Procédures légères

24 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour tester un capteur de glycémie implanté sous la peau chez des animaux élevés en groupe. La pose se fait sous tranquillisation, le capteur restant en place environ deux semaines, ce qui peut provoquer une gêne ou une inflammation. Les 8 porcs équipés du capteur seront tués pour étudier leur composition corporelle, les 16 autres renvoyés en élevage jusqu'au poids d'abattage habituel, environ 115 kg. Le porteur présente la méthode comme une alternative moins invasive à la pose d'un cathéter.

Objectifs

L'alimentation permet d'assurer le développement et la santé des animaux. Le glucose est l'un des nutriments essentiels au bon fonctionnement des cellules de l'organisme, et sa concentration dans le sang est reconnue comme un bon indicateur de la régulation de l'énergie. Cette mesure nécessite le prélèvement d'un échantillon de sang, souvent de manière répétée au cours de la journée. Chez le porc, le prélèvement de sang requiert une contention de l'animal (acte stressant) et, dans le cas de prélèvements répétés, la pose d'un cathéter réalisée sous anesthésie générale. Le projet vise à tester un capteur miniaturisé implanté en intradermique pour mesurer la concentration circulante de glucose, en temps réel et pendant plusieurs jours. Nous testons un capteur glycémique commercialisé pour les personnes diabétiques. Une première étude a permis de démontrer la capacité du capteur à fournir des données pertinentes sur des porcs maintenus durant 6 jours seuls dans une loge, pour éviter l'arrachement du cathéter. Ce mode de logement sécurisait aussi la position du capteur glycémique. Une deuxième étude est indispensable pour valider le capteur comme une méthode peu invasive de mesures des constantes physiologiques internes pour des porcs élevés en groupe. Si le capteur reste fonctionnel dans ces conditions d'élevage en groupe, cela permettrait de déterminer les relations entre les concentration en glucose dans le sang au cours de la nuit et de la journée, et des différences dans le comportement alimentaire, l'activité physique, ou encore les interactions sociales entre les animaux.

Bénéfices attendus

Les bénéfices immédiats attendus seront de fournir une alternative à la technique invasive de pose d'un cathéter pour le suivi des cinétiques des concentrations de glucose en réponse à des changements dans l'environnement (alimentaire, thermique, sanitaire, etc.). Cette méthode permettrait d'identifier les relations entre la régulation de la glycémie (concentration en glucose), le comportement alimentaire et les interactions physiques et sociales de l'animal. Elle pourrait être alors préconisée pour suivre la physiologie de l'animal afin de détecter précocement, par un suivi en temps réel, d'éventuells problèmes d'adaptation à l'envrionnelment d'élevage, avant leur manifestation en terme de santé ou de dégradation de son bien-être.

Procédures

Une injection intramusculaire pour tranquillisation (durant 15 minutes) à une dose pré-anesthésique, une prise de sang réalisée à l'oreille et la pose d’un capteur en intradermique (2 minutes) sur l'encolure et sécurisé par un bandage durant la sédation, puis après réveil, un suivi des animaux en petit groupe par observations pendant 14 jours.

Impact sur les animaux

La présence d'une aiguille en intradermique sur le capteur et la sécurisation du dispositif par une bande adhésive peuvent entraîner une gêne, voir une inflammation durant les 2 semaines où le capteur est positionné sur l'animal.

Devenir

Les 8 porcs concernés par la pose d'un capteur glycémique en intradermique seront euthanasiés à la fin de l'expérience pour étudier leur composition corporelle. Les 16 autres porcs utilisés pour étudier le comportement social au sein des cases collectives n'auront pas subi de procédure particulière autre que la pose d'un bandage autour de l'encolure, et seront replacés dans un bâtiment d'élevage dédié à la fin des 3 semaines d'expérimentation. Ils seront élevés selon les pratiques d'élevage jusqu'au stade usuel de commercialisation (environ 115 kg de poids vif).

Remplacement

Le porc est l'espèce cible de ce projet qui vise à identifier une méthode alternative à la méthode de référence pour étudier les mécanismes de régulation des constantes métaboliques face aux défis posés par des changements dans l'environnement (alimentaire en premier lieu, mais aussi thermique, social, sanitaire, etc.) des animaux d'élevage. Il n'est pas possible d'étudier finement le métabolisme du porc au bénéfice de sa santé et son bien-être, avec une application pour la recherche mais aussi à terme en élevage, sans utiliser des porcs de génotype conventionnel (Large White x Landrace x Piétrain). L'utilisation de cellules en culture permettrait de caractériser les mécanismes moléculaires de la régulation du taux de glucose intracellulaire, mais ne renseigne nullement sur les variations quotidiennes de la glycémie (concentration dans le sang) en relation avec l'activité métabolique des nombreux tissus utilisateurs de glucose (muscles, tissus adipeux, intestins) ou du foie (production de glucose), et avec le comportement alimentaire du porc, son efficience alimentaire, son activité physique, et son état de santé. L'utilisation d'animaux vivants est donc nécessaire pour rendre compte de processus biologiques extrêmement dynamiques, et sujets à une large variabilité entre individus.

Réduction

Chaque porc dit "sentinelle" (n = 8) est son propre témoin durant les 3 semaines d’expérimentation, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des valeurs fiables tout en prenant en compte la variabilité interindividuelle de la consommation alimentaire ou des comportements, et des processus induits (ingestion, digestion). Une analyse des corrélations sera réalisée entre les mesures de concentration en glucose circulant (concentrations maximales ou minimales de glucose circulant, heures des pics, aire sous la courbe, etc...) et les mesures de comportements et d'ingestion d'aliment (quantité, rythme des repas) effectués sur chaque animal. Le nombre de 8 porcs sentinelles à équiper chacun d'un capteur glycémique a été déterminé sur la base de la bibliographie disponible quant à la validation de capteurs glycémiques développés en médecine humaine pour des miniporcs, et selon notre propre connaissance des variations interindividuelles des concentrations de glucose sanguin récemment objectivées pour des porcs du même génotype et de même stade munis des mêmes capteurs glycémiques mais élevés en loge individuelle. La taille des groupes dans chaque case (n = 6 porcs/case) a été déterminée pour fournir des évaluations fiables des interactions sociales entre animaux.

Raffinement

Le projet vise justement à raffiner la méthode standard de suivi des concentrations en glucose sanguin en évitant la pose d'un cathéter jugulaire ou des prélèvements répétés de sang par contention de l'animal et prélèvement à la veine jugulaire. Pour les porcs dits "sentinelles" (n = 8, soit 2 porcs/case), la pose du capteur glycémique est réalisée en tranquillisant l'animal par l'administration d'un mélange médicmenteux à dose pré-anesthésique en intramusculaire. Le capteur est placé sur la face externe de l'encolure, à la base de l'oreille droite, en utilisant l'applicateur fourni dans le kit qui permet l'insertion d'une microaiguille en intradermique et la pose d'un patch sur le capteur. Le capteur permet ensuite des mesures des taux de glucose sans douleur, ni contention ni stress. Le porc sera familiarisé avec les humains grâce aux soins quotidiens durant la première semaine avant la pose du capteur, ce qui permettra la préanesthésie dans le couloir attenant à la loge d'élevage, ceci pour ne pas perturber l'animal (pas de changement d'environnement). Un bandage sera posé également sur les congénères de chacune des 4 loges (n = 16 porcs), si possible sans autres manipulations qu'un isolement temporaire dans un coin de la loge, ceci grâce à la familiarisation à l'humain durant la première semaine. Pour des porcs où cela ne serait pas possible (animal manifestement stressé), la même procédure que pour les porcs "sentinelles" serait alors appliquée en remplacement. Toutes les cases sont équipées de dispositifs d'enrichissements renouvelés régulièrement et au gré des comportements individuels: matériels manipulables (chaînes métalliques , balles en plastique dur, étoiles en plastique et métal, croix en plastique dur, toiles de jute...) qui ne peuvent pas être rongés. Les animaux sont suivis quotidiennement par du personnel expérimenté afin de détecter l'atteinte d'un point limite.

Choix des espèces

Le porc est l'espèce cible du projet. Le projet vise à trouver une méthode pour étudier les évolutions des constantes physiologiques du porc face aux défis posés par les changements de son alimentation, les modifications de son environnement ou les évolutions des pratiques d'élevage. Il n'est pas possible d'étudier ces évolutions sans utiliser des porcs de génotype conventionnel (Large White x Landrace x Piétrain). L'utilisation de cellules en culture permettait de caractériser les mécanismes moléculaires de la régulation intracellulaires, mais pas les variations quotidiennes de la glycémie. Les effets mesurés résultent de processus biologiques extrêmement dynamiques, impliquant l'effet de comportements tels que l'activité physique ou le rythme d'alimentation, et l'aptitude à digérer l'aliment et à utiliser les nutriments. Ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits sur des cellules en culture in vitro. Ils sont soumis à une large variation inter-individuelle. Les porcs pèsent environ 50 kg de poids vif (autour de 3-4 mois d’âge). Cela permet d'étudier les variations de la glycémie chez un animal en croissance, puisque ce projet vise à étudier les évolutions et régulations de la glycémie chez des animaux représentatifs de leurs congénères élevés pour la production de viande et confrontés à des situations de challenges environnementaux rencontrés en élevages. Techniquement, le poids de 50 kg environ est idéal en terme de manipulation, et a été aussi choisi dans notre premier projet visant à valider les valeurs fournies par les capteurs glycémiques pour des porcs élevés en loge individuelle.

570 chèvres vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sans mise à mort prévue. Elles subissent des prises de sang annuelles, soit 2 à 7 prélèvements sur cinq ans, pour rechercher un déterminisme génétique de la résistance à l'arthrite encéphalite virale caprine. Le porteur indique que les animaux seront réutilisés selon l'avis vétérinaire et que la contention peut provoquer un stress léger et des hématomes. Il revendique que la génétique de la réponse à la maladie 'ne peut être étudiée qu'in vivo'.

Objectifs

Des données récentes de la littérature suggèrent que la prédisposition aux maladies lentivirales, comme par exemple l’Arthrite Encéphalite Virale Caprine (appelée CAEV) des caprins ou son équivalent chez les ovins (appelée Maedi-Visane) a une composante génétique. Dans une ferme expérimentale au Brésil, l’analyse de tests Elisa, sur plus de 500 chèvres de race Saanen et Alpine, a montré que l’héritabilité de l’occurrence du CAEV se situe entre 2.6 et 12.8 % (Bibliographie). Par ailleurs, une équipe américaine a publié la découverte d’une mutation dans un gène impliquée dans la réponse à l’infection par les lentivirus rétroviraux responsables du Visnae-maedi chez les ovins (bibliographie). L’étude portait sur un ensemble 3545 sérologies, dont un sous ensemble de 69 cas-contrôles génotypés avec une puce à ADN haut débit a permis d’identifier le marqueur génétique responsable de la résistance/sensibilité. Ces résultats ouvrent donc des perspectives d’étude et de gestion génétique de cette maladie dans nos populations françaises de caprins. L’objectif de notre projet est de créer un dispositif cas-contrôle dans l’espèce caprine pour une étude d’association tout génome. Pour cela nous phénotyperons une population de 570 chèvres Alpines de l'Etablissement Utilisateur pendant 5 ans. Le phénotypage consistera à réaliser des sérologies CAEV annuelles, et d’observer la présence d’arthrite (gros genoux). L’ensemble des 570 chèvres sera génotypé avec une puce à ADN caprine haut débit. Un sondage sérologique a confirmé la présence du virus dans l’élevage. Avec une prévalence de cas positif présumée de 90%, nous projetons d’obtenir un dispositif d’au moins 55 chèvres négatives et leur contrôle pour conduire l’analyse d’association tout génome.

Bénéfices attendus

CCe projet permet en premier lieu de dresser un état des lieux du statut sanitaire CAEV du troupeau pour aider à sa gestion en local (réforme des animaux séropositifs et cliniquement atteints) Ce projet permet surtout d’initier une première étude du déterminisme génétique de la résistance des chèvres au CAEV. Le cas échéant, les résultats pourront être utilisés par les éleveurs et les organismes de sélection pour sélectionner des chèvres plus résistantes ou résilience (moins de symptômes) au CAEV.

Procédures

Les animaux sont soumis à des prises de sang annuelles, soit 2 à 7 prises de sang maximum en 5 ans. Soit un volume de sang prélevé inférieur à 100 ml maximum correspondant à moins de 2% du volume total de l'animal sur une période 5 ans. La duurée de la prise de sang est inferieure à 30 secondes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous réalisons des prises de sang. Les chèvres peuvent éprouver un stress léger lors des contentions nécessaires pour les prises de sang. Une nuisance éventuelle serait l'apparition d'hématome suite aux prises de sang effectuées.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie. Aucune mise à mort n’est prévue, car les chèvres ne subissent que des prises de sang Les animaux pourront être réutilisés selon l’avis du vétérinaire sanitaire et vétérinaire SBEA

Remplacement

La génétique de la réponse au CAEV implique des mécanismes biologiques complexes, qui incluent différents aspects de l’expression de la maladie (sérologie, expression clinique articulaire) qui nous intéressent ici et qui donc ne peuvent être étudiés qu’in vivo.

Réduction

Nous demandons une saisine pour 570 chèvres. Cet effectif se justifie comme suit. Les marqueurs génétiques SNP de la puce qui seront étudiés (N~ 50 000) sont bi allélique. La fréquence de ces allèles est de 0.3 en moyenne. Nous voulons observer des différences de 10% de fréquence entre les cas et les contrôles. Pour cela il nous faut un minimum de 55 chèvres cas et 55 chèvres contrôles. Avec 570 chèvres phénotypées et génotypées et une prévalence supposée de 90% de positifs, nous prévoyons donc d’obtenir au moins 55 chèvres négatives que nous pourrons apparier facilement à 55 chèvres contrôle. Les analyses statistiques des marqueurs génétiques, dans les groupes cas et contrôle, s’appuieront sur des analyses d’association tout génome à l’aide de modèle polygénique, incluant l’effet des génotypes et faisant appel aux principes de l’analyse de variance.

Raffinement

Les chèvres seront hébergées en groupe, sur une litière paillée. Le milieu sera enrichi avec des brosses et des plateformes en bois. Elles seront nourries à volonté. Les prises de sang réalisées ne nécessitent qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à être manipulés. Un baume décongestionnant, antiseptique et cicatrisant pourra être appliqué, en massage sur les veines, en cas de besoin. Les chèvres ont l’habitude d’être manipulée par des manipulateurs expérimentés et habilités (animaliers) qui côtoient ces animaux quotidiennement.

Choix des espèces

L’espèce caprine est l’espèce cible. La physiologie et la réponse immunitaire des ruminants sont particulières à ces espèces. La génétique de la réponse au CAEV implique des mécanismes biologiques complexes, qui incluent différents aspects de l’expression de la maladie (sérologie, expression clinique articulaire) qui nous intéressent ici et qui donc ne peuvent être étudiés qu’in vivo. Nous utilisons des chèvres non gestantes en lactation, afin d’évaluer l’effet de leur génétique sur leur statut sanitaire vis-à-vis du CAEV et évaluer l’éventuel impact sur l’inflammation mammaire et la production laitière.

588 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections dans le péritoine et des gavages de médicaments présentés comme non toxiques, puis sont tuées vers l'âge de deux mois pour prélever rate, ganglions, côlon, foie, poumon, peau et tissu adipeux. Le porteur indique un stress et des douleurs légères liés aux gestes, l'objectif étant de décrire le métabolisme des lymphocytes T régulateurs selon les tissus. Sur le remplacement, il affirme que le métabolisme d'une cellule ne s'étudie pas hors de son environnement tissulaire et annonce un remplacement partiel par la culture cellulaire et la bio-informatique.

Objectifs

Une population de cellules immunes appelée lymphocytes T régulateurs ou « Treg », joue un rôle majeur dans la prévention des maladies auto-immunes. Les patients ou les souris déficients en Treg développent un syndrome auto-immun très sévère. Les Treg sont présents non seulement dans le sang, la rate ou les ganglions lymphatiques mais également dans de nombreux autres tissus dît non-lymphoïdes tels que le poumon, le muscle, le foie, l’intestin, la peau ou le tissu adipeux. Le rôle des Treg des tissus non-lymphoïdes n’est que partiellement connu et varie en fonction de l’organe. Par exemple, il a été décrit que les Treg du tissu adipeux sont capables de contrôler le diabète de type 2 ou l’obésité, que les Treg du muscle sont impliqués dans la réparation tissulaire après blessure, que les Treg de l’intestin contrôlent l’inflammation locale et le microbiote ou encore que les Treg de la peau participent au bon fonctionnement du follicule pileux. Ainsi, au delà de leur rôle de contrôle de l’inflammation, les Treg participent à l’intégrité et au bon fonctionnement des organes. L’environnement métabolique est très variable d’un tissu à l’autre. Ainsi, le sang, la rate ou les ganglions lymphatiques sont riches en glucose et en oxygène, à l’inverse de la plupart des tissus non-lymphoïdes qui ont des taux faibles d’oxygène et de glucose. Les Treg ont alors besoin de s’adapter d’un point de vue métabolique pour pouvoir vivre et fonctionner normalement dans chacun de ces tissus. Pourtant, on ne connaît presque rien sur le profile métabolique des Treg des tissus. Ceci s’explique par le fait que les seules technologies disponibles jusqu’à il y a encore très peu de temps nécessitaient de grands nombres de cellules, nombres inatteignables pour l’étude des Treg des tissus non-lymphoïdes qui sont des cellules rares. L'objectif de ce projet est de faire un état de lieux sur le profile métabolique des Treg des tissus lymphoïdes et non lymphoïdes en utilisant une nouvelle technologie. Grâce à ce travail nous espérons pouvoir caractériser les similitudes et les différences de métabolisme cellulaire entre les Treg de différents tissus à l’homéostasie. Il pourrait permettre de mieux comprendre le mécanisme d’action de certains traitements utilisés en médecine qui affecte le métabolisme cellulaire (Metformine, Sirolimus, Tecfidera) en connaissant mieux leurs effets sur les Treg. Ce projet pourrait aussi permettre de pouvoir mieux manipuler les Treg à des fins thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Grâce à ce travail, nous espérons avoir une meilleure connaissance de la biologie des Treg en général et plus particulièrement du profile métabolique des Treg des tissus lymphoïdes (rate, ganglions lymphatiques) et non lymphoïdes (foie, poumon, colon, peau et tissu adipeux). A terme, les résultats de ce projet pourraient permettre de proposer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’homme. En effet, la pharmacopée comprend de nombreuses molécules agissant sur différentes voies métaboliques. Certaines de ces molécules sont largement utilisées en médecine actuellement (metformine, rapamycine, DMF). Notre étude permettra de mieux comprendre comment ces médicaments pourraient agir sur les Treg de différents tissus et mieux comprendre ainsi leur mode d’action. De plus, une meilleure connaissance du profile métabolique des Treg de différents tissus pourrait permettre de proposer des traitements qui pourraient agir, en les stimulant ou en les inhibant, sur certains sous-type de Treg, avec un impact bénéfique sur le fonctionnement de ces tissus.

Procédures

L’expérience consistera à injecter des médicaments non toxiques par voie intra-péritonéale. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. On fera aussi des gavages qui dureront moins de 30 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. On effectuera un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 20 secondes par souris. Enfin, ces souris, seront euthanasiés quand elles auront 2 mois d’âge (compter 5 à 10 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Pour le gavage et les injections par voie intra-péritonéale, nous anticipons un stress et des douleurs légères chez les souris. Différents produits seront administrés mais ils ne produiront pas de nuisance supplémentaire aux souris.

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour pouvoir prélevez de nombreux tissus biologiques (rate, ganglions, colon, foie, poumon, peau, tissu adipeux) sur lesquels on effectuera des analyses cellulaires et immunologiques multiples.

Remplacement

Le profile métabolique d’une cellule ne peut être étudié en dehors de son environnement tissulaire. Pour étudier le métabolisme des Treg des tissus lymphoïdes et non-lymphoïdes nous avons besoin d’avoir recours à une étude in vivo chez l’animal. Les études précédentes utilisant des cultures de cellules fraichement purifiées ou des lignées cellulaires pour connaître le métabolisme d’un type cellulaire est contestable dans la mesure où l’environnement métabolique de la culture ne peut refléter fidèlement l’environnement métabolique d’un tissu in situ. C’est pourquoi nous faisons ces études in vivo. Nous utiliserons la souris dans la mesure où c’est un modèle de référence d’étude des Treg et que nous avons développé au laboratoire un modèle de souris génétiquement modifiées unique qui permet de répondre aux questions soulevées par ce projet. Dès que possible, on effectuera un remplacement partiel de la souris par des expériences de culture cellulaire et par des analyses bio-informatiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Sur les 3 années, nous utiliserons un total de 588 souris de 6 à 10 semaines d’âge. Du fait de la variabilité interindividuelle entre souris, nous utiliserons 2 souris par groupe pour les études de profile métabolique et les expériences seront répétées 4 fois (4 réplicats biologiques), pour avoir un total de 8 souris pour chaque type d’inhibiteur pour l’analyse du profile métabolique des Treg. Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Une approche de réduction du nombre d’animaux utilisés est de réaliser les expériences en étudiant en même temps l’effet de 2 inhibiteurs différents. Nos études in vivo portent sur l’analyse de différents organes. Ainsi pour chaque animal euthanasié nous prélèverons tous les organes étudiés (rate, ganglion, foie, poumon, colon, peau, tissu adipeux) afin de collecter et analyser le plus de données possibles par animal.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont optimisées pour réduire douleur, souffrance ou stress. Les souris seront hébergées selon les conditions de la règlementation de la Directive 2010/63 EU en cages ventilées d'une superficie de 500cm2 à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h et avec accès ad libitum à la nourriture et à la boisson. Le change de la litière sera réalisé 1 fois toutes les 2 semaines et les biberons chaque semaine. Les souris resteront toujours en groupes sociaux (de 2 à 5 souris). L'enrichissement fourni est du sizzlnest pour le nid et une maison rouge dans chaque cage. Les animaux sont vérifiés tous les jours par le personnel du service de zootechnie. L’état général des animaux (apparence physique, changement de comportement) sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en œuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Toute observation de souffrance animale (blessure, prostration, poil hérissé, modification majeure du comportement, expression faciale particulière indiquant des signes de souffrance) fera l’objet d’un avis au responsable de l'animalerie et sera suivi de l’application de ses conseils en tant qu’expert. En pratique si on trouvait un animal qui présente des signes de souffrance, nous l’euthanasierons. La dentition de chaque souris sera vérifiée régulièrement.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le système immunitaire de l’Homme et les Treg en particulier. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. L’utilisation de souris génétiquement modifiées nous permet d'étudier le rôle du métabolisme cellulaire sur la stabilité des Treg. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche. Les expériences seront réalisées sur des souris jeunes adultes d’environ 8 semaines (6 semaines pour les plus jeunes et 10 semaines pour les plus âgées).

1 600 bars vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Marqués par puce sous anesthésie puis mesurés hors de l'eau à deux reprises, ils sont tués à l'âge d'un an pour déterminer leur sexe par observation des gonades, aucun caractère visible ne permettant de le faire sur l'animal vivant. Le porteur indique viser la transmission entre générations des effets de la température sur le sexe, avec un objectif appliqué de contrôle du sex-ratio en élevage, où il juge les femelles plus intéressantes pour leur croissance. Sur le remplacement, il affirme que l'espèce ne peut être remplacée et que le travail sur cultures cellulaires n'est pas envisageable.

Objectifs

Le bar est une espèce dont le sexe est déterminé pendant la phase d'élevage larvaire, par une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux. Nous avons clairement identifié précédemment des périodes de sensibilité à la température de l'eau, ainsi qu'une variation génétique de la propension des animaux à devenir femelle ou mâle. Ces observations devraient pouvoir permettre de prédire le sex-ratio d'une population, à partir de la connaissance 1) des parents utilisés pour produire cette population et 2) des températures d'élevage utilisées. Cependant, les données observées diffèrent régulièrement des prédictions, parfois dans des proportions importantes. Il a par ailleurs été montré que l'effet de la température sur le déterminisme du sexe du bar passait par une modulation de l'expression de certains gènes. Nous faisons l'hypothèse que cette modulation est durable dans le temps, et qu'il est même plausible qu'elle puisse se transmettre en partie à la génération suivante. Ceci pourrait expliquer pourquoi dans certains cas, des animaux produisent des descendances ayant des sex-ratio inattendus. Pour tester cette hypothèse, il est nécessaire de conduire des expérimentations transgénérationnelles, de préférence sur 3 générations (F0, F1, F2) ayant été soumises à différentes conditions environnementales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'évaluer l'étendue la transmission transgénérationnelle des effets de l'environnement chez le bar. Chez les mammifères, ces effets sont remis à zéro en quasi-totalité entre générations, alors que chez les poissons il existe des observations montrant une transmission d'effets de l'environnement entre générations, en particulier pour le déterminisme du sexe. Mieux comprendre ce mécanisme permettra de contrôler et prédire le sexe des populations de bar en élevage. Ceci est important, d'une part car chez cette espèce les femelles ont un plus grand intérêt pour l'élevage que les mâles (croissance rapide, maturité tardive), et d'autre part car contrôler le sex-ratio est essentiel pour pouvoir mener efficacement des programmes de sélection génétique. Comprendre comment les conditions d'élevage à une génération pourraient (ou non) influer sur le déterminisme du sexe à la génération suivante est donc très important, en particulier si cela pouvait expliquer les forts écarts aux prédictions qui sont régulièrement observés.

Procédures

Les animaux seront marqués par transpondeur RFID (30 secondes , sous anesthésie) pour pouvoir suivre leur développement jusqu'à l'âge de 1 an. Pendant cette période, ils seront mesurés 2 fois hors de l'eau (sous anesthésie, une minute à chaque fois).

Impact sur les animaux

Les nuisances et les effets indésirables devraient être très limités, toutes les procédures sont d'une sévérité légère et sont maîtrisées par notre équipe sur cette espèce. En particulier, le marquage des animaux peut entraîner des nécroses de tissus autour de la marque. Ceci est évité par une désinfection du matériel à l'alcool, et une maîtrise du geste technique. Une autre possibilité est que les animaux se stressent ou se blessent pendant la pêche, avant l'anesthésie. Ceci est évité par une sédation légère dans le bac d'élevage qui permet de les capturer en douceur, sans stress. Les conditions d'élevage en captivité ont par ailleurs été optimisées pour cette espèce.

Devenir

Les 1600 animaux seront euthanasiés à l'âge de 1 an, pour pouvoir déterminer leur sexe, ce qui ne peut se faire de façon fiable que par observation visuelle des gonades (pas de caractères sexuels secondaires observables sur poisson vivant).

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer le Bar commun pour ces recherches qui impliquent l'étude du déterminisme du sexe d’une espèce de poisson d’importance halieutique et piscicole, dont le système de détermination du sexe (polygénique avec influences environnementales) est assez unique. De plus, le déterminisme du sexe étant un phénomène complexe, à l'échelle de l'individu, avec une forte influence de l'environnement, le travail sur cultures cellulaires n'est pas envisageable

Réduction

Cette étude comprend 16 lots de poissons (8 pères F1 avec chacun un lot de descendants élevé à haute température (HT) et un lot à basse température (BT)). Notre objectif est de pouvoir mettre en évidence des écarts de sex-ratio de 10 % entre les lots. Pour révéler un écart de cette importance, l'effectif nécessaire est de 100 poissons par lot, soit 1600 au total.

Raffinement

Pendant le marquage et les biométries lors des mesures de croissance, nous utiliserons une procédure d'anesthésie optimisée pour cette espèce: pré-anesthésie dans les bassins pour calmer les poissons et permettre une pêche non stressante, puis anesthésie plus profonde pour toutes les manipulations hors de l'eau (qui dureront moins d'une minute pour chaque poisson). Après manipulation, les poissons seront placés en seaux de réveil sans anesthésiques, afin de s'assurer d'une reprise d'équilibre et d'activité de nage avant le retour vers les bassins d'élevage.

Choix des espèces

Le bar commun est à la fois une espèce modèle pour le déterminisme du sexe (polygénique avec influences environnementales) et une espèce importante pour l'aquaculture. Nous avons à la fois un objectif académique (rôle de la transmission entre générations d'effets environnementaux dans le déterminisme du sexe) et appliqué (contrôle du sexe en élevage) Les animaux seront étudiés du stade juvénile à l'âge de 1 an, où l'observation visuelle des gonades sur poissons euthanasiés permet un sexage sans erreur

1000 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 400 tuées par anesthésie létale pour prélèvements et 600 réutilisées dans d'autres projets. Les poissons sont filmés puis soumis à un test comportemental de réactivité émotionnelle par isolement social de quarante minutes, décrit comme un stress aigu, et à un abaissement du niveau d'eau pendant cinq minutes par jour. Le porteur présente l'étude comme un moyen d'améliorer le bien-être des truites d'élevage grâce à une structure d'enrichissement amovible. Il reprend une communication de la Commission européenne sur la "nécessité" d'améliorer le bien-être des poissons d'élevage, l'application visée étant la pisciculture commerciale.

Objectifs

Le bien-être animal est une notion importante, qui suscite un intérêt croissant depuis quelques années, notamment en élevage. Elle ne fait plus seulement appel à la notion d’équilibre et d’homéostasie nécessaires entre l’animal et son environnement, à l’absence d’expériences négatives et contraignantes, mais implique dorénavant également la possibilité pour l’animal d’accéder à des émotions positives et de diminuer ses états mentaux négatifs. Bien que des progrès ont été mis en place pour améliorer le bien-être des animaux dans la plupart des filières d’élevage, certaines en nécessitent encore pour une prise en compte optimale. Une manière d’améliorer le bien-être des poissons d’élevage est d’incorporer des éléments d’enrichissements dans leur environnement. L’enrichissement physique consiste à apporter des éléments complexifiant physiquement (plantes, structures) ou sensoriellement (visuel, auditif…) l’habitat. Cependant, l'ajout de divers objets dans les bassins peut s'avérer contraignant pour les pisciculteurs lors de la pêche ou de l'entretien. Ce projet a pour vocation de tester une stratégie d’enrichissement physique dans le but d’améliorer le bien-être des truites en élevage par l'ajout dans les bassins d'une structure amovible et donc facile d'entretien, composée de plantes fixées à une plaque servant d'abri. Nous analyserons le comportement des poissons et leur réponse au stress selon que leur environnement ait été enrichi ou non pendant 3 mois, dès les jeunes stades.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de tester une structure d'enrichissement du milieu de vie des truites visant à améliorer leur bien-être et leur réponse au stress en élevage. La structure d'enrichissement est composée de plantes fixées à une plaque servant d'abri et serait facile à mettre en place en élevage car amovible limitant ainsi les contraintes liées à l'entretien et à la pêche. En cas de succès du projet et de résultats prometteurs (moins de stress et de comportements agressifs, meilleure croissance), notre stratégie d'enrichissement pourra être testée en élevage commercial, afin d’évoluer vers des systèmes plus respectueux du bien-être des poissons. Ce projet rejoint les consignes données par la commission Européenne lors de sa communication 236 du 12/05/2021 sur la nécessité de trouver des moyens d’améliorer le bien-être des poissons d’élevage et en particulier pendant la phase d’élevage pour ensuite les communiquer à la filière piscicole.

Procédures

Il n'y aura pas de prélèvement sur animal vivant pour ce projet. Les prélèvements de sang auront lieu après anesthésie à dose létale de l’animal.

Impact sur les animaux

Nous faisons l'hypothèse que les effets générés par la structure d'enrichissement pendant 3 mois sur l'un des deux traitements seront au contraire bénéfiques pour les animaux. Les truites seront simplement filmées pendant leur élevage. Lors du test comportemental de réactivité émotionnelle, le stress induit par l'isolement social en environnement nouveau pendant 40 minutes est inévitable puisque nous cherchons précisément à mettre en évidence les réponses émotionnelles des poissons. Par expérience, nous savons que ce test crée un stress aigu mais le pic de cortisol reste bien en-deçà des niveaux atteints lors des procédures classiques (confinement prolongé) et aucun point limite n'a jamais été atteint lors des 40min de test pendant lesquelles les poissons sont observés à l'écran en direct. Le transfert des poissons depuis leur bac d’élevage jusqu’au bac de test est limité à son maximum car les bacs sont disposés à proximité immédiate, et il est réalisé par du personnel compétent et expérimenté. Les animaux seront également mis à jeun 24 heures avant toute manipulation pour éviter les régurgitations (procédure classique d'élevage). Le stress modéré d'abaissement du niveau de l'eau appliqué au groupe en fin d'expérimentation dure seulement 5 minutes par jour. S'il permettra une légère élévation du cortisol nécessaire pour mettre en évidence une différence éventuelle de résistance au stress entre nos 2 traitements après 5 jours, il sera modéré dans la mesure où les poissons resteront dans leur environnement avec leurs congénères.

Devenir

Les poissons prélevés pour les analyses plasmatiques et morphologiques seront mis à mort selon les normes réglementaires. Les animaux surnuméraires nécessaires pour atteindre la densité optimale par bac et filmés pendant les observations du groupe pourront être réutilisés dans d'autres projets de l'Unité.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative à cette expérimentation animale puisque le but de cette étude est d’observer le comportement des poissons en réponse à la présence ou à l’absence d’un enrichissement de l'environnement dans l’optique d’une application future en élevage. Les réponses émotionnelles des poissons nécessitent également de manipuler des animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux prélevés ainsi que le nombre de bacs d'élevage par traitement ont été réfléchis pour permettre des analyses statistiques fiables. Le nombre d'animaux par bac a aussi été ajusté au mieux pour se rapprocher des conditions réelles en élevage mais également pour assurer une densité optimisant la stabilité hiérarchique des poissons au sein des bacs (

Raffinement

Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité, nourriture). L’enrichissement de l'environnement d'élevage permet précisément d'améliorer le bien-être des truites, ce que nous chercherons à confirmer avec la structure facile d'entretien proposée. Néanmoins, pendant toute cette période d’élevage, le comportement des animaux sera surveillé de près par les animaliers quotidiennement. Les manipulations sont réalisées par du personnel compétent le plus rapidement possible pour limiter le stress. Les bacs de tests comportementaux sont situés à proximité des bacs d'élevage afin de limiter le stress du transfert.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce d’intérêt agronomique puisqu’elle représente 95% de la production française piscicole en eau douce. La question du bien-être de cet animal de rente est donc primordiale en France mais aussi en Europe. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusée dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). Les expérimentations démarreront un mois après la première alimentation des alevins, soit 3 mois après la fécondation des oeufs. Cela représente un stade charnière visé pour l'application en pisciculture. De plus, l'application de l'enrichissement à des stades précoces a montré qu'elle était mieux assimilée et plus efficace compte tenu de la flexibilité comportementale des jeunes animaux.

320 poulets de chair vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis vendus vivants à l'issue. Chaque animal subit jusqu'à trois prélèvements sanguins au sinus occipital à l'âge adulte, pour comparer les effets d'une reproduction au sol et en cage sur la fertilité et le comportement. Le porteur présente l'étude comme une réponse aux "demandes sociétales de bien-être animal", tout en la reliant à des enjeux de sélection génétique et de performances de reproduction. Il indique que la reproduction au sol peut s'accompagner de picage, d'agressivité et de cannibalisme, et cible deux lignées de poulets à croissance lente et rapide.

Objectifs

En sélection, les lignées de volailles sont, pour une partie de leur vie, hébergées en cage individuelle. La reproduction en cage permet un suivi individuel de la ponte, mais surtout une reproduction par insémination artificielle qui permet de limiter la consanguinité en contrôlant les couples reproducteurs et de connaître le pedigree de la descendance à chaque génération. Aujourd’hui, nous cherchons à concevoir un élevage sans cage, plus en lien avec les demandes sociétales de bien-être animal. Si la reproduction au sol ouvre la possibilité d’exprimer des comportements naturels positifs (activité, bain de poussière,…), l’effet global sur le bien-être des animaux doit être mieux évalué. Des interactions sociales agressives entre adultes au sol peuvent s’accompagner d’une baisse du bien-être du troupeau, avec l’apparition de picage, de comportements violents voire de cannibalisme. D’autre part, ce mode d’élevage des reproducteurs pourrait avoir un effet sur la fertilité et la fécondité des mâles comme des femelles. Le but du projet est d’estimer la faisabilité et les conséquences d’une reproduction au sol sur le comportement et les performances des reproducteurs en utilisant deux lignées génétiques de poulets de chair, variant sur la vitesse de croissance et les caractéristiques métaboliques. Ce projet évaluera comment une reproduction au sol impacte le bien-être et la fertilité des animaux reproducteurs, et si cet impact varie entre lignées aux caractéristiques bien distinctes. Le projet implique des prises de sang sur les animaux pour évaluer le taux d’hormones indicatrices de comportements aggressifs et du niveau de stress des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet servira de socle à un renouvellement de nos pratiques pour accompagner la transition vers un mode alternatif d’élevage en sélection. A court terme, il permettra l’évaluation des pratiques prenant en compte : les effets positifs ou négatifs d’un élevage au sol sur le bien-être et les performances de reproduction des animaux. Il sera également important d’évaluer l’impact de la reproduction au sol sur le travail des animaliers. Au niveau scientifique, ce projet permettra une meilleure connaissance des interactions entre environnement d’élevage (cage vs sol) et génétique (croissance lente vs rapide) sur les performances de reproduction et le comportement des animaux.

Procédures

Chacun des 320 animaux, d’élevage en cage ou d’expérimentation au sol, seront soumis à 3 prélèvements sanguins maximum à l’âge adulte, séparés d’au moins 3 semaines entre eux. La technique de prélèvement de sang au sinus occipital ne dure que quelques secondes (15s environ).

Impact sur les animaux

320 animaux d’élevage en cage ou d’expérimentation au sol, seront soumis à 3 prélèvements sanguins à l’âge adulte. Les prélèvements sanguins à l’âge adulte entrainent un risque de douleur légère de courte durée, un léger risque d’hématome et un potentiel stress de contention.

Devenir

Tous les animaux n’ayant subi qu’une porcedure légère seront disponibles à la vente (animaux vivants).

Remplacement

Pour évaluer les possibilités de reproduction au sol des poulets de chair et connaître leur impact sur le bien-être, le modèle le plus adapté est le poulet de chair lui-même.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires pour ce projet a été évalué d'après des publications scientifiques de simulation de précision de l'estimation des paramètres physiologiques et génétiques estimés dans ce projet. Les effectifs les plus faibles sont pour les mâles. De nombreux caractères seront testés, dont plusieurs ont déjà montré des différences significatives à moins de 20 individus. D’autre part, des prélèvements multiples, permettront de renforcer la puissance des effets observés entre traitements en utilisant moins d’animaux. Les femelles seront, elles, au nombre de 60 par traitement. Un sexe ratio de 1 mâle pour 3 femelles est le standard utilisé en reproduction en cage. Les animaux au sol permettront de tester trois traitements différents : au sol en sexes séparés (sans reproduction), au sol en reproduction libre, et au sol avec reproduction contrôlée (où un mâle est placé avec trois femelles choisies par l’expérimentateur), pour réduire le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Le calme et une contention soignée pendant la prise de sang seront mis en oeuvre. Par ailleurs, les animaux voués à l’expérimentation de la reproduction au sol seront élevés sur copeaux, en groupe, et auront accès à l’aliment selon les schémas de rationnement. Un panel d’enrichissements du milieu sera disponible : perchoirs, cachettes, nids, et distribution de nourriture aléatoire dans la litière. En plus des bienfaits habituels des enrichissements, ces derniers seront cruciaux pour limiter l’agressivité entre les animaux, que ce soit les comportements harceleurs des mâles envers les femelles (cachettes), l’agressivité entre mâles, ou la compétition pour la nourriture (distribution dans la litière favorisant le grattage). Tous les animaux seront visités quotidiennement pendant 15 à 20 minutes. Si un animal est blessé ou malade (emplumement, picage) ou s’il est en souffrance (prostration permanente), il sera isolé en infirmerie jusqu’à récupération complete.

Choix des espèces

L’objectif étant l’etude de la reproduction au sol des poulets de chair, le modèle le plus adapté est le poulet de chair lui-même. Toutes les procédures seront realisées sur des animaux adultes, pour phénotyper des reproducteurs.

736 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal est irradié aux rayons gamma sur le corps entier pendant une contention d'un quart d'heure, une partie recevant un régime riche en lipides, avec des échographies sous anesthésie et un prélèvement d'organes terminal. Le porteur affirme que l'irradiation à faible dose n'entraîne ni douleur ni brûlure et se limite à un stress de contention. Il présente l'étude comme une contribution aux normes de radioprotection, en complément d'études épidémiologiques jugées insuffisantes.

Objectifs

L’objectif de notre étude est d’identifier la réponse de la microvascularisation cardiaque et cérébrale à une exposition aigüe à des doses faibles à modérées de RI, associée ou non à un facteur de risque tel qu’un régime riche en graisse. Pour cela, l’évaluation de potentielles conséquences sur les troubles moléculaires, physiopathologiques, phénotypiques et fonctionnels cardiaque et cérébral sera réalisée. L’objectif de ce projet sera d’évaluer cette hypothèse par un modèle expérimental d’exposition externe unique aux rayonnements gamma corps entier. Les effets des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants gamma à long terme sur le les vaisseaux du cœur et du cerveau seront évalués afin d’apporter des réponses très attendues quant aux questions des effets biologiques pouvant induire des pathologies non-cancéreuses comme les pathologies cardiovasculaires pour permettre d’alimenter le système de radioprotection. En mimant une exposition à des doses faibles à modérées, ce projet sera complémentaire aux études épidémiologiques et permettra d’apporter des réponses notamment dans les gammes de doses où les études épidémiologiques manquent de puissance statistique

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir de nouvelles connaissances sur les effets à long terme d’une exposition de doses faibles à modérées sur la microvascularisation (cardiaque et cérébrale), afin de participer à la détermination des normes en radioprotection pour des institutions du domaine de la radioprotection.

Procédures

Pour les animaux exposés aux rayonnements gamma, l’irradiation durera maximum 10 minutes. Ainsi la durée de contention des souris en boîte d’irradiation sera maximum de 15 (10 min d’irradiation + 5 minutes de préparation). Certains lots recevront un régime alimentaire riche en lipides pendant toute la durée de l’étude. Pour tous les animaux, les échographies sont non invasives et effectuées sous anesthésie. L’ensemble des prélèvements sera réalisé en terminal.

Impact sur les animaux

L’irradiation à de faibles doses n’entraine pas de douleur ni de brulure aux animaux, seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque a été observée à long terme. Néanmoins un stress des animaux est possible lors de la mise en boite d’irradiation même s’il y a habituation au tube à contention. L’ajout d’un régime riche en graisse n’impact pas le bien-être des animaux. Cela peut pour les temps longs les faire prendre du poids.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris seront euthanasiées pour prélever des organes (cœur et poumons) qui permettront une analyse histologique complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.

Remplacement

Pour mimer l’exposition corps entier de résidents vivants en zone contaminée ou les travailleurs (après un accident nucléaire par exemple celui de Tchernobyl ou Fukushima), il est nécessaire d’avoir recours à une exposition externe à des doses faibles de rayonnements ionisants gamma (imitant les rayonnements ionisants du CS137) sur un modèle intégré (microvascularisation cardiaque et cérébrale). De plus, les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles à modérées et ne permettent pas d’identifier des processus physiologique et/ou physiopathologique, il est de plus très difficile de maintenir des cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules.

Réduction

Au total, 736 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre de 20 à 26 animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude et avec notre expérience concernant ce type d'analyses et ces modèles murins pour être au minimum. Il n’y aura pas 20% de mortalité mais la puissance statistique sera supérieure à celle attendue avec 20 souris. Si nous n’observons pas de mortalité tous les animaux seront pris en compte pour nos résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe, mais en cas de bagarres, les animaux pourront être isolés. Les souris seront suivies quotidiennement. Elles seront pesées régulièrement une fois par mois. Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues aux bagarres entrainera l’euthanasie anticipée. Les infections ou blessures éventuelles seront traitées localement par application de Vétédine, crème antibiotique ou par administration d’antibiotique.

Choix des espèces

Ce projet vise à déterminer un seuil dose pour lequel on observe le développement de pathologies microvasculaire (raréfaction au niveau cardiaque ou cérébrale) et également des troubles du rythme cardiaque chez des souris irradiées en corps entier avec des rayonnements gamma à faible dose et ce afin de mimer des effets secondaires à long terme de l’exposition des personnes en territoire contaminé post accident nucléaire. Les souris seront âgées de 2 mois (8 semaines) au moment de l’irradiation car à cet âge leur système nerveux sympathique cardiaque est mature. Des souris C57BL/6 males seront utilisées pour notre projet afin de pallier les effets cardioprotecteurs des hormones comme les œstrogènes. Néanmoins lorsque nous aurons des résultats sur les mâles et si ceux-ci sont significatifs, nous pourront prévoir la réalisation de ces mêmes expériences sur des souris femelles.