contribuant à réduire le nombre d’animaux requis à des fins scientifiques.
Remplacement
Afin de s’approcher au plus de la morphologie des souris, des modèles de souris 3D permettront, en amont de la phase sur animaux vivants, de tester les différents modèles de prototypes conçus, pour vérifier la bonne adaptation à la morphologie de la souris (forme du dos, périmètre du cou, diamètres des pattes etc…). Cette démarche permettra d’effectuer une première sélection des prototypes, et la mise en place des dispositions nécessaires pour équiper l’animal. Cependant, le recours au modèle animal reste, dans ce projet, un passage obligé étant donné que certains critères d’évaluations, tels que le comportement ou la tolérance de l’animal ne peuvent être déportés sur un modèle alternatif.
Réduction
Des calculs statistiques ont permis de déterminer le nombre d’animaux nécessaires par lot pour la réalisation de cette étude, à partir des courbes de croissances des fournisseurs et du premier jeu de mesures morphométriques obtenu sur des souris mortes issus d'autres études. Ces calculs tiennent aussi compte de la marge d’erreur de fabrication, d’un éventuel retrait des animaux de l’étude, et du schéma expérimental (équipement par 2 ou par 4 etc…). Des groupes de taille similaire ont été utilisés dans différentes publications rapportant l’utilisation de dispositif externe chez la souris (entre 5 et 9 animaux par groupe). Ce nombre d’animaux suffisait pour observer les avantages et inconvénients des dispositifs lorsque les animaux étaient équipés. Lors de la procédure d’évaluation, si plusieurs itérations doivent être réalisées, le même lot d’animaux sera équipé plusieurs fois afin de limiter au maximum l’utilisation de nouveaux lots d’animaux. Lors de la procédure de validation, le lot d’animaux sera équipé des plusieurs formes de prototypes ayant atteint cette phase. Cette méthode permettra de limiter le nombre total d’animaux requis afin de limiter au maximum l’utilisation de nouveaux lots d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans la même salle où auront lieu les procédures. Ils effectueront une semaine d’acclimatation avant le début de l’étude. Seul un déplacement de cage sera opéré afin de réaliser l’anesthésie dans une autre salle, prévue à cet effet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards, avec de la nourriture (standard) et de la boisson en accès libre. De l’enrichissement compatible avec le port d’un dispositif sera utilisé (litière, matériel de nidification). Les souris seront manipulées avec toutes les précautions requises et des interactions fréquentes sont prévues avec l’expérimentateur, afin de réduire le niveau de stress lié à la manipulation au cours des procédures. 24 heures avant la pose du prototype sur l’animal, une familiarisation au textile composant le prototype, similaire au protocole existant chez d’autres espèces, sera réalisée, diminuant le stress et maximisant les chances de succès de l’hébergement collectif. Une anesthésie légère sera effectuée facilitant l’équipement et le dé-équipement des souris minimisant le stress et éviter une contention des animaux éveillés. Sous anesthésie, l’hypothermie sera limitée par un tapis chauffant. Les griffes seront raccourcies. Si malgré ces précautions, des lésions ou des irritations apparaissent, des soins adaptés seront réalisés et une observation accrue de l’animal sera effectuée préalablement à sa réintégration au protocole. Les souris seront habituées progressivement à porter ce dispositif en se basant sur les protocoles d’habituation existants pour d’autres espèces. Un renforcement positif après les anesthésies sera mis en place en donnant quelques gouttes de lait concentré aux souris. Lors de la procédure d’évaluation, un test de prototype par jour par animal aura lieu pour limiter le mal être et les biais sur les résultats. Pour la procédure de validation, afin de limiter un biais éventuel dû à la présence du manipulateur dans la salle d’expérimentation, le manipulateur surveillera le comportement des souris via un suivi par vidéo, depuis une salle adjacente. Des points de contrôle seront réalisés à des temps réguliers. Chaque étape constituant la procédure de validation sera séparée par un temps de repos d’au moins une nuit. Si un des points limites prédéfinis est atteint (perte de poids importante, déshydratation, isolation dans un coin, automutilation, altération de la respiration etc…), la procédure sera arrêtée pour cet animal.
Choix des espèces
La souris représente environ 60% des modèles animaux utilisés à des fins scientifiques en France en 2021. Ce modèle est utilisé de manière importante dans des domaines nécessitant d’avoir accès aux constantes physiologiques des animaux pour répondre aux différentes thématiques de recherche ou pour suivre l’état des animaux au cours des expérimentations. Les souris seront utilisées à 10 semaines d’âge, le premier jour de l’expérience. Les animaux, à cet âge, sont les plus utilisés en recherche, et sont considérés comme adultes. Ceci permettra donc de toucher la plus grande gamme de souris utilisée dans le domaine de la recherche.
Détermination de la toxicocinétique d’un candidat médicament en vue de son utilisation clinique dans la lutte contre la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
52 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 36 en gravité sévère. Elles reçoivent chaque matin pendant onze jours, par voie orale, un candidat médicament contre la maladie de Huntington à doses croissantes, avec des prélèvements de sang à la queue, avant d'être tuées pour examiner leurs organes et l'atteinte du cerveau, pour mesurer la toxicité du composé. Le porteur reconnaît qu'aux fortes doses la molécule peut provoquer une toxicité et des signes d'inconfort. Il affirme que les études de toxicité sont "obligatoirement" réalisées chez l'animal et constituent une "étape indispensable" avant tout médicament.
Objectifs
La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique (18000 personnes atteintes en France et environ 300 000 personnes dans le monde) pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Un candidat médicament capable de réparer l’activité des neurones humains et de souris a été identifié. Il a été montré qu’un traitement sous cutané avec cette molécule permettait d’améliorer les troubles du mouvements et psychiatriques de la souris atteinte de la maladie de Huntington. Afin de développer un médicament pour les patients atteints de la maladie de Huntington à partir de cette molécule, nous allons dans ce projet : 1/ identifier les éventuels effets toxiques d’une prise répétée à différentes doses de la molécule et 2/ évaluer les effets de plusieurs doses d’administration. Cette molécule est un traitement potentiel pour la maladie de Huntington qui n’a jamais été utilisée auparavant et qui mérite d’être étudiée.
Bénéfices attendus
Il a été démontré que l'administration d’une seule dose de cette molécule avait un effet thérapeutique chez les souris atteintes de maladie de Huntington sans induire de toxicité. Afin de développer un traitement pour les malades, nous allons ici étudier l’effet de cette molécule administrée en dose répétée et voir quelles sont les meilleures doses répétées pour avoir un effet thérapeutique sans toxicité.
Procédures
Le traitement sera réalisé par voie orale tous les matins pendant 11 jours. Ce geste, d’une durée inférieure à 10 secondes, est bien toléré par l’animal. Un prélèvement sanguin sera réalisé à l'extrémité de la queue de l'animal à trois temps différents après gavage, le premier et le dernier jour du traitement. 30 secondes seront nécessaires au prélèvement sanguin et n’engendrera qu’un léger stress à l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés dans cette étude sont des souris d’âge adulte. Le traitement sera administré oralement, voie d’administration obligatoire car c’est celle qui sera utilisée chez l’homme. La contention et l’administration orale peuvent engendrer un léger stress chez l’animal. Une toxicité induite par le traitement est possible aux fortes doses, se traduisant par des signes d’inconfort chez l’animal.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'observer l'aspect des différents organes après administration du traitement ainsi que de mesurer l’atteinte du cerveau par cette molécule.
Remplacement
Les études de toxicité sont obligatoirement réalisées chez l’animal. Elles sont une étape indispensable à la validation d’une molécule avant d’en envisager son utilisation comme médicament chez le patient. Notre étude permettra de documenter les éventuels effets toxiques de cette molécule et aidera à définir les doses répétées à utiliser.
Réduction
Pour cette procédure, nous limitons le nombre d’animaux au minimum afin de pouvoir réaliser des analyses quantifiables et reproductibles. Au final, les animaux seront répartis dans 13 groupes de 4 animaux. Ces effectifs seront suffisants pour calculer les valeurs de concentrations de la molécule dans le sang et pour doser les différents paramètres de toxicité. Également, cet effectif sera suffisant pour nous permettre d’écarter le risque de conclure à une toxicité macro ou micro qui serait due au hasard par des analyses statistiques.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés dans des cages en respectant les normes en vigueur. Les cages sont équipées de litière (avec possibilité de faire un nid) et d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, le tout changé toutes les semaines. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude, de façon à prévenir toute survenue de points limites (poils hérissés, prostration, isolement dans la cage), et leur poids sera évalué de façon quotidienne. Le traitement par gavage sera réalisé par le personnel compétent, permettant ainsi de limiter au maximum le stress associé à ce geste.
Choix des espèces
Les études précédemment réalisées avec cette molécule ont été faites chez la souris. Dans un souci de cohérence et afin de pouvoir compléter nos données, la présente étude sera également réalisée chez la souris. Puisque l’étude vise à préparer les études de toxicité réglementaires qui seront réalisées sur animaux adultes, notre étude sera également réalisée sur des animaux adultes.
Evaluation du potentiel thérapeutique de la modulation de deux gènes pour traiter les dysferlinopathies 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
163 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une maladie musculaire rare, elles subissent des tests de force et de coordination, une course forcée jusqu'à l'abandon entretenue par de petits chocs électriques, un isolement de douze heures et des prélèvements allant jusqu'à 15 % de leur volume sanguin, avant un test terminal sous anesthésie et la mise à mort pour prélever les muscles. Le porteur signale une faiblesse musculaire dès quatre mois, une angoisse modérée et des douleurs musculaires liées à la course forcée. Il affirme qu'un modèle cellulaire ne suffit pas à évaluer une thérapie et qu'il faut mesurer les effets sur l'ensemble de l'organisme.
Objectifs
Les dysferlinopathies font partie des maladies rares du muscle et regroupent notamment la myopathie distale de Miyoshi et la myopathie des ceintures 2B. Les principaux signes cliniques sont la faiblesse musculaire et une atrophie prononcée des muscles, pouvant mener à des déficiences fonctionnelles sévères. A ce jour, il n'existe aucun traitement pour ces maladies, et aucune preuve de concept thérapeutique permettant de restaurer les fonctions motrices de souris modélisant cette myopathie. L'objectif de ce projet est ainsi d'étudier le potentiel thérapeutique de la modulation de deux gènes jouant un rôle important dans le muscle et s'étant déjà montrée efficace pour d'autres types de myopathies présentant des dérégulations similaires.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d'évaluer deux potentielles thérapies et pourrait permettre de fournir une première preuve de concept thérapeutique en vue de traiter des patients atteints de dysferlinopathie. En outre, cette étude apportera de nouvelles clés de compréhension sur les mécanismes associés à cette maladie et sur les acteurs impliqués.
Procédures
Des tests de force et de coordination non invasifs réalisés sur un temps court (une minute environ et 5 mins respectivement) seront réalisés trois fois durant la période d'étude des souris (de 4 à 6 mois d'âge). Chaque test sera réalisé trois fois avec un temps de repos de 10 minutes. Un autre test de fonction motrice consistant à faire courir la souris jusqu'à abandon sera réalisé 1 à 3 fois durant la vie de l'animal et durera au maximum 1h40. Les mouvements spontanées de l'animal seront également quantifiés durant 12h en laissant l'animal seul dans une cage. Des prélèvements de sang de 15% du volume total de l'animal seront réalisés toutes les deux semaines au maximum. Un dernier test sous anesthésie précédant l'euthanasie des animaux permettra de mesurer la force musculaire des souris. Ce test durera au maximum une heure, et l'animal sera surveillé.
Impact sur les animaux
Les premiers signes cliniques apparaîssent à 4 mois chez les souris et se limitent à de la faiblesse musculaire au niveau des membres, pouvant induire une angoisse modérée chez l'animal. Les animaux seront euthanasiés à 6 mois afin d'éviter la progression de la maladie et pour réaliser par la suite des analyses moléculaires. Les nuisances causées par les différents tests sont la chute de l'animal dans une cage remplie de litière entraînant une légère peur chez l'animal, l'extension de l'animal par tirement progressif de la queue par l'expérimentateur, l'isolement de l'animal pendant 12 h, la contrainte à la course par délivrance de petits chocs électriques pouvant entraîner des douleurs musculaires sur le court terme et l'anesthésie générale de l'animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue des deux procédures afin de récolter les muscles nécessaires aux analyses moléculaires et histologiques. Les animaux issus des accouplements ayant pour but le maintien de la lignée durant la durée du projet seront euthanasiés avant l'apparition des signes cliniques.
Remplacement
Le projet consiste à évaluer l'effet bénéfique de thérapies sur les fonctions locomotrices et la fatigue musculaire. Malheureusement, l'utilisation d'un modèle cellulaire ne suffit pas pour évaluer le potentiel d'une thérapie dans le cas d'une maladie musculaire. En effet, il est nécessaire de pouvoir évaluer les effets sur la contractilité du muscle ainsi que sur l'ensemble de l'organisme. Le modèle murin, étant suffisamment proche de l'homme physiologiquement et structurellement, permet de pouvoir étudier la physiopathologie ainsi que les effets d'une thérapie.
Réduction
Les tests phénotypiques prévus sont faiblement invasifs et permettent donc un suivi longitudinal des souris, ce qui réduit fortement le nombre de souris nécessaires. Les analyses histologiques et moléculaires seront effectuées sur les mêmes animaux après euthanasie. Le nombre d'animaux a été choisi à partir des données présentes dans une étude traitant des déficits moteurs du même modèle de souris et permettant d'observer des différences de démarche, d'activité locomotrice et de poids de muscles entre les souris myopathes et les souris saines dès 15 semaines d'âge.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu'au sevrage avant d'être hébergés en groupe. Chaque cage sera enrichie avec des nids de chanvre. En cas de difficultés locomotrices des animaux, la nourriture sera placée dans la cage. Lors des mesures in situ, le stress et la douleur liés à la procédure seront éliminés par injection intrapéritonéale d'un mélange d'anesthésiants et d'analgésiques. Durant toute l'expérience, la température corporelle de l'animal sera maintenue à sa valeur basale au moyen d'une plaque et d'une lampe chauffante. Un contrôle visuel de sa respiration sera effectué. Les animaux seront pesés deux fois par semaine et observé quotidiennement pour vérifier que leur état ne se dégrade pas. Dès lors qu'une perte de poids est observée, les animaux seront alors pesés quotidiennement. L'animal sera sorti de sa cage par les mains du manipulateur disposées en coupe. Avant chaque test phénotypique, l'animal sera familiarisé avec le matériel pour minimiser son stress.
Choix des espèces
Les souris sont suffisamment semblables à l'homme physiologiquement pour être un bon modèle d'étude des maladies musculaires. Dans notre projet, par exemple, la mutation présente chez les souris provient d'une mutation spontanée d'une lignée murine récapitulant les principaux signes cliniques observés chez l'homme. Les souris seront utilisées entre 4 mois et 6 mois d'âge, i.e. adultes. Cet âge correspond à l'apparition des signes cliniques moteurs chez les souris déficientes en dysferline. Le phénotype dégénère progressivement tout au long de la vie de la souris, il est donc préférable de réaliser les tests phénotypiques le plus tôt possible afin de limiter l'angoisse animale.
Etude de l’effet de différentes molécules ciblant les récepteurs à peptide RFamide sur la modulation de la nociception chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 020 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, réparties entre deux établissements. Selon les protocoles, elles reçoivent des injections répétées et subissent des tests de douleur par immersion de la queue dans l'eau chaude, pression sur la queue, filaments de Von Frey ou plaque froide, certaines après une chirurgie de constriction d'un nerf, pour tester des molécules ciblant des récepteurs de l'hypersensibilité à la douleur. Le porteur décrit un abaissement du seuil douloureux, des inflammations aux points d'injection et de suture et des troubles de la locomotion et de l'alimentation. Il affirme que l'évaluation de la douleur n'est "réalisable que sur l'animal entier" et présente la souris comme "incontournable" en neurosciences.
Objectifs
La douleur chronique est un problème de santé publique majeur. Elle diminue la qualité de vie des patients et son traitement a un impact économique considérable. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes de la douleur, peu de progrès ont été faits dans le développement de nouveaux analgésiques. Dans le cadre d’une douleur modérée à sévère, les opiacés restent à ce jour le moyen le plus efficace de traiter ces douleurs. Par contre, leurs effets indésirables sont nombreux, dont notamment la tolérance analgésique caractérisée par une diminution au cours du temps de l’effet du traitement nécessitant une augmentation des doses pour soulager le patient. La prise chronique d’opiacés entraîne également le développement d’une hypersensibilité à la douleur. Il y a donc des points communs entre l’hypersensibilité induite par les opiacés et le développement de l’hypersensibilité induite par les douleurs chroniques. Nos résultats récents indiquent que les récepteurs à neuropeptides RFamide sont impliqués dans ces phénomènes. Ce projet est un projet de recherche préclinique qui vise à développer de nouvelles voies thérapeutiques analgésiques peu ou pas caractérisées jusqu'à présent. Pour ce faire, nous avons récemment identifié des composés capables de bloquer sélectivement ces récepteurs à neuropeptides RFamide impliqués dans l’hypersensibilité. L’évaluation de l’activité de ces molécules dans différents modèles de douleur chez la souris nous permettra de mieux comprendre le rôle de chaque récepteur dans la modulation de la perception de la douleur et le développement de l’hyperalgésie. Ainsi il nous sera possible d’envisager le développement de nouveaux traitements de la douleur plus sûrs et présentant moins d’effets secondaires que les traitements existants. Le même projet est déposé dans deux établissements utilisateurs pour des raisons de disponibilités d’équipements scientifiques dont le planning des utilisations n’est pas connu à ce jour. Toutefois, le nombre d’animaux annoncé : 3020, sera utilisé sur l’ensemble des deux établissements.
Bénéfices attendus
Dans l’ensemble, les résultats de ce projet, combinés aux résultats obtenus par l’approche génétique, permettront d’affiner le rôle de chacun de ces récepteurs à neuropeptides RFamide et de leurs ligands endogènes (molécules naturellement synthétisées par les neurones pouvant s’y fixer) dans la modulation de la nociception, c’est-à-dire de la perception de stimulus douloureux et dans le développement de l’hyperalgésie induite par les opiacés et les douleurs persistantes. Ils pourraient permettre à terme d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la douleur.
Procédures
Gestes techniques subit par animal selon la procédure et le groupe auquel il appartient : PE1 : Injection composé x5 (10 secondes) / 10 tests Tail Immersion Test (TIT) d’une durée de 30 secondes / 10 tests Tail Pressure test (TPT) d’une durée de 30 secondes PE2 : Injection é x20 (10 secondes) / 15 tests TIT d’une durée de 30 secondes / 15 tests TPT d’une durée de 30 secondes PE3 : Injection x5 (10 secondes) / 10 tests TIT d’une durée de 30 secondes / 10 tests TPT d’une durée de 30 secondes PE4 : Groupe 1 : Injection x6 (10 secondes) / 10 tests TIT d’une durée de 30 secondes / 10 tests TPT d’une durée de 30 secondes Groupe 2 : Injection x9 (10 secondes) / 14 tests TIT d’une durée de 30 secondes / 14 tests TPT d’une durée de 30 secondes PE5 : Groupe 1 : Chirurgie CCI (20 minutes) / Injection x10 (10 secondes) / 15 tests du Von Frey d’une durée de 20 minutes / 15 tests de la plaque froide d’une durée de 5 minutes Groupe 2 : Chirurgie CCI (20 minutes) / Injection x10 (10 secondes)/ 15 tests du Von Frey d’une durée de 20 minutes / 15 tests de la plaque froide d’une durée de 5 minutes PE6 : Chirurgie incisionnelle (5 minutes) / Injection (10 secondes) x7 / 10 tests du Von Frey d’une durée de 20 minutes / 10 tests du plantar d’une durée de 15 minutes PE7 : Groupe 1 : Injection ITH sous anesthésie générale gazeuse (10 minutes anesthésie comprise) / 11 tests TIT d’une durée de 30 secondes Groupe 2 : Injection ICV sous anesthésie générale gazeuse (10 minutes anesthésie comprise) / 11 tests TIT d’une durée de 30 secondes PE8 : Injection composé (10 secondes) x1 / Injection anesthésie générale x1 (10 secondes) / injection analgésie locale x1 (10 secondes) / Ouverture thoracique (30 secondes) / Prélèvement de sang (30 secondes) / Perfusion / Prélèvement du cerveau PE9 : Injection composé (10 secondes) x1 / Prélèvement sanguin sur animal vigile (30 secondes)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant apparaitre après application de nos procédures, sont l’abaissement du seuil douloureux, l’apparition d’inflammation / œdème / infection au niveau des points d’injection ou des sutures chirurgicales, comportements anormaux, problème de locomotion, d’alimentation. Nous pouvons aussi nous attendre à une amélioration du niveau de douleur pour les molécules qui s’avéreront efficaces.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Aucune réutilisation d'animaux n'est possible du fait de l'administration de substances pharmacologique et des modèles de douleur subit par les animaux qui mettraient en cause les résultats d'une nouvelle procédure si elle était réalisée.
Remplacement
Les molécules testées in vivo sont au préalable sélectionnées sur la base d’évaluations in vitro afin de déterminer leur affinité et leur activité sur le récepteur d'intérêt ainsi que leurs caractéristiques physicochimiques. Ces expériences permettent de limiter fortement le nombre de molécules à tester sur l'animal. Cependant l'évaluation de leurs effets sur la nociception n’est réalisable que sur l’animal entier ; il n’existe, à ce jour, pas de modèles in vitro permettant de réaliser ce travail. Nous avons choisi la souris pour pouvoir comparer les résultats obtenus avec le phénotype des souris knockout pour les différents récepteurs RFamide disponibles au laboratoire dans les mêmes modèles de douleur.
Réduction
En raison de la variabilité dans les différentes expériences prévues et de nos résultats antérieurs, le nombre d’animaux est limité à 10 par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. L’évaluation préalable in vitro de nos molécules permet de réduire grandement le nombre de molécules à évaluer in vivo et par conséquent réduit également fortement le nombre d’animaux nécessaires pour leur évaluation. Les expériences seront menées sur les mâles et étendues aux femelles dans les modèles de douleur les plus pertinents.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte, dans un milieu enrichi, et observés quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente dans un établissement agréé de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et après concertation auprès de la structure chargée du bien-être animal. Dès que cela est possible, les gestes douloureux sont réalisés sous anesthésie générale, accompagnées d’une analgésie locale et sur tapis chauffant afin d’améliorer le confort de l’animal. Le réveil se fait individuellement en cage propre sous lampe chauffante.
Choix des espèces
Les objectifs du projet consistent à étudier les effets de ligands des récepteurs RFamide sur l’hyperalgésie induite par les opiacées ou associée aux douleurs persistantes. Pour ce faire, il nous est indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe prenant en compte les cascades de réactions, les voies de signalisation, la communication entre les organes afin d’être dans des conditions au plus proche de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. En plus de sa proximité physiologique avec l’Homme, la souris possède également une forte homologie génétique faisant d’elle un bon modèle d’étude de la douleur. L’ensemble de nos expérimentations animales est réalisé sur des souris dont le fond génétique permet de visualiser au mieux le développement de l’hyperalgésie. Par ailleurs, c'est également ce fond génétique que nous avons utilisé pour générer des souris génétiquement modifiées pour les différents récepteurs RFamide, ce qui nous permettra de comparer les conséquences du blocage pharmacologique et génétique de ces différents récepteurs. A leur arrivée au laboratoire, les souris sont âgées de 6 semaines avec un poids allant de 25 à 30 grammes. Les animaux sont soumis aux procédures expérimentales à partir de 8 semaines, ce qui correspond à l’âge de la maturité sexuelle et à un développement complet du système nociceptif.
Développements méthodologiques et formations sur la plateforme imagerie par résonance magnétique (IRM) chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 100
300 rongeurs, 200 souris et 100 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal peut subir jusqu'à vingt séances d'IRM sous anesthésie, d'une durée maximale de quatre heures, parfois avec injection d'un produit de contraste, non pour répondre à une question précise mais pour mettre au point des protocoles d'imagerie et former de nouveaux utilisateurs de la plateforme. Le porteur signale les risques de l'anesthésie répétée, hypothermie, troubles cardio-respiratoires et non-réveil, ainsi qu'une douleur au point d'injection. Il indique développer d'abord les méthodes sur échantillons in vitro ou ex vivo et ne recourir à l'animal vivant que pour valider les protocoles.
Objectifs
L'imagerie par résonance magnétique (IRM) du petit animal est une technique non invasive et non destructive des tissus in vivo. Elle permet l'étude longitudinale et tri-dimensionnelle notamment du cerveau normal et pathologique. Les divers types de contrastes et de modalités structurelles, fonctionnelles et spectroscopiques font de l'IRM une technique de choix pour la recherche en neurosciences expérimentales. Les applications de l'IRM expérimentale sont notamment la caractérisation d'une cohorte d'animaux (phénotypage), le suivi longitudinal de la progression d'une maladie ou d'un traitement thérapeutique, la validation de nouveaux biomarqueurs d’imagerie. Un large spectre de protocoles d’imagerie standards mais aussi avancés et innovants est possible avec l'IRM petit animal. L’objectif de ce projet est large et consiste à : (i) Développer des méthodes spécifiques innovantes aux besoins des équipes de recherches (ii) Adapter des méthodes standards existantes aux besoins des équipes de recherches (iii) Pratiquer des sessions de formation aux nouveaux utilisateurs de la plateforme Pour atteindre cet objectif, des expériences sur animaux anesthésiés doivent être menées.
Bénéfices attendus
Ce projet présente des bénéfices à long terme. Du point de vue scientifique, ce projet permet à la plateforme de rester à la pointe de la technologie et d’appliquer de nouvelles méthodes pour répondre à des questions scientifiques diverses (phénotypage d'une cohorte d'animaux, le suivi longitudinal de la progression d'une maladie ou d'un traitement thérapeutique, la validation de nouveaux biomarqueurs d'imagerie). D’autre part, ce projet permet de mettre en place ou d’optimiser des protocoles d’imagerie déjà existants. A la fin de chaque étude, nous pouvons estimer sa faisabilité avec la méthode choisie et l’équipement disponible, ce qui permet de ne pas initier d’études impliquant un grand nombre d’animaux lorsque les résultats obtenus ne sont pas satisfaisants. Au contraire, l’acquisition de ces données préliminaires lorsqu’elles sont robustes et pertinentes peuvent être utilisées pour appuyer une demande de financement. Du point de vue humain, ce projet permettra au personnel d’acquérir de nouvelles compétences : la préparation de l’animal (si la formation initiale d’expérimentation animale est validée), connaissances techniques de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et des séquences, prise en main de la console IRM, traitement des données IRM.
Procédures
Les animaux, 300 au total incluant 200 souris et 100 rats, réaliseront des examens d'imagerie par résonance magnétique (IRM) sous anesthésie gazeuse avec ou sans injection dans la veine de la queue d’un agent de contraste à base de gadolinium selon le besoin de l’étude. La procédure IRM dure 4h maximum (de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal). Les examens pourront être répétés jusqu’à 20 fois sur le même animal avec un délai de 24h minimum de récupération.
Impact sur les animaux
Différents risques sont identifiés : Risques liés à l’anesthésie : stress thermique (hypothermie), difficultés cardio-respiratoires, non récupération de la vigilance suite à la narcose Risque liés à l’injection intraveineuse de produit de contraste : douleur au point d’injection , hématome, saignement possible très localement
Devenir
Tous les animaux (300 au total, rats et souris confondus) peuvent être utilisés plusieurs fois dans le même projet : plusieurs examens par imagerie par résonance magnétique (IRM) avec ou sans injection de produit de contraste peuvent être réalisés sur le même animal. En fin de période de maintien (15 mois ou 20 examens IRM) ou en cas de points limites atteints les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Les développements méthodologiques et optimisations des protocoles IRM (imagerie par résonance magnétique) existants seront dans un premier temps réalisés sur des échantillons in vitro ou ex vivo (organe prélevé). Seules les méthodes nécessitant un organisme vivant complexe seront intégralement développées in vivo. Pour les autres méthodes, des tests in vivo seront réalisés en fin de processus afin de valider la méthode précédemment testée et développée sur des échantillons in vitro ou ex vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum. Selon les études, entre 1 et 3 animaux par lots pourront être utilisés pour valider les protocoles. Un animal est le minimun nécessaire pour obtenir une preuve de concept en validant la faisabilité de la méthode et 3 animaux est le minimum pour calculer la moyenne et l’écart-type sur les mesures réalisées. Un maximum de 10 animaux par lots sera utilisé pour avoir un échantillon suffisant afin d’obtenir un échantillon plus représentatif. L’imagerie est de fait une méthode non invasive pouvant être répétée pour un suivi longitudinal, évitant ainsi certaines euthanasies à des temps de références d’intérêt en récoltant les données par ce moyen. Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, nous favorisons la réutilisation d’animaux ayant déjà été utilisés dans d’autres études avec des procédures classées légères. Un total maximum de 300 animaux est prévu sur les 5 années de ce projet, dont 200 souris et 100 rats. La réalisation d’un examen IRM (imagerie par résonance magnétique) sur un animal permettra également de former une équipe directement sur son étude pilote et d’éviter d’utiliser des animaux seulement pour de la formation. Le but de ce projet étant plutôt de réaliser des études de faisabilité, nous n’envisageons pas de réaliser systématiquement des tests statistiques. La moyenne et écart type seront calculés (pour les groupes supérieurs à 3 animaux) pour avoir une référence et pourront être utilisés à posteriori pour des calculs de puissance pour les études ultérieures.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées et dans des conditions contrôlées de température/hygrométrie/éclairage. Les cages sont enrichies (nids, congénères, bâtonnets à ronger). Le transport des animaux entre la zone d’hébergement et la salle d’IRM (imagerie par résonance magnétique) se fait à l’aide d’un chariot dans une cage d’hébergement avec un enrichissement identique à celui de la cage d’origine. Les animaux sont laissés au calme pendant une demi-heure dans la salle de préparation pour qu’ils s’habituent à ce nouvel environnement. Une seule cage à la fois est amenée dans la pièce de préparation. Pendant qu’un animal est utilisé, les autres animaux de la cage sont laissés dans leur cage avec nourriture, eau ad libitum et enrichissement. Avant l’installation de l’animal sur le berceau IRM, du gel oculaire est appliqué pour éviter tout dessèchement oculaire, de la lidocaïne est appliquée sur les zones en contact avec les barres d’oreilles et de la vaseline est appliquée avant d’insérer la sonde rectale. La chambre de réveil est thermostatée, l’animal n’est remis dans sa cage d’origine que lorsqu'il est parfaitement réveillé. Il sera à nouveau examiné sous 24 heures pour vérifier sa récupération et plus si le besoin s’en fait ressentir. Tout au long de l’examen IRM (4h maximum), la profondeur de narcose et la température interne de l'animal sont contrôlées. La procédure sera immédiatement arrêtée et l’animal sorti pour vérification en cas de souffrance/angoisse chez les animaux pendant l’IRM, repérée par : une respiration supérieure à 120 respiration par minute (RPM) ou inférieure à 20 RPM malgré l'ajustement d'anesthésique ; une température supérieure à 40 degrés pendant plus de 5 min, une chute de température (perte de 1 degré en moins de 5 min) non liée à la baisse de température de consigne du bain marie ou de modification de l’anesthésie, une température trop basse (inférieure à 34 degrés pendant plus de 5 min et sans augmentation de cette dernière). Un animal inclus dans un lot test fera au plus 20 IRM dans sa vie (entre 3 semaines et 15 mois) avec un délai de récupération de 24h minimum et en ayant vérifié son état de récupération. Les animaux engagés seront surveillés quotidiennement par la zootechnie et une fois par semaine par un membre de l’équipe. En cas de signes de mal être : poils piqués, amaigrissement, posture voutée, un avis sera demandé à la structure en charge du bien être animal et au vétérinaire.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les principales espèces utilisées sur notre plateforme, leur taille permet de les utiliser dans ce type de machine pour acquérir des séquences capables de donner des détails anatomiques et fonctionnels qui contribue à répondre aux questions scientifiques posées. De plus, les rongeurs permettent l’étude de comportements complexes et de nombreux modèles rongeurs sont développés pour mimer des pathologies humaines. Les animaux peuvent être imagés entre 3 semaines et 15 mois, en fonction du protocole des équipes utilisatrices ou de la réutilisation longitudinale des animaux. Néanmoins, en l’absence de besoin spécifique pour le développement de la méthode, les animaux utilisés seront de jeunes adultes (âgés de 2 à 6 mois) afin d'avoir des conditions physiologiques les plus courantes possibles.
Effet d’un inhibiteur de Janus kinases (JAK) sur la fonction plaquettaire, l’hémostase, et la thrombose artérielle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 50 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Gavées une fois ou pendant sept jours avec un inhibiteur de JAK, elles subissent ensuite soit un prélèvement de sang terminal à l'aorte, soit la provocation d'une thrombose de la carotide sous anesthésie, pour confirmer que ce médicament de la polyarthrite favorise la formation de caillots. Le porteur signale que le gavage peut perforer l'œsophage ou provoquer une fausse route avec du sang dans la bouche, et que l'anesthésie peut perturber la respiration. Il affirme qu'il est "impossible" de remplacer la souris par des modèles in vitro pour étudier la thrombose.
Objectifs
La famille JAK (Janus Kinase) comprend 4 membres (JAK1, JAK2, JAK3 et TYK2) qui sont liés à des récepteurs appelés tyrosine kinases. Ce sont des enzymes qui sont responsables de la régulation de nombreuses fonctions cellulaires liées au système immunitaire. Les inhibiteurs de JAK ont un impact sur les maladies auto-immunes, comme la polyarthrite rhumatoïde. Cependant, l'utilisation d'inhibiteur universel de JAK, qui ciblent tous les membres de la famille, dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde, pourrait présenter un risque de formation accrues de caillots sanguins. L'objectif de ce projet est de confirmer l'effet d’augmentation de formation des caillots sanguins d'un inhibiteur universel de JAK à l'aide de modèles expérimentaux in vitro, ex vivo et in vivo.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet seront de mieux comprendre l’effet de l'inhibiteur universel de JAK afin de permettre une meilleure prise en charge des patients atteints d’arthrite rhumatoïde i) sur la fonction des plaquettes,ii) l’hémostase qui est un processus qui permet au corps de stopper un saignement. L’hémostase « colmate » une blessure par exemple en formant un caillot qui va arrêter le saignement et iii) la thrombose artérielle qui va correspondre à la formation d’un caillot dans un vaisseau sanguin. Ce caillot peut obstruer partiellement ou complétement le vaisseau et ainsi entrainer des problèmes de circulation sanguine et des complications médicales.
Procédures
Ils seront soumis à un gavage en administration unique ou répété sur 7 jours sur animal vigile. Le gavage d'un animal prend environ 2 minutes, un prélèvement de sang terminal à l’aorte abdominale sous anesthésie qui dure environ 10 minutes ou à une thrombose à la carotide sous anesthésie qui dure environ 1 heure.
Impact sur les animaux
Une des complications attendues est un impact de l’anesthésie (nécessaire au prélèvement de sang à l’aorte abdominale et au modèle de thrombose) sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Il existe également un risque de saignement au site d’incision lors du prélèvement de sang à l’aorte et du modèle de thrombose .L’insertion de la canule lors du gavage présente des effets indésirables tel qu’un risque de perforation. Un autre effet indésirable possible est le risque de fausse route lors de l'administration de l'inhibiteur universel par voie orale se manifestant par des difficultés respiratoires et/ou la présence de sang dans la bouche.
Devenir
Le prélèvement à l’aorte est un prélèvement terminal car la quantité de sang prélevée est très importante donc il est nécessaire après prélèvement de mettre les animaux à mort. La formation d’une thrombose sur la carotide altère la circulation sanguine et donc la fin de la procédure nécessite la mise à mort de l’animal.
Remplacement
Le but de ce projet est de confirmer l'effet pro-thrombotique du pan-inhibiteur de JAK en évaluant son impact sur la thrombose et les caillots sanguins à l'aide de modèles expérimentaux in vitro, ex vivo et in vivo. La formation de thrombose est un processus complexe car il implique différents types de cellules et des conditions spécifiques liées à la circulation du sang (vaisseaux, pression artérielle, flux sanguin). En raison de cette complexité, il est impossible de remplacer l'utilisation de souris par des modèles in vitro ne nécessitant pas de recours à la souris.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans cette étude est réduit au minimum, avec un nombre de 10 souris par groupe pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées par l’enrichissement des cages avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet de compartimenter leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont plusieurs par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. Les conditions de travail pour l’utilisation de modèles animaux ont été raffinées au maximum afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations.
Choix des espèces
La souris est un animal facilement disponible et les modèles d’étude in vivo y sont largement répandus et maîtrisés. Des souris WT C57BL/6J seront utilisées dans ce projet. Les souris seront utilisées au stade adule entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.
Nourrissage de tiques dures sur vertébrés pour élevage en laboratoire
- Conservation des espèces
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Tests réglementaires
Chèvres : 8
31 animaux non-humains, 23 lapins et 8 chèvres, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, aucun tué à l'issue. Rasés puis équipés de sacs de tissu contenant des tiques, fixés sur les oreilles des chèvres ou le dos des lapins, ils sont utilisés pour nourrir ces tiques et entretenir des colonies de laboratoire. Le porteur affirme que la salive des tiques est analgésique et que les animaux ne souffrent pas, tout en signalant des croûtes, des rougeurs quand les lapins arrachent les sacs et, chez une chèvre, une réaction œdémateuse de l'oreille. Il présente le gorgement artificiel sur membrane comme encore "difficile" à généraliser, et prévoit de replacer les chèvres dans une ferme pédagogique et les lapins via une association.
Objectifs
Le présent projet vise au maintien des colonies de tiques non infectées sur des animaux sains au sein de notre établissement afin de poursuivre les études entamées depuis 2018. L’élevage des deux espèces de tiques entretenues en insectarium a comme objectif premier de mieux comprendre leurs traits de vie (éléments extérieurs qui influencent le cycle de vie de la tique comme par exemple la température et l’hygrométrie) pour déterminer les contraintes présidant à son installation dans une zone géographique donnée et d’optimiser sa surveillance. Les tiques sont connues pour leur capacité à transmettre des agents pathogènes comme celui responsable de la maladie de Lyme. Le fait de disposer de tiques exemptes de pathogènes permet d’étudier ex vivo leur capacité à acquérir, maintenir et transmettre de nouveaux pathogènes ce qui démontre expérimentalement son rôle de vecteur. Par exemple, Rhipicephalus bursa, tique méditerranéenne, a été élevée afin de déterminer sa capacité à transmettre un virus nouvellement installé en Europe, le poxvirus responsable de la Dermatose Nodulaire Contagieuse Bovine. Il est également possible de purifier la salive des tiques pour étudier son rôle dans la modulation de la réponse immunitaire de l’hôte, afin d’identifier des biomarqueurs permettant de développer des tests d’exposition à la piqûre de tiques, surtout si l’on rate sa détection sur un hôte infesté, homme ou animal.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les besoins de la tique, d’identifier son milieu de vie optimal (niche écologique), ses capacités de dissémination et d’aider à la mise au point de méthodes de lutte efficaces. Pour cela, il est nécessaire de disposer d’un nombre suffisant de tiques à étudier au laboratoire, ce que seul le maintien des colonies de tiques sur animaux permet aujourd’hui. Le projet vise également à développer et optimiser le gorgement artificiel (nourrissage des tiques sur des membranes synthétiques contenant du sang), pour d’abord comprendre les déterminants critiques au nourrissage des tiques et découvrir de nouvelles pistes de lutte contre elles, et d’autre part, un jour, s’affranchir des animaux pour la production de colonies de tiques. De plus, le gorgement artificiel des tiques reste indispensable à la réalisation des études sur leur capacité à acquérir et maintenir des agents pathogènes à partir du sang infecté, sans l’utilisation d’infections expérimentales sur animaux. Ce volet est important pour mieux évaluer les risques sanitaires liés à la présence de quelles espèces de tiques.
Procédures
Les animaux ne sont soumis qu'aux gorgements des tiques. Aucun autre prélèvement n'est partiqué.
Impact sur les animaux
Les animaux ne souffrent pas de la présence des tiques : il est en effet connu que leur salive contient des substances analgésiques ce qui leur permet (dans la nature comme en élevage) de rester en place pendant des semaines sans être éliminées par leur hôte. Avant toute installation de sac de tissu contenant des tiques, les animaux (chèvres ou lapins) sont rasés dans la zone où les sacs seront positionnés. Le rasage des poils ne présente pas de gêne à l’animal. La seule gêne à proprement parlé est occasionnée pour les animaux par les sacs hermétiques positionnés sur les oreilles (chèvres) ou sur le dos (lapins). Aucun développement de l’immunité vis-à-vis des tiques n’est apparu parmi les animaux utilisés. Néanmoins, il peut apparaitre parfois quelques croûtes, qui disparaissent rapidement, au niveau du site de fixation des tiques (dos des lapins, oreilles des chèvres). Quand les lapins arrachent les sacs installés sur leur dos, il arrive également que la peau soit rougie. Une des chèvres a manifesté à deux ou trois reprises en 5 ans une réaction œdémateuse et suintante de l’oreille suite à la fixation des tiques. Cette réaction, qui entraîne la mort des tiques, a disparu en quelques jours.
Devenir
Les chèvres seront replacées dans une ferme pédagogique pour une retraite paisible. Les lapins seront replacés chez des particuliers via une association type white rabbit.
Remplacement
Il est difficile de remplacer complètement le nourrissage de tiques sur animaux de laboratoire. Néanmoins, des essais d’alimentation artificielle de tiques sont déjà en cours et vont se poursuivre, en s’appuyant sur l’expérience d’autres équipes travaillant sur ce sujet dans le monde. Il a été possible de gorger des tiques adultes H. marginatum grâce à un dispositif artificiel. Les performances sont légèrement moins bonnes que lors de gorgement naturel sur animaux, mais surtout on ne peut obtenir qu’un faible nombre de femelles gorgées simultanément. Il n’a en revanche pas été possible de nourrir des tiques immatures, en partie du fait que cette espèce est une tique à deux hôtes , c’est-à-dire que les larves restent fixées à leur hôte pour se métamorphoser en nymphes, qui s’attachent immédiatement au même endroit : la durée de fixation des tiques immatures est ainsi de 3 à 4 semaines minimum (contre 10-15 jours pour les adultes), durée pendant laquelle il est très compliqué de garder intactes et non contaminées les membranes placées entre le sang et les tiques.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires à l’entretien de nos populations de tiques a été fortement réduit par rapport à ce qui était prévu lors du projet précédent. Dans le présent projet, nous tenons compte de cette réduction importante, permise par l’absence d’immunité et le maintien d’un bon état général des animaux suite à chaque session de gorgement. Néanmoins, une des problématiques est l’âge des lapins et des chèvres qui doivent être renouvelés périodiquement, généralement tous les 4 et 8 ans, respectivement. Le nombre d’animaux nécessaire au projet n’augmente pas mais leur renouvellement est nécessaire pour tenir compte de la durée de vie de l’animal au sein du laboratoire par rapport à sa durée de vie totale.
Raffinement
Les chèvres sont des animaux grégaires. Elles vivent en groupe dans notre animalerie, dans le même box. Les lapins sont transférés en cas de nécessité de la zone d’hébergement, où ils sont gardés dans des cages individuelles, à la zone de production de tiques, dans l’insectarium, où ils sont également maintenus dans des cages individuelles. Celle-ci sont en plexiglas ce qui permet un contact visuel avec les congénères car les sessions de gorgement des tiques concernent toujours 3 ou 4 animaux simultanément. Les cages sont conçues pour réduire les risques d’échappement des tiques, et pour que les animaux puissent se voir. Chaque cage est également équipée d’un abri opaque sous lequel les lapins peuvent se réfugier s’ils le désirent. Ils ont également à disposition des pierres à grignoter, tout comme dans les cages d’hébergement.
Choix des espèces
Les chèvres font partie des hôtes naturels des tiques dures adultes et présentent un format facilement gérable en animalerie. Les lapins font partie des hôtes naturels des stades immatures (larves et nymphes) des tiques Hyalomma et sont plus faciles à maintenir en élevage que les autres hôtes naturels (oiseaux et lièvres). Leur format de plusieurs kilos (4-5 kg) permet des infestations plus importantes, de 500 à 1000 larves, que celles qui pourraient être mises en œuvre avec d’autres animaux, comme les rongeurs, ce qui limite le nombre d’animaux nécessaire. Leur longue durée de vie est également un atout pour limiter le nombre d’animaux expérimentaux, tout comme leur réutilisation a des fréquences variables, en fonction des besoins des études scientifiques en cours : sessions de gorgement tous les 1-3 mois pour les chèvres, tous les 3-6 mois pour les lapins. Les stades immatures des tiques Rhipicephalus bursa se gorgent normalement sur les mêmes hôtes (ruminants) que les tiques adultes, mais cela ne peut être pratiqué compte tenu du risque d’échappement de ces stades. Ce sont en effet des tiques de très petite taille (quelques millimètres) et leur durée de gorgement est très importante (3 à 4 semaines). Cette longue durée entrainerait des risques accrus de décollage des sacs et de dissémination potentielle des tiques dans les box. Les lapins représentent une alternative applicable aux stades immatures de l’espèce. Chèvres de 1 an car elles s’habitueront plus facilement à l’environnement de l’animalerie. Lapins de 11-13 semaines (2-3 kg) car ils sont adaptés morphologiquement (taille des oreilles), physiologiquement et immunologiquement à la charge parasitaire (tiques) de l’élevage.
Impact des récepteurs sérotoninergiques 5-HT7 sur la neuroinflammation dans un modèle de sclérose en plaque chez la souris : étude d’imagerie.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Témoins ou privées d'un récepteur, elles subissent trois séances d'imagerie cérébrale d'environ une heure sous anesthésie, avec pose d'un cathéter caudal et injection d'un radiotraceur, avant d'être tuées par surdosage pour prélever leur cerveau, afin d'étudier le rôle de récepteurs sérotoninergiques dans la neuroinflammation d'un modèle de sclérose en plaques. Le porteur indique qu'un produit ajouté à l'alimentation peut faire perdre 11 à 15 % du poids corporel les premières semaines, et signale un possible stress, une hypothermie légère et des hématomes. Il annonce une nouvelle piste thérapeutique au conditionnel et au long terme, et affirme que seules des études chez l'animal vivant reproduisent cette complexité.
Objectifs
Le projet porte sur la découverte de nouveaux traitements de la sclérose en plaque (SEP). Comme dans un grand nombre de maladies neurologiques, la SEP est associée à un processus inflammatoire à l’origine d’un déséquilibre des interactions entre les cellules du système nerveux central (SNC) et périphérique (SNP). Le projet est focalisé sur un neurotransmetteur (messager chimique permettant aux cellules nerveuses de communiquer avec d’autres cellules) majeur du SNC qui est aussi impliqué dans la communication avec le SNP. Ce neurotransmetteur agit en se liant sur différents récepteurs exprimés par les cellules, dont le rôle précis est encore mal élucidé. L’hypothèse innovante de notre projet est que des récepteurs sont impliqués dans les mécanismes inflammatoires associés au système neurotransmission. L’objectif général est de mieux comprendre ces mécanismes et d’ouvrir une nouvelle piste thérapeutique pour les maladies neuroinflammatoires dont la SEP, avec un médicament qui, via un effet sur ces récepteurs, permettra de moduler le processus d’inflammation dans le cerveau (neuroinflammation, NI). Pour cela, nous allons explorer cette NI en utilisant une méthode d’imagerie in vivo parfaitement validée dans le laboratoire, dans un modèle connu de SEP chez la souris. Ce modèle sera mis en œuvre chez des souris témoins et des souris n’exprimant pas le récepteur. L’hypothèse est que la NI induite dans le modèle sera exacerbée chez les souris transgéniques par rapport aux souris Témoins. Les résultats de cette étude nous permettra, dans une étape suivante du projet, d’évaluer les effets de nouveaux composés agissant sur ces récepteurs.
Bénéfices attendus
La finalité du projet est d’apporter de nouvelles connaissances dans le domaine des neurosciences et plus particulièrement celui des maladies neuroinflammatoires. Le bénéfice attendu à court terme est de mieux comprendre le rôle des récepteurs dans les mécanismes de neuroinflammation associés à une affection telle que la SEP. A plus long terme, il est de faire émerger une nouvelle piste thérapeutique pour la SEP, maladie neurodégénérative qui touche plus de 110 000 personnes en France, affecte le cerveau, la moëlle épinière et les nerfs optiques, et pour laquelle aucun traitement permettant de la guérir n’est actutellement disponible.
Procédures
L'imagerie durera environ 1h11, cette étude sera réalisée sous anesthésie générale, 3 fois sur chaque l’animal à trois âges différents. Les animaux seront soumis à la mise en place d’un cathéter à la veine caudale sous anesthésie générale, la durée est de 10 min. Les souris recevront une injection en intra-veineuse d'un radiotraceur d'une durée d'une minute et seront ensuite imagées pendant 60 min. L'étape suivante sera réalisée par surdosage d'anesthesie. A la suite de la constatation de l'arrêt des battements cardiaques, la chirurgie sera réalisée sur tous les animaux, elle durera 10 min.
Impact sur les animaux
Les explorations seront réalisées chez des souris témoins et trangéniques. Nuisances liés à l'administration d'une produit pharmacologique dans l'alimentation : les données connues indiquent une possible légère perte de poids. Dans une publication scientifique, il a été décrit que les animaux recevant une prise alimentaire avec le produit pharmacologique peut entraîner une diminution significative du poids corporel de 11 à 15% au cours des 5 premières semaines de traitement, avec un retour à la non significativité la 6ème semaine . Dans une publicartion scientifique plus récente utilisant les mêmes conditions expérimentales, il est mentionné qu’aucune souris n’est morte durant la période de traitement pour les souris transgéniques. Aucune différence en terme de développement, croissance, température corporelle, reproduction, fonctionnement neurologique n’a été décrite chez les souris transgéniques vs souris témoins. Nuisances liées à l'imagerie: possible stress lié à la manipulation des animaux, légère hypothermie induite par l'anesthésie générale et possibilité d'hématome suite au placement du cathéter poyur les souris trangéniques et témoins.
Devenir
Quarante huit heures après la 3ème séquence d’imagerie, tous les animaux seront mis à mort et leur cerveau prélevé afin de réaliser des études d’immuniohistochimie sur coupes.
Remplacement
Au cours d’une affection neurologique telle que la sclérose en plaque, les processus neuroinflammatoires résultent d’interactions complexes entre différents types cellulaires (neurones, cellules gliales) et moléculaires (libérations d’un grand nombre de facteurs chimiques), et sont intriquement liés au fonctionnement de la barrière hémato-encéphalique (interface cerveau/circulation sanguine). Seules des études chez l’animal vivant peuvent reproduire cette compléxité. De plus, la méthode d’imagerie que nous allons utiliser l’est également chez l’humain (même traceur radioactif), d’où une transposition plus facile des résultats que nous obtiendrons.
Réduction
L’utilisation de la méthode d’imagerie in vivo au cours de ce protocole va permettre de réduire le nombre d’animaux utilisé qui est néanmmoins dicté par les groupes expérimentaux réquis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée. Ainsi, chaque animal sera exploré par imagerie 3 fois au cours de sa vie. Nous prévoyons de réaliser les protocoles d’imagerie dans 2 séries expérimentales qui ne comporteront que des mâles ou que des femelles. En effet, le sexe semble être un facteur à prendre en compte dans ce projet car : - Il est connu que la SEP affecte deux à trois fois plus de femmes que d’hommes . Dans le modèle, on trouve des informations variées, indiquant une démyélinisation identique chez les mâles et les femelles , mais aussi une réponse fonctionnelle différente en fonction du sexe . Nous explorerons ainsi 2 groupes d’animaux / sexe, soit 15 mâles + 10 femelles transgéniques et 15 mâles + 10 femelles témoins, (afin d’assurer un minimum de 8 animaux à exploiter, par exemple en cas d’échec de l’injection intra-veineuse du traceur ou de mort au cours de l’imagerie). Les résultats seront analysés en utilisant des test stastiques appropriés.
Raffinement
Après la phase d’acclimatation, les animaux seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les souris seront observées une à 2 fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort. Pour l’imagerie, les animaux auront une anesthésie gazeuse. Une protection occulaire sera appliquée pendant toute la durée de l’imagerie. L’animal sera maintenu durant toute l’expérimentation sur un tapis chauffant. Nous assurerons une surveillance continue du rythme respiratoire et de la température corporelle de l’animal et le surveillerons jusqu’à son réveil complet.
Choix des espèces
- La souris est un modèle de choix car les mécanismes inflammatoires responsables des dysfonctionnements neurologiques sont très similaires à ceux présents chez l’humain. - Le récepteur étudié est présent dans les deux espèces. - Le modèle de SEP que nous utiliserons est largement décrit et validé dans la littérature. - La taille du cerveau de la souris est compatible avec la résolution spatiale de la caméra microTEP (environ 1 mm). Nous utilisons des souris d'age adulte car : - la SEP touche une population adulte - le modèle étudié est déjà décrit à ce stade de la vie chez la souris