Procédures légères

48 veaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous gardés vivants dans leur élevage à l'issue. Atteints d'une infection du nombril ou inclus comme témoins, ils reçoivent l'antibiotique amoxicilline-acide clavulanique et subissent des prélèvements de sang, dont neuf en un jour via un cathéter jugulaire posé 24 heures, et de matières fécales, pour comparer l'effet des voies d'administration sur le microbiote et la résistance aux antibiotiques. Le porteur décrit des prélèvements courants en élevage et une douleur "modérée et de courte durée" à la pose du cathéter. Il présente ces données comme "indispensables" au vétérinaire prescripteur et écarte tout modèle in vitro pour une étude de terrain.

Objectifs

L’émergence de mécanismes d’antibiorésistance constitue un véritable problème de santé publique et un défi majeur pour la santé animale et la santé humaine. Limiter l’émergence de mécanismes de résistance aux antibiotiques (AB) nécessite de les utiliser notamment avec des posologies adaptées. Or, les données pharmacocinétiques des AB chez l’animal et notamment chez l’animal malade sont souvent limitées, alors que le contexte infectieux peut affecter les concentrations plasmatiques en AB et donc leur efficacité. Cette question est d’autant plus importante que ces animaux sont destinés ensuite à être consommés. Il est possible que la voie d’administration orale ou parentérale n’ait pas les mêmes effets sur le microbiote et sur l’apparition de mécanismes de résistances. Certains AB administrés par voie injectable pourraient être à l’origine de dysbioses et faciliter la sélection de bactéries résistantes. Il est possible que des traces d’AB puissent en effet atteindre le tube digestif, créant des conditions favorables au développement des mécanismes de résistance. Les données sur les concentrations intestinales en AB et l'exposition consécutive du microbiote, en conditions réelles de traitement ne sont pas disponibles. Cette étude pourrait apporter des données clefs afin de mieux traiter les animaux et protéger le consommateur et surtout apporter des éléments permettant de mieux utiliser les AB afin de limiter la résistance tout en garantissant leur efficacité. Parmis les antibiotiques utilisés en médecine vétérinaire l’association amoxicilline/acide clavulanique (AMC) est un des antibiotiques les plus couramment utilisé. Sa consommation a augmenté en santé humaine et animale ces dernières années. Son importance est telle que sa disparition de l’arsenal thérapeutique à cause des résistances qui pourraient apparaître suite à son usage, mettrait en péril le traitement des affections bactériennes en santé animales et humaine. Les objectifs de ce projet sont : - De comparer l’exposition du microbiote à l’association amoxicilline/acide clavulanique (AMC) en fonction de la voie d’administration chez des veaux d’élevage atteints d’omphalophlébite (afin de raffiner la posologie d’administration des anti-infectieux chez les ruminants). - D’évaluer les conséquences chez des animaux sains (ou atteints d’omphalophlébite) de l’administration d’AMC sur la composition du microbiote intestinal et sur l’émergence de gènes de résistances bactériens au niveau de ce microbiote.

Bénéfices attendus

A terme l’étude permettra d’apporter de nouvelles informations concernant les impacts d’un traitement antibiotique sur la composition du microbiote et l’émergence de gènes de résistance chez les bactéries de ce microbiote. En particulier, il permettra d’éclairer le prescripteur sur les risques encourus de l’usage des antibiotiques, quelle que soit la voie d’administration. Aujourd’hui, il est recommandé de recourir à la voie injectable, partant du postulat que l’exposition du microbiote à l’AB est minime voire nulle. Or, ce postulat tend à être remis en question. Notre étude permettra d’apporter des éléments supplémentaires important pour le prescripteur. A ce jour, les études d’impact sur le microbiote se multiplient mais peu concernent les animaux d’élevage, et encore moins des animaux malades traités dans les conditions normales d’emploi d’un AB largement utilisé qu’est l’AMC. Ainsi, notre étude sera le reflet le plus proche de la réalité et les résultats obtenus représentatifs de l’usage réel des AB. Ces résultats seront donc plus impactants pour le vétérinaire. Enfin, par l’analyse des concentrations plasmatiques chez l’animal malade, les résultats permettront ou non de conforter les posologies fixées dans l’autorisation de mise sur le marché de l’AB, posologies fixées il y a plusieurs années sans prendre en considération les méthodes actuelles permettant de les calculer (modèle PK/PD). Ce modèle d’étude est d’autant plus intéressant qu’il utilise des cas spontanés d’infections bactériennes. Il s’agit donc d’une réelle opportunité de proposer un bon usage de l’AMC, antibiotique majeur de l’arsenal thérapeutique en médecine animale. Le bénéfice de l’étude est un bénéfice pour l’élevage en tant que tel qui pourra par la suite permettre d’adapter l’usage de l’antibiotique de façon personnalisée selon la CMI de la bactérie qui circule dans l’élevage. Le second bénéfice est un bénéfice pour la santé publique car les résultats permettront d’émettre des recommandations en matière d’usage des antibiotiques et d’impact sur la sélection de bactéries résistantes. Ces données sont indispensables pour le vétérinaire prescripteur dans l’application de l’arrêté du 22 juillet 2015 relatif aux bonnes pratiques d’empli des médicaments contenant une ou plusieurs substances antibiotiques en médecine vétérinaire.

Procédures

Les animaux sont soumis à des prélèvements alors qu'ils sont vigiles. Il s'agit de prélèvement de sang et de matières fécales. Ces prélèvements sont des prélèvements communément réalisés par l'éleveur et/ou un vétérinaire dans le cadre de diagnostic clinique. Ils ne sont donc que très peu source de stress pour les animaux. Pour cette étude, 3 à 4 prélèvements de matières fécales sont prévus ; et 9 prélèvements sanguins de 3 ml sont prévus par jour soit seulement 27 ml, soit moins d'1% du volume sanguin de l'animal.

Impact sur les animaux

Le protocole ne comporte pas de risques pour la santé de l’animal qui bénéficie du traitement de première intention. Les animaux non traités ne subiront que des prélèvements de matières fécales. La contrainte principale relève de la répétition des prélèvements sanguins le premier jour du traitement pour les individus malades sous traitement. Le recours à un cathéter permettra de limiter l’inconfort de l’animal et le volume total de sang prélevé reste inférieur au volume possible à prélever (30 ml au total soit moins d’1% du volume sanguin d’un veau âgé de moins d’un mois).

Devenir

Les animaux proviennent d'élevages. La procédure sera réalisée au sein même de l'élevage. Tous les animaux restent vivants à la fin de la procédure et ils resteront dans leur élevage.

Remplacement

Ce projet est une étude terrain et il n’existe pas d’alternative in vitro pour répondre à notre problématique. Par ailleurs, il n’est pas envisageable de recourir à un modèle d’infection expérimentale qui nécessiterait l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques car l’objectif est bien de coupler les données pharmacocinétiques à l’exposition du microbiote dans un contexte d’élevage.

Réduction

Le nombre d’individus est le strict minimum pour réaliser une étude statistique. Le résultat de nos études statistiques d’une étude précédente démontrent que 3 élevages avec 16 animaux par élevage est le minimum pour pouvoir interpréter les résultats, en particulier ceux concernant les modifications du microbiote.

Raffinement

Il est indispensable que ce projet soit mené au sein de différents élevages avec plusieurs animaux dans chaque élevage pour des questions de représentativité du microbiote au sein de l’élevage. Le prélèvement de fèces par le rectum peut induire un stress pour le veau. Cependant, cette technique est la seule qui préserve la contamination environnementale de l’échantillon, condition fondamentale pour l’analyse bactériologique. D’autre part, la pose d’un cathéter à la jugulaire est un acte courant lors de la prise en charge médicale des veaux notamment lors de gastro-entérite néonatale. Bien que non réalisé en routine pour la prise en charge des omphalites, cet acte induit une douleur et un stress modéré et de courte durée pendant la pose du cathéter. Par ailleurs, il sera moins contraignant que de réaliser des prises de sang à intervalle rapproché. Une fois le cathéter mis en place, les prélèvements sanguins sont facilités et beaucoup moins douloureux pour le veau qu’en l’absence de cathéter. Les cathéters ne seront mis en place que pour une durée de 24 h, ce qui limite très fortement les risques de phlébite. Néanmoins, en cas de détection d’une zone indurée ou douloureuse au niveau du site de pose du cathéter, le veau sera exclu de l’étude et pris en charge par le vétérinaire praticien de l’élevage. Les signes physiologiques suivants chez les veaux traités pour omphalite permettront de retirer l’animal de l’essai: - Persistance d’une hyperthermie (température supérieure à 40° entre 24 à 48h après la mise en place du traitement ATB + AINS) - Arrêt de prise alimentaire ou non reprise de l’alimentation dans les 24 à 48h après la mise en place du traitement - Émission de selle avec méléna (selles de couleurs noires) Les signes physiologiques suivants chez les veaux contrôles permettront de retirer l’animal de l’essai: - Émission de selle avec méléna (selles de couleurs noires) - Arrêt de prise alimentaire En cas de retrait de l’animal, alors le vétérinaire pourra modifier le traitement du veau malade et/ou du veau non malade.

Choix des espèces

Il s’agit d’une étude terrain. La population cible est composée de veaux d’élevages âgés de maximum 20 jours, atteints d’infections non digestives pouvant être traitées à l’amoxicilline-acide clavulanique. Les omphalites sont un bon modèle infectieux car un motif d’utilisation de l’amoxicilline dans un contexte infectieux distinct de toute atteinte du tube digestif. De plus, les omphalites concernent les jeunes animaux, encore pré ruminant. La population cible est composée de veaux d’élevages âgés de maximum 20 jours, atteints d’infections non digestives pouvant être traitées à l’amoxicilline-acide clavulanique. A cet âge là les animaux n'ont pas encore de rumen et

480 animaux non-humains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 150 tués à l'issue, 310 réutilisés et 20 chiens proposés à l'adoption. Souris, rats, cobayes, hamsters, lapins et chiens subissent des prélèvements sanguins et des administrations répétées par de multiples voies, non pour produire des connaissances mais pour entraîner le personnel aux gestes techniques des études précliniques de médicaments. Le porteur reconnaît que ces gestes peuvent provoquer douleur, stress, perte de poids et mobilité réduite. Il présente la réutilisation comme un moyen de réduire le nombre d'animaux et indique qu'un apprentissage sur mannequins précède le passage à l'animal vivant.

Objectifs

L’acquisition de compétences techniques par le personnel appelé à utiliser des animaux dans un cadre expérimental est nécessaire pour la bonne réalisation des études de sécurité et d’efficacité pré-clinique de médicaments ainsi qu’au maintien du bien-être animal, notamment l’administration de médicaments sous surveillance vétérinaire. Cette acquisition ne peut se faire que par le suivi d’un programme de formation réalisé dans le cadre d’une qualification initiale du personnel aux actes techniques les plus courants qu’il sera amené à appliquer dans les projets de recherche autorisés par le ministère. Ce projet s’inscrit directement dans le cadre de ce programme de formation et s’adresse au personnel ayant la certification en expérimentation animale (ou en cours d’obtention). Il en constituera la dernière étape. Il sera précédé par l’utilisation de susbtituts aux animaux vivants (manequins, tissus articificiels, etc) lorsqu’ils seront disponibles, et débutera par une période d’observation des gestes effectués par un utilisateur expérimenté, afin qu’aucun geste ne soit pratiqué pour la 1ère fois sur un animal vivant. Le passage à l’utilisation d’animaux vivants ne se fera que lorsque les collaborateurs en formation auront démontré une aptitude suffisante lors du travail sur des systèmes de simulation lorsque ceux-ci sont disponibles. Un encadrement des collaborateurs en formation par des tuteurs expérimentés, le service vétérinaire, le service formation, et la structure en charge du bien-être animal (SBEA) permettra d’évaluer en permanence l’évolution des aptitudes de ces collaborateurs ainsi que le maintien en bonne santé des animaux utilisés dans le cadre de la formation.

Bénéfices attendus

Ce projet conclura la formation du personnel concepteur et/ou réalisateur de procédures expérimentales afin de garantir une maitrise parfaite des principaux gestes techniques (prélèvements sanguins et administration par voie orale, veineuse, sous-cutanée, intranasale, intrarectale ou encore intrapéritonéale) nécessaires à la conduite des projets d’études pré-cliniques. Ce projet permettra ainsi au personnel formé de débuter une étude dans le cadre d’une procédure autorisée en garantissant une maîtrise parfaite des gestes techniques réalisés. La qualité des données expérimentales ainsi obtenues sera ainsi optimale, tout en réduisant l’impact négatif sur le bien-être des animaux en conséquence de gestes non maitrisés et mal réalisés. De plus, ce projet permettra, pour des utilisateurs expérimentés, de maintenir leur niveau de compétence technique dans la cadre de gestes effectués à intervalle de temps long.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang vigile et anesthésie dont le nombre et la fréquence suivent les recommandations EFPIA (European Federation of Pharmaceutical Industries Associations), ECVAM (European Center for the Validation of Alternative Methods), et de l’International Consortium for Innovation and Quality in Pharmaceutical Development.

Impact sur les animaux

La formation à certains gestes techniques, bien que faiblement invasifs, peut constituer un risque pour la santé des animaux utilisés. En fonction du type de geste, des douleurs dans la zone où le geste est pratiqué,une augmentation du stress, une perte de poids, ou encore une réduction de la mobitilité pourront être observés. Cependant, il n’est pas attendu que ces effets persistent dans le temps, ni qu’ils soient systématiques en raison du strict encadrement par des tuteurs expérimentés. Avant chaque réalisation du geste technique, le collaborateur en formation et le tuteur s’assureront du bon état de santé de l’animal. De plus, les animaux identifiés pour la formation feront l'objet d'une surveillance accrue par les vétérinaires du centre.

Devenir

La procédure de ce projet est une procédure légère au cours de laquelle il n’est pas attendu d’effets indésirables particuliers chez les animaux. Ainsi, si un vétérinaire rend un avis favorable, la plupart des animaux de ce projet pourront être réutilisés dans un autre projet autorisé, y compris le projet présent. Le vétérinaire prendra en compte l’effet cumulatif pour chaque animal (ou lot d’animaux pour les rongeurs) dans sa décision. Pour les animaux naïfs avant de commencer ce projet, il sera possible de les réutiliser dans des procédures légères ou modérées. Pour les animaux non naïfs au début de ce projet (c’est-à-dire ayant déjà été inclus dans au moins une autre procédure expérimentale), il sera privilégié la réutilisation dans des procédures sans réveil, bien qu’une utilisation dans des procédures légères ou modérées soient aussi possible. Enfin, la mise à l’adoption d’une partie des chiens est envisagée, après avis vétérinaire et de la SBEA.

Remplacement

Avant d’être formé aux gestes techniques sur un animal vivant, le personnel en formation effectuera un apprentissage des ces gestes sur des systèmes de substitution (mannequins, tissus artificiels, etc). Ces systèmes de substitutions seront mis en place de manière progressive au cours de la durée de ce projet.

Réduction

L’utilisation de système de substitutions (mannequins, tissus artificiels, etc) d’une part, et l’évaluation des compétences par un personnel qualifié avant passage à l’animal d’autre part permet de réduire le nombre d’animaux. Ces systèmes de substitution seront mis en place progressivement au cours de ce projet afin d’identifier et tester les plus adaptés aux gestes techniques et aux espèces utilisées dans les études de sécurité et d’efficacité pré-clinique de candidat médicament. Ils seront mis à jour régulièrement selon l’avancée des connaissances techniques et scientifiques. De plus, dans la plupart des cas, les animaux utilisés dans le cadre de la formation sont des animaux ayant participé à des procédures expérimentales d’un niveau de gravité réelle légère ou modérée. Ceci permettra d’éviter le plus possible l’utilisation d’animaux naïfs uniquement dans un but démonstratif et éducatif. De même, des animaux ayant participés à la formation à des gestes techniques faiblement invasifs pourront être ensuite inclus dans d’autres projets, après consultation du servicevétérinaire et de la SBEA. Cette ré-utilisation permet de réduire jusqu’à 50% le nombre d’animaux utilisés uniquement pour la formation.

Raffinement

Les animaux utilisés en formation font l’objet d’une surveillance accrue de la part des animaliers, du service vétérinaire et de la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux, faisant a minima un point trimestriel sur le suivi des animaux en formation. Avant chaque pratique d’un geste technique. L’utilisation de grille de score comportemental et de bien-être permet de s’assurer du bon état de santé des animaux, et si besoin d’exclure de la formation ceux présentant des signes cliniques ou un comportement anormal et mettre en place un traitement adpaté si nécessaire. Chaque animal utilisé pour la formation à des gestes techniques possède une fiche individuelle sur laquelle est documentés, à chaque utilisation, le(s) type(s) de gestes techniques pratiqué(s) ( en précisant les volumes d’admistration et de prélèvement, les produits administrés, etc), ainsi que l’identification du collaborateur en formation et du tuteur présent lors de la session. Ces fiches individuelles sont consultables par le service vétériniare et la SBEA dans le cadre du suivi de l'utilisation des animaux en formation. Les volumes prélevés et adminitrés aux animaux de formation respectent les lignes directrices EFPIA (European Federation of Pharmaceutical Industries Associations), ECVAM (European Center for the Validation of Alternative Methods), et de l’International Consortium for Innovation and Quality in Pharmaceutical Development afin de réduire le stress des animaux. Lorsque cela est possible (c’est-à-dire après un avis vétérinaire et de la SBEA), la ré-utilisation d’animaux issus d’autres procédures expérimentales permet d’avoir, pour la formation, des animaux habitués à la contention et à la réalisation des gestes techniques faiblement invasifs. Cela participe à la diminution du stress de l’animal et du collaborateur en formation. Enfin, le passage à la réalisation d’un geste technique sur l’animal vivant pourra se faire d’abord sous anesthésie afin de réduire le stress de la contention tant pour l’animal que le collaborateur en formation, et ce même si le geste est praticable sur un animal vigile.

Choix des espèces

Les études de sécurité et d’efficacité pré-clinique sont des études réglementaires (ICH M3(R2) et ICH S3A) in vivo qui nécessitent l’utilisation d’au moins deux espèces différentes. Les rongeurs, les lapins et les chiens sont trois types d’espèces fréquemment utilisés, il est donc important que le personnel soit formé sur ce type d’espèces. De plus, l’apprentissage de gestes techniques sur ces espèces permet ensuite de transposer les compétences acquises à d’autres espèces comme les primates non humains qui sont essentiels dans la recherche biomédicale mais dont l’utilisation dans un cadre de formation uniquement n’est pas règlementaire. L’âge des animaux utilisés dans la formation sera proche de l’âge des animaux lors des études. Pour les Rongeurs et Lapins, à partir de 8 semaines, et pour les chiens à partir de 6 mois.

66 roussettes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces petits requins pêchés en mer sont soumis à des changements de salinité et de température pendant 24 heures avec quatre prélèvements sanguins, avant d'être tués pour disséquer leur moelle épinière et caractériser des cellules nerveuses, afin d'étudier l'adaptation des requins aux variations de leur milieu. Le porteur affirme que ces variations restent dans la gamme naturelle et n'attend de stress que lors des manipulations et des prises de sang. Il indique qu'aucune culture de ces cellules n'est possible faute de connaissances, et qu'il n'existe donc "pas d'alternative" in vitro.

Objectifs

Chez les poissons, comme chez les autres vertébrés, l’organisme adapte sa physiologie aux variations de son environnement grâce à la perception des fluctuations environnementales comme par exemple les variations de températures ou de lumière par son système nerveux central qui contrôle alors les sécrétions hormonales, notamment au niveau de l’hypophyse, qui régulent différentes fonctions biologiques. En plus du cerveau, il existe chez les poissons un système nerveux supplémentaire situé à l'extrémité caudale de la moelle épinière, appelé système neurosécréteur caudal. Ce système neurosécréteur caudal jouerait un rôle dans la coordination de différents processus physiologiques de l’organisme en réponse à des variations de salinité ou de température, comme montré récemment dans la littérature chez le flétan. Chez les requins, le système neurosécréteur caudal est constitué de neurones géants appelés cellule de Dahlgren. Bien qu’identifiées depuis longtemps, aucune étude récente n'a porté sur la caractérisation plus poussée de ces cellules. L'objectif du présent projet est d’analyser et de comparer les sécrétions hormonales des cellules de Dhalgren isolées à partir de roussettes adultes mâles qui auront été soumises à des changements de température et de salinités sur un temps court et dans le respect du principe des 3R.

Bénéfices attendus

L’analyse de la réponse hormonale des cellules de Dahlgren chez des animaux soumis à des variations de température et de salinité nous permettra d’établir ou non si ces cellules peuvent jouer un rôle essentiel dans l’adaptation des requins aux contraintes environnementales liées au changement climatique. A plus long terme, les bénéfices susceptibles de découler de cette étude chez une espèce de requin largement abondante sont de différents niveaux : (1) apporter des connaissances sur un modèle de requin qui seront bénéfiques à la compréhension des capacités d’adaptation d’autres espèces de requins dont les populations sont en danger ; (2) comparer les résultats obtenus sous un angle de l’évolution des espèces et d’identifier ainsi des processus fondamentaux conservés ; (3) disposer de marqueurs hormonaux en tant qu’outil pour caractériser les capacités d’adaptation d’une espèce donné en fonction de son environnement et ainsi adapter cet environnement pour un meilleur bien-être dans le cadre de programmes de préservation d’espèces aquatiques ou d’élevages. L’absence de variations hormonales des cellules de Dahlgren posera la question d’un autre rôle de ces cellules et c’est pourquoi nous prélèverons, en fin d’expérimentation, un maximum de tissus biologiques chez un même animal pour explorer différentes fonctions physiologiques.

Procédures

Des roussettes mâles adultes seront pêchées puis acclimatées dans des bacs de grande dimension alimentés avec de l'eau de mer naturelle à 15°C et sous un cycle de lumière artificielle 8L:16D correspondant aux conditions optimales décrites dans la littérature. Trois procédures dont les paramètres seront dans la gamme des conditions naturelles pour les requins, seront mises en place : (1) Test de salinité de 24h effectué sur 3 lots : 1 lot de 6 animaux transférés d’une eau de mer non diluée (100%) vers une eau de mer 100% (lot contrôle) ; 1 lot de 6 animaux transférés d’une eau de mer diluée (eau de mer à 80%) vers une eau de mer 100% ; 1 lot de 6 animaux transférés d’une eau de mer 100% vers une eau à 80%. (2) Test thermique de 24h effectué sur 3 lots : 1 lot de 6 animaux transférés de 15°C vers 15°C (contrôle) ; 1 lot de 6 animaux transférés de 15°C vers 10°C ; 1 lot de 6 animaux transférés de 15°C vers 20°C. (3) Test combinant les changements de température et de salinité et qui portera sur 5 lots, chacun de 6 animaux, sur une durée de 24h : eau de mer 100% vers 100% à 15°C; eau de mer 80% vers100% à 10°C; eau de mer de 80% vers 100% à 20°C; eau de mer 100% vers80% à 10°C; eau de mer de 100% vers 80% à 20°C. Pour l’ensemble des animaux, une série de 4 prélèvements sanguins à 0h, 6h, 12h et 24h après les transferts, de moins de 1mL et n’excédant pas, au total, 10% du volume sanguin de l’animal sera effectuée pour des analyses biochimiques. A la fin des expérimentations, les animaux seront mis à mort pour récupérer un grand nombre de tissus biologiques dont les moelles épinières pour la caractérisation des cellules de Dahlgren. Ces dernières seront analysées par des approches techniques hautement résolutives afin d’obtenir des résultats significatifs à partir d’un minimum de cellules, et donc d’animaux, collectées.

Impact sur les animaux

Les variations de température et/ou de salinité qui seront appliquées sont dans des gammes physiologiques et naturellement rencontrées par les requins, dont la roussette ; il n’y a donc pas de nuisance ou d’effet indésirable attendu sur la base de ces variations. Par contre, un stress et inconfort est attendu lors de la prise (manipulation) des animaux lors des transferts d’une condition à l’autre ainsi que lors des prélèvements sanguins. Ces derniers correspondent à un degré de sévérité de classe légère. Une acclimatation et une sédation sont envisagées.

Devenir

Mise à mort pour prélèvement des cellules de Dahlgren en vue de leur caractérisation moléculaire et le prélèvement de différents organes pour analyser l’impact des variations de température et/ou de salinité sur différentes fonctions biologiques. Du fait de leurs localisations dans la moelle épinière, les cellules de Dahlgren ne peuvent être prélevées qu’après dissection.

Remplacement

L’impact des variations environnementales sur la physiologie de ce requin sera abordé en ciblant les cellules de Dahlgren mais également en prélevant un nombre maximum de tissus biologiques chez un même animal afin d’avoir une analyse plus large et plus intégrée. L'accès à la veine caudale, dans laquelle les hormones des cellules de Dahlgren sont libérées, est facilement accessible et permettra une analyse des sécrétions dans le temps et évitera ainsi d’utiliser des animaux supplémentaires. L’utilisation de culture de cellules de Dahlgren n’est actuellement pas possible du fait, justement, de l’absence de connaissances sur ces cellules spécifiques et il n’y a donc pas d’alternative in vitro disponible. Cependant, les hormones identifiées au niveau des cellules de Dahlgren au cours de ce projet seront, par ailleurs, testées in vitro sur des lignées cellulaires pour étudier leur mode d’action.

Réduction

L’expérimentation in vivo est réduite à 6 animaux par condition expérimentale pour permettre une analyse statistique appropriée pour les faibles effectifs. Les variations testées de température et de salinité, la durée de l’expérimentation ainsi que les temps de prélèvement des échantillons sanguins ont été définis et réduits au minimum sur la base des données bibliographiques. Ces données ont notamment montré qu’une exposition de la petite roussette, ou d’une autre espèce de requin, dans un milieu de salinité différente provoquait une variation significative des paramètres plasmatiques à 6h et que la réponse de tissus biologiques impliqués dans l’osmorégulation était observée entre 12h et 24h après le changement de milieu. Les températures choisies correspondent à celle qui impacte (20°C) ou non (10°C) la spermatogenèse et à celle qui impacte (20°C) ou non (15°C) la croissance embryonnaire de la roussette. Ces températures correspondent également à une augmentation de 5°C des température moyennes de surface des océans dans les scénarios de changement climatique. Ces données bibliographiques nous ont donc permis de bien cerner les conditions à tester et d’éviter l’utilisation d’un nombre plus important d’animaux. De plus, l’utilisation de technologies performantes à haute résolution permet d'obtenir des données statistiquement analysables à partir de faibles quantités d’échantillons, ce qui permet de limiter le nombre de cellules de Dahlgren à prélever, et donc d’animaux. Un maximum d’organes sera prélevé sur un même animal pour des études ultérieures liées au projet et pour leurs utilisations dans des projets différents réalisés par d’autres chercheurs s’intéressant à cette espèce.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant au minimum 4 semaines avant les expériences dans des systèmes à flux ouvert avec de l'eau de mer naturelle à 15°C, sous un cycle de lumière artificielle 8L:16D et ils seront en groupe à raison d’une densité de 5 animaux / 100L (environ 35kg/m3). Cette période de 4 semaines est justifiée par une préconisation généralement admise de 2 semaines de délai entre le transport des animaux et leur inclusion expérimentale auxquelles sont rajoutés 2 semaines minimum qui permettront une manipulation des animaux (caresses du museau, caresses ventrales, prise en main dans les bacs, tests d’immobilité tonique). Au cours de cette période, les animaux seront nourris de poissons ou de mollusques ad libitum à une fréquence d'une fois par semaine, ce qui est en accord avec le mode d'alimentation des requins. Les animaux seront également pesés et mesurés puis identifiés par un marquage externe (fil de couleur placé autour du corps devant la nageoire dorsale). Lors des tests, les animaux seront transférés dans un bac de 100L (hauteur de 60 cm) permettant une nage sans contrainte et ainsi assurer une bonne irrigation des branchies et, selon les conditions, permettant également aux animaux de boire. Lors de ces tests une observation de comportements de stress (nage rapide et comportement de fuite hors du bassin, rougeurs de la peau) entrainera aussitôt l’exclusion des animaux. Pour les prélèvements sanguins les animaux seront transférés dans un bac de petite dimension (1m x 0.30m) pour permettre leur sédation et la mise en place d’une pompe buccale non invasive pour assurer l’irrigation des branchies. En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour procéder aux prélèvements des tissus biologiques.

Choix des espèces

L’espèce utilisée, Scyliorhinus canicula est un requin Carcharhiniforme non classé comme vulnérable (Least Concern) sur la liste rouge de l’UICN (Union internationale pour la conservation de la nature). Du fait de son abondance et de la disponibilité de données scientifiques, dont génomiques, cette espèce est considérée comme une espèce modèle pour l’étude des requins. Ces derniers appartiennent au groupe des poissons cartilagineux (Chondrichtyens) qui regroupe également les holocéphales (ou chimères) et les raies. Au cours de l’évolution, les poissons cartilagineux ont divergé des vertébrés osseux il y a environ 420 millions d’années. Ils constituent donc un taxon d’intérêt pour les études phylogénétiques. De plus, les études en physiologie des poissons s’intéressent très peu à celle des requins et des raies alors qu’ils constituent un groupe très différent des poissons osseux et qu’ils sont de plus en plus menacés dans nos écosystèmes marins. Seuls des animaux adultes de sexe mâle seront utilisés. Les roussettes mâles atteignent une maturité sexuelle à 6,6 ans pour une taille de 54 cm. Afin d’utiliser des lots homogènes, nous identifierons les animaux au préalable dans une gamme de taille de 60±3 cm et de poids de 680±30g. L’utilisation d’adultes est justifiée par le fait de prélever des animaux en milieu naturel qui aient eu des cycles de reproduction, donc moins impactant pour la ressource, et de disposer d’animaux de taille suffisante pour le prélèvement des échantillons biologiques.

760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent une biopsie de la queue pour le génotypage et des injections, dont une dans la veine caudale sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélever le cœur et d'autres organes, afin d'étudier les mécanismes de toxicité de l'adrénaline sur le cœur dans l'insuffisance cardiaque. Le porteur indique que les biopsies et injections provoquent une douleur légère et que la manipulation stresse les animaux. Sur le remplacement, il affirme le recours "incontournable" à l'animal, les cellules cardiaques adultes ne survivant pas au-delà de deux à trois jours en culture.

Objectifs

L'insuffisance cardiaque est une maladie grave et fréquente (1 à 2 % de la population des pays développés) dont l'espérance de vie à 5 ans est de seulement 50% malgré les traitements actuels. Quelle que soit son étiologie, l'insuffisance cardiaque est associée à une augmentation chronique d’adrénaline et de noradrénaline dans la circulation et ceci a des conséquences néfastes pour le cœur. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes de toxicité de ces hormones sur le coeur, dans l'espoir de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour de futurs traitements de l'insuffisance cardiaque.

Bénéfices attendus

Comprendre les mécanismes de la toxicité de l'adrénaline et de la noradrénaline pourrait permettre de trouver à terme de nouveaux traitements pour améliorer la contraction du cœur dans l’insuffisance cardiaque et donc la survie des patients atteints de cette maladie.

Procédures

Un prélèvement sur animaux vigiles, durée 30 secondes. 2 injections, durée 3 secondes/injection, 1 injection caudale, durée 30 secondes, sous anesthésie. 1 injection pour euthanasie.

Impact sur les animaux

Le prélèvement d'une biopsie de queue (1 mm) pour le génotypage et les injections occasionnent une douleur légère. L'injection à la queue est réalisée sous anesthésie mais est susceptible d'entraîner une douleur passagère au réveil. La manipulation des animaux pour effectuer ces opérations, bien qu'effectuée par du personnel formé, provoque un stress.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié pour prélèvement du coeur et des autres organes majeurs, ce qui sera indispensable pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques conduisant à l'insuffisance cardiaque.

Remplacement

Le recours incontournable à des animaux se justifie par la nécessité d’étudier la répartion de l’AMPc dans les cardiomyocytes. Il se justifie par l’impossibilité d’obtenir des lignées de cellules cardiaques adultes possédant les mêmes caractéristiques que les cardiomyocytes primaires, par le fait que les cellules cardiaques adultes ne conservent pas un phénotype stable en culture et ne survivent pas au delà de 48 à 72h.

Réduction

Des souris des deux sexes seront utilisés dans ce projet car il n'existe pas d'évidence que le sexe modifie la répartition de l'AMPc et ceci permettra de réduire le nombre d'animaux produits. Une planification minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité statistique de l’étude, et en conservant une puissance statistique suffisante pour observer un effet. Dans la mesure du possible, les cardiomyocytes et les tissus seront partagés afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés. Des expériences d’imagerie, de biochimie et de biologie moléculaire seront effectuées à partir du même isolat de cardiomyocytes afin de réduire encore le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s’assurer qu’ils ne subissent aucun stress. Au quotidien, l’aspect des souris sera examiné (aspect général, état du pelage, prostration éventuelle) et des pesées seront effectuées une fois par semaine afin de mettre en œuvre les points limites appropriés. Afin d’améliorer leurs conditions d’hébergement de l’enrichissement sera ajouté dans leurs cages. Les rats sont mis en cage et observés tous les jours. Les cages sont changées 2 fois par semaine afin de minimiser une éventuelle infection. L’injection dans la veine caudale est réalisée sous anésthésie à l'isoflurane.

Choix des espèces

La souris est un mammifère comme l’Homme dans lequel il est possible d’étudier la fonction d’un gène pour mieux comprendre son rôle dans le développement des maladies. Dans ce projet, nous utilisons des souris dont un gène est modifié uniquement dans le cœur dans le but de mieux comprendre son rôle dans l’insuffisance cardiaque ce qui pourrait permettre à terme de trouver de nouveaux traitements de cette maladie. Nous utilisons des animaux adultes car l’insuffisance cardiaque touche principalement des sujets adultes.

12 000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie des animaux témoins étant réutilisée dans d'autres projets et le reste tué. Ils reçoivent des composés par voie orale, intrapéritonéale ou sous-cutanée, puis sont soumis à l'un de cinq tests comportementaux mesurant l'anxiété, avec parfois une mise à jeun jusqu'à vingt heures et un isolement sans eau ni nourriture jusqu'à quarante minutes, pour évaluer de nouvelles molécules anxiolytiques. Le porteur estime les atteintes limitées à un stress et une brève douleur d'injection. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne suffit et juge le rat et la souris "les espèces les plus adaptées" avant tout passage chez l'humain.

Objectifs

Les troubles anxieux constituent une maladie psychique chronique fréquente et souvent invalidante qui s’exprime sous plusieurs formes chez l’homme (anxiété généralisée, phobies, trouble panique, troubles obsessionnels compulsifs…). Ils touchent environ 21% de la population générale sur la vie entière et peuvent être associés à de nombreux facteurs de comorbidité (prise d’alcool, troubles dépressifs…). Si les antidépresseurs et les anxiolytiques sont généralement employés dans les traitements des troubles anxieux, ces derniers présentent cependant de nombreuses limites (efficacité limitée, effets secondaires…). Ce projet a pour objectif d’étudier les effets de nouveaux produit synthétisés ou acquis au sein du laboratoire dans des modèles comportementaux chez le rongeur permettant de mimer le trouble anxieux et le comportement compulsif chez l’homme. Il s’agira de mesurer la capacité de composés à agir sur l’activité anxieuse et/ou compulsive chez le rat ou la souris pour poursuivre de développement de ces nouvelles molécules en phase clinique chez l’humain.

Bénéfices attendus

A court terme, il s’agira de démontrer à l’aide de données chez l’animal l’efficacité potentielle de nouveaux produits pharmacologiques : les procédures mises en œuvre permettront de mesurer la capacité de nouvelles molécules vis-à-vis du comportement anxieux de rongeurs, de les comparer et ainsi de choisir la meilleure selon des critères de sélection pour l’application thérapeutique ciblée. A long terme, ce projet permettra de générer des données scientifiques pré-cliniques robustes indispensables pour le développement de nouveaux candidats médicaments, notamment avant le passage en phase de tests chez l’Homme.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à des administrations dont la voie (orale, intrapéritonéale, sous-cutanée) ainsi que la fréquence d’administration (aigüe ou chronique, dans ce cas 2 administrations/jour max) seront adaptées en fonction des objectifs de recherches. Les animaux seront soumis à un seul des 5 tests de la procédure de ce projet. Chacun des tests a pour objectif de mesurer l'anxiété des animaux et d'évaluer le potentiel de candidats médicaments à moduler cette anxiété. La durée de chaque test sera de 5 minutes à 30 minutes. Les délais d'administration avant les phases de test seront de 0 à 4h. Pour chaque administration, une courte contention (

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet, les animaux recevront des administrations de composés avant les évaluations comportementales. Il est possible que la courte contention alors nécessaire (

Devenir

Les animaux traités avec des composés pharmacologiques qui risqueraient d’interagir avec d’autres expérimentations dans le but d’une réutilisation seront mis à mort. Certains animaux, les animaux contrôles, pourront cependant être réutilisés pour d’autres projets en fonction des objectifs de recherche si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée. La décision sera prise par le responsable projet (une personne compétente désignée par lui) ou le vétérinaire.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de nouvelles entités pharmacologiques sur le comportement anxieux dans le cadre du développement de nouveaux médicaments. Il n’existe à ce jour pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet c’est pourquoi l’utilisation de modèles in vivo est indispensable avant toute administration à l’homme, rat et souris étant ici les espèces les plus adaptées.

Réduction

Un effectif minimum et suffisant de 12 animaux par groupe expérimental est prévu afin d’obtenir une robustesse satisfaisante des tests statistiques. En fin de procédure, les animaux (en particulier les contrôles) seront au maximum réutilisés dans d’autres projets comportementaux ou bien pour des analyses histologiques faisant l’objet d’autres projets.

Raffinement

Les animaux (rats, souris) sont hébergés en animalerie centrale et restent 5 jours en acclimatation avant toute expérimentation. Tout au long des études, les animaux sont hébergés en groupe (nombre maximal défini par la règlementation en cours) dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement de milieu (tunnel, Sizzle pad pour nidification…). Le change des cages se fait 1 à 2 fois par semaine. Les animaux sont observés chaque jour, et font l’objet d’un suivi SBEA (Structure Bien-être Animal) par l’expérimentateur chaque semaine avec entrée des observations (et des éventuelles actions prises) dans une base de données. Les membres de la SBEA (Structure Bien-être Animal) effectuent une observation mensuelle de tous les animaux. En cas d’atteinte d’un des points limites, l’animal est écarté de l'étude pour subir les soins essentiels ou être euthanasié si nécessaire. Le raffinement sera aussi obtenu grâce au recours à des procédures les moins invasives possibles ainsi qu’à la familiarisation des animaux aux procédures expérimentales (période d’habituation aux pièces et dispositif expérimental, phase de familiarisation aux manipulations, administrations…).

Choix des espèces

Le rat et la souris sont déjà largement caractérisés d’un point de vue comportemental et neurochimique et ils ont un système nerveux suffisamment évolué pour envisager raisonnablement une extrapolation à l’homme de certains résultats. De nombreux parallèles existent en effet entre les caractéristiques comportementales étudiées chez le rat ou la souris et les caractéristiques du comportement humain. Ce sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets de substances sur l’anxiété et/ou l’activité compulsive. Les animaux sont utilisés au stade adulte chez la souris comme chez le rat. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets de produits sur l’animal à d’autres stades de développement. De plus, les tests d’anxiété/activité compulsive décrits dans ce projet sont classiquement réalisés dans la littérature sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités motrices et cognitives fonctionnelles.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses d'une mutation modélisant le syndrome de l'X fragile, elles reçoivent un composé dans l'eau de boisson pendant huit jours, puis sont tuées pour prélever le cerveau et enregistrer l'activité électrique sur des coupes, afin de tester si ce composé calme l'hyperexcitabilité du cortex. Le porteur indique que ces souris ne montrent pas d'altération du comportement à l'âge utilisé et que le composé n'a pas provoqué d'effet indésirable. Sur le remplacement, il affirme qu'étudier l'activité neuronale dans le cerveau entier est "indispensable" et ne peut se faire sur des cultures cellulaires.

Objectifs

Le syndrome de l’X fragile (SXF) est une maladie génétique qui provoque des problèmes intellectuels et touche environ 10 000 personnes en France. Cela est dû à une mutation dans un gène qui empêche la production d'une protéine essentielle pour le fonctionnement normal des cellules nerveuses dans le cerveau. Ce dysfonctionnement des cellules nerveuses entraîne des problèmes d'excitabilité dans le cerveau, plus particulièrement dans une région appelée cortex. Actuellement, il n'y a pas de traitement spécifique pour cette maladie héréditaire. Les traitements existants ne font que soulager certains symptômes, mais ne guérissent pas la maladie. C'est pourquoi il est très important de rechercher de nouveaux traitements qui pourraient changer le cours de la maladie. Une approche potentielle pour traiter le SXF serait de trouver un traitement qui pourrait réduire cette hyperexcitabilité dans le cerveau. L'objectif de ce projet est de tester l'effet d'un composé administré dans l'eau de boisson sur l'hyperactivité du cortex observée dans un modèle de souris atteintes de SXF. En d'autres termes, nous allons étudier si ce composé peut aider à calmer l'excitabilité excessive dans le cerveau de ces souris pour améliorer leur état.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les dysfonctionnements des cellules neuronales observés dans le SXF, forme la plus fréquente de déficience intellectuelle héréditaire, et notamment les mécanismes responsables de l’hyperexcitabilité au niveau du cortex cérébral, et de tester l'effet d'un candidat médicament sur cette hyperexcitabilité, dans le but de développer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’Homme afin de traiter cette pathologie.

Procédures

Administration d'un composé dans l'eau de boisson pendant 8 jours. Euthanasie : Administration du mélange d’anesthésiques/analgésiques (10 secondes), anesthésie de la souris par inhalation d'un anesthésique (maximum 5 minutes), prélevement du cerveau (2 minutes).

Impact sur les animaux

Les souris modèles du SXF que nous utilisons ne présente pas d’altération de leur comportement à l’âge utilisé. Le composé étudié n’induit aucun effet indésirable après 8 jours d’administration dans l’eau de boisson.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés afin de réaliser les coupes cérébrales et procéder aux enregistrements de l’activité cérébrale sur ces coupes.

Remplacement

Les expériences in vivo, en utilisant des modèles animaux, permettent d'étudier le fonctionnement des neurones dans leur contexte naturel, c'est-à-dire à l'intérieur du cerveau entier. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour étudier l'activité éléctrique neuronale des différentes régions du cerveau et le bénéfice de certains traitements sur ces modifications d'activité neuronale envisagés dans ce projet. Ces approches expérimentales ne peuvent pas être remplacées par des méthodes substitutives type approche in sillico / in vitro ou culture cellulaire ... L'utilisation du modèle souris nous permet de mimer la physiologie et la pathologie humaine et de corréler les modifications anatomiques et physiologiques observées in vivo à des déficits.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des tests statistiques. Nous adapterons les tests statistiques en fonction des observations.

Raffinement

Avant toute administration, une période d’acclimatation des animaux d’au moins 5 jours sera respectée. Une observation des animaux sera effectué quotidiennement sans exception (Week-ends & jours fériés). Pendant la période d’administration du composé dans l’eau de boisson (8 jours), un contrôle renforcé selon la fiche de suivi sera réalisé à minima 3 fois, afin de s’assurer de l’absence d’effet indésirable inattendu. En cas d’altération de l’état de l’animal, la surveillance sera rapprochée et il sera soigné selon les recommandations du vétérinaire et en accord avec le directeur d’étude.

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées chez la souris, dont l’étude est extrêmement répandue au sein des laboratoires de recherche en Neurosciences, rendant les résultats pertinents pour la communauté scientifique nationale et internationale. Ces rongeurs, de petite taille et d’élevage facile, possèdent un système nerveux dont le développement est extrêmement proche de celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est suffisamment complexe. Pour l'étude des déficits du SXF, un modèle de souris de cette maladie nous permettra d’étudier l’effet d’un traitement sur les dysfonctionnements neuronaux observés dans le SXF. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, de 6 semaines à 15 semaines. En effet, des études préliminaires réalisées par notre client ont montré une efficacité du composé testé sur un autre modèle de souris malades à l’âge adulte.