Procédures légères

511 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, la plupart tuées à l'issue et vingt-sept gardées en vie pour la reproduction. Porteuses d'un modèle de maladie de Charcot, elles reçoivent une injection de vecteur viral dans le cerveau ou la moelle et subissent deux tests moteurs mesurant force et coordination. Le porteur indique que les animaux perdent du poids et de la mobilité, et sont mis à mort avant la paralysie totale des membres. Il affirme que le modèle murin reproduit les traits de la maladie et qu'une approche sur cellules souches humaines est "à ce jour impossible".

Objectifs

La maladie de Charcot ou sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative rare caractérisée par la dégénérescence des motoneurones de la moelle épinière qui innervent les muscles. La perte des motoneurones conduit à la paralysie des membres, puis au décès par détresse respiratoire. Au cours de la progression de la maladie, les premiers motoneurones touchés sont ceux impliqués dans l’effort intense (motoneurones vulnérables) alors que les posturaux résistent à la maladie (motoneurones résistants). Un des enjeux majeurs est de comprendre les mécanismes responsables de la perte sélective des motoneurones. Pour aborder cette question, nous avons séquencé l’ARN des motoneurones impliqués dans la posture et de ceux impliqués dans l’effort bref et intense. A partir des banques d’ARN, nous avons sélectionné un gène dont l’expression est spécifique des motoneurones impliqués dans les efforts musculaires intenses. Ce gène contribue au transfert d’information entre neurones et neurones-muscles : la neurotransmission Sa délétion chez la souris n’induit pas de phénotype locomoteur. La souris modèle de la maladie de Charcot utilisée dans le projet est très bien caractérisée et reproduit les traits cliniques de la pathologie. L’effet de la perte du gène candidat sera évalué sur la progression de la maladie. Ce projet a une pertinence médicale directe en abordant la question de la vulnérabilité et la résistance dans les maladies des motoneurones.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d’explorer de nouvelles pistes thérapeutiques en ciblant les acteurs responsables de la vulnérabilité des motoneurones vis-à-vis de la maliadie de Charcot. Notamment, réduire spécifiquement l’excitabilité des motoneurones est une approche qui permettrait de prolonger et/ou d’améliorer la qualité de vie des patients.

Procédures

Afin de suivre l’évolution des capacités motrices des souris atteintes de la maladie de Charcot, les animaux seront suivis par des tests comportementaux simples, non invasifs, ne nécessitant pas de déprivation de nourriture. Deux tests comportementaux moteurs seront ici utilisés pour définir les capacités motrices et les propriétés de coordination motrice. Chaque test prend moins de 5 min par souris. Notre étudions l’expression de gènes candidats participant au processus de dysfonctionnement des neurones moteurs. A cette fin, une préparation des tissus est nécessaire avant de procéder à la biopsie. Nous procédons donc à une perfusion intra-cardiaque sur des animaux anesthésiés ayant reçu une dose léthale d’anesthésique/analgésique chimique. Cette procédure prend moins de 5 min par animal. Les souriceaux recevront une seule injection de vecteur viral en intracerébroventriculaire et les souris agées de 30 jours recevront une seule injection virale en intrathécal.

Impact sur les animaux

Le modèle rongeur de la maladie de Charcot que nous utilisons récapitule les principaux traits de la pathologie humaine et a fait l’objet de nombreuses études nous permettant de connaître très précisément leur tableau clinique. Les nuisances attendues sont une perte de poids, une mobilité réduite .Les animaux sont euthanasiés avant la paralysie totale des membres (quand le temps de retourment de l'animal mis sur le dos est supérieur à 15 secondes) et donc avant la détresse respiratoire (qui n'a jamais été observée dans le modèle rongeur).

Devenir

27 animaux seront en utilisation continue pour la reproduction. Tous les autres seront euthanasiés pour répondre à deux nécessités du projet : 1) prélever des tissus afin d’étudier des paramètres histologiques. 2) l’autre nécessité est liée à la pathologie elle-même, qui est fatale chez l’homme et également dans le modèle murin de la maladie de Charcot utilisé ici, et rentre dans le cadre de l’étude de l’approche thérapeutique sur l’espérance de vie des souris qui auront reçu ou non le traitement.

Remplacement

Le modèle murin de la maladie de Charcot mime l’ensemble des traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques de la maladie humaine et la validation fonctionnelle et le protocole thérapeutique pré-clinique que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles animaux de la maladie. De même notre stratégie ciblée sur les sous population de motoneurones spinaux est à ce jour impossible sur des cellules souches humaines pluripotentes induites, car ce modèle in vitro ne permet pas de reproduire la diversité fonctionelle électrique et synaptique des populations de motoneurones de la moelle épinière.

Réduction

Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes d’animaux. Nous suivons donc un traitement statistique qui permet de réduire le nombre d’animaux et limiter les faux-positifs. Pour les cohortes de suivi de la progression de la maladie : N= 24 souris par condition (12 males et 12 femelles). Pour les analyses histopathologiques, N = 8 souris par condition (4 males et 4 femelles) .

Raffinement

Une connaissance extensive du modèle murin de la maladie de Charcot permet de connaître et donc anticiper les différentes étapes de la maladie et donc de normaliser le suivi des animaux. Une surveillance régulière est mise en place et assurée par les expérimentateurs et nous travaillons étroitement avec la structure du bien-être animal. L’enrichissement du milieu avec des copeaux dans les litières, igloo, PVC et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à fournir un environnement non stressant propice au repos. Les points limites sont définis par le suivi régulier du poids des souris et leur capacité à effectuer une tache motrice reflexe simple. Un arbre décisionnel spécifique est défini et suivi par les expérimentateurs associés au projet. De plus une surveillance visuelle quotidienne est effectuée par les zootechniciens. Toute anomalie indépendante de la pathologie comme des signes d’angoisse, de détresse ou de douleur est signalée afin d’apporter une réponse rapide et adaptée. Une grille d’évaluation définie par la structure du bien-être animal nous permet de suivre les animaux ainsi identifiés et de prendre rapidement des mesures adaptées.

Choix des espèces

La lignée de souris transgénique modèle de la maladie de Charcot qui est utilisée dans ce projet récapitule la progression rapide de la pathologie, ce qui est le plus souvent observée en clinique. De plus ce modèle reproduit les traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques spécifiques de la maladie, à savoir la perte précoce des motoneurones impliqués dans les efforts musculaires intenses. Nous avons identifié un gène marqueur des motoneurones vulnérables dans la maladie de Charcot et qui pourrait intervenir dans les fonctions d’effort musculaire. Nous allons induire la perte de fonction de ce gène chez la souris modèle de la maladie de Charcot et suivre l’effet sur la progression de la maladie. Les cohortes utilisées pour l’analyse de la progression de la maladie sont suivies à différentes étapes de la maladie (non symptomatique, début de la maladie et symtomatique) jusqu’au point limite défini pour ce modèle de la maladie de Charcot (environ 4.5 mois pour des animaux sans traitement).

700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris transgéniques modèles de maladie d'Alzheimer reçoivent une injection intracérébrale unique sous anesthésie, avec un risque d'hypothermie, d'arrêt cardio-respiratoire ou de douleurs post-opératoires. Une partie est tuée pour prélever le cerveau, l'autre tuée sans prélèvement pour l'entretien de la colonie. Le porteur cherche à savoir si moduler les lysosomes prévient la perte de neurones et affirme qu'aucune méthode autre que le modèle animal ne permet d'étudier cette dégénérescence.

Objectifs

Au cours de la maladie d’Alzheimer (MA), des pertes de neurones et de synapses se produisent dans des régions particulières du cerveau. Ces pertes sont bien corrélées à l’intensité des troubles cognitifs caractérisant la maladie. Cependant, le mécanisme des pertes neuronales reste mal connu. Des études ont montré une altération des lysosomes, de petits organelles intraneuronaux chargés de la dégradation des protéines. Notre objectif est de déterminer si les pertes de synapses dans la MA pourraient être dues à cette altération des lysosomes. Pour cela nous allons déterminer si des traitements modifiant le fonctionnement des lysosomes permettent de prévenir les pertes de neurones et de synapses dans un modèle murin de MA.

Bénéfices attendus

Les mécanismes des pertes de neurones et de synapses dans la maladie d'Alzheimer (MA) sont encore très mal connus, et ce projet a pour objectif de tester un mécanisme qui pourrait orienter vers une thérapeutique. En effet, ces études permettront de déterminer si une modulation du fonctionnement lysosomal est une cible thérapeutique envisageable contre la MA.

Procédures

Un élevage de souris transgéniques modèles de maladie d'Alzheimer présentant des pertes de neurones et de synapses sera effectué. Les souris auront une chirurgie consistant en une injection intracérébrale unique sous anesthésie générale, après avoir reçu l’injection en sous-cutanée d’un analgésique. L'analgésique sera également injecté en post-opératoire. Cette procédure durera une heure. Les souris seront euthanasiées en fin de période de maintien pour prélèvement et analyses.

Impact sur les animaux

Les souris APPxPS1-KI développent spontanément une pathologie neurodégénérative avec l'âge, mais elles seront euthanasiées avant l'apparition d'un phénotype dommageable. La contention des souris pour l'injection d'un analgésique avant et après la chirurgie ou avant l'euthanasie peut entraîner peur et stress. La chirurgie effectuée sous anesthésie générale comporte des risques associés à l'anesthésie (hypothermie, arrêt cardio-respiratoire). De plus, les souris pourraient souffrir de douleurs post-opératoires suite à la chirurgie.

Devenir

Une partie des animaux sera euthanasiée pour prélèvement du cerveau et analyses, et l'autre partie euthanasiée sans prélèvement (maintien de la colonie).

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet ces modèles animaux sont les seuls à permettre d’étudier la perte progressive de neurones et synapses adultes se produisant dans la maladie d’Alzheimer.

Réduction

Les 700 souris générées permettent (1) de renouveler les reproducteurs, (2) de réaliser les injections intracérébrales, et (3) de réaliser des analyses ne nécessitant pas de procédure expérimentale mais seulement la collecte de tissus après une procédure d’euthanasie. Le nombre d’animaux utilisés pour les injections intracérébrales (280) est réduit au maximum, la taille des groupes d’animaux ayant été établie pour obtenir une puissance statistique suffisante. Il sera en effet nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les méthodes sont choisies pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse : (i) les souris ont à disposition, comme élément d’enrichissement, des composants de nidification et des batonnets ; (ii) une surveillance quotidienne des paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie) est réalisée ; (iii) une surveillance quotidienne des animaux est effectuée, afin de détecter un état de stress ou de douleur. En cas de blessure, de pathologie, d’hypoactivité et de mouvement anormal, l’avis du vétérinaire sera demandé, et s'il le recommande les animaux seront euthanasiés afin d’éviter toute souffrance. Les souris sont anesthésiées durant la chirurgue, et nous administrons un antalgique en pré- et postopératoire pour éviter les douleurs post-opératoires suite à l’injection intracérébrale.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris transgéniques, modèle murin de maladie d'Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèles autres que les souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs du projet. Les injections intracérébrales seront effectuées à 3 mois, avant que les pertes de neurones et de synapses ne soient observées chez les souris, et leurs effets seront analysés 3 mois après injection, quand ces pertes sont significatives. Les géniteurs seront utilisés entre 2 et 8 mois d'âge, période optimale pour la reproduction des souris.

635 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la plupart tués (565), une partie réutilisée (60) et quelques individus transférés vers un élevage ou une association. Les femelles subissent une superovulation par sept injections d'hormones en quatre jours et des transferts d'embryons sous anesthésie avec interruption de gestation, les adultes des biopsies de peau et prises de sang. Le projet produit des embryons pour en cultiver les cellules souches et étudier leur capacité à coloniser un embryon hôte. Le porteur affirme impossible de remplacer la production d'embryons de lapin et présente la superovulation comme un moyen de réduire le nombre de femelles utilisées.

Objectifs

Les cellules de l’embryon très précoce ont une propriété unique, à savoir la capacité de produire tous les types de cellules d'un organisme adulte. Cette propriété peut être étudiée en injectant les cellules embryonnaires dans des embryons hôtes pour créer des chimères, c’est-à-dire des embryons constitués de cellules de deux origines différentes. Notre projet vise à comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires qui régissent la capacité des cellules embryonaires à produire des embryons chimères chez le lapin. Ce projet nécessite l’utilisation de nombreux embryons et par conséquent de nombreuses lapines superovulées. Le lapin est ainsi choisi comme espèce modèle, d’une part pour sa capacité à produire de grandes quantités d’embryons, et d’autre part pour les caractéristiques communes de son développement embryonnaire avec celui de l’Homme.

Bénéfices attendus

Les cellules de l’embryon précoce représentent un outil extraordinaire à la fois pour la recherche fondamentale et la recherche appliquée, aussi bien en médecine humaine que vétérinaire, grâce à leur capacité à produire tous les types de cellules d'un organisme adulte. Les connaissances fonctionnelles acquises sur les cellules de lapin permettront d’améliorer les conditions d’utilisation des cellules humaines dans le cadre de thérapies cellulaires de maladies dégénératives. Elles permettront également de créer des modèles de maladies humaines, de thérapies cellulaires ou de développement embryonnaire.

Procédures

Trois types d’interventions sont prévues : 1. Prélèvements de peaux et de sang sur animaux vigiles adultes avec anesthésie locale : une fois par animal, durée de l'expérimentation 10 minutes (40 minutes avec le temps d'action de la pommade anesthésiante), 5 mâles et 5 femelles. 2. Traitement de superovulation sur lapines : une fois par lapine, 7 injections d’hormones sur 4 jours, 411 femelle. 3.Transferts embryonnaires sur lapines anesthésiées : 1 fois par lapine, durée de l'opération 1h15 jusqu'au réveil, 214 lapines prévues.

Impact sur les animaux

Les lapines subiront de courts désagréments liés aux injections d’hormones ou de produits anesthésiants. Elles éprouveront un léger stress lors de la réalisation d’inséminations artificielles et de faibles douleurs lors des chirurgies de transfert embryonnaire. Les lapins sentiront aussi un léger stress et une faible douleur lors de la réalisation de biopsies au niveau des oreilles.

Devenir

La plupart des procédures nécessitera la mise à mort des animaux (lapines productrices d'embryons et lapines receveuses d’embryons avec interruption des gestations). Les animaux adultes utilisés pour des prélèvements de peau et de sang seront réutilisés : les mâles pour fournir du sperme pour les reproductions et les femelles pour produire des embryons. Les femelles ayant subi un transfert embryonnaire avec un développement à terme pourront être réutilisées pour des productions d'embryons. Les mâles inféconds seront proposés à l'association GRAAL.

Remplacement

Du fait de la nature intrinsèque du projet, à savoir la compréhension de la capacité des cellules embryonnaires à créer des embryons chimères, il est impossible de remplacer la production d’embryons de lapin. Ces embryons seront utilisés pour mettre leurs cellules en culture ou pour tester les propriétés de celles-ci. Cependant, une fois les cellules embryonnaires en culture, différents tests cellulaires et moléculaires permettront de définir la qualité de ces cellules, afin d’étudier in vivo, uniquement celles montrant un réel potentiel à produire des embryons chimères.

Réduction

Le recourt aux superovulations permettra de diminuer d’un tiers le nombre de lapines utilisées pour produire les embryons, avec 20 à 30 embryons obtenus en moyenne par femelle au lieu de 8 à 12. De plus, nous utiliserons pour produire et transplanter des embryons, des lapines ayant déjà donner naissance à des lapereaux, dont on connait ainsi le potentiel reproducteur, afin d’éviter d’employer des lapines stériles. Le nombre d’embryons nécessaire pour les tests de colonisation embryonnaire (50 embryons par lignée cellulaire) a été choisi pour pouvoir valider les résultats d’un point de vue statistique et assurer la pertinence de l’effet biologique, à savoir l’existence d’une réelle différence dans les taux de colonisation entre cellules testées et cellules contrôles. De plus, ces tests seront progressifs avec un arrêt du développement des embryons injectés à 4, 6 ou 10 jours et une évaluation du niveau de colonisation obtenu, afin de ne poursuivre les analyses que des lignées cellulaires présentant de forts potentiels de colonisation embryonnaire et donc limiter au maximum le nombre de lapines utilisées.

Raffinement

Les animaux seront nourris deux fois par jour, avec le matin une dose de croquette appropriée à leur état et leur âge et une grosse poignée de foin et avec l'après-midi des légumes frais (choux, salade, persil, carottes, radis...). Les lapins seront surveillés tous les jours par des animaliers qualifiés, et régulièrement placés pendant 24h à 48h dans une aire de récréation de 1,2 m2 comportant du foin, différents jouets (bâton à mâcher, balle, chaîne pendue) et objets pour se cacher (carton, banc, tunnel) et leur permettant de courir et de bouger plus facilement. Le choix des animaux à placer en récréation dépendra du temps qu’ils resteront à l’animalerie, les mâles étant prioritaires car ils seront gardés environ 2 ans, ainsi que les femelles receveuses et/ou gestantes qui seront sur places pendant un à deux mois.

Choix des espèces

Le but de notre projet étant de comprendre les mécanismes qui permettent aux cellules de l’embryon très précoce de coloniser un embryon hôte et de donner toutes les cellules composant un organisme adulte, le lapin est un animal modèle intéressant à plusieurs titres. Il présente de nombreux avantages en élevage, tels que sa taille moyenne, sa prolificité, son intervalle de génération court et sa forte production embryonnaire. De plus, le lapin est plus apparenté aux primates que ne l’est la souris, et présente un développement embryonnaire et un mode d’implantation dans la muqueuse utérine identiques à ceux des primates. Ainsi les cellules de l’embryon très précoce de lapin permettraient de développer différents modèles d’étude de maladies humaines, de thérapie cellulaire ou de développement embryonnaire. Tous les animaux seront utilisés en âge de reproduction, soit entre 5 et 30 mois pour les mâles et entre 9 et 36 mois pour les femelles ayant déjà eu une mise-bas.

1 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent du tamoxifène par voie intrapéritonéale cinq jours durant, des vecteurs viraux insérant des gènes, des chirurgies crâniennes sous anesthésie, puis sont fixées environ une heure, vigiles, pour des enregistrements électrophysiologiques pendant des stimulations. Le porteur mentionne des complications rares comme infections, douleurs chroniques ou baisse de température, et tue toutes les souris pour des prélèvements post-mortem. Cette recherche fondamentale sur les circuits du cortex vise à éclairer des maladies comme la schizophrénie ou l'autisme, le porteur affirmant qu'aucune lignée cellulaire ne reproduit la physiologie des neurones.

Objectifs

Les déficits cellulaires, les connexions et les circuits du cerveau sont responsables de nombreuses maladies graves telles que l'épilepsie, la schizophrénie, l'autisme et la dépression. Le cortex cérébral, qui est la partie du cerveau responsable des fonctions cognitives complexes, intègre les informations sensorielles. Cela se fait grâce à des interactions précises entre différents types de cellules du cerveau. Notre projet de recherche vise à comprendre comment ces cellules du cortex cérébral se connectent les unes aux autres et comment ces connexions contribuent aux changements dans le fonctionnement du cerveau, qui sont perturbés dans les maladies cérébrales. Nous nous concentrons en particulier sur une couche spécifique du cortex appelée couche superficielle 1 (L1), qui joue un rôle clé dans l'intégration des informations sensorielles et contextuelles. Les cellules spécifiques de cette couche, appelées interneurones L1, ont différentes caractéristiques structurelles et fonctionnelles. Cependant, nous ne savons pas encore comment ces différentes populations de cellules interneuronales contribuent à l'intégration des informations contextuelles avec les stimuli sensoriels. Nous avons découvert que de nombreux neurones de la couche L1 expriment un récepteur appelé récepteur cannabinoïde de type 1 (CB1), qui joue un rôle important dans les changements des connexions inhibitrices entre les cellules du cerveau. Ces changements pourraient avoir un rôle clé dans la transmission des informations contextuelles vers la couche L1 lors du traitement sensoriel. Nous supposons que les sous-groupes de neurones CB1-positifs et CB1-négatifs dans la couche L1 sont activés de manière différente par des informations contextuelles provenant de différentes voies du cerveau, ce qui influence la flexibilité du traitement sensoriel. Notre projet se concentre sur le cortex visuel des souris. Nous espérons que cette recherche nous aidera à mieux comprendre les mécanismes spécifiques des circuits neuronaux impliqués dans la perception sensorielle, ce qui pourrait conduire au développement de nouvelles thérapies pour le traitement des maladies cérébrales.

Bénéfices attendus

Les maladies du cerveau ont un impact important sur la santé, l'autonomie, l'éducation, l'emploi, la mobilité et les relations personnelles des individus, ce qui représente un fardeau considérable sur le plan social et économique. Il est crucial de comprendre les caractéristiques de base qui régissent les connexions entre les différents types de neurones dans le cerveau, tant dans des états normaux que pathologiques. En particulier, les problèmes liés au développement des circuits inhibiteurs du cortex cérébral sont impliqués dans des troubles neurologiques tels que la schizophrénie, la dépression et l'autisme. Cependant, nous avons encore beaucoup à apprendre sur l'organisation des microcircuits inhibiteurs, notamment dans la couche L1, aussi bien dans des conditions normales que dans des troubles. Nous espérons que ces études nous aideront à découvrir de nouvelles approches thérapeutiques pour ces maladies. En utilisant des souris génétiquement modifiées, nous pourrons cibler des types spécifiques de cellules et de réseaux, ce qui nous permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques des maladies du cerveau.

Procédures

Toutes les souris seront injectées avec du tamofixen par voie intrapéritonéale (IP) au stade adulte (3 min/animal) pendant 5 jours. Une partie des souris transgéniques recevra une insertion de gènes au stade adulte en utilisant des vecteurs viraux. Toutes les souris seront recevront un traitement anti-douleur (3 min/animal). Les souris sont anesthésiées pour les chirurgies (30-40 min/animal). Une autre partie des souris recevra une insertion de gènes en utilisant des vecteurs viraux couplé à un système qui permettra soit l’imagerie soit les enregistrement électrophysiologiques (40 à 60 min /animal). Pour les enregistrements en électrophysiologie, les souris seront préparées sous anesthésie (pendant 15 min) puis réveillées pour être vigiles au moment des stimulations qui engendrent des activités neuronales, sujets de nos études. Les enregistrements nécessitent la fixation de l’animal pendant environ 1h, des séances d’habituation sont prévues pour préparer l’animal (1h). Toutes les souris seront injectées avec une injection d’un anti-inflammatoire par voie sous-cutanée (3 min/animal) et anti-douleur (3 min/animal), 30 min après seront anesthésiées pendant toute la durée de la chirurgie (30-40 min/animal). Une autre partie de souris transgéniques adultes subiront insertion de gènes par vecteurs viraux, et couplé à un système qui permettra soit l’imagerie soit les enregistrement électrophysiologiques. Toutes les souris seront injectées avec une injection d’un anti-inflammatoire par voie sous-cutanée (3 min/animal) et anti-douleur (3 min/animal), 30 min après seront anesthésiées pendant toute la durée de la chirurgie (30-40 min/animal). Pour les enregistrements électrophysiologiques, le jour de l'expérience, les souris seront brièvement anesthésiées (15 min/animal) et une électrode à haute densité sera descendu pour permettre l'enregistrement électrophysiologique. Le jour de l’euthanasie tous les souris seront injectées avec l’analgésique (3 min/animal) 10 min avant l’euthanasie (3 min/animal).

Impact sur les animaux

Le génotype des souris que nous utilisons n'a pas été associé à des effets indésirables connus sur les animaux. En général, nos interventions sont bien tolérées par les souris et n'affectent pas leur apparence ou leur comportement général. Cependant, il peut arriver très rarement que certaines complications se produisent, telles que des infections, des douleurs chroniques (visibles par une prostration, un mauvais ou un manque de toilette, une posture voutée), des saignements pendant les chirurgies ou une baisse de température pendant la procédure. Bien que beaucoup plus rares, il est également possible que les fils utilisés lors des chirurgies se détachent. L'injection intrapéritonéale de tamoxifène doit être réalisée sur une période de 5 jours. Ces injections sur 5 jours peuvent provoquer un certain stress lié à la manipulation de l'animal et des réactions locales possibles. Il est possible que l'administration d'injections pendant 5 jours consécutifs entraîne une légère perte de poids chez l'animal. Cependant, dans les heures qui suivent la chirurgie, il est possible que l'animal présente une réduction de l'activité spontanée. L'expérience de stimulation visuelle nécessite que l'animal soit éveillé et maintenu immobile, tandis que plusieurs essais de stimulations visuelles lui sont présentés. Cela nécessite une période d'adaptation à l'environnement d'enregistrement. Lors des deux premières séances, les animaux peuvent présenter des signes de stress tels que la présence de déjections sur le tapis roulant circulaire. Cependant, ces signes diminuent au fur et à mesure des séances à mesure que l'animal s'habitue à son environnement. Il est important de surveiller attentivement les souris tout au long de ces procédures et de signaler tout problème ou changement anormal à l'équipe de recherche.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasies en fin d’experience. Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Il n’y a pas d’autres alternatives à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car des modèles adéquats du circuit cortical contenant le nombre, les types et la localisation appropriés de récepteurs dans les réseaux excitateurs et inhibiteurs ne sont pas disponibles. L'objectif de nos expériences est de découvrir les actions des gènes, des neuromodulateurs et des médicaments sur les circuits neuronaux dans le cerveau intact. Il s'agit d'une question empirique qui nécessite l'examen de circuits intacts pour y répondre. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie des neurones des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact, De plus, il n'existe aucun modèle remplaçant l'utilisation d'animaux qui permettrait d'étudier les propriétés du reseau dans le cerveau entier d’un animal vigile.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (n = 1650) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal : les animaux recevront les injections virales seront implantés pour l'électrophysiologie ou l’imagerie simultanément afin de maximiser les mesures longitudinales multiples sur le même animal. Toutefois, les avantages de la réutilisation des animaux seront mis en balance avec les effets négatifs sur leur bien-être, en tenant compte du cumul sur toute une vie de l'animal. En outre, notre expertise dans l'entraînement des souris à être fixé par la tête dans l'installation d'imagerie ou d'électrophysiologie réduira également la variabilité et, dans une large mesure, les nombres globaux nécessaires pour obtenir une signification statistique dans les cohortes. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille de chaque groupe sera déterminée par l'utilisation de tests statistiques appropriés, y compris le calcul de puissance. La taille réelle de l'échantillon, et donc la signification statistique, dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Des mesures telles que la formation du personnel, l'habituation, l'acclimatation et le temps de récupération sont prises pour réduire tout impact physique et psychologique potentiel des procédures expérimentales. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton, kraft et maisonnettes) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. La préférence pour les procédures non invasives par rapport aux procédures invasives est prise en considération et, lorsque des interventions invasives sont nécessaires, les directives appropriées en matière d'anesthésie/analgésie seront suivies, auprès du comité interne de l'institution, chargé de la prise en charge du Bien-être animal (strutucture chargée du bien-etre animal) . Les animaux auront à manger et à boire à volonté. Des croquettes adaptées à la gestation et à l’allaitement seront mise à disposition pour les animaux en accouplement. Des points limites sont mis en place et sont respectés pour limiter toute souffrance aux souris utilisées

Choix des espèces

Les propriétés de base des microcircuits neuronaux chez la souris sont similaires à celles d’autres mammifères. Actuellement seulement les modeles murins nous permettent de visualiser les types d’interneurones que nous voulons étudier. Les approches expérimentales multiples réalisées chez la souris permettent une analyse complète allant du comportement jusqu’à l’activité d’un seul neurone. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. De plus, chez la souris, la période de gestation est courte et les portées sont importantes, permettant de produire suffisamment d’animaux pour plusieurs expériences à partir de peu de fondateurs. Le développement du cerveau est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Nous maitrisons suffisamment les techniques proposées dans ce projet pour réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour nos expériences. Les lignees que nous utiliserons ne présentent pas de phenotype dommageable. Des animaux adultes seront utilisés pour toutes les procédures (entre P35 et P150). Toutes les procédures nécessitent des interventions chirurgicales qui ne peuvent être pratiquées que sur des animaux adultes. Nos animaux sont identifiables par tatouage des phalanges et un petit prélèvement de l’extrémité de la queue est nécessaire à leur génotypage.

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur induit une maladie d'Alzheimer par injection intracérébrale d'un peptide amyloïde, administre une molécule chaque jour par voie intrapéritonéale, puis évalue la mémoire par le labyrinthe en Y, le test d'évitement passif avec un stimulus aux pattes, la reconnaissance du nouvel objet et le test du Hamlet. Toutes les souris sont ensuite tuées pour des analyses biochimiques post-mortem. Le porteur affirme le modèle murin "indispensable" et "seul recours in vivo" pour observer l'effet de la molécule sur la mémoire.

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer l'effet de la Fluoroethylnormemantine (FENM) à long terme sur des modèles de rongeurs de la maladie d'Alzheimer (MA). Une étude préliminaire a démontré l'efficacité supérieure de la FENM en comparaison de la Mémantine (médicament utilisé pour la prise en charge des patients atteints par la MA). Cependant l'effet de la Mémantine est connu pour son manque d'éfficacité dans le temps et ses nombreux effets secondaires. C'est pourquoi la FENM a été testée en comparaison de la Mémantine dans un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer sur 2 mois de traitement. Contrairement à la Mémantine où après 1 mois de traitement son efficacité est nulle, la FENM maintient le processus de mémorisation des animaux traités et cela même après un arrêt de traitement. Afin de compléter ses résultats et dans l'objectif d'un développement clinique de la molécule, la FENM sera administrée sur deux modèles de rongeurs de la MA après un traitement à la mémantine pour juger de sa supériorité dans le temps par rapport au médicament de référence. De plus l'efficacité de la FENM sera évaluée après un traitement à long terme dans un milieu reproduisant les comportements naturels des animaux afin cette fois-ci d'évaluer la mémoire spatiale et topographique des animaux (mémoire faisant appel à notre orientation dans un environnement) des animaux, expérience jamais encore étudiée.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de préciser les effets pharmacologiques "in vivo" à long terme d'une molécule neuroprotectrice très efficace sur les modèles précliniques de la maladie d'Alzheimer. Ces informations apporteront des précisions importante quant au futur développement clinique de cette molécule de nouvelle génération.

Procédures

3 procédures au sein de ce projet concerneront une administration d'un peptide, ou de l'eau distillée, dans le ventricule droit des animaux par injection intra-cerébro-ventriculaire (ICV). Cette procédure sous anesthésie générale ne dure pas plus d'une minute, et se réalise une seule fois sur les animaux en début de procédure. Pour les tests de comportement, le labyrinthe en Y (8 min) (procédures 1-4), le test d'évitement passif (2 fois 5 min), le test du nouvel objet (3 fois 10 min) (procédures 1 à 3) et le test du Hamlet (2 semaines d’entrainement à 4h/jour pendant 10 jours et 2 fois 10 min pour le probe test (test de mémoire topographique, procédure 4 seulement)) seront réalisés au cours des procédures. Lors de l'apprentissage dans le test d'évitement passif les animaux reçoivent un stimulus non douloureux au niveau des pattes. Toute variation importante de la sensibilité aux stimulus conduit à l'arrêt de la procédure. Afin de traiter ces animaux, une injection intrapéritonéale quotidienne (tous les jours, 24h d'intervalle) sera réalisée sur la durée de la procédure expérimentale (ne dépassant pas 2 mois). En fin d'expérience les animauxseront euthanasiés et les échantillons seront prélevés pour analyses biochimiques.

Impact sur les animaux

Concernant le modèle pharmacologique induit par l'injection intra-cérébro-ventriculaire de peptide amyloide, la procédure d'injection peut induire du stress chez l'animal. Les animaux utilisés subiront deux autres types de stress modéré : une injection intrapéritonéale quotidienne et, un test d'évitement passif permettant d'évaluer la mémoire à long terme. Pour cela, un léger stimulus non douloureux sera produit au niveau des pattes de la souris. Les effets attendus sont un retardement des effets néfastes de la MA notamment sur les différents types de mémoires (court terme, long terme, spatiale et orientation dans un environnement soit topographique) sans effet secondaire.

Devenir

A la fin de chaque procédures les animaux seront euthanasiés afin de recupérer le matériel biologique permettant des analyses biochimiques post-mortem.

Remplacement

Afin de déterminer l'efficacité de la FENM, les tests doivent se faire « in vivo » en vue d’un éventuel développement clinique. De plus, l’utilisation de modèles murins de la MA pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques de la MA. Les approches in silico ou in vitro ou ex vivo ne permettent pas d’étudier l’effet de la molécule FENM sur le comportement des animaux notamment sur la mémoire spatiale de travail ou mémoire topographique ou de reconnaissance. Il est aussi impossible de voir les potentiels effets indésirables de la molécule. A ce jour, afin d’envisager un développement clinique aucune autre alternative que l’animal ne peut être envisagé.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux les doses administrées aux animaux se baseront sur les doses efficaces observées sur un modèle aigu de la MA précédemment obtenus au laboratoire. Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe) sauf pour l'une des procédure où nous pensons reproduire les résultats obtenus précédemment sur un fond génétique différent . Pour cela 6 souris/groupe sont nécessaires à l'étude. Une veille bibliographique sera également prise en compte tout au long du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de concentrer un maximum d’échantillons et éviter ainsi de relancer des expérimentations.

Raffinement

De la naissance jusqu’à la fin de vie des animaux les procédures d’injections seront peu douloureuses avec une administration par voie intra-péritonéale. Pour les injections intra-cérébro-ventriculaires, une injection d'analgésique sera administrée afin de palier la douleur. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. Afin de suivre les animaux une feuille de bien-être, avec des points limites sera accessible à l’animalerie et complété par l’expérimentateur lorsque tout comportement suspect (plaie, lésions cutanées, agressivité, stéréotypie, apathie, convulsions, …) sera remarqué par celui-ci. Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des copeaux de coton et des bâtons en bois et des cabanes en carton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid.

Choix des espèces

Le modèle souris est adapté aux protocoles comportementaux et déja utilisé dans les expériences antérieures au laboratoire. Les doses et mode d'administration sont donc connus. Les animaux seront étudiés à l'âge de 5 semaines qui correspond à l'âge adulte pour le modèle pharmacologique et aussi à partir de l'âge de 4 mois, âge auxquels les symptômes de la MA apparaissent dans le modèle transgénique.

225 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, réutilisés d'une étude à l'autre (210) ou proposés à l'adoption (15), et tués si aucune réutilisation n'est possible. Le porteur induit chez eux une dermatite par contact avec un allergène, puis enchaîne prélèvements sanguins jusqu'à sept fois par jour, aspirations à l'aiguille fine et biopsies cutanées, jusqu'à vingt-et-une par procédure. Il reconnaît des risques de mauvaise cicatrisation et d'infection sur les sites de biopsie. Ce modèle réglementaire sert à tester des candidats médicaments contre la dermatite atopique canine, une mise au point que le porteur juge "indispensable" sur l'espèce cible.

Objectifs

Il s’agit d'un modèle représentatif de la dermatite atopique. La prévalence est estimée de 10 à 15% avec potentiellement 15 à 20 millions de chiens affectés en Europe et aux Etats-Unis. C’est une maladie inflammatoire et prurigineuse de la peau caractérisée par une implication de la voie immunitaire du Th2. Elle engendre de nombreux signes cliniques. Des surinfections bactériennes et fongiques peuvent apparaitre. La qualité de vie du chien est altérée. La dermatite atopique canine étant une maladie multifactorielle, le traitement est complexe. Une grande variabilité dans la réponse au traitement est observée et les thérapies doivent être adaptées au cas par cas. La gestion des surinfections associées est souvent un échec. Afin de travailler sur l’efficacité des médicaments, il est nécessaire d’établir un modèle de dermatite atopique canine. Les modèles existants présentent de nombreuses limites et une grande variabilité, et on observe une absence de réponses à certains thérapeutiques comme la cyclosporine. L’établissement d’un modèle de dermatite canine sera une étape importante pour évaluer l’efficacité de candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont : A court terme, la mise au point d’un modèle de dermatite peu invasif et reproductible chez l’espèce cible (chien), permettra d’induire un processus inflammatoire similaire à celui à l’œuvre dans la dermatite atopique canine. Ce modèle permettra d’investiguer de nouveaux candidats médicaments. Par la suite, l’évaluation et l’obtention de nouveaux médicaments et thérapies permettront une prise en charge plus efficace des dermatites atopiques canine afin d’améliorer la santé et la qualité de vie des chiens atteints.

Procédures

- prélèvement sanguin, jusqu’à 7 fois par jour puis régulièrement - aspiration à l’aiguille fine, jusqu’à 8 fois par mois - biopsies punch, pas plus de 3 sites collectés par temps de prélèvement. Jusqu’à 4 fois par mois, jusqu’à 7 fois par procédure - examen clinique, selon le protocole et l’état général des animaux, environ 4 fois par mois ou plus si l’état de l’animal le justifie - température, fréquence définie selon le protocole et l’état général des animaux - pesée, fréquence selon l’âge, le statut physiologique et l’état corporel des animaux - Sensibilisation avec mise en contact de l'allergène suivi ou non d'une épreuve. L'épreuve est caractérisée par une ou plusieurs applications de l'allergène sur les régions préalablement sensibilisées ou sur d'autres régions du corps - Administration d’un candidat médicament ou d’un produit contrôle, selon les modalités définies Avec anesthésie ou sédation obligatoire : - biopsies au bistouri, pas plus de 3 sites collectés par temps de prélèvement. Jusqu’à 4 fois par mois, jusqu’à 7 fois par procédure Un maximum de 21 biopsies au total peut être réalisé sur une procédure.

Impact sur les animaux

Des nuisances seront engendrées par les actes techniques durant les études : tonte, biopsies, prises de sang, applications locales répétées, contention, éventuelles anesthésies ou injections d’analgésiques, administration de candidats médicaments, prises de température. La durée de chaque étude de mise en place du modèle est évaluée à en moyenne 3 mois (une durée maximale de 16 semaines pour la combinaison des phases de sensibilisation, latence et épreuve, et de 12 semaines pour la phase de suivi sera acceptée). Des périodes de wash-out suffisantes (plusieurs semaines) seront laissées avant nouvelle utilisation de l’animal. L’état général de l’animal sera évalué par un vétérinaire avant inclusion dans une nouvelle étude. Les biopsies s’accompagnent en outre d’un risque de mauvaise cicatrisation, ou d’infection (rupture de l’intégrité cutanée). Les sites de biopsie doivent être entièrement cicatrisés avant le passage en étude d'évaluation de l'efficacité de candidats médicaments, ou avant que l’animal participe à une nouvelle étude de mise en place d'un modèle de dermatite. Les anesthésies présentent un risque même chez les animaux sains. Les nuisances générées seront aussi celles présentes dans les dermatites, à savoir : - Inflammation (rougeur, chaleur, douleur, gonflement) - Risque de surinfections cutanées (bactériennes ou fongiques) - Prurit La dermatite générée est de durée limitée dans le temps. A titre indicatif, dans le cadre du modèle HDM, la peau redevient macroscopiquement et histologiquement semblable à ce qu’elle était avant administration en quelques jours à plusieurs semaines. Ainsi, pour les chiens inclus dans la procédure d'évaluation de l'efficacité de candidats médicaments, plusieurs phases de sensibilisation et/ou épreuve pourront être réalisées afin d’étudier les candidats. Il n’est pas attendu d’effets secondaires liés aux candidats médicaments, sur la base d’études préliminaires d’innocuité et de tolérance et des données disponibles chez d’autres espèces.

Devenir

Les animaux ne sont pas euthanasiés en fin d’étude mais réutilisés ou adoptés. Si aucune réutilisation /adoption n'est possible (animaux trop âgés), les animaux seront euthanasiés par injection de Dolethal par voie intracardiaque sous anesthésie.

Remplacement

La dermatite atopique canine est une maladie complexe et multifactorielle, résultant d’interactions entre prédisposition génétique, facteurs environnementaux, altération et de la barrière cutanée et phénomènes immuns. La mise au point d’un modèle in vivo s’avère indispensable, afin d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments (pré-requis réglementaire : données d’efficacité et de sécurité sur espèce cible). Les molécules retenues pour développer le modèle auront été évaluées en premier lieu in vitro ou in vivo (généralement, sur modèles murins). L’inflammation provoquée par ces molécules est bien caractérisée, les expérimentations ont été répétées et ont montré des résultats fiables et reproductibles chez les souris. La capacité de ces molécules à engendrer une réponse Th2, avec nombreux changements caractéristiques de la dermatite atopique, a été démontrée. Ces modèles murins ont permis d’étudier la dermatite atopique et d’avancer dans l’évaluation de candidats thérapeutiques chez l’Homme. Si d’autres molécules devaient être évaluées pour mettre au point le modèle de dermatite canine, elles seraient sélectionnées pour leurs résultats probants in vitro et in vivo. Les candidats médicaments qui seront testés in vivo sur le modèle établi sont sélectionnés sur la base de connaissances immunologiques et de données chez d’autres espèces (rats, souris, Homme). Ces candidats auront été évalués in vitro ou ex vivo afin d’attester leur sécurité et leur efficacité sur des modèles cellulaires, des modèles innovants (organ-on-chip, bioprinting 3D…). L’évaluation finale des candidats médicaments sélectionnés sur un modèle vivant de dermatite atopique reste indispensable pour apprécier leur efficacité et/ou leur innocuité dans le cadre d’une maladie dégénérative complexe. De plus, des données d’efficacité et d’innocuité sur l’espèce cible doivent être fournies dans les dossiers réglementaires.

Réduction

Pour les études réglementaires, le nombre minimum requis d’animaux est fixé par les textes (pharmacopée et/ou autres textes réglementaires concernés). Lors des phases de recherche, dans la perspective de réduction, les effectifs sont évalués au plus juste (historique, définition des objectifs, travail avec des biostatisticiens) de façon à minimiser le nombre de chiens utilisés tout en garantissant une approche rigoureuse et ceci afin d’éviter le risque d’études non conclusives. Une recherche de littérature non systématique a montré que les groupes se constituaient de 2 à 20 chiens dans les modèles existants de dermatite atopique canine (IgE, HDM). En effet, dans le modèle House-Dust Mite par exemple, les groupes varient de 2 chiens pour le raffinement du modèle, jusqu’à, exceptionnellement, 20 chiens par groupe. Un tel effectif peut être nécessaire en raison de la grande variabilité de la réponse. Lorsque le statut des animaux le permet, les animaux utilisés peuvent être issus de procédures (légère ou modérée) antérieures. La réutilisation permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Seuls les animaux ayant retrouvé un état de santé et bien-être complet, attesté par un vétérinaire, seront réutilisés. Les sites de biopsies doivent être entièrement cicatrisés avant toutes réutilisations.

Raffinement

Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique. La durée optimale est de 7 jours pour des chiens provenant de fournisseurs référencés. Si cette durée n’est pas suffisante elle sera rallongée jusqu’à ce que les animaux soient aptes à entrer dans la procédure. Les chiens sont hébergés en groupe sur litière. Ils bénéficieront de zones de jeu avec interaction quotidiennes avec l’Homme. Les jouets présents dans les zones d’hébergement et dans les zones de jeu sont régulièrement changés pour favoriser la curiosité. Afin de limiter le stress lié aux actes (contention, administrations et sensibilisations, prélèvements) ces derniers seront travaillés en renforcement positif avec friandises et caresses lors de training pendant l’acclimatation puis pendant toute la durée de l’étude. Les biopsies seront réalisées dans des conditions stériles, sur un site préparé chirurgicalement (tondu et désinfecté), avec un protocole d’analgésie et/ou d’anesthésie adapté. Le protocole anesthésique sera évalué au plus juste pour limiter les effets secondaires indésirables (les molécules et doses seront adaptées pour favoriser un réveil rapide). Les animaux anesthésiés seront individuellement placés sous surveillance, au calme et au chaud si besoin et ce jusqu’à leur réveil complet. Le personnel intervenant dans l’étude sera formé aux actes afin de travailler avec expertise. Les sites d’incision seront surveillés quotidiennement pour détecter une douleur, une rougeur, un gonflement ou du prurit. Un léger degré de rougeur, de gonflement et de prurit est attendu après la chirurgie ; cependant, si des anomalies cliniques de sévérité supérieure à celle attendue apparaissent, l'animal sera traité de manière appropriée pour remédier au problème (exemple : anti-inflammatoires, antibiotiques, désinfection, pommades ou sprays cicatrisants). Une collerette pourra être utilisée.

Choix des espèces

L’efficacité et l’innocuité doivent être évaluées sur l’espèce cible. Les chiens seront généralement âgés de 6 mois à 3 ans (âge au cours duquel la dermatite atopique canine s’exprime cliniquement chez le chien). Les chiens pourront donc être de jeunes adultes et des adultes. Les candidats seront ensuite testés sur les chiens présentant des signes de dermatite atopique.