Procédures légères

2500 anguilles européennes vont être capturées et utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchées dans le milieu naturel. Chaque individu est anesthésié et reçoit une marque numérotée insérée dans la cavité abdominale, dans un protocole de marquage-recapture destiné à mesurer l'efficacité d'une passe à poissons. Le porteur agit sur une espèce menacée et affirme n'avoir "pas d'autre choix" que d'utiliser l'anguille elle-même, en limitant le marquage à un quart des individus en migration. Les manipulations visent l'aménagement d'un ouvrage hydraulique, présenté comme le moyen d'évaluer la continuité écologique.

Objectifs

La population d'anguilles à l'échelle européenne et française est dans une situation alarmante. De nombreuses passes spécifiques anguilles sont installées sur la plupart des obstacles à la migration lorsqu'une démarche de rétablissement de la continuité écologique est mise en place. L'efficacité de telles passes est plus ou moins connue suivant les sites. L'emplacement de ces passes au niveau de l'ouvrage est crucial au regard de son efficacité. Le second élément crucial qui conditionne l’efficacité de la passe est l'attractivité pour les anguilles. La moindre modification des conditions hydrauliques proches de l’entrée de la passe peut permettre d’améliorer l’efficacité ou au contraire modifier son efficacité. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité d'une passe et de l'améliorer pour faciliter le passage des anguilles en montaison. Un nombre d’anguilles en migration est seulement le reflet des individus en migration sur l’ouvrage, et non le reflet des individus en attente en aval, et qui ne réussissent pas à emprunter l’obstacle. Seul un suivi avec marquage-recapture permet d’avoir une idée de l’efficacité. Le nombre d'anguilles marquées qui empruntent de nouveau la passe à anguilles est utilisé à la fois de manière brute en regardant le pourcentage ayant migré en lien avec les conditions environnementales mais également en analysant les délais de recapture des individus. Plus le délai de recapture est court plus les individus trouvent facilement l'entrée et donc l'attractivité est élevée.

Bénéfices attendus

L'objectif principal de cette étude est de renforcer l'évaluation de l’efficacité d'une passse à anguilles en fonction de la gestion des systèmes hydrauliques avoisinant et conditionnant son attractivité pour les anguilles, et ainsi favoriser la migration des anguilles vers les secteurs amont, rendant accessible des secteurs propices à leur croissance. L'objectif est d'améliorer l'efficacité et faciliter son accés aux anguilles.

Procédures

Les individus seront anesthésiés puis marqués avec des marques avec numéro individuel de taille adaptée au poids de l'animal afin de ne pas impacter le comportement de l'individu. L'intervention sur chaque individu durera quelques minutes, entre l'anesthésie, le marquage, le réveil et le retour dans le milieu naturel. Les marques sont placées dans la cavité abdominale. 2500 anguilles seront marquées sur la durée de l'expérimentation , sur une population en migration pouvant aller annuellement jusqu'à 200 000 individus.

Impact sur les animaux

Toutes les données disponibles antérieures sur les anguilles permettent d’avoir des courbes de correspondances taille / poids importantes. Ainsi afin de respecter le ratio de 2% du poids du poisson, nous savons que nous ne pourrons pas marquer d’individus de moins de 13cm avec des marques de 8mm et de moins de 20 cm avec les marques de 12mm. Pour les individus proches de ces tailles, le poids est vérifié avant marquage. Avant marquage, les anguilles sont scannées afin de vérifier qu'elles ne sont pas déjà porteuses d'une marque. Si c'est le cas, elles sont immédiatement remises à l'eau. Cela permet de ne pas utiliser deux fois le même animal. Les deux types de marques sont tout de même utilisés, pour limiter le risque de non détection des marques quand les anguilles grandiront. La distance de détection des marques 12mm est plus importante, et certains individus ont été détectés 15 à 20 ans après au moment de la dévalaison ces dernières années. Cependant les individus peuvent être stressés par le piégeage et le marquage. Tout sera mis en œuvre pour réduire ce stress avec un temps de piégeage réduit (max une nuit), et un renouvellement constant de l’eau du bac de repos, ainsi que du bac de réveil après marquage. Dans le bac de réveil, des plantes aquatiques seront installées afin d’offrir des caches aux anguilles, et de réduire leur stress.

Devenir

tous les individus en fin de procédure seront remis dans le milieu naturel

Remplacement

L'étude cible la migration de l'anguille et son comportement au moment du franchissement d'un aménagement spécifique installé devant un obstacle à la migration. Les obstacles à la migration sont un problème majeur à la sauvegarde et restauration de l'espèce et de nombreuses questions restent encore en suspens.

Réduction

Sur les 5 ans, le nombre maximum d’anguilles marqué sera de 2 500 anguilles (500 par an). Les données recueillies sur la base d’un marquage de 500 anguilles par an permet d’avoir un reflet fidèle du comportement migratoire des anguilles de l’année. Les marquages se font en plusieurs fois, et c’est lors de ces marquages que nous nous assurons de ne pas dépasser un maximum de 25% des anguilles migrantes. Le nombre d’anguilles marquées à chaque session tient compte des anguilles en migration à ce moment-là.

Raffinement

Les piégeages des anguilles en amont de la passe spécifique se fera la nuit, ce qui permettra de réduire le stress des individus. Le marquage commencera dès le matin. Lors de l’anesthésie et toujours dans une optique de réduction du stress, l’eau du cours d'eau, sera utilisée afin de ne pas changer l’eau de stabulation et de vie des poissons. Le réveil se fera également dans l’eau du cours d'eau, cette eau sera renouvelée très régulièrement, et des végétaux aquatiques seront installés dans le bac de réveil. Il a été constaté lors de précédents suivis que la mise en place de végétaux aquatiques dans le bac de réveil réduit de manière drastique le stress des anguilles qui se camouflent sous ces herbiers. Les anguilles sont anesthésiées pendant les manipulations. Un linge humide permet de manipuler les individus afin de protéger le mucus.

Choix des espèces

Cette opération a pour objectif de suivre le comportement d’une espèce sauvage, l'Anguille européenne, lors de sa migration. Nous n'avons pas d'autre choix que d'utiliser cette espèce. Les anguilles marquées sont celles en migration au niveau des passes spécifiques. Leur taille médiane est de 160 mm, les individus allant de 130mm à 260mm environ. Deux types de marques seront utilisées en fonction du poids des individus, sachant que les plus petites marques (8mm) ne pourront être utilisées sur des individus de taille inférieure à 130mm. Lors de cette migration, le stade de développement des anguilles fiat que l'on parle d'"anguilles jaunes".

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Rendues amnésiques par la scopolamine, elles passent un test de mémoire de travail spatiale et reçoivent des injections de deux agents pharmacologiques, pour vérifier si leur association améliore la mémoire, piste envisagée pour la maladie d'Alzheimer. Le porteur décrit une douleur légère liée aux injections et annonce n'attendre aucune nuisance du test comportemental. À l'issue, les cerveaux des 60 souris sont prélevés, et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut évaluer la mémoire.

Objectifs

Plusieurs données de la littérature indiquent que l’inhibition d’une enzyme cérébrale, la phosphodiestérase 7 (PDE7), pourrait s’avérer être une stratégie intéressante pour traiter les troubles de la mémoire induits par la maladie d’Alzheimer. En parallèle, il a également été montré que l’activation de certains récepteurs cérébraux (les récepteurs 5-HT4) engendrait des effets bénéfiques sur la mémoire chez l’animal. Notre hypothèse de recherche est que l’activation des récepteurs 5-HT4, conjuguée à l’inhibition des PDE7, exercerait des effets bénéfiques puissants sur la mémoire. Notre étude vise à démontrer, chez l’animal, la preuve d’intérêt de cette association. Cette étude pilote sera réalisée dans un modèle d’amnésie induite par la scopolamine chez la souris adulte.

Bénéfices attendus

Cette étude pilote permettra de valider la preuve de concept de l’intérêt d’une association de deux agents pharmacologiques pour lutter contre des déficits de mémoire induits chez la souris. Si notre preuve de concept est validée, nous pourrons envisager d’approfondir l’étude de l’efficacité de cette approche dans un modèle animal de la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les 60 souris seront exposées trois fois à un test comportemental (test de mémoire de travail spatiale) d’une durée de 5 min et n’engendrant aucune nuisance chez l’animal. A chaque session de test, chaque souris recevra 2 ou 3 injections aigües d’agents pharmacologiques. Chaque injection (voie intra-péritonéale et sous-cutanée) nécessite une contention de l’animal et prendra environ une minute par souris. L’ensemble de la procédure durera 1 mois, comprenant 3 sessions de 5 min de test de mémoire séparées de 2 semaines chacune.

Impact sur les animaux

Lors de ce projet, les animaux vont subir des administrations par voies intra-péritonéale et sous-cutanée nécessitant une contention. Un stress physique et une douleur légère dus aux injections sont attendus lors de ces manipulations. Aucune nuisance sur la souris n’est attendue suite à la réalisation de la tâche comportementale (test d’exploration réalisé en situation libre, d’une durée de 5 minute par souris). Enfin, concernant les agents pharmacologiques utilisés, aucun d’entre eux, aux doses envisagées, n’est connu pour induire des nuisances ou effets indésirables chez la souris. Seule la scopolamine est utilisée comme agent amnésiant, et dont les effets délétères sur la mémoire ne sont que transitoires (moins de 24h).

Devenir

A l’issue de l’unique procédure présentée dans ce projet, tous les animaux (n=60 souris) seront mis à mort. Les cerveaux de tous les animaux seront prélevés afin de réaliser des études post-mortem complémentaires.

Remplacement

Ce projet vise à favoriser le développement de nouveaux médicaments susceptibles d’avoir un intérêt dans le cadre de la prévention et/ou le traitement de pathologies telles que la maladie d’Alzheimer. Or la recherche de nouveaux médicaments nécessite (scientifiquement et règlementairement) l’utilisation d’espèces animales. De plus, l’évaluation des performances de mémoire ne peut être réalisée que sur un organisme capable d’effectuer une tâche cognitive (ici un test de mémoire de travail spatiale). Ainsi, aucun remplacement par des modèles in vitro ou in silico (modèles mathématiques, bio-informatique) ne peut être réalisé.

Réduction

Un total de 60 souris sera nécessaire pour cette étude pilote. En faveur d’une réduction du nombre d’animaux utilisé, nous avons choisi d’utiliser à la fois des souris femelles et des souris mâles. Nous avons également choisi de réaliser successivement les trois sessions expérimentales sur les mêmes souris et de poursuivre cette étude comportementale par des mesures post-mortem.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, souffrance et angoisse infligées, les animaux seront maintenus dans des conditions d’hébergement optimales et stables : température, cycle de lumière, hygrométrie, enrichissement minimal du milieu d’hébergement (maisonnette, papier kraft), cage de dimension 24cm (l) x 40cm (L) x 18cm (h) apportant une surface au sol de 160 cm² par animal. Ils seront surveillés quotidiennement par un personnel qualifié et une attention particulière sera apportée à l’apparence physique externe des animaux, aux variations éventuelles de poids ainsi qu’aux changements de comportements. Les injections intra-péritonéales et sous-cutanées seront réalisées exclusivement par un personnel qualifié. Afin de diminuer le stress de nos animaux, un protocole de familiarisation des animaux à l’animalerie et à l’expérimentateur sera mis en place sous la forme de handling dès l’arrivée des animaux au sein de notre animalerie. Afin de réduire la douleur et la détresse de nos animaux nous avons choisi un point limite précoce et compatible avec les objectifs scientifiques de notre recherche.

Choix des espèces

Les souris font partie des espèces animales les plus exploitées en recherche biomédicale du fait de leur facilité de reproduction et de la similarité du système nerveux central qu’elles présentent avec l’Homme. Leur comportement est bien décrit et il est possible d’en mesurer les modifications. Les modèles murins possèdent une bonne faculté d’apprentissage justifiant leur utilisation dans l’étude de la mémoire. Des souris de souche C57BL6 adultes (minimum 8 semaines d’âge) seront utilisées dans ce projet, un âge auquel les grandes fonctions physiologiques sont arrivées à maturité.

80 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardés en vie et rendus à leur animalerie d'origine. Ils subissent un stress d'hypoxie et trois séances d'imagerie IRM sous anesthésie légère, pour mesurer les effets d'un déficit d'oxygène sur l'hippocampe et évaluer une plante, Guiera senegalensis, comme antioxydant. Le porteur indique que l'hypoxie pourrait détruire des neurones sans pour autant affecter le bien-être de l'animal, et surveille la respiration pendant l'anesthésie. Il affirme que cette étude comportementale et neurobiologique nécessite des animaux vivants dotés des structures cérébrales voulues.

Objectifs

Les radicaux libres sont connus pour être responsables d’un vieillissement cellulaire. Dans des conditions normales, les radicaux libres sont produits à de faibles concentrations et agissent comme des molécules de signalisation pour les cellules. Dans certaines situations, le nombre de radicaux libres présents dans les cellules est trop important. Ce stress oxydant conduit à un dysfonctionnement cellulaire, voire à la mort cellulaire. Il a été incriminé dans la physiopathologie de nombreuses affections humaines (par exemple la maladie d’Alzheimer). L’hypoxie (un déficit d’apport en oxygène dans les tissus de l’organisme) est l’une des causes de stress oxydant. Au niveau cérébral, l’hypoxie génère des processus inflammatoires qui peuvent se solder par une destruction des neurones au niveau de l’hippocampe, structure très impliquée dans l’apprentissage et la mémoire. L’apnée, c’est-à-dire un arrêt de la respiration pendant au moins 20 secondes, même si elle est volontaire, pourrait participer à la genèse d’un stress oxydant à travers l’hypoxie créée. En Afrique, Guiera senegalensis (Combretaceae) est une plante utilisée en pharmacopée traditionnelle. Ses feuilles possèdent de nombreux composés, notamment les flavonoïdes et les acides polyphenoliques, qui sont des antioxydants naturels. L’objectif général de ce projet est d’évaluer les effets bénéfiques de l’extrait hydroéthanolique des feuilles de Guiera senegalensis dans la gestion du stress oxydant et dans la prévention d’impacts neurobiologiques de l’hypoxie au niveau cérébral.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera une information précieuse sur le lien entre hypoxie sous apnée et les corrélats neurobiologiques dans l’hippocampe comme prédicteurs de désordres mnésiques, ainsi que le bénéfice potentiel de Guiera senegalensis dans le traitement des effets hypoxiques des phénomènes d’apnée naturelle. De plus, ce projet permettra d’entrevoir une applicabilité potentielle de cette plante dans des pathologies liées au stress oxydatif. Autrement dit, Guiera senegalensis pourrait offrir un choix alternatif ou complémentaire dans la prévention et le traitement de ces pathologies. Il permettra également de collecter des données pilotes nécessaires pour un projet collaboratif plus large, qui se propose de corréler les données acquises sur ce modèle d’apnée chez le rat avec des données acquises sur des apnéistes humains.

Procédures

Trois séances d’imagerie sont prévues pour caractériser le modèle d’hypoxie cérébrale à 1 jour, 7 jours et 15 jours post-induction. Chaque séance (d’une durée d’environ 1/2 journée) comprendra une session d’acquisition IRM (d’une durée maximale de 2 heures).

Impact sur les animaux

Le modèle d'hypoxie pourrait induire des lésions cellulaires et des processus inflammatoires qui pourraient se solder par une destruction de certains neurones au niveau de l'hippocampe, mais cela ne devrait pas affecter le bien-être de l'animal. L’examen IRM étant une modalité de neuroimagerie totalement non-invasive et non-irradiante, les potentiels effets indésirables sont liés au fait que l’examen est réalisé sous anesthésie légère. Pour éviter tout risque d’arrêt respiratoire, la fréquence respiratoire est surveillée en permanence tout au long de l’examen. Il est également possible d’observer une légère perte de poids le lendemain de l’examen, suite au stress potentiellement induit par la combinaison transport (~10min)/examen (~2h) entre les deux bâtiments d’expérimentation se faisant face.

Devenir

Après l’examen IRM les animaux seront gardés en vie et retourneront en hébergement dans leur animalerie d’origine.

Remplacement

L’évaluation comportementale et neurobiologique en réponse à un stress hypoxique induit par apnée, nécessite l’utilisation des animaux vivants possédant les structures cérébrales requises. L'analyse cellulaire des différentes structures cérébrales ne peut être réalisée in silico ou en cellule isolée, ni même chez les invertébrés.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera minimisé autant que possible grâce à l’étude de plusieurs paramètres chez le même animal et de façon longitudinale avec des approches non-invasives comme l’IRM. Les analyses statistiques seront celles classiquement utilisées dans la littérature.

Raffinement

Que ce soit durant leur transport ou lors de l’examen IRM, une grande attention est apportée au bien-être des animaux, et tout est mis en œuvre pour éviter les sources potentielles de stress. Transports : Les animaux sont transportés dans leur boîte habituelle (enrichie), avec leurs partenaires habituels et manipulés par les personnes assurant leur suivi quotidien. Les boîtes sont protégées du froid ou du chaud éventuel. Manipulations/anesthésie avant/après examen IRM : Ces actes sont réalisés par les personnes qualifiées assurant le suivi quotidien des animaux. Examen IRM : Il est réalisé sous anesthésie, dans un berceau chauffé uniquement dédié à ces animaux, avec contrôle de la respiration et de la température. Lors d’une acquisition IRM, si la respiration sort des limites prévues, l’examen est immédiatement interrompu et l’animal est mis sous surveillance accrue jusqu’à sa récupération. En dehors des sessions d’examen IRM, les animaux seront hébergés par groupe (2 à 4) avec de l’enrichissement autant que possible (tunnel transparent de couleur rouge, bâton à ronger, papier à déchiqueter). Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance (mise en place de points limites) et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec la Structure bien être animale et les conseils vétérinaires.

Choix des espèces

La littérature concernant le stress hypoxique est majoritairement basée sur des études chez le rat, fournissant une base de connaissances solide. De plus, la littérature sur les expériences d’apnée est plus importante chez le rat. Ce modèle animal est donc le plus approprié à la fois pour les études comportementales, biochimiques, immunohistochimiques et de neuroimagerie par IRM. Des rats nouvellement sevrés (~23-26 jours) seront utilisés en accord avec les données de la littérature concernant la période adaptée à un bon apprentissage de la nage chez les rats.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées, jusqu'à douze pour certaines, et des prélèvements sanguins, pour étudier l'effet d'un composé libérant l'oxygène sur les cellules souches du sang dans la moelle osseuse. Le porteur signale comme atteintes des douleurs aux points d'injection et le stress lié aux manipulations. Il affirme qu'il faut mener l'étude sur des individus vivants et met à mort les souris pour analyser leurs cellules.

Objectifs

Les cellules du sang assurant l'oxygénation des tissus et la défense immunitaire se développent dans la moelle osseuse (MO) à partir de cellules souches hématopoïétiques (CSH) tout au long de la vie des individus. L'ensemble des mécanismes biologiques qui gouvernent l'auto-renouvellement et la différenciation des CSH ne sont pas totalement élucidés. Chez l’homme, la perturbation de ces mécanismes participe au développement de maladies auto-immunes et de leucémies. Une meilleure compréhension de ceux-ci permettra de développer des cibles et des stratégies thérapeutiques pour traiter les patients. Les CSH sont maintenues dans la moelle osseuse qui constituent leur niche. Il a été montré que le faible niveau d’oxygène présent dans cette niche est essentiel au maintien des CSH en dormance. Récemment un dérivé synthétique qui augmente la libération de l’oxygène dans les tissus et le sang a été développé. Ce dérivé est utilisé pour rétablir des niveaux d’oxygène normaux dans le traitement de cancers solides. Ce composé est actuellement en essai clinique phase II pour le traitement de patients atteint de cancer du pancréas. Notre but est de définir si des niveaux d’oxygène plus importants dans la niche des CSH, lors de traitement avec ce composé, perturbent le maintien des CSH et conduisent à des dérégulations de ces cellules.

Bénéfices attendus

Nous espérons par ces expériences mettre en évidence qu’un niveau d’oxygène plus important dans la niche perturbe la maintenance des CSH et influence leur différenciation qui peut être à l’origine d’un vieillissement prématuré du système hématopoïétique ou d’immunodéficience. Il est important de connaitre les effets de composés libérant l’oxygène dans les tissus puisque des patients atteints de cancer solides sont traités avec ces substances. Une meilleure connaissance du développement des CSH en présence de traitement augmentant l’oxygène dans les tissus permettra d’adapter plus précisément le traitement de patients atteints de cancer.

Procédures

12 souris seront injectées 4 fois, 12 autres souris 8 fois et 12 autres souris 12 fois. La durée du temps d’injection est inférieure à une minute. 12 animaux seront soumis à des prélèvements sanguins prélevés 2 fois à 4 semaines d'intervalles et 12 autres seront prélevés 1 fois. Le prélèvement de sang est de l’ordre de la minute.

Impact sur les animaux

Les nuissances sur les animaux dans ce protocole sont les douleurs au niveau des sites d'injection de l'ITPP et le stress des animaux lors de ces injections et durant les prises de sang.

Devenir

Les souris injectées intrapéritonéalement seront mises à mort pour être analysées et évaluer les effets du traitement.

Remplacement

Les cellules souches hématopïétiques (CSH) se développent dans une niche de la moelle osseuse. Cet environnement particulier permet d’établir un gradient d’oxygène faible dans les zones périphériques (près de l’os) et élevé dans les zones vascularisées centrales. Les CSH sont maintenues dans les zones faibles en oxygène. Nous cherchons à définir si un traitement anti-hypoxie mené sur un individu peut affecter ces CSH dans leur environnement. Pour cela il est important de mener l’étude sur des individus vivants.

Réduction

Ces expériences seront réalisées sur 6 animaux pour les traitements avec le composé et comparées à 6 animaux contrôles pour chaque temps de traitement analysé (4, 8 et 12 semaines). A l'aide de tests statistiques utilisés nous serons en mesure de conclure.

Raffinement

Pour le raffinement : puisque les souris peuvent êtres immunodéficientes elles seront hébergées en cages ventilées et filtrées et manipulées sous -hotte pour maintenir un environnement le plus aseptique possible. Nous serons très vigilants pour être dans les conditions les plus aseptiques possibles lors des injections intrapéritonéales ainsi que lors des prises de sang.Si les animaux présentent des signes de souffrance (perte de poids supérieur à 20% ou prostration de l'animale) liées au traitement nous éliminerons ces animaux par euthanasie et chercherons à déterminer les causes de ces souffrances. Si des antibiotiques ou des analgésiques peuvent éliminer les souffrances animales détectées nous les utiliserons.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour l'analyse du développement des CSH dans la moelle osseuse. De nombreux réactifs (anticorps permettant d'identifier les CSH notament) pour mener à bien ces analyses sont disponibles. De plus les études visant à traiter les cancers humains à l’aide de composé favorisant la libération de l'oxygène ont été menées chez la souris, indiquant que cet animal est un modèle de choix pour l’étude de ce composé. Les animaux sont utilisés à partir 6 semaines ce qui correspond au stade de maturité adulte du système hématopoïétique et avant 6 mois pour ne pas introduire un biais dans les résultats avec des animaux vieillissants.

3 504 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces femelles reçoivent une injection intramusculaire puis sont hébergées en cages à roues pour mesurer leur activité de course, dispositif servant à comparer des molécules myorelaxantes destinées à la dystonie et à la spasticité. Le porteur annonce n'attendre aucun signe clinique après l'injection et justifie le projet par les recommandations de l'agence du médicament ainsi que par la politique de sa société, qu'il présente comme un gage de "respect de l'animal". À l'issue, les muscles injectés sont prélevés pour analyse histopathologique.

Objectifs

Ce projet vise à caractériser des produits myorelaxants à effet rapide et durable pour traiter les maladies neuromusculaires telles que la dystonie et la spasticité chez l’homme. Conformément aux recommandations de l’Agence Européenne du Médicament, nous devons mettre en évidence les propriétés pharmacologiques et pharmacodynamiques de ces molécules avant la mise en place d’essais cliniques chez l’homme. De plus, ce projet a été initié, évalué et validé par la direction de notre société dont la politique est basée sur un gage de qualité, de professionnalisme, d’intégrité et de respect de l’animal.

Bénéfices attendus

Les troubles du mouvement sont des pathologies neuromusculaires, souvent chroniques, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires pouvant entraîner des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces pathologies neuromusculaires implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène…Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents (somnolence, nausée, fatigue). Une solution pour diminuer ces effets secondaires consiste à administrer le baclofène via une pompe intrathécale ; cette approche est toutefois invasive. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces pathologies : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente de clairs avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Toutefois, cette approche peut encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. Il n’existe à ce jour pas de test in vitro qui permette de tester la pharmacologie

Procédures

Injection des composés : 1 injection x 1 minute / animal Pesée tout le long de l'étude : minimum 5 pesée x 30 sec / animal = 2.5 min / animal. Mesure du DAS tous les jours : 30 sec / animal pendant environ 28jours soir 14 min/ animal. Mesure de l'activité roue : les rats sont continuellement herbergés dans les cages à roues.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de cette procédure, aucun signe clinique n’est attendu ici suite à l’injection des composés, d’après nos résultats obtenus dans l’étude princeps et la littérature. En effet lors de notre précédent projet, aucun signe clinique de type infection ou inflammation suite à l’injection n’a été observé. Cependant, dans le cas où l’injection serait mal réalisée les signes observés et les mesures mises en oeuvre sont décrits dans le tableau fourni dans l’annexe jointe.

Devenir

Les animaux seront euthanasié à la fin de procédures. Nous prélévrons les muscles injectés pour des analyses histopathologiques

Remplacement

La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes internes. Or, bien qu’il existe des modèles in vitro qui permettent d’étudier la jonction neuromusculaire, la pertinence de ces modèles pour mimer la fonctionnalité de la jonction est débattue, et ils ne récapitulent pas les problématiques de diffusion qui se jouent in vivo. Le test de la course volontaire sur une roue en accès libre chez le rongeur, a été développé pour comparer les myorelaxants, et a permis par le passé de développer de nouvelles molécules.

Réduction

Pour chacun des protocoles, 6 animaux par groupe seront étudiés afin d'obtenir des résultats qui soient statistiquement comparables et qui permettent d'apporter des conclusions fiables qui ne peuvent être remis en question ce qui nécessiterait la réalisation d'un nouveau protocole pour confirmer les résultats. En plus des groupes impliquant les traitements avec les principes actifs, un groupe avec un produit de référence seront ajoutés aux protocoles.

Raffinement

les animaux seront hébergés en groupe avec enrichissement du milieu (bille en verre, et roue), et surveillés quotidiennement. L’injection intramusculaire dans le membre inférieur est réalisée sous contention par un expérimentateur entraîné, diminuant le stress pour les animaux. De plus, de la réception jusqu'à la fin du protocole, une observation quotidienne des animaux sera réalisée (état général, comportement, souffrance, stress et détresse, inconfort, réponse aux stimuli externes). De J0 à jusqu'au jour de l'euthanasie, il conviendra de suivre : - l’état général de l’animal (plusieurs fois la première semaine après l’injection), puis à chaque suivi clinique (1 à 2 fois par semaine) - la réaction à l’administration des principes actifs et du produit de référence - le poids (2 fois la première semaine, puis 1 fois par semaine jusqu’à la fin du protocole.

Choix des espèces

Afin d’évaluer l’activité myorelaxante sur ce modèle, nous souhaitons avoir recours au test de la course volontaire sur une roue libre d’accès chez le rongeur. En effet, la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). Au contraire, ce test est un modèle pertinent pour évaluer l’efficacité de molécules myorelaxantes. Par souci de continuité avec les premières études, nous utiliserons le rat, afin de pouvoir réutiliser certains paramètres déterminés et optimisés dans les études précédentes. Rats femelles Sprague Dawley femelles âgées de 6-7 semaines en début d’expérimentation et 18 semaines maximum en fin d’expérimentation. Des animaux juvéniles seront choisis par souci de continuité avec les études précédentes.

720 porcelets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 540 poursuivant ensuite leur cycle de production et 180 tués pour prélèvements. Ils subissent des prises de sang jugulaires, des collectes de fèces et d'urine, et peuvent être exposés à des températures de 16 à 33 °C et à un jeûne allant jusqu'à 24 heures. L'objectif est commercial, tester des solutions nutritionnelles et des additifs de croissance pour porcelets sevrés en vue d'une mise sur le marché. Le porteur affirme que la complexité des régulations physiologiques ne permet pas de recourir à des modèles in vitro.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer les effets de différentes stratégies alimentaires et conditions d’élevage sur différents paramètres physiologiques et sur les performances de croissance des porcelets sevrés (de 21 à 70 jours d’âge).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la meilleure connaissance de la physiologie du porcelet permettant in fine la mise en marché d’une ou plusieurs solutions nutritionnelles ou additifs permettant d’améliorer la santé et/ou les performances de croissance des porcelets pendant la phase de post-sevrage.

Procédures

Au maximum, 2 séries de maximum 3 prises de sang par ponction à une veine jugulaire ou à la région caudale pourront être réalisées. Les prises de sang seront espacées d'au moins 30 minutes et les séries de 3 prises de sang seront espacées d'au moins 7 jours. Par ailleurs, des mesures répétées (5 en 4 heures) à l’aide d’un dispositif de biologie déportée pourront être réalisées avec deux gouttes de sang par prélèvement sur les porcs. Un maximum de 3 prélèvements de fèces pourra avoir lieu par application de la procédure. De plus, jusqu’à 3 collectes d’urine pourront avoir lieu, espacées d’au moins 7 jours. La collecte se fera grâce à une poche de récolte d’urine collée sous l'abdomen des porcelets mâles, gardée maximum 7 heures, afin d’obtenir un volume suffisant d’urine. Les prélèvements de fèces, de sang et d’urine pourront être réalisés indépendamment les uns des autres. Les porcs pourront être soumis à des conditions dites « dégradées », représentatives des conditions rencontrées en élevages : déviation de températures de 16 à 33°C. Les porcs pourront être soumis à une mise à jeun n’excédant pas 24h.

Impact sur les animaux

Les prélèvements d’échantillons biologiques peuvent induire un stress lors de la manipulation des animaux. Afin de réduire le stress ou la douleur, le nombre de tentatives de collecte d’échantillons biologiques sera limité, les animaux seront manipulés le moins possible et le nombre d’animaux exposés à la procédure sera préalablement défini en respectant le principe de réduction.

Devenir

Les animaux ayant reçu un additif non autorisé au sein de l’Union européenne seront euthanasiés et exclus du circuit de consommation humaine. De plus, au maximum 3 essais avec 60 porcelets soit 180 porcelets au total pourront faire l’objet d’euthanasie afin de prélever des échantillons biologiques. Les autres animaux seront maintenus en vie et continueront leur cycle de production.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de comprendre comment les stratégies nutritionnelles et/ou méthodes d’élevage mises en œuvre affectent la santé, le bien-être et les performances du porcelet sevré par la compréhension des mécanismes physiologiques (dosage de biomarqueurs dans le sang, les fèces et les urines). L'effet d'une solution nutritionnelle ou d'un changement de conditions environnementales sur la santé et les performances de croissance des porcs est la résultante d'une série de mécanismes et régulations physiologiques (digestives, métaboliques, endocrinologiques) interagissant entre elles. La complexité de ces interactions ne permet pas d’utiliser de modèles alternatifs comme la modélisation ou la mise en place d’études in-vitro.

Réduction

L’objectif de ce projet est d’évaluer la réponse physiologique des porcelets à une ou plusieurs stratégies nutritionnelles et/ou soumis à différentes conditions d’ambiance. La variabilité observée pour les biomarqueurs est généralement plus faible que celle observée pour les performances de croissance. Cela implique de fait un nombre plus faible d’animaux impliqués dans chaque essai. Toutefois, la variabilité dépend du biomarqueur, ce qui nécessite d’adapter le nombre de porcelets par traitement expérimental à chaque mise en oeuvre de la procédure. (=essai). Un exemple de calcul de « la puissance statistique du test » prenant en compte une valeur seuil de significativité de 5%, une différence de 5% de GMQ (=Gain Moyen Quotidien) entre les traitements et un coefficient de variation de 4,3% donne un nombre minimal de 12 répétitions (=individus) par traitement expérimental avec un maximum de 5 traitements expérimentaux par essai. Toutefois, s’il s’agit d’une étude de prévalence, 60 porcelets peuvent être nécessaires afin d’obtenir au moins 5 individus par modalité de traitement. La méthode de calcul de « la puissance statistique du test » est robuste et est couramment utilisée pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires à la mise en évidence d'une différence significative entre deux groupes dans un essai. Lorsque plusieurs traitements seront comparés, les essais seront réalisés sur des animaux homogènes (poids vif, sexe et origine génétique) et en bonne santé afin de réduire la variabilité individuelle en début d’essai. La distribution des données sera évaluée selon qu’elles se situent, ou non, dans l’intervalle moyenne ± 2 écarts types afin d’identifier les données aberrantes. Après élimination des données aberrantes, les données zootechniques seront soumises à des analyses de variance avec le traitement expérimental en effet fixe. La mortalité et les évènements sanitaires seront évalués selon des tests d’indépendance. Le niveau de significativité est fixé à P

Raffinement

L’état de santé des animaux sera vérifié quotidiennement par les techniciens animaliers de l’EU. Si un porc présente des signes de stress, ou des douleurs (boiteries, blessures…), alors il sera écarté de l’étude. Des points limites stricts et définis à l’avance sont appliqués tout au long du projet. De plus, le nombre de tentatives de collectes d'échantillons biologiques sera limité et la manipulation des animaux sera restreinte afin de réduire la souffrance ou le stress appliqué à ces animaux.

Choix des espèces

L'espèce choisie pour la réalisation du projet est le porc car les phénomènes physiologiques (digestifs, métaboliques, endocrinologiques) étudiés dans le cadre de ce projet sont hautement spécifiques de l'espèce porcine. De plus, la spécificité des conditions d'élevage de cette espèce de rente ne permet pas de la remplacer par une autre espèce modèle. Enfin, le porc est l’espèce cible des traitements testés. Les animaux utilisés seront des porcelets sevrés âgés de 21 à 70 jours.

12 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis rendus au pâturage. Ils sont placés à l'attache dans des stalles individuelles sur caillebotis pendant deux périodes de six jours, pour mesurer l'ingestion et la digestion de rameaux d'arbres fourragers avec collecte des fèces et des urines. L'objectif est de documenter la valeur nutritive de fourrages issus d'arbres, peu étudiée en Europe. Le porteur affirme que les méthodes in vitro existent pour classer les aliments mais restent "moins fiables" que la mesure sur animal vivant.

Objectifs

Pour réaliser des études fines des mécanismes physiologiques d'ingestion et de la digestion des aliments chez les ruminants , les animaux modèles utilisés sont, ici des moutons castrés. C'est un modèle animal de référence pour établir les valeurs de digestibilité et d’ingestibilité des aliments pour ruminants, et pour comprendre les processus digestifs afin de les modéliser. De par son caractère générique, les résultats qu’il permet d’obtenir sont le plus souvent extrapolables aux autres catégories de ruminants (bovins, caprins, brebis et agneaux).

Bénéfices attendus

La valeur alimentaire des fourrages issus des arbres est peu étudiée ainsi que leur appétence, acceptabilité et l'ingestion par les animaux. Les études scientifiques sur le sujet sont encore peu nombreuses en Europe et portent plutôt sur des zones pastorales ou tropicales. Le manque de références sur la valeur nutritive des essences d’arbre en milieu tempéré constitue un frein pour le développement de leur utilisation. Les résultats obtenus dans ce projet permettront de compléter des études précédentes réalisées sur la valeur alimentaire des feuilles uniquement. Cette expérimentation permettra d'apporter des références et de caractériser la ressource fourragère dans sa globalité à l'échelle du rameau (feuilles, jeunes tiges et brindilles) consommable par les animaux et portera également sur de nouvelles essences d'arbres. Ces données viendront compléter les tables de production des arbres (hors forêt).

Procédures

Au cours de l'expérimentation, les animaux seront soumis à deux périodes de digestibilité d'une durée de 6 jours.

Impact sur les animaux

La procédure de mesure de digestibilité implique une période d’adaptation des animaux à leur régime de 7 jours qui sur un dispositif de case individuelle sur caillboti. Ensuite, les animaux sont installés à l’attache dans des stalles à digestibilité individuelles sur caillebotis en bois, permettant de mesurer les quantités ingérées et de collecter toutes les fèces et urines. Le premier jour de mise en stalle, aucune mesure n’est prévue. Les collectes de fèces et d’urines sont réalisées durant 6 jours, durée indispensable à la précision requise pour la mesure chez le ruminant, compte tenu de la longue durée de résidence des digestas dans le tractus digestif. Toutes les stalles individuelles sont installées dans une même pièce pour limiter l’isolement des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à l'issue de la procédure et conduit en lot au pâturage.

Remplacement

La mesure in vivo de digestibilité est la méthode de référence pour quantifier la digestibilité des fourrages. Des méthodes alternatives (in vitro) existent pour classer différents aliments sur leur digestibilité mais sont moins fiables.

Réduction

Pour la mesure d’ingestibilité puis la digestibilité, la variabilité entre animaux est plus importante pour l'ingestibilité que pour la digestibilité (la variabilité entre animaux de l’ingestibilité est de l’ordre de 9 % alors que celle de la digestibilité est de l’ordre de 3 %), il est recommandé d’utiliser un minimum de 6 animaux. La digestibilité mouton est réalisée classiquement pendant 6 jours, avec 6 moutons nourris ad libitum.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un bâtiment d'élevage éclairé naturellement. Les parcs d'élevage adjacents seront séparés par des barrières en bois à claire-voie permettant un contact visuel entre animaux de différents parcs et diminuant l’angoisse possible liée au cloisonnement. La taille des stalles à digestibilité est adaptée au gabarit de l’animal. Elle lui permet de se lever et de se coucher sans entrave et leur disposition permet aux animaux de se voir et de s’entendre. Les animaux seront préalablement habitués aux stalles pendant la période pré- expérimentale. Les animaux seront alimentés à volonté, deux fois par jour, et disposeront d’eau à volonté et d’une pierre à sel afin d'éviter l'apparition de maladies métaboliques ou de carences. Les fèces et les urines seront récoltées tous les jours dans les bacs situés sous le caillebotis, pesées, et échantillonnées. Les moutons seront suivis tous les jours lors de la distribution de l’alimentation par un animalier habilité, responsable de la mise en oeuvre du protocole.

Choix des espèces

Le mouton castré, de race Texel est un modèle animal de référence pour établir les valeurs de digestibilité et d’ingestibilité des aliments pour ruminants, et pour comprendre les processus digestifs afin de les modéliser. De par son caractère générique, les résultats qu’il permet d’obtenir sont le plus souvent extrapolables aux autres catégories de ruminants (bovins, caprins, brebis et agneaux). Dans ce type d'études l'animal modèle que nous étudions est à l'entretien, sans besoin de croissance, et donc adulte (24 mois et plus). Nos équations de prédictions sont basées sur des animaux adultes sur ce principe si nous voulons extrapoler nos résultats à d'autres modèles animaux.