Procédures légères

949 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Modèles de la maladie d'Alzheimer, elles sont génotypées par prélèvement d'oreille ou de queue, opérées par injection dans le cortex moteur et soumises à des tests d'apprentissage sur roue avec isolement partiel, pour étudier le rôle du vieillissement de cellules gliales dans le déclin cognitif. Le porteur indique que l'isolement peut induire des "troubles dépressifs" et que la chirurgie provoque une douleur atténuée par des antidouleurs. Les souris des procédures sont euthanasiées pour prélèvement des tissus, tandis qu'une cohorte de lignées est conservée pour des études ultérieures.

Objectifs

La cognition et son déclin avec le vieillissement font partie intégrante des maladies psychiatriques et neurodégénératives liées au développement et à l'âge, en particulier dans la maldie d'Alzheimer. Si les circuits neuronaux sont à la base de l'organisation cérébrale, une accumulation de preuves a désormais mis en évidence le rôle potentiel des cellules oligodendrogliales dans la plasticité cérébrale et la cognition. Dans ce projet, nous allons tenter de comprendre si le phénotype vieillissant des cellules oligodendrogliales peut directement participer à l'apparition de symptômes dans le modèle murin d'Alzheimer, notamment en accélérant la neurodégénérescence axonale. Ce projet est divisé en plusieurs étapes, à partir d'un modèle murin d'Alzheimer 5xFAD : 1/ Caractériser l'effet du vieillissement oligodendroglial sur les capacités cognitives ; 2/Identifier les gènes dérégulés dans les cellules oligodendrogliales ; 3/ Caractériser le rôle de gène cibles oligodendrogliaux dans l'apparition de déficits cognitifs. En caractérisant l'effet du vieillissement des cellules oligodendrogliales sur la cognition, notamment dans un modèle murin de maladie d'Alzheimer, notre projet pourrait donner lieu à des développements cliniques à fort impact, pour une maladie encore sans traitements efficaces.

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet répondra aux besoins scientifiques suivants. À court terme : une meilleure compréhension du rôle des cellules oligodendrogliales et des voies dérégulées dans l'apparition des déficits cognitifs dans un modèle murin de maladie d'Alzheimer. À long terme : développer des stratégies translationnelles basées sur une réactivation et rajeunissement des cellules oligodendrogliales pour ralentir la neurodégénérescence dans la maladie d'Alzheimer, et donc retarder l'apparition de symptômes chez les patients. Le déclin de la cognition cérébrale représente un problème majeur de santé publique, car les déficits d'apprentissage développemental et la démence liée à l'âge peuvent fortement affecter la qualité de vie des personnes et les dépenses de santé globales.

Procédures

Les souris seront soumises à un bref (5 secondes, une fois) punch d'oreille pour le génotypage après sevrage. D'autres devront être génotypés avant sevrage, en prélevant un échantillon de queue (sous anesthésie, 5 secondes, une fois). Des animaux subiront une anesthésie à l'isoflurane. Certaines souris seront injectées chirurgicalement dans la zone corticale motrice (chirurgie de 30 minutes, comprennat le temps pré- et post-opératoire, une fois). Des souris seront soumises à des tests comportementaux afin d'évaluer leur capacité d'apprentissage moteur (2 semaines, isolement partiel, une fois). Les souris seront anesthésiées avant d'être euthanasiées (1 minute, une fois).

Impact sur les animaux

Lors du génotype avant sevrage ou pendant la chirurgie, on pourrait noter quelques saignements. Lors des tests comportementaux, les souris seront partiellement isolées et peuvent donc présenter des troubles dépressifs. Après la chirurgie, les animaux pourraient ressentir de la douleur, qui devrait etre limitée par les traitement anti-douleur prévus.

Devenir

Tous les ensembles expérimentaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Une cohorte des lignées de souris générées Tet1cKOxAD sera conservée dans notre animalerie, pour des études ultérieures.

Remplacement

Si des progrès ont été réalisés pour modéliser les pathologies et la connectivité neuronale dans les cultures (organoïdes par exemple), ces modèles ne suffisent pas à appréhender pleinement les fonctions cognitives au niveau de l'organisme et comment pouvoir les maintenir malgrès le déclin observé avec l'âge. À l'heure actuelle, il est nécessaire d'utiliser des modèles de souris pour mieux aborder le rôle de cellules spécifiques et de voies moléculaires dans la mémoire et l'apprentissage. En parallèle, nous exploitons des modèles in vitro de co-cultures primaires, de lignées cellulaires et de cellules souches pluripotentes induites humaines. En effet, pour optimiser notre approche lentivirale, nous allons d'abord tester notre protocole sur des lignées cellulaires Olineu, afin de limiter les étapes d'optimisation sur des cultures cellulaires primaires.

Réduction

Afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux nécessaires dans chaque procédure expérimentale afin de détecter un effet statistiquement pertinent, nous avons effectué une analyse de puissance grâce à plusieurs tests statistiques. En raison de la variabilité interindividuelle, nous avons prévu d'inclure 5 souris par groupe, pour chacun des essais comportementaux. Nous n'avons remarqué aucune différence de comportement entre les sexes lors de nos études précédentes, nos cohortes seront donc composées de souris des deux sexes. Pour les animaux sacrifiés pour les cultures de tissus, nous devons mettre en commun 3 tissus de souris par expérience. Notre expérience avec ce modèle de co-culture suggère de prévoir 4 répétitions par test in vitro, pour chaque lecture (immunohistochimie, électrophysiologie,...).

Raffinement

Les animaux sont sous la surveillance et l'observation quotidiennes de soigneurs animaliers formés et chargés de veiller à leur bien-être. Pour la procédure d'apprentissage de la roue complexe, les animaux seront hébergés individuellement jusqu'à 7 jours dans une cage enrichie, dans laquelle nous n'observons normalement aucun phénotype d'isolement social. Il est à noter que les cages de comportements sont transparentes, donc l'isolement est partiel : les souris sont isolées mais maintiennent un contact visuel et auditif auprès de leur cohorte (10-20 souris). Cependant, si nous observons un changement de comportement ou un manque d'intérêt pour la roue, l'animal sera exclu de la procédure et replacé dans sa cohorte de groupe. Pour la chirurgie stéréotaxique, les souris recevront une injection d'anti-douleurs et seront sous anesthesie profonde. Pendant la chirurgie, nous placerons l'animal sur un tapis chaufant et appliquerons une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée et couvrirons les yeux pour éviter une exposition intense à la luminosité pendant la procédure. La chirurgie sera réalisée dans des conditions stériles (gants, outils, instruments,...). Après la chirurgie, l'animal sera placé sous une lampe chauffante jusqu'au réveil anesthésique. Des granulés alimentaires ramollis et de l'eau supplémentaires seront fournis à l'intérieur de la cage pour les animaux, afin de fournir un soutien trophique général et de garantir que la perte de poids est limitee. Si l'état général du corps atteint des points limites, les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale après anesthésie.

Choix des espèces

Les modèles de souris sont pertinents car ils sont couramment utilisés dans les études comportementales portant sur les fonctions et les déficits cognitifs. L'existence de lignée knock-out ou modèles de la maladie d'Alzheimer nous permet de recréer des modèles pertinents dans notre établissement. Pour les procédures comportementales, les souris adultes seront utilisées à l'âge de 4 mois. Pour les procédures utilisées en culture, les souriceaux de 7 jours seront utilisés pour collecter les tissus cérébraux.

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Exposées pendant la gestation et la lactation à des mélanges de polluants, elles subissent une série de tests comportementaux, activité locomotrice, anxiété, apprentissage et mémoire spatiale, avant d'être euthanasiées pour prélèvement des tissus cérébraux. Le porteur indique que l'exposition pourrait altérer l'apprentissage et la mémoire, effets que le projet vise justement à déterminer. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne peut remplacer l'animal entier pour l'étude des effets comportementaux, une partie des analyses étant faite in vitro.

Objectifs

L’évaluation des effets de contaminants chimiques se fait encore actuellement substance par substance, ce qui ne reflète pas de manière réaliste l'exposition environnementale. Ce projet vise à étudier chez la souris les effets neuraux de mélanges réalistes de polluants chimiques, identifiés dans des matrices et cohortes humaines, et à des doses faibles estimées pour cette exposition environnementale. Ce travail combinera des approches complémentaires d’analyses comportementales, neuroendocrines, cellulaires et moléculaires afin de caractériser les effets et les modes d'action de ces mélanges et ainsi participer à travers les données produites à l'amélioration de l'évaluation des effets de mélanges de substances chimiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de cette étude sont i) l'obtention de données sur les effets potentiels sur la santé humaine de l'exposition à deux cocktails de contaminants environnementaux, ii) l’identification de biomarqueurs pertinents de l’exposition qui peuvent servir à l’évaluation du risque pour la santé humaine, et iii) l’établissement et l’amélioration d'approche d'évaluation des effets de mélanges de contaminants chimiques à des doses de l'ordre de l'exposition environnementale.

Procédures

Les animaux analysés seront exposés pendant les périodes gestationnelle et lactationnelle à de très faibles doses de substances chimiques, incorporées dans un morceau de pâte à cookie proposé aux mères gestantes sans contrainte. Les animaux issus de ces mères exposées, seront séparés en deux lots. Un premier lot subira une euthanasie réglementaire sous analgésié/anesthésie après sevrage. La mort de l’animal est immédiate dès le début l’euthanasie et la procédure dure environ 15 minutes. Le deuxième lot sera analysé dans 5 tests comportementaux. Après sevrage, les animaux seront évalués pour leur activité locomotrice (1 fois 2h) puis état d’anxiété basale (1 fois 10 min), et à l’âge adulte, pour l’apprentissage et la mémoire spatiale (4 essais de 90 secondes chacun par jour pendant 8 jours, puis deux tests finaux de 60 secondes chacun, 20 minutes et 24h-72 h après le dernier test), puis pour leur activité locomotrice (1 fois 2h) et état d’anxiété basale (1 fois 10 min). A l’issue de ces tests, les animaux subiront une euthanasie réglementaire sous analgésié/anesthésie. La mort est immédiate dès le début de l’euthanasie et la procédure dure environ 15 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales d’anesthésiques et d’antalgiques peuvent générer une douleur légère au point de piqûre. Un léger inconfort peut être généré par la première introduction des souris dans les dispositifs utilisés dans les tests comportementaux. Les effets comportementaux potentiels de l’exposition développementale aux mélanges de contaminants, qui sont à déterminer dans ce projet : effets locomoteurs, troubles anxieux, altération de l’apprentissage et de la mémoire.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés pour prélever les tissus nécessaires à la réalisation des analyses neuroanatomiques et immunohistochimiques.

Remplacement

L’évaluation pour la santé humaine des effets de l’exposition aux polluants chimiques repose sur l’utilisation des modèles rongeurs et la caractérisation dans ces modèles in vivo des effets et des mécanismes de ces substances. Jusqu’à présent, ces critères ne peuvent être étudiés que dans ces modèles in vivo. Une méthode alternative ne peut remplacer l’animal entier notamment pour l’étude des effets comportementaux. Néanmoins, certains aspects de cette étude seront remplacés par de la modélisation mathématique et une approche in vitro de cultures de cellules.

Réduction

Les effectifs utilisés (450 au total) ont été calculés au plus juste afin d'obtenir une puissance statistique significative. L’utilisation des animaux servira seulement pour l’exposition aux mélanges complets, afin de caractériser les effets et les mécanismes d’action des mélanges. La comparaison des effets de certaines substances seules à ceux des mélanges, ou la dissection des mécanismes moléculaires des polluants du mélange seront effectuées in vitro sur des cultures de cellules. Par ailleurs, plusieurs régions cérébrales ainsi que plusieurs organes seront collectés et stockés pour des études ultérieures.

Raffinement

Les animaux seront produits et hébergés localement, conformément à la législation en vigueur, afin d'éviter tout stress lié au transport, sous la supervision de soigneurs et d’un vétérinaire qualifiés. Les souris seront soumises à un cycle lumière- obscurité de 12 h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l'enrichissement, un nid sera placé dans la cage. Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement. De plus, une habituation à l'expérimentateur est pratiquée pendant au moins une semaine avant le début des tests comportementaux, afin d'éviter tout stress lié à la manipulation. La mise en place de points limites précoces permet une surveillance adaptée des animaux et une prise en charge antalgique ou anesthésique dès que nécessaire.

Choix des espèces

La souris est l'un des modèles les mieux caractérisés pour ces études comportementales et neuroendocrines grâce à la disponibilité d'outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques...), et de données dans la littérature permettant d'une part de comparer les résultats obtenus avec ceux des autres laboratoires et d'autre part d'implémenter les connaissances sur cette thématique. Les tests réalisés depuis le sevrage jusqu'à l'âge adulte sur les souris mâles et femelles permettent d'avoir une analyse longitudinale des effets à court et à long terme.

1 036 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent trois irradiations de l'abdomen sous anesthésie, des coloscopies pour l'administration d'un patch ou d'un gel, puis un prélèvement sanguin terminal, l'irradiation pouvant toucher l'intestin grêle et provoquer un amaigrissement et un gonflement abdominal irréversibles. L'objectif déclaré est de tester des traitements régénératifs contre les lésions du côlon provoquées par la radiothérapie chez des patients atteints de cancer pelvien. Le porteur affirme qu'évaluer un tel traitement exige un modèle animal intégré et que les organoïdes ne sont pas techniquement possibles ici.

Objectifs

L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer les bénéfices thérapeutiques des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) ainsi que des molécules anti-inflammatoires et antifibrotiques lorsqu'elles sont intégrées dans un dispositif médical innovant auto-enroulé ou dans une solution liquide gélifiante à 37°C. L'objectif principal est de traiter de manière ciblée et locale les lésions colorectales radio-induites, en favorisant la régénération tissulaire et en réduisant l'inflammation et la fibrose associées à ces lésions. Par conséquent, ce projet vise à améliorer la qualité de vie des hommes et des femmes atteints de radioproctopathie.

Bénéfices attendus

Le projet de recherche scientifique vise à apporter plusieurs bénéfices dans le domaine de la prévention et du traitement des lésions radio-induites dans le côlon, notamment : - Meilleure compréhension de la dynamique précoce des lésions radio-induites : Le projet permettra d'approfondir notre compréhension des mécanismes sous-jacents aux lésions radio-induites dans le côlon. Cela inclut l'identification des processus cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement initial des lésions, ainsi que l'évolution de ces lésions au fil du temps. Cela permettra une détection précoce plus précise et une intervention thérapeutique plus efficace. - Développement d'un traitement préventif : Le projet vise à développer des approches thérapeutiques préventives pour réduire le risque de lésions radio-induites dans le côlon. Cela pourrait inclure l'utilisation de molécules spécifiques, de dispositifs de libération locale ou d'autres stratégies novatrices visant à protéger les tissus normaux contre les effets néfastes de la radiothérapie. Un tel traitement préventif pourrait contribuer à améliorer la qualité de vie des patients en limitant les lésions radio-induites. - Développement d'un traitement curatif de la radioproctopathie : la radioproctopathie désigne les lésions radio-induites spécifiquement localisées dans le colon descendant-rectum. Le projet vise à développer des traitements curatifs ciblant cette condition. Cela pourrait impliquer l'utilisation de molécules thérapeutiques spécifiques, de dispositifs de libération locale ou d'autres approches novatrices pour promouvoir la guérison des lésions, réduire l'inflammation, restaurer la fonction normale du colon et éviter la fibrose. Cette approche curative pourrait améliorer la qualité de vie des patients et réduire les complications à long terme. En somme, les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. Il comprend une meilleure compréhension de la dynamique précoce des lésions radio-induites dans le colon, ainsi que le développement de traitements préventifs et curatifs pour la radioproctopathie. Ces avancées contribueront à améliorer les résultats cliniques, à réduire les effets indésirables de la radiothérapie et à améliorer la qualité de vie des hommes et femmes atteints de cancer pelvien.

Procédures

- Irradiations locales au niveau de l'abdomen sous anesthésie gazeuse (maximum 6 minutes), 3 fois avec un intervalle de 48 heures entre chaque séance. - Coloscopie sous anesthésie gazeuse, d'environ 10 minutes, une ou deux fois selon le groupe pour l’administration du traitement (patch ou gel). - Prélèvement de 10 ml de sang à partir de l'artère mésentérique avant l'euthanasie, d'environ 2 minutes, sous analgésique et anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

Les deux modèles d’irradiation localisée du colon, chez le rat, utilisés dans ce projet sont déjà utilisés dans le laboratoire. Ce modèle d’irradiation du côlon peut toucher une petite zone de l’intestin grêle, qui est mobile, entraînant des signes cliniques spécifiques irréversibles : amaigrissement de l’animal accompagné d’un gonflement au niveau de l’abdomen. La mise en place du système enroulé se fait sous coloscopie avec anesthésie, de même pour le liquide gélifiant qui sera administré par voie rectale sous anesthésie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires.

Remplacement

L’objectif de cette étude est de valider in vivo sur un modèle de pathologie radio-induite cliniquement relevant l’efficacité de traitements locaux combinés. Pour évaluer l’efficacité thérapeutique d’un traitement, il est nécessaire d’utiliser un modèle intégré in vivo. De plus l’effet de ces traitements, pour qu’ils soient pertinents, nécessitent leur interaction avec les différents compartiments du côlon, condition retrouvée chez le modèle animal intégré. D'autre part, l'utilisation des organoïdes pour la réalisation de ce projet n'est actuellement pas techniquement possible, car il est nécessaire d'obtenir une monocouche orientée de cellules.

Réduction

Pour atteindre la pertinence statistique, les groupes sont classiquement constitués de 10 à 20 individus selon le paramètre utilisé. Une analyse sera réalisée afin de comparer tous les groupes entre eux.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement pendant toute la durée des expérimentations. Le bien-être de l’animal sera évalué quotidiennement par le suivi de son comportement et de son aspect physique (aspect du poil, prise alimentaire, présence de fèces dans la cage, perte de mobilité…). De plus, des dispositifs d'enrichissement seront mis en place dans les cages pour créer un environnement stimulant pour les animaux. Si au cours de l’expérience un animal montre des signes caractéristiques de souffrance, il sera retiré de l’expérimentation et euthanasié si son état est jugé irréversible.

Choix des espèces

Le rat est un modèle clé en recherche préclinique, en particulier dans la recherche pharmacologique et toxicologique, en raison de sa similitude avec l'être humain dans l'élimination des toxicités. Le protocole d’irradiation proposé a été mis au point au laboratoire chez le rat. La taille du rat permet aisément la réalisation d’irradiations fractionnées. En outre, nous utiliserons des animaux de 275 g à 300 g pour les différentes études citées ci-dessus (rats à l’âge adulte). Pour la mise en culture des CSM (hors du champ d’application), nous utiliserons des rats GFP mâles ou femelles d6 semaines provenant de notre élevage interne. La multi-potentialité des CSM et leur capacité réparatrice est réduite avec l’âge, nous isolerons donc les CSM à partir de rats juvéniles.

1 984 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Après deux à trois injections de candidats vaccins ARN, la moitié est infectée par aérosol avec le bacille de la tuberculose puis mise à mort quatre semaines plus tard, les souris qui perdent du poids pouvant l'être plus tôt. Le porteur indique tester une vingtaine de candidats au service de l'objectif de l'OMS "En finir avec la tuberculose d'ici à 2030". Il affirme qu'une réponse immunitaire protectrice ne peut être validée que sur un "organisme entier" et retient la souris comme "meilleur compromis éthique".

Objectifs

La tuberculose reste un problème majeur en santé publique touchant des millions d’individus. L’infection par Mycobacterium tuberculosis, agent de la tuberculose, est généralement traitée par antibiotiques. Cependant, ces bactéries présentent actuellement des niveaux alarmants de résistances à ces antibiotiques, constituant une menace majeure pour la santé et la sécurité sanitaire. Il y a donc urgence à développer des traitements alternatifs. Si les vaccins sont reconnus comme des outils très efficaces pour atténuer la résistance aux antibiotiques, la mise au point d'un vaccin efficace contre les bactéries intracellulaires telles que Mycobacterium tuberculosis, reste à développer. En effet, le seul vaccin actuellement approuvé contre la tuberculose est une souche de Mycobacterium bovis atténuée (BCG). S'il est efficace chez les jeunes enfants, son efficacité chez les adultes, reste insuffisante pour induire une protection efficace. Le développement d’un vaccin antituberculeux efficace produisant une immunité protectrice à tous les âges est donc une priorité absolue pour endiguer la propagation de la tuberculose résistante aux antibiotiques afin d’atteindre l'objectif défini par l'Organisation Mondiale de la Santé "En finir avec la tuberculose d'ici à 2030". L’objectif de ce projet est de développer de nouveau vaccins antituberculeux efficaces en utilisant des approches innovantes. Le but du projet est de produire des vaccins mRNA permettant l’expression des antigènes de Mycobacterium tuberculosis définis et de tester l’efficacité de ces vaccins dans des modèles animaux. Les bénéfices du projet seront la production de vaccins antituberculeux protecteurs efficaces contre des souches de Mycobacterium tuberculosis résistantes aux antibiotiques. Une fois défini, ces vaccins seront testés dans des essais cliniques chez l’homme pour être développés pour la population humaine. Il est prévu dans le projet de tester une vingtaine de candidats vaccins dans des expériences de protection chez la souris.

Bénéfices attendus

Dans son ensemble, le projet devrait aboutir à la production de vaccins antituberculeux protecteurs efficaces contre l’infection par Mycobacterium tuberculosis, et pourrait ainsi palier le problème du développement de souche bactériennes résistantes aux antibiotiques, qui est un des problèmes majeurs de santé publique défini par l’Organisation Mondiale de la Santé. Ce projet devrait permettre de définir un protocole vaccinal chez la souris qui nous aidera à déterminer une stratégie vaccinale efficace contre la tuberculose chez l’homme. En effet, dans le cadre d’un projet européen plus large, les formulations vaccinales et le protocole de vaccination, une fois établis chez la souris, seront alors évalués chez le primate non humain et lors d’essais cliniques chez l’homme avec l’objectif de développer un vaccin antituberculeux pour la population humaine. Par ailleurs, en cas de succès, la stratégie de caractérisation et d’élaboration de nouveaux vaccins basé sur l’identification d’antigène et d’expression par ARNm pourra alors être utilisée pour la mise en place de nouveaux vaccins contre d’autres infections intracellulaires pathogènes.

Procédures

Pour tous les animaux, 2 à 3 injections de vaccins à l’aide de seringues sur animaux vigiles prenant une dizaine de secondes par animal. Les injections sont espacées de 21 jours. 1 prélèvement sanguin un jour après la dernière injection prenant quelques secondes par animal. Pour la moitié des animaux, une infection par des bacilles tuberculeux par voie aérosol est réalisée ; la durée de l’exposition est d’une vingtaine de minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront 2 à 3 doses de vaccin par voie intramusculaire. Il est maintenant reconnu que les vaccins à base d’ARNm n’entrainent que des effets indésirables légers et plus particulièrement une douleur de courte durée sur le site d’injection lors de la vaccination. D’autre part il est important de noter que les formulations vaccinales seront préalablement testées pour leur biodélivrance et leur toxicité par le laboratoire les produisant. Ainsi, concernant les animaux impliqués dans cette demande, ils ne recevront que des formulations n’induisant que des effets secondaires légers généralement observés lors d’une vaccination. La vaccination des souris n’induit que des douleurs légères. Cependant 4 semaines après la dernière injection, les souris seront infectées par des bacilles tuberculeux. Les souris sont mises à mort 4 semaine après l’infection. Cette période est choisie car cela permet aux bactéries de se multiplier dans les organes sans développer de signe pathologique de la tuberculose. Les dommages et effets indésirables pour les animaux sont donc considérés comme modérés dû à la présence de foyer de multiplication des bactéries dans la rate et les poumons mais sans symptôme pathologique.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort car le projet nécessite de faire des analyses sur des organes vitaux. Ces organes ne pourront être prélevés qu’après mise à mort de l’animal.

Remplacement

Il s’agit ici de tester différentes formulations de vaccins de type ARNm. Toutes les questions pouvant être apportées par l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules isolées à partir de sang telle que l’expression des ARNm ou l’activation des cellules du système immunitaire seront réalisées in vitro. Cependant, l’induction d’une réponse immunitaire est un phénomène complexe faisant intervenir de nombreux types cellulaires dans différents organes et ne peut être étudiée que dans sa globalité. En effet, il existe de nombreux éléments inducteurs et régulateurs impliquées dans ces réponses et certains ne sont pas encore connus. L’évaluation de l’efficacité des vaccins sur l’induction d’une réponse immunitaire protectrice devra donc être analysée et validée sur un organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux que nous estimons nécessaire repose sur la forte expérience de nos collaborateurs sur la conception d’études de ce type et validée par des biostatisticiens. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux strictement nécessaire pour atteindre l’objectif fixé. Les expériences passées ont montré que le nombre d’animaux par groupe utilisé ici (5) est le minimum requis pour obtenir des résultats pertinents et statistiquement significatifs. Un nombre inférieur d’animaux pourrait conduire à une expérience non interprétable du fait d’un manque de puissance des données générées. La répétition de l’expérience pourrait être nécessaire pour la robustesse des données établies. Par ailleurs, nous utiliserons des techniques expérimentales nous permettant d’analyser sur un seul individu de multiples facteurs caractérisant la réponse immunitaire pour obtenir le maximum d’information pour chaque animal utilisé.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un environnement protégé et hébergées en groupe, avec une litière appropriée, des matériaux de nidification, et une nourriture adaptée. La durée et les doses sont calculées pour ne pas induire d’effet indésirable, tout en atteignant les objectifs scientifiques. Néanmoins, des observations régulières des animaux seront effectuées tout au long des expériences. Pour les souris qui seront infectées par Mycobacterium tuberculosis, nous serons sensibles à l’apparition du moindre signe clinique telles la parésie et la piloérection qui sont précurseurs, sur la base d’expériences passées, d’une perte de poids. Dès apparition de ces signes cliniques, un suivi strict du poids d’abord 2 fois par semaine puis à fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids sera effectué (de 2 fois par semaine à tous les jours jusqu’à 2 fois par jour, l’animal sera mis à mort en fin de journée s’il est estimé que le point limite sera atteint avant la pesée du lendemain matin). La perte de poids ou l’apparition de symptômes importants suggérant une souffrance de l’animal caractérisée par un score défini par une table de score clinique seront considérés comme point limite; les animaux concernés seront mis à mort. Pendant la durée de l’expérience, les animaux restent dans leur environnement habituel.

Choix des espèces

La souris présente le meilleur compromis éthique entre modèle mammifère, résultats le plus proches de l’humain. Les métabolismes sont bien caractérisés et largement comparables à ceux de l’homme. Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel comme modèle pour l’infection par Mycobacerium tuberculosis permettant d’analyser les réponses immunitaires dirigées contre le bacille, mais aussi qui permet d’analyser et d’évaluer le contrôle de la prolifération bactérienne dans les organes cibles, et donc l’effet protecteur. En conséquence, les connaissances acquises seront vraisemblablement transférables à l’homme. D’autre part, de nombreux outils très performants sont disponibles pour l’analyse de réponses immunitaires chez la souris nous permettant d’avoir des réponses claires et précises en utilisant de faibles quantités d’échantillons et permettant ainsi d’analyser différents facteurs. De plus de nombreuses données sont déjà disponibles (par notre expérience et dans la littérature) nous permettant de valider les résultats par comparaison. Le système immunitaire étant parfaitement développé chez les individus matures, nos travaux sont effectués sur des animaux adultes. Les souris de 6 semaines seront livrées. Les manipulations sont toujours planifiées après avoir laissé une semaine d’adaptation aux animaux.

1 037 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent un baguage à l'oreille et l'ablation d'un bout de queue, des injections rétro-orbitaires quotidiennes sous anesthésie, jusqu'à huit prélèvements urinaires en cage métabolique avec six heures d'isolement à chaque fois, et un prélèvement sanguin terminal, le protocole induisant une insuffisance rénale. Le porteur indique viser une meilleure compréhension des mécanismes de la fibrose du rein, les retombées pour les patients humains restant renvoyées au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, il affirme que les approches in vitro ne reproduisent pas la complexité de l'organe et retient la souris pour ses outils génétiques, son temps de génération court et ses portées nombreuses.

Objectifs

Les maladies rénales chroniques sont un enjeu majeur de santé publique. Les traitements actuels sont basés sur une immunosuppression agressive par les corticoïdes et des agents anti-cancéreux ciblant le système immunitaire, aux effets indésirables importants. Les reins ont une certaine capacité de régénération mais suite à un stress continu et grave, le rein cicatrise mal conduisant à ce qu'on appelle la fibrose tubulo-interstitielle. La fibrose et l’inflammation chronique entrainent une altération structurelle et fonctionnelle du rein jusqu’à induire une insuffisance rénale chronique. Une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques est donc impérative en vue de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à prémunir les reins de cette fibrose délétère. Nos données préliminaires dans des modèles cellulaires ont identifié des mécanismes potentiels de protection ou au contraire favorisant la fibrose rénale. L’objectif principal de ce projet est donc de valider nos résultats en étudiant ces mécanismes chez la souris dans un contexte plus représentatif de l'organe dans son entier.

Bénéfices attendus

A terme ces travaux permettront une meilleure compréhension des mécanismes conduisant au développement de la fibrose rénale afin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de l’insuffisance rénale chez l'homme.

Procédures

Une identification (baguage à l'oreille + prélèvement d'un morceau de queue

Impact sur les animaux

Identification: baguage + prélèvement d'un morceau de queue (

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes et analyser les reins.

Remplacement

Nous utilisons différentes approches in vitro pour analyser les mécanismes de l'atteinte rénale. Les cibles identifiées sont d'abord testés sur des cellules en culture. En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours des maladies rénales comme les interactions avec le système immunitaire ou les interactions entre organes. C'est pourquoi nous avons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.

Réduction

le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Nous optimisons l'utilisation des organes pour les différentes analyses afin de réduire le nombre d'animaux utilisés

Raffinement

les animaux seront élevés en cages enrichies avec eau et nourriture ad libitum et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal- être. Une grille de score de souffrance et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. Les cages sont enrichies en coton et bâton de bois. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale de mammifère en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas suffisantes en ce qui concerne l'étude des lésions rénales au cours de l'hypertension artérielle car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les pathologies étudiées touchent essentiellement les adultes donc nous réaliserons les modèles expérimentaux chez des souris adultes.

2400 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une aiguille prélève une partie du liquide de l'œil sous anesthésie pour provoquer une inflammation de la chambre antérieure, avec une possible hémorragie, puis des traitements sont instillés jusqu'à huit fois par jour, parfois par la pose chirurgicale d'un implant. L'objectif est de tester de nouveaux traitements contre l'inflammation oculaire. Le porteur retient le lapin pour la taille de son œil, proche de celle de l'humain, et affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'œil "dans sa globalité fonctionnelle".

Objectifs

L'inflammation de la partie antérieure de l'œil peut survenir à la suite d'un traumatisme, une chirurgie intra oculaire, une maladie auto immune, une maladie inflammatoire (spondylarthrite ankylosante, maladie de Behçet, maladies rhumatismales), une infection virale (herpès, zona), ou bactérienne (lèpre, tuberculose, syphilis).... Elle entraîne la rupture de la barrière hémato aqueuse, qui permet de contrôler le débit et la composition de l'humeur aqueuse, le liquide contenu entre la cornée et l'iris qui a une fonction d'épuration et d'apport de nutriment pour l'endothélium cornéen, l'iris et le cristallin. La barrière est constituée par les cellules épithéliales des capillaires de l'iris et du corps ciliaire, structure riche en vaisseaux et en muscles située juste derrière l'iris et dont une partie sécrète l'humeur aqueuse. Lorsque la barrière est rompue, l'humeur aqueuse se charge en protéines plasmatiques et ne peut plus assurer correctement ses fonctions, le mécanisme impliquerait la libération de prostaglandines. Notre but est d’utiliser un modèle expérimental d'inflammation de la chambre antérieure avec rupture de la barrière hémato-aqueuse chez le lapin afin de tester l'action de substances thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements luttant contre l'inflammation oculaire.

Procédures

L'induction du modèle expérimental se fera par paracentèse c'est à dire prélèvement d'une partie de l'humeur aqueuse à l'aide d'une fine aiguille et d'une seringue sur animal anesthésié. Les animaux seront ensuite observés par des méthodes non invasives dans les heures qui suivent, en utilisant une lampe à fente, ou un appareil mesurant la turbidité dans la chambre antérieure. Ces examens sont réalisés en routine chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste et sans hospitalisation ou en clinique vétérinaire. Ils ne durent que quelques minutes et pourront être réalisés plusieurs fois par jour. Les administrations de traitements pourront se faire plusieurs fois par jour et sur la durée de l’étude quand elles sont sous forme de gouttes ou d’injections. La fréquence de ces administrations dans la majorité des cas n’excèderont pas 6 à 8 administrations par jour pour le cas des gouttes ophtalmiques. Dans ce cas, l’animal est maintenu immobile moins d’une minute. Si le traitement à administrer est sous forme d'implant, la pose de celui-ci peut nécessiter une anesthésie et éventuellement des points de sutures au niveau des conjonctives ou de la cornée ou bien par l’utilisation d’une bio-colle. Cet acte chirurgical dure cinq minutes tout au plus et sera réalisé généralement une seule fois, puisque l’implant a vocation à délivrer son contenu sur une longue période.

Impact sur les animaux

Le modèle expérimental entraîne une inflammation au niveau de l'œil et une possible hémorragie de la chambre antérieure, réversibles au bout de 24 heures. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une gêne transitoire. Si le traitement consiste en une injection péri-ou intra-oculaire, une anesthésie locale sera pratiquée préalablement, accompagnée d'une anesthésie générale si l'immobilisme complet de l'animal est requis. Les traitements impliquant une chirurgie pour insérer un implant au niveau de l'œil pourraient entrainer des inflammations, des rougeurs voire des démangeaisons au niveau du site d'implantation ces signes disparaissent naturellement ou à l’aide d'antibiotiques sous quelques jours. Les procédures décrites sont réalisées par un personnel formé et dans des conditions réduisant au maximum les risques de nuisances ou d’effets indésirables. Malgré le soin et la vigilance apportés à la manipulation des animaux, un stress est toujours possible au moment de leur manipulation lors des observations, de l’administration de l’anesthésie ou des traitements.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo sur les tissus impactés (évaluations histologiques, dosages de biomarqueurs et de produits...).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de méthode alternative

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques pour des comparaisons multiples; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin non traité. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les lapins seront placés préférentiellement par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

L'espèce animale choisie a une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. Le lapin est choisi pour la taille de son œil, proche de celle de l'homme. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. Les animaux seront de jeunes adultes, minimum 8 à 12 semaines, cet âge correspond à la maturité fonctionnelle et visuelle chez les lapins.

1316 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une microchirurgie cérébrale ou des injections induisent la destruction de la myéline, avec une faiblesse des pattes quand la moelle épinière est visée, avant l'analyse des cerveaux post-mortem. L'objectif est d'identifier des molécules capables de régénérer la myéline dans la sclérose en plaques. Le porteur annonce une avancée "majeure" au conditionnel et affirme qu'aucune culture ne reflète ce processus dans un "organisme entier".

Objectifs

La sclérose en plaques est une maladie chronique inflammatoire affectant le système nerveux central. Ses causes restent encore mal connues et ses manifestations cliniques sont la conséquence d'une destruction de la myéline (une enveloppe qui protège le prolongement émis par les neurones que l'on appelle l'axone) dans le cerveau et la moelle épinière. La maladie débute dans la grande majorité des cas chez l'adulte jeune, typiquement entre 20 et 40 ans, et se traduit par des troubles divers touchant par exemple la motricité ou la vision. Aucun traitement n'est actuellement disponible pour réparer la myéline détruite et donc éviter la progression de la maladie vers des troubles persistants. L'absence de réparation de la myéline implique vraisemblablement un défaut de communication entre les différentes populations de cellules présentes dans le tissu nerveux, à savoir les neurones, les cellules qui synthétisent la myéline et les cellules qui participent au processus inflammatoire. Afin de développer un traitement induisant la régénération de la myéline, nous allons analyser plusieurs protéines qui permettent de transmettre des signaux entre ces différentes populations de cellules. L'objectif final est d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourraient être considérées dans le futur pour le développement de nouveaux médicaments.

Bénéfices attendus

Le projet devrait permettre d'identifier une ou plusieurs petites molécules remyélinisantes, ce qui constituerait une avancée majeure dans le domaine des maladies démyélinisantes du système nerveux central et pourrait prévenir l'apparition de handicaps irréversibles et sévères notamment chez les patients atteints de sclérose en plaques. Le passage de la forme rémittente de cette maladie à sa forme progressive constitue en effet une évolution dramatique pour les patients. De plus, la démyélinisation du système nerveux central est aussi présente dans d'autres maladies neurodégénératives comme par exemple la maladie d'Alzheimer. Par conséquent, les petites molécules identifiées dans ce projet pourraient aussi être bénéfiques dans cette dernière pathologie pour laquelle une approche thérapeutique efficace manque cruellement.

Procédures

1 injection intra-péritonéale sera effectuée quotidiennement pendant 5 jours avant de réaliser soit une microchirurgie cérébrale d'une durée de 30 minutes sous anesthésie générale pour injecter la molécule induisant une démyélinisation dans le cerveau, soit 2 injections sous-cutanées et 2 injections intra-péritonéales sous anesthésie générale pour induire une démyélinisation de la moelle épinière. Les traitements par les petites molécules à l'étude nécessitent 1 administration orale ou intra-nasale quotidienne pendant 10 à 21 j ou bien une administration sous-cutanée tous les 2 jours pendant 14 jours. Un tatouage et une biopsie de la queue à l'âge de 9-10 jours sont effectués sur les animaux vigils.

Impact sur les animaux

Les injections intra-péritonéales et sous-cutanées peuvent conduire à une douleur ou un petit hématome. La microchirurgie peut mener à une douleur transitoire et une gène au niveau de la suture de la peau qui termine l'acte chirurgical. Les administrations orales et intra-nasales peuvent conduire à une gène transitoire au moment de la réalisation du geste. Les animaux chez lesquels on induit une démyélinisation de la moelle épinière présentent une faiblesse au niveau des pattes.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des procédures, puisque le projet est exclusivement destiné à analyser les cerveaux post-mortem.

Remplacement

Aucune culture cellulaire ou tissulaire ne peut refléter le processus de régénération de la myéline existant dans un organisme entier étant donné la complexité de ce processus qui fait intervenir 4 types de cellules neurales et un nombre considérable de populations de cellules immunitaires infiltrant le tissu nerveux.

Réduction

Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux utilisés en nous limitant au nombre strictement nécessaire pour déterminer l'existence de véritables différences entre les groupes d'animaux qui sont comparés. Notre expertise dans le domaine indique qu'en dessous de 8 animauxpar groupe pour les modèles mimant une destruction de la myéline cérébrale ou 10 animaux par groupe pour les modèles mimant la destruction de la myéline dans la moelle épinière, on ne peut pas apporter une conclusion définitive aux questions que nous nous posons. Des tests statistiques ont été utilisés pour valider le nombre d'animaux à utiliser et seront utilisés pour exploiter les résultats obtenus.

Raffinement

Les molécules à l'étude peuvent être administrées par diverses voies, mais nous choisissons les voies les moins invasives (orale et intra-nasale) ne nécessitant pas d'injection. La microchirurgie et les injections nécessaires pour induire la destruction de la myéline sont réalisées sous anesthésie générale par du personnel qui possède une grande habileté pour effectuer ces gestes. La période de réveil des animaux anesthésiés se passe sur un tapis chauffant. Les animaux sont observés tous les jours tout au long de l'expérimentation.

Choix des espèces

Tous les modèles de démyélinisation ont été mis au point chez la souris. Des animaux adultes âgés de 7 à 12 semaines sont utilisés afin de se placer dans des conditions d'animaux jeunes, puisque la sclérose en plaques comme la maladie de Charcot atteignent l'adulte jeune.