Procédures légères

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. La moitié d'entre elles naissent sans microbiote et reçoivent par un gavage unique une flore intestinale d'origine humaine, puis toutes mangent pendant vingt-huit jours un aliment contaminé par un pesticide, une toxine de champignon ou un désinfectant, avec prélèvement de crottes deux fois par semaine. À la fin, toutes sont tuées pour analyser les protéines de leurs tissus intestinaux, et le porteur annonce que l'exposition alimentaire "ne devrait pas induire de nuisances pour les animaux". Sur le remplacement, il décrit des méthodes de laboratoire "de plus en plus développées" pour reproduire ces interactions, avant de conclure qu'il "reste nécessaire d'étudier leurs effets chez l'animal".

Objectifs

Le microbiote intestinal est constitué de milliers de micro-organismes, tels que des bactéries, des champignons et des virus, qui vivent dans notre intestin. Il joue un rôle important dans le maintien de notre santé et peut être impliqué dans le développement de certaines maladies. Son équilibre peut être perturbé par différents facteurs, notamment l’alimentation, certaines maladies ou l’exposition à des substances présentes dans notre environnement telles que les pesticides, les toxines produites par des champignons ou les produits désinfectants. Ces perturbations peuvent fragiliser la paroi intestinale et favoriser des problèmes liés au métabolisme ou au système immunitaire. Nous étudierons l’impact des contaminants sur les protéines produites par les souris et les micro-organismes des flores intestinales (de souris ou humanisées), en comparaison avec les souris témoins. Cette étude nous apportera des informations sur l’état de santé de l’intestin et sur les interactions de la flore intestinale avec l’organisme hôte.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment trois contaminants peuvent modifier le microbiote intestinal et altérer le fonctionnement de l’organisme. Les résultats permettront notamment d’identifier les changements dans la composition du microbiote, son activité et la réponse de l’organisme après exposition à ces substances. En mettant ces différents changements en relation, nous chercherons à mieux comprendre comment l’exposition à des substances toxiques peut perturber l’équilibre du microbiote et contribuer au développement de certaines maladies. Les résultats obtenus pourront contribuer à améliorer l’évaluation des risques liés à ces contaminants et à mieux protéger la santé humaine et animale, dans une approche « Une seule santé ». Le projet permettra également de développer des méthodes et des outils d’analyse facilitant l’utilisation de la métaprotéomique pour étudier les perturbations du microbiote, afin de mieux prendre en compte ces effets dans l’évaluation des risques liés aux contaminants.

Procédures

Seules les souris axéniques au départ (souris à flore humanisée) subiront un seul gavage qui ne durera pas plus d'une minute. Le gavage sera effectué sur des animaux éveillés et ne sera réalisé qu’une seule fois pour l’inoculation du microbiote d’origine humaine. L’administration des contaminants se fera par l’alimentation pendant toute la durée de l’exposition (28 jours), après l’inoculation du microbiote et sa stabilisation (sauf pour les animaux avec aliment témoin). Des échantillons de matières fécales (1 à 2 crottes) seront prélevés chez l’ensemble des souris une fois par semaine entre leur arrivée et le démarrage de la supplémentation, puis deux fois par semaine jusqu'à la fin de l’étude.

Impact sur les animaux

Le gavage, qui pourrait constituer une source de stress pour les animaux, sera réalisé par un opérateur expérimenté afin d'assurer la sécurité des animaux et de réduire leur inconfort lors de la contention. L’administration des contaminants se fera par l’alimentation pendant toute la durée de l’exposition, après inoculation du microbiote et sa stabilisation (sauf pour les animaux avec aliment témoin). Elle ne devrait pas induire de nuisances pour les animaux ni provoquer de perturbation au niveau de la faim et de la soif. Les opérateurs sauront rapidement repérer d’éventuels signes cliniques afin de limiter leur souffrance.

Devenir

À la fin de la procédure, l’ensemble des animaux sont mis à mort afin de réaliser des analyses protéomiques sur leurs tissus intestinaux.

Remplacement

À ce jour, il est difficile de reproduire complètement les interactions entre le microbiote intestinal et l’organisme avec des modèles cellulaires. L’intestin est en effet un système complexe qui fait intervenir plusieurs éléments, notamment la digestion, le système immunitaire et le microbiote. Pour les contaminants présents dans les aliments, des méthodes de laboratoire sont de plus en plus développées afin de reproduire ces interactions. Cependant, il reste nécessaire d’étudier leurs effets chez l’animal afin de prendre en compte l’ensemble des mécanismes se produisant après l’ingestion d’un contaminant, ainsi que leurs conséquences sur les protéines présentes dans l’intestin.

Réduction

Nous avons réduit au minimum le nombre de souris par lot, à savoir 10 souris (5 mâles et 5 femelles) réparties dans 4 lots pour les souris conventionnelles et 4 lots pour les souris à flore humanisée. Ces lots sont eux-mêmes subdivisés en 4 groupes de traitement (comprenant le groupe contrôle de chaque flore et chaque sexe), soit un total de 5 x 2 (sexes) x 4 (lots contaminés ou de contrôle) x 2 (flore murine ou humanisée) = 80 souris nécessaires à cette étude pour obtenir la puissance statistique suffisante, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux, en tenant compte de la variabilité des données métaprotéomiques pour les effets de la flore, du traitement et du sexe.

Raffinement

Le transport des animaux sera assuré par un transporteur agréé garantissant leur bien-être. À leur arrivée dans nos locaux, ils seront hébergés par groupe de cinq (mâles et femelles séparés) dans des cages. Pour les animaux axéniques, les cages seront à l’intérieur d’un isolateur avec une ventilation adéquate. Les animaux auront à leur disposition de la litière en bois, un palier et un tunnel suspendu, des igloos, des matériaux pour la nidification et d'autres matériaux d'enrichissement tout au long du protocole. Une observation quotidienne de l’état clinique des animaux sera assurée, avec utilisation d’une grille de scoring pour la détection des points limites. Le seuil de déclenchement est fixé selon un score défini au préalable et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, consistance des fèces, perte de poids de plus de 15 %, déshydratation, yeux et abdomen creux) suffisamment prédictifs et spécifiques à ce projet.

Choix des espèces

La souris est un modèle couramment utilisé pour étudier les perturbations du microbiote intestinal. La souche utilisée est particulièrement bien documentée et permet de reproduire et d’étudier ces perturbations dans des conditions contrôlées. Elle permet notamment d'administrer facilement des contaminants dans l'alimentation, de contrôler les doses utilisées et de suivre l'évolution de la perturbation du microbiote ainsi que son éventuel retour à l'équilibre. Les souris axéniques, c’est-à-dire dépourvues de microbiote, constituent également un modèle reconnu pour étudier le rôle du microbiote humain et ses interactions avec l’organisme. Leur utilisation dans ce projet est cohérente avec la première partie de l’étude qui utilise la même souche de souris, mais avec un microbiote normal. Les souris axéniques auront 5 semaines à leur arrivée et commenceront le traitement à l’âge de 9 semaines. Cet âge correspond au début de la maturité sexuelle et au stade « jeune adulte » chez la souris. Il est adapté aux objectifs du projet, les perturbations du microbiote intestinal étudiées concernant notamment cette période de la vie. Les souris conventionnelles seront également traitées à partir de l’âge de 9 semaines afin de conserver les mêmes conditions d’âge entre les différents groupes.

Une plaie ouverte dans une patte arrière, puis quinze minutes à compter les caillots qui s'y forment : 27 souris hémophiles B vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent d'abord une injection quotidienne de facteur IX pendant cinq jours, naturel pour un groupe, variant Padua pour l'autre, l'évaluation intervenant sept jours après la dernière injection. La mise à mort est justifiée par un prélèvement d'un millilitre de sang total, volume que le maintien en vie ne permet pas, et les pattes arrière sont ensuite disséquées. Le porteur précise que ces souris, contrairement aux personnes hémophiles, ne saignent pas spontanément et qu'il faut un traumatisme pour provoquer l'hémorragie étudiée.

Objectifs

L’hémophilie B est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur IX (FIX). La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FIX est indétectable dans le sang, est caractérisée par des saignements spontanés surtout au niveau articulaire. La prise en charge recommandée est le traitement prophylactique par concentrés de FIX afin de réduire voire éviter les saignements spontanés. Cette prophylaxie peut être également effectuée par la thérapie génique qui permet au patient de produire son propre FIX. Le FIX est une petite protéine qui peut diffuser à l’extérieur des vaisseaux et en cas d’apport régulier de FIX (comme lors d’une prophylaxie au long cours) et y former un réservoir extravasculaire autour des vaisseaux. L’objectif de ce projet est d’évaluer le comportement extravasculaire d’un variant du FIX appelé FIX-Padua chez les souris hémophiles B, ce variant est utilisé pour la thérapie génique de l’hémophilie B chez l’homme.

Bénéfices attendus

Au travers de la comparaison des groupes de souris recevant un traitement par FIX-WT ou FIX-Padua, ce projet pourrait améliorer la compréhension des mécanismes extravasculaires du FIX, en particulier du variant Padua, et clarifier son potentiel à former des réservoirs tissulaires. Il permettra d’évaluer si cette accumulation extravasculaire contribue à une hémostase durable, même en l’absence de FIX plasmatique détectable. Ces résultats pourraient guider l’optimisation des stratégies de thérapie génique pour l’hémophilie B, en améliorant l’efficacité clinique et le phénotype hémorragique en réduisant les saignements sévères, notamment au niveau des articulations et des muscles.

Procédures

Les souris seront séparées en 2 groupes : Groupe 1 : traitement prophylactique par FIX naturel (FIX-WT) Groupe 2 : traitement prophylactique par le variant FIX-Padua Un traitement quotidien par FIX (naturel ou variant Padua) 100 UI/kg sera injecté chez toutes les souris et sera poursuivi pendant 5 jours. Ensuite, l’activité coagulante du FIX extravasculaire sera évaluée 7 jours après la dernière injection de FIX, en l’absence de tout résidu du FIX dans le sang. Pour cette évaluation, le nombre de caillots sanguins formés seront comptés pendant 15 minutes à partir d’une plaie vasculaire au niveau d’une patte arrière. Un prélèvement sanguin sera réalisé pour la mesure de FIX qui doit être indétectable. Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress seront effectués sous anesthésie générale et sous médicament anti-douleur. Les souris bénéficieront d’un enrichissement adapté améliorant leur bien-être. Les souris seront mises à mort et les pattes arrière et des organes seront disséquées pour l’étude histologique à la recherche du FIX extravasculaire. Les animaux seront soumis, sous anesthésie générale, à 1. Une plaie vasculaire : 2-3 min 2. Observation de formation de caillots sanguins : 15 min 3. Un prélèvement sanguin : 1 min 4. Une injection: 2 min 5. Un prélèvement sanguin de 1mL et mise à mort: 3-5 min

Impact sur les animaux

Au cours du projet, tous les gestes sont réalisés sous anesthésie à l’isoflurane. Le modèle de souris hémophile KO ne présente pas de saignement spontané mais un risque d’hémorragie en cas de blessure.

Devenir

La mise à mort est justifiée par la nécessité de prélèvement de 1mL de sang total, non compatible avec le maintien en vie de l'animal

Remplacement

La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude l’étude de la diffusion du FIX dans les tissus dont les articulations. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude.

Réduction

En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesures et d’études sur le même animal.

Raffinement

Application de points limites stricts et spécifiques du projet pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie.

Choix des espèces

La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.

Vingt et un jours d'hébergement individuel, cinq injections en cinq jours consécutifs puis une greffe de cellules tumorales : 280 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue par exsanguination sous anesthésie profonde. L'objectif est de comprendre comment des protéines des cellules immunitaires du cerveau éteignent la sensation de faim au cours d'un cancer, la perte de poids et la fonte musculaire attendues étant décrites comme les paramètres mêmes de l'étude. Le porteur justifie la souris par des interactions que ni culture cellulaire ni simulation informatique ne reproduiraient, et conclut que le recours à la souris vivante est, selon ses mots, "indispensable". Seuls des mâles entrent dans le protocole, les femelles issues des croisements étant affectées au maintien des lignées et conservées pour une seconde phase annoncée.

Objectifs

Le cancer s'accompagne fréquemment d'une perte d'appétit sévère et d'une perte de poids importante, un syndrome appelé cachexie cancéreuse. Ce syndrome touche plus de la moitié des personnes atteintes de cancer et est directement responsable de 20% des décès liés au cancer. Malgré son impact considérable sur la qualité de vie et la survie, aucun traitement efficace n'existe à ce jour. On sait que la tumeur produit des substances chimiques qui circulent dans le sang et agissent sur le cerveau pour éteindre la sensation de faim. Ces substances agissent sur une région du cerveau qui joue le rôle de chef d'orchestre de la faim et de la satiété. Dans cette région, des cellules immunitaires du cerveau semblent jouer un rôle clé en relayant les signaux de la tumeur vers les neurones qui déclenchent la sensation de faim. Quand ces cellules immunitaires sont activées par la tumeur, elles produisent des substances nocives qui inhibent les neurones de la faim. Mais le mécanisme précis par lequel cela se produit reste inconnu. Nos recherches ont identifié des protéines présentes dans ces cellules immunitaires du cerveau qui semblent contrôler leur réponse aux signaux tumoraux. En l'absence de ces protéines, les cellules immunitaires du cerveau deviennent moins agressives et produisent moins de substances nocives pour les neurones de la faim. Ce projet vise à comprendre comment ces protéines contrôlent la perte d'appétit associée au cancer, et à évaluer si agir sur elles pourrait constituer une nouvelle piste thérapeutique pour aider les personnes atteintes de cancer à maintenir leur appétit et améliorer leur qualité de vie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre comment les substances produites par une tumeur agissent sur les cellules immunitaires du cerveau pour éteindre la sensation de faim chez les personnes atteintes de cancer. Ces connaissances combleront une lacune majeure dans la compréhension de la perte d'appétit associée au cancer, pour laquelle aucun traitement efficace n'existe à ce jour. À plus long terme, comprendre ce mécanisme ouvrira la voie au développement de nouveaux traitements capables de restaurer l'appétit chez les personnes atteintes de cancer. Cela représente un enjeu majeur car maintenir un bon état nutritionnel améliore la tolérance aux traitements anticancéreux, réduit les complications liées à la dénutrition et améliore significativement la qualité de vie. Les découvertes réalisées dans ce projet pourraient également s'appliquer à d'autres maladies provoquant une perte d'appétit et une fonte musculaire, comme certaines maladies inflammatoires chroniques, l'insuffisance cardiaque ou le vieillissement, élargissant ainsi considérablement leur impact potentiel sur la santé humaine.

Procédures

- Injections d'une molécule permettant d'activer la modification génétique (5 fois, sur 5 jours consécutifs, durée < 30 secondes par injection) - Injection de cellules tumorales ou de solution physiologique pour les contrôles (1 fois, durée < 30 secondes) - Prélèvements sanguins (2 fois, espacés de minimum 3 semaines, durée < 2 minutes) - Évaluation de la composition corporelle et de la force musculaire (3 fois, aux jours 0, 14 et 21, durée < 2 minutes) - Pesée et mesure de la prise alimentaire quotidienne (durée < 1 minute) - Chirurgie finale sans réveil sous anesthésie et analgésie

Impact sur les animaux

Les effets attendus sur les animaux utilisés dans ce projet sont principalement liés au développement tumoral et à ses conséquences sur l'organisme, qui constituent précisément le phénomène étudié. Les souris porteuses de tumeurs pourront présenter une perte de poids progressive, une réduction de la prise alimentaire, une diminution de l'activité et une fonte musculaire au cours des 21 jours de suivi. Ces manifestations sont caractéristiques du modèle de cachexie cancéreuse et représentent les paramètres scientifiques étudiés. Le développement tumoral peut entraîner une gêne locale au site d'injection ainsi qu'un stress modéré lié à la présence de la masse tumorale. Une surveillance quotidienne de l'intégrité de la peau au site d'implantation sera assurée. Les injections répétées sur cinq jours consécutifs peuvent induire un stress modéré lié aux manipulations répétées, sans entraîner de souffrance. Les prélèvements sanguins sont des procédures brèves pouvant induire une douleur ponctuelle lors de l'introduction de l'aiguille. L'hébergement individuel pendant 21 jours peut engendrer un stress lié à l'absence de contact physique avec les autres animaux, atténué par le maintien d'un contact visuel et auditif entre les animaux grâce à des cages transparentes disposées côte à côte. Globalement les effets indésirables attendus sont modérés et feront l'objet d'un suivi clinique rigoureux. À l'issue du protocole, tous les animaux sont mis à mort sous anesthésie et analgésie pour permettre les analyses tissulaires.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin de protocole expérimental pour prélèvement et analyse des tissus, ou lors de l'atteinte des points limites afin de limiter la souffrance. La mise à mort est réalisée par exsanguination sous anesthésie profonde suivie d'une perfusion intracardiaque d'une solution de fixation.

Remplacement

Les questions posées dans ce projet nécessitent d'étudier comment les cellules immunitaires du cerveau communiquent avec les neurones de la faim dans un contexte de cancer, et quelles en sont les conséquences sur le comportement alimentaire et le métabolisme de l'organisme entier. Ces phénomènes font intervenir des interactions complexes entre le système immunitaire, le cerveau et les organes périphériques qu'aucun modèle informatique ou culture cellulaire ne peut reproduire. Des expériences sur cellules sont réalisées en amont de ce projet pour valider les mécanismes impliqués. Ces expériences permettent de réduire le recours à l'animal en limitant les expériences chez la souris aux seules questions qui ne peuvent pas être résolues autrement. Cependant le recours à l'animal vivant est indispensable pour plusieurs raisons. La communication entre les substances produites par la tumeur, les cellules immunitaires du cerveau et les neurones de la faim implique des interactions avec la circulation sanguine et les barrières naturelles du cerveau qui ne peuvent pas être reconstituées en dehors d'un organisme vivant. De même la mesure de la prise alimentaire, du poids et de la composition corporelle nécessite un organisme intègre. Enfin l'utilisation de souris génétiquement modifiées est la seule approche permettant de démontrer le rôle causal des protéines étudiées dans ce contexte. L'utilisation d'animaux vivants est donc indispensable et ne peut pas être remplacée par des alternatives non animales pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux prévu pour ce projet a été déterminé sur la base d'un calcul statistique rigoureux réalisé à partir de données préliminaires disponibles au laboratoire sur la prise alimentaire et le poids corporel de souris porteuses de tumeurs. Ce calcul garantit que le nombre d'animaux utilisés est suffisant pour obtenir des résultats fiables, sans être supérieur au strict nécessaire. Il indique un effectif de 15 animaux par groupe auquel un coefficient de 25% est ajouté pour tenir compte des pertes éventuelles, portant l'effectif à 20 animaux par groupe. Le projet est organisé en trois groupes d'animaux indépendants correspondant aux trois lignées de souris génétiquement modifiées étudiées, chacune avec ses propres animaux contrôles issus de la même portée. Chaque groupe comprend des animaux avec et sans tumeur, soit un total de 280 animaux sur l'ensemble du projet. Plusieurs mesures sont prises pour limiter le nombre total d'animaux utilisés. Des expériences sur cellules sont réalisées en amont pour valider les hypothèses scientifiques et limiter le recours à l'animal aux seules questions ne pouvant pas être résolues autrement. Les tissus prélevés au sacrifice sont partagés entre toutes les analyses prévues afin qu'un même animal contribue simultanément à l'ensemble des mesures sans nécessiter d'animaux supplémentaires. L'utilisation d'animaux issus de la même portée comme contrôles permet de réduire la variabilité entre les individus et donc le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs. Des analyses statistiques sont prévues pour comparer les résultats entre les groupes.

Raffinement

Plusieurs mesures concrètes sont mises en place pour réduire au minimum le stress et la souffrance des animaux tout au long de ce projet. Chaque animal est observé quotidiennement par du personnel formé, ce qui permet de détecter rapidement tout signe de mal-être et d'intervenir immédiatement. Des points limites stricts sont définis et appliqués sans délai dès qu'un animal présente des signes de souffrance, afin de ne pas prolonger inutilement son inconfort. Les cages sont aménagées avec des matériaux de nidification, des abris et des tubes qui permettent aux souris de se réfugier et servent également à les manipuler sans contact direct avec la main, réduisant considérablement leur stress lors des manipulations. Si des signes de perte d'appétit apparaissent, une alimentation adaptée et facilement accessible est proposée pour faciliter l'accès à la nourriture des animaux à mobilité réduite. Dans ce cas, la mesure quotidienne de la prise alimentaire n'est plus interprétable, mais l'animal reste inclus dans le suivi clinique et les analyses tissulaires terminales.. Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé à la manipulation des rongeurs. Une anesthésie et une analgésie adaptées sont administrées pour la mise à mort, garantissant l'absence de souffrance. Tout au long du projet, une veille scientifique est assurée afin d'intégrer les nouvelles méthodes de raffinement disponibles et toute évolution des recommandations en matière de bien-être animal.

Choix des espèces

La cachexie cancéreuse implique des interactions complexes entre le système immunitaire, le cerveau et les organes du corps qui ne peuvent être étudiées que dans un organisme vivant entier. Les organismes plus simples comme la mouche du vinaigre ou le ver de terre ne possèdent pas de région cérébrale comparable à celle étudiée dans ce projet, ni de cellules immunitaires du cerveau équivalentes à celles de la souris et de l'homme. Ils ne permettent donc pas d'étudier la communication entre les cellules immunitaires du cerveau et les neurones de la faim dans un contexte de cancer. De plus les outils génétiques utilisés dans ce projet sont spécifiquement développés et validés chez la souris. Le recours à la souris est donc indispensable et constitue le modèle le plus pertinent scientifiquement tout en représentant le niveau de complexité biologique minimal requis pour répondre aux questions posées. L'induction de la modification génétique est réalisée à l'âge de 6 semaines, suivie d'une période de repos de 4 semaines. Les souris ont donc 10 semaines au moment de l'implantation tumorale. À cet âge leur système immunitaire et leur cerveau sont pleinement matures, ce qui garantit une réponse représentative de la situation adulte et comparable à ce qui est observé chez les personnes atteintes de cancer. Ce projet utilise initialement des souris mâles, en cohérence avec nos données préliminaires et avec les modèles de référence en cachexie cancéreuse, garantissant la comparabilité des résultats. Le cycle hormonal féminin module la prise alimentaire, le métabolisme et les réponses inflammatoires de façon cyclique, ce qui augmente la variabilité entre individus et les effectifs nécessaires. Conformément aux recommandations actuelles, cette stratégie sera étendue aux femelles dans une seconde phase du projet, après validation du mécanisme chez les mâles. Les femelles issues des croisements sont affectées au maintien des lignées (reproduction) et conservées en vue de l'extension de l'étude aux femelles prévue en seconde phase du projet.

Établir les données exigées par les autorités avant un essai clinique ou une mise sur le marché : 5 880 rongeurs, 3 180 souris et 2 700 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une substance leur provoque une hypersalivation, unique ou entretenue, puis ils reçoivent des candidats-médicaments jusqu'à deux fois par jour pendant trois à quatre semaines, avec prélèvements répétés de salive et de sang et des jeûnes de six à huit heures chez la souris, de douze heures chez le rat. Certains arrivent avec un cathéter déjà implanté dans une veine, l'opération ayant été faite chez le fournisseur avant la livraison. Le porteur affirme qu'il n'existe "donc pas de modèle alternatif reproduisant nos procédures expérimentales" et présente ces expériences comme un "prérequis réglementaire majeur" pour les dossiers déposés auprès des autorités.

Objectifs

Dans le cadre de nos programmes internes de maturation et de développement préclinique, nous évaluons de nouvelles molécules pharmaceutiques, qu'il s'agisse de composés innovants ou de médicaments repositionnés. Chaque molécule du pipeline fait l'objet d'études de toxicologie, de pharmacocinétique et d'efficacité. La présente demande porte spécifiquement sur des études d'efficacité dans le domaine de la sialorrhée chez le rat ou la souris. La sialorrhée (hypersalivation ou défaut de clairance salivaire) est un symptôme fréquent chez les patients atteints de pathologies neurologiques telles que la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Parkinson, certaines paralysies cérébrales ou d'autres affections neurodégénératives. Elle altère fortement la qualité de vie, entraîne des difficultés de communication et d'alimentation et accroît le risque de fausses routes et d'infections respiratoires. La caractérisation de l'effet d'un candidat-médicament sur la production salivaire est une étape indispensable du développement préclinique. Elle permet de sélectionner les modèles les plus pertinents, de caractériser l'intensité et la durée de l'effet, de définir les doses et schémas d'administration optimaux tout en limitant les effets indésirables, et d'établir une relation entre le profil pharmacocinétique et l'activité biologique. Le débit salivaire ne pouvant être mesuré de façon fiable chez les patients cibles, ce projet vise à établir, chez le rat ou la souris, la relation entre l'exposition systémique d'agents anti-sialorrhée et l'inhibition de la sécrétion salivaire. Ces données ne peuvent être obtenues qu'au moyen de modèles animaux intégrant les mécanismes physiologiques impliqués (système nerveux autonome, glandes salivaires, distribution du traitement). Elles constituent un prérequis réglementaire majeur pour les dossiers soumis aux autorités, en vue d'un essai clinique ou d'une AMM.

Bénéfices attendus

Ce projet se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans la sialorrhée. Il inclura le screening in vivo de molécules efficaces et l’étude, si nécessaire, de leur mécanisme d’action dans un contexte physiologique et pertinent avant une éventuelle administration chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments dont les effets sur la sialorrhée seraient supérieurs aux molécules de référence, fournissant un préalable nécessaire à toute expérimentation ou commercialisation chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations d’inducteur de la sialorrhée (aigues ou répétées) donnant des modèles aigus ou chroniques, ainsi qu’à des administrations de candidats-médicament de manière aiguë (une seule administration) ou répétée. Les administrations dureront au maximum 15 minutes par séance (temps nécessaire à la contention, l’injection et l’observation immédiate). Le nombre d’administrations dépendra de la molécule et de la voie d’administration considérées, d’une fois par semaine à deux fois par jour pendant 3-4 semaines maximum. Des prélèvements de salives seront réalisés à différents temps quelques minutes après induction du modèle et jusque plusieurs jours après induction à l’aide de dispositifs adaptés. Selon les besoins expérimentaux, la collecte sera effectuée sous anesthésie générale gazeuse ou sous contention légère lorsque cela est possible afin d’optimiser le bien-être de l’animal et la qualité des prélèvements. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse au cours de l’étude (environ 5 minutes par prélèvement). Afin de limiter les nuisances potentielles associées aux prélèvements sanguins répétés, des animaux porteurs de cathéters vasculaires pourront être utilisés, les procédures chirurgicales associées à l'implantation des cathéters ayant alors été réalisées chez le fournisseur dans une veine adaptée aux objectifs de l’étude et permettant la réalisation de prélèvements sanguins répétés sans manipulations invasive répétées. Selon les besoins de l’étude, plusieurs prélèvements pourront être réalisés au cours d’une même journée, tout en veillant à maintenir la perméabilité du dispositif et à assurer le bien-être de l’animal. Tous les prélèvements sanguins respecteront les préconisations concernant le volume maximal autorisé ainsi que le temps de récupération des animaux. En fonction du produit testé, de sa fréquence d’administration et de données scientifiques concernant son absorption, une mise à jeun pré- et/ou post-administration pourra être envisagée. La durée de jeûne sera limitée à la période la plus courte compatible avec l’objectif scientifique, généralement 6 à 8h chez la souris et 12h chez le rat. L’accès à l’eau sera maintenu pendant cette période.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont principalement liées à l’induction transitoire de la sialorrhée, aux possible administrations répétées, aux prélèvements de salive et de sang, ainsi qu’à la contention ou à l’anesthésie nécessaire à certaines procédures. Les injections peuvent provoquer une douleur transitoire ou une petite irritation au point de ponction. L’administration orale peut entraîner un inconfort, une irritation de l’œsophage et du stress lié à la contention. Les administrations répétées, quel que soit le mode, peuvent générer une appréhension de la manipulation et un stress accru. Les animaux pourront présenter une gêne transitoire, une modification temporaire de l’activité, un stress lié à la mise à jeun ainsi que des effets pharmacologiques attendus des composés administrés tels que l’hypersalivation, des larmoiements/sécrétions nasales augmentés, des troubles digestifs et neurologiques (tremblements) légers, une bradycardie transitoire, une somnolence, une modulation de la prise alimentaire/eau. Les prélèvements sanguins intermédiaires (réalisés sous anesthésie) peuvent causer une douleur passagère, une petite hémorragie locale ou un stress lié à la contention ou à l’anesthésie. La cathétérisation d’animaux par le fournisseur agréé pourrait générer des nuisances spécifiques (douleur, inflammation locale) qui seront limitées par une surveillance régulière, l’adaptation des prélèvements, une anesthésie si nécessaire et l’application de points limites adaptés. Les doses administrées seront choisies sur la base de la littérature et/ou des résultats d’études préalables de telle sorte qu’elles n’induisent pas d’effets délétères ou de souffrance chez l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure car certains bio-fluides et tissus devront être prélevés pour réaliser des analyses complémentaires indispensables à l'évaluation scientifique des expérimentations menées. Nous prévoyons de collecter différents bio-fluides (salive et sang) et tissus (comme les glandes sublinguale, submandibulaire, parotide, de la muqueuse buccale) afin de réaliser des analyses d'expression génique ou histologique pour évaluer les éventuels changements morphologiques ou dégénératifs. Ces analyses sont essentielles pour valider les résultats physiopathologiques observés durant les expériences, en apportant des preuves complémentaires au niveau cellulaire et moléculaire.

Remplacement

Notre projet se focalise sur trois modèles d’étude d’efficacité de nouvelles molécules ou de molécules en repositionnement pouvant agir sur la sialorrhée et nécessitant l’utilisation de modèles animaux adéquats mimant au mieux les symptômes observés chez l’Homme. Le débit salivaire ne pouvant pas être mesuré de façon fiable chez les patients cibles, des échelles cliniques validées sont le plus souvent mise en place. Cependant chez le rat ou la souris, le débit salivaire pourra être étudié précisément à travers nos différents modèles afin de reproduire au mieux la pathophysiologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, ce système est indispensable pour reproduire la physiologie d’un organisme entier et est un prérequis réglementaire majeur dans la constitution des dossiers soumis aux autorités compétentes, notamment dans la perspective d’une autorisation d’essai clinique ou d’une demande d’autorisation de mise sur le marché. Les modèles cellulaires permettent d'étudier certains mécanismes impliqués dans la sécrétion salivaire mais ne permettent pas de reproduire l'ensemble des interactions physiologiques entre le système nerveux autonome, les glandes salivaires, la pharmacocinétique du traitement et la réponse pharmacodynamique observée chez l’animal. Il n'existe donc pas de modèle alternatif reproduisant nos procédures expérimentales.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité (6-12 animaux/groupe) du traitement. Une analyse statistique appropriée sera réalisée à l’aide d’un test non paramétrique.

Raffinement

Les conditions d’hébergement respecteront les exigences pour le respect du bien-être de l’animal ; il y aura 2 à 3 rats ou 5 à 6 souris par cage selon le poids de l’animal, avec nourriture à disposition (sauf pendant les périodes de mise à jeun), eau à disposition et présence d’un enrichissement du milieu. Les procédures auront lieu dans une pièce calme, avec une manipulation délicate et habituation à l’expérimentateur. Un tunnel sera utilisé pour manipuler les souris sans les saisir par la queue. Les animaux seront randomisés afin d’optimiser l’expérience. L’objectif est de préserver le bien-être animal et de garantir la validité des résultats en limitant les biais. A la fin des procédures, lors des prélèvements de sang avant euthanasie, une analgésie sera réalisée par l’ajout d’un collyre en plus de l’anesthésie.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles d'étude très développés et caractérisés, étant donné leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études d’efficacité en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Le choix de l'espèce utilisée dépendra en particulier de la molécule utilisée, des objectifs et des besoins de l'étude. Elle pourra être éventuellement testée dans les 2 espèces afin de montrer une efficacité espèce-indépendante. Pour se fournir en animaux, 3 fournisseurs agréés différents sont envisagés pour pallier tout éventuel problème de commande ou de délai d’approvisionnement même si nous privilégions un fournisseur en particulier pour la réalisation de nos études. Les animaux seront âgés de 6 à 8 semaines au minimum, à un stade de jeune adulte pour permettre de déterminer l’efficacité du traitement sur des animaux à maturité sexuelle dont les organes et le système immunitaire sont pleinement développés au début de l’étude

Pour mesurer si la chaleur subie pendant la gestation modifie le sperme de la descendance, 220 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers et modérés. 40 brebis donneuses reçoivent une éponge vaginale, huit injections intramusculaires et deux injections intraveineuses, puis sont tuées pour que leurs utérus livrent les embryons, transférés par chirurgie sous anesthésie générale dans 120 receveuses. 30 des brebis gestantes passent tout leur dernier mois de gestation à 30 °C le jour et 25 °C la nuit, avec un risque d'hyperthermie, de difficultés respiratoires et d'avortement annoncé par le porteur. Les 60 agneaux mâles subissent cinq prises de sang et trois collectes de semence chacun avant d'être tués pour le prélèvement des testicules et de la prostate, les brebis receveuses retournant, elles, au troupeau d'origine.

Objectifs

Dans un contexte de changement climatique, ce projet vise à étudier les conséquences d’une exposition à des températures élevées pendant la fin de la gestation sur le développement de la descendance chez les ovins. L’hypothèse posée par l’étude est qu’une exposition à la chaleur pendant la vie fœtale peut modifier le fonctionnement du placenta et affecter le développement de différents organes chez la descendance. Une attention particulière sera portée au développement de l’appareil reproducteur mâle, car des altérations de la qualité ou de la quantité des spermatozoïdes pourraient avoir des conséquences sur la fertilité et les performances de reproduction. Les analyses porteront notamment sur des mécanismes épigénétiques, qui permettent à notre environnement d'influencer le fonctionnement de certains gènes, sans modifier notre ADN. L’étude repose sur la comparaison d’animaux présentant des capacités différentes de tolérance à la chaleur, élevés dans des conditions climatiques contrastées. Les objectifs scientifiques sont de caractériser les effets du stress thermique sur le fœtus, d’évaluer ses conséquences à long terme sur le développement de la descendance mâle et d’identifier les mécanismes biologiques favorisant l’adaptation aux fortes températures et leur origine. Ce projet se déroulera sur 4 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet cherche à mieux comprendre les conséquences de l’augmentation des températures liée au changement climatique sur les animaux d’élevage. Plus particulièrement, il étudie l’impact d’une exposition à la chaleur pendant la gestation sur le développement fœtal, le poids à la naissance, la croissance des individus et les capacités de reproduction des animaux à l’âge adulte. Les chercheurs souhaitent déterminer si une exposition à des températures élevées avant la naissance peut avoir des effets durables sur le développement des animaux. Ils étudieront également les mécanismes naturels qui permettent à certains animaux de mieux résister à la chaleur que d’autres et chercheront à savoir si cette capacité d’adaptation dépend principalement de la mère ou des échanges entre la mère et le fœtus pendant la gestation. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre comment les animaux s’adaptent aux fortes chaleurs et comment ces adaptations peuvent influencer leur santé et leurs performances de reproduction. À plus long terme, ces connaissances pourraient contribuer au développement de stratégies permettant de limiter les effets négatifs des épisodes de chaleur sur les animaux d’élevage et ainsi aider les filières agricoles à faire face aux conséquences du changement climatique.

Procédures

Les donneuses d’embryons subiront un transport de 2 heures entre l'EU1 et l'EU2, une pose d'éponge par voie intravaginale, une série de 8 injections par voie intra-musculaire et 2 injections intra-veineuses sur animal vigile (EU1). Si les inséminations sont faites avec de la semence congelée, une laparoscopie sera réalisée sur chacune des brebis à inséminer (EU4). Le temps d’intervention de cet acte se compte en minutes (3 à 5 min par brebis). Concernant les receveuses, une pose d'éponge par voie intra-vaginale, une injection par voie intra-musculaire et 2 injections intra-veineuses sur animal vigile et une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie pour le transfert d’embryons (30 minutes) seront réalisées (EU2 et 3). Durée de chaque injection : quelques secondes. 3 prises de sang seront effectuées sur l’ensemble des 60 mères gestantes (à 110 jours, 125 et ~147 jours de gestation). 30 de ces brebis gestantes subiront un stress thermique en bâtiment à ambiance contrôlé durant tout le dernier mois de gestation (30°C en journée et 25°C la nuit). Les descendants mâles subiront 5 prises de sang (naissance, 1, 3, 6 et 9 mois) et des collectes de semence (3 éjaculats par mâles à partir de 8 mois d’âge ; EU2). La durée d'une prise de sang est d'une à deux minutes, contention comprise et celle de la collecte d’un éjaculat de quelques minutes.

Impact sur les animaux

Le transport entre l'EU2 et l'EU1 et la découverte d’un nouvel environnement pourra engendrer un stress transitoire chez les femelles. Certains effets indésirables liés à l’anesthésie et la chirurgie peuvent survenir (hypothermie et douleurs post-opératoires). Le stress thermique pourrait entrainer une hyperthermie sur les brebis avec des difficultés de régulation de température corporelle et respiratoire dues également au dernier stade de gestation. Un risque d’avortement ou de mise-bas précoce pourrait survenir. Un petit hématome pourrait apparaitre à la jugulaire, lié aux quelques prises de sang effectuées. Enfin, le stress généré par l’ensemble des manipulations pourrait également apporter une nuisance supplémentaire.

Devenir

Pour des raisons de compatibilité avec les objectifs de l’étude, la collecte des embryons sera réalisée sur les utérus post-mortem. Les 40 femelles donneuses d'embryons seront donc euthanasiées. Les 120 embryons mâles collectés seront remis en place dans 120 femelles receveuses synchronisées. Toutes celles non gestantes, qui ne seront donc pas intégrées à la suite de la procédure (stress thermique) retourneront au sein du troupeau d’origine (N~60). Toutes celles qui seront gestantes entreront dans l’étape suivante de la procédure (N~60). En fin de procédure, ces mères pourront retourner dans le troupeau d’origine après Le SEVRAGE des descendants. Les descendants mâles seront mis à mort à la fin de l’expérimentation afin de collecter les organes nécessaires à l’étude fonctionnelle de l’impact du dérèglement climatique. L’étude portant sur divers organes, dont les testicules et la prostate, une approche par biopsie n’est pas compatible. Leur retour au sein du troupeau n’est également plus possible (reproduction compromise).

Remplacement

Il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant d’étudier de manière fiable les conséquences d’une exposition à la chaleur pendant la gestation sur le développement des animaux après leur naissance et jusqu’à l’âge adulte. Les objectifs du projet nécessitent d’évaluer les interactions complexes entre la mère, le placenta et le fœtus, ainsi que leurs effets à long terme sur la croissance, la santé et la reproduction de la descendance. Les modèles cellulaires ou les cultures de tissus disponibles aujourd’hui ne permettent pas de reproduire l’ensemble des mécanismes biologiques qui se déroulent au cours de la gestation ni d’évaluer leurs conséquences sur l’organisme entier. Ils ne permettent notamment pas d’étudier les effets de la chaleur sur les échanges entre la mère et le fœtus, ni les répercussions de cette exposition sur le développement futur de l’animal. L’utilisation d’animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet et améliorer les connaissances sur les conséquences du changement climatique pour les animaux d’élevage.

Réduction

Le nombre d’animaux a été optimisé de façon à obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. En ce sens, le nombre d’animaux inclus dans ce projet a été déterminé de manière à obtenir des résultats scientifiquement fiables tout en limitant au maximum leur utilisation. Les connaissances actuelles ne permettent pas encore de prédire précisément les effets d’une exposition à la chaleur pendant la gestation sur le développement futur des animaux. De plus, certaines caractéristiques biologiques étudiées présentent naturellement une forte variabilité entre individus. Le projet prévoit donc le suivi de 60 descendants mâles issus de mères réparties dans différents groupes expérimentaux, avec ou sans exposition à la chaleur pendant la fin de la gestation. Cette organisation permettra de comparer les effets des conditions étudiées tout en tenant compte de la variabilité naturelle observée entre les animaux. Le nombre d’animaux a également été calculé pour compenser les pertes pouvant survenir au cours de l’expérimentation, notamment lorsqu’une gestation n’aboutit pas ou lorsqu’un animal ne peut pas être inclus dans toutes les étapes du suivi. Afin d’obtenir les 60 descendants nécessaires à l’étude, 120 femelles receveuses seront incluses dans le protocole. 40 femelles donneuses seront également nécessaires pour produire les embryons transférés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe, conformément à leur comportement naturel, dans des espaces adaptés avec une litière paillée et différents enrichissements permettant de favoriser leur confort et leurs comportements habituels. Les interventions chirurgicales nécessaires à l’insémination intra-utérine (éventuelle) et au transfert des embryons seront réalisées sous anesthésie générale avec une prise en charge adaptée de la douleur avant, pendant et après l’intervention. Des mesures complémentaires seront mises en place pour assurer le confort des animaux, notamment le maintien de leur température corporelle pendant et après la chirurgie. Les techniques utilisées sont choisies afin de limiter au maximum le caractère invasif des interventions et de favoriser une récupération rapide. Les prélèvements sanguins seront réalisés par du personnel qualifié et expérimenté selon des méthodes couramment utilisées en élevage. Ces actes sont de courte durée et n’entraînent qu’une gêne légère et temporaire. Les animaux seront habitués à la présence des soigneurs et manipulés dans des conditions visant à réduire leur stress. Après chaque prélèvement, une récompense alimentaire leur sera distribuée. L’état de santé et le comportement des animaux seront surveillés quotidiennement pendant toute la durée du projet. En cas d’apparition d’un problème de santé ou de signes de douleur, un traitement approprié sera administré sous la supervision du vétérinaire référent afin de limiter au maximum toute souffrance.

Choix des espèces

Les ovins ont été choisis en raison de leur reproduction saisonnée, soumise au stress thermique soit en fin de gestation, soit en début de gestation (selon les pratiques des éleveurs). De plus les avantages biologiques apportés par cette espèce (temps de gestation court et taille des animaux) permettent aux ovins de servir de modèle pour d’autres espèces et notamment les gros ruminants. Cette étude permettra d'évaluer l'effet d’un stress thermique appliqué en fin de gestation (dernier mois) en environnement contrôlé sur la construction du phénotype de la descendance. Mais également d’identifier les mécanismes de thermo-adaptation et leur origine, en comparant deux races ovines ayant des capacités de résilience différentes au stress thermique (race française vs Brésilienne). Toutes les femelles (donneuses et receveuses) seront des adultes sexuellement matures. Les animaux générés après mise-bas seront des agneaux mâles et ils seront suivi jusqu’à un stade post-puberté (~9 mois d’âge). Ces animaux permettront d'évaluer l'effet d’un stress thermique appliqué en fin de gestation (dernier mois) en environnement contrôlé sur la construction du phénotype de la descendance.

1 072 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers et modérés. Une arthrite leur est déclenchée par deux injections en deux jours, relancée après rémission chez certaines, puis des nanoparticules sont injectées dans la veine de la queue ou directement dans l'articulation de la cheville sous anesthésie gazeuse. Les bénéfices annoncés, repérer plus tôt les personnes à risque et développer de meilleurs traitements, sont renvoyés au terme du projet, quand le gonflement articulaire et les rechutes provoquées sont immédiats. Sur le remplacement, le porteur écrit que les cellules en boîte et les mini-organes ne reproduisent ni la circulation du sang ni l'organisation d'une articulation, et qualifie les deux formes d'arthrite induites de "les plus adaptés pour répondre de façon fiable à nos questions".

Objectifs

L’arthrite est une maladie qui provoque une inflammation des articulations (comme les genoux, les chevilles, les doigts ou les poignets). Quand une articulation est enflammée, elle peut devenir gonflée, rouge, chaude et douloureuse. La maladie se passe souvent par périodes : il y a des moments où l’inflammation est très forte (on appelle ça des poussées), puis des moments où ça va mieux (rémission). Mais parfois, l’inflammation revient (rechute). À long terme, l’arthrite peut abîmer le cartilage et l’os et rendre les mouvements plus difficiles. Aujourd’hui, on ne comprend pas encore exactement pourquoi l’inflammation commence, pourquoi elle s’arrête, ni pourquoi elle revient. Dans notre corps, il existe des cellules qui nous protègent contre les microbes. Parmi elles, il y a les macrophages. On peut les comparer à des « agents de nettoyage » et de défense du corps. Dans les articulations, il existe deux grands types de macrophages : les macrophages résidents qui sont déjà présents dans l’articulation et aident l’articulation à rester en bonne santé et les macrophages recrutés qui arrivent depuis le sang comme des renforts appelés en urgence. Des études récentes montrent que certains macrophages recrutés peuvent rester dans l’articulation même après la fin d’une poussée. Mais on ne sait pas encore si cela peut faire revenir la maladie. Le but de notre projet est de mieux comprendre le rôle de ces deux types de macrophages pendant les différentes étapes de l’arthrite : au début de la poussée, quand la maladie se calme, et quand elle revient. Pour cela, nous utilisons un modèle d’arthrite chez la souris, car il permet d’étudier l’inflammation dans un organisme vivant et de comprendre des mécanismes qui ne peuvent pas être observés uniquement en laboratoire sur des cellules isolées. À terme, ce projet nous permettra de repérer plus tôt les personnes à risque d’arthrite et de développer de meilleurs traitements pour les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet peut apporter plusieurs bénéfices importants : 1. Mieux comprendre l’arthrite. Nous voulons mieux connaître le rôle des deux types de macrophages aux différentes étapes de la maladie et lors des rechutes. Cela aidera à comprendre pourquoi, chez certaines personnes, l’inflammation s’installe et continue longtemps alors que chez d’autres, elle disparaît. 2. Trouver de meilleurs indicateurs de la maladie. Nous cherchons des “marqueurs”, c’est-à-dire des signes mesurables dans les cellules, qui permettraient de suivre l’évolution de la maladie, de prévoir une poussée et de mieux voir si un traitement fonctionne. 3. Ouvrir la voie à de nouveaux traitements. En comprenant mieux comment agissent ces cellules, nous pourrions identifier de nouvelles façons d’agir sur l’inflammation, avec des traitements plus précis et qui provoquent moins de réactions indésirables. 4. Aider au-delà de l’arthrite. Les mécanismes étudiés concernent aussi d’autres maladies inflammatoires. Les résultats pourraient donc être utiles à un plus grand nombre de patients.

Procédures

Pour mener ce projet, nous utilisons des souris et réalisons des gestes courts et répétés sur une durée limitée. 1) Pour reproduire l’arthrite, les souris vigiles reçoivent deux injections en deux jours (J0 et J1, qui durent 10-20 secondes). Chez certaines, une seconde série d’injections est relancée après rémission de la même façon. Selon le site d’injection, une brève anesthésie au gaz (geste

Impact sur les animaux

Pour réaliser ce projet, les souris sont brièvement maintenues pour de petites injections rapides (10 à 20 secondes). Cela peut provoquer une gêne légère au point de piqûre, qui disparaît rapidement. Les injections dans l’articulation sont faites sous anesthésie au gaz avec réveil rapide. Les signes liés au modèle d’arthrite comprennent souvent une rougeur et un gonflement passager de l’articulation (degré modéré). Les souris sont observées cinq fois par semaine (poids, hydratation, gonflement des pattes). En cas de perte de poids >10 % en 7 jours, ou gonflement important des pattes (> 1,4 mm d’épaisseur) nous mettons en place respectivement des aliments humidifiés et une analgésie adaptée. Si un problème persiste, les gestes sont arrêtés et l’animal est retiré de l’étude. Ces mesures systématiques qui sont mises en place pour prévenir, soulager et écourter tout inconfort assurent le respect du bien-être animal tout au long de l’étude et sont indispensables pour obtenir des résultats fiables tout en respectant les animaux utilisés.

Devenir

À la fin de l’étude, tous les animaux sont mis à mort. Cela est nécessaire pour permettre la collecte des organes et tissus et l’analyse des effets du modèle expérimental et des traitements testés.

Remplacement

Aujourd’hui, il n’existe pas de méthode sans animal qui permette d’observer, dans un organisme vivant, comment les différents types de macrophages se comportent au cours d’une poussée d’arthrite, d’une rémission puis d’une rechute. Les cellules en boîte ou les mini-organes de laboratoire ne reproduisent ni la circulation du sang, ni l’organisation d’une articulation. Les modèles de souris que nous utilisons (deux formes d’arthrite, l’une qui a tendance à se résoudre, l’autre plus persistante) offrent une évolution prévisible et sont les plus adaptés pour répondre de façon fiable à nos questions.

Réduction

Nous limitons le nombre d’animaux au strict nécessaire grâce à un calcul statistique préalable (6 souris par groupe et par moment clé). Nous regroupons les contrôles quand c’est possible, et nous réalisons plusieurs analyses sur les mêmes animaux en utilisant des articulations différentes. Pour les injections dans l’articulation, une patte reçoit le produit à tester et l’autre sert de témoin, ce qui divise le nombre d’animaux par 2. Les prélèvements sont réalisés au même moment pour ne pas avoir besoin de créer plusieurs groupes d’animaux contrôles.

Raffinement

Les gestes sont courts, réalisés avec de fines aiguilles, avec contention douce et réchauffement. Les injections dans l’articulation sont faites sous anesthésie au gaz, avec réveil surveillé. Si un animal montre des signes d’inconfort, une analgésie adaptée peut être administrée sans perturber les résultats. Les souris sont suivies cinq fois par semaine (poids, hydratation, gonflement des pattes) et plus souvent dans les 72 h après une injection. Des seuils d’arrêt clairs (perte de poids importante, gonflement excessif des pattes) entraînent l’arrêt immédiat des gestes et, si nécessaire, un retrait de l’animal de l’étude. Aucun prélèvement n’est réalisé sur animal éveillé.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus adaptée pour ce projet. Elle permet d’utiliser des lignées « sur mesure » qui rendent visibles ou modifiables certaines cellules. Cela est indispensable pour distinguer les macrophages déjà présents dans l’articulation de ceux qui arrivent depuis le sang, et pour tester leur rôle au bon moment. Les modèles d’arthrite utilisés provoquent soit une poussée rapide et prévisible suivie d’une résolution, soit une évolution plus lente et durable. Ces modèles sont idéaux pour suivre les différentes phases de la maladie et identifier les mécanismes qui persistent et empêchent la rémission. Nous utilisons des souris adultes (12 à 16 semaines). À cet âge, les cellules que nous étudions sont bien développées et la taille de souris facilite la réalisation de gestes sûrs et les résultats sont plus homogènes.

Tuées, gardées pour la reproduction ou versées à d'autres protocoles, 25 400 souris vont être élevées sur trois ans pour fournir sept lignées génétiquement altérées, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers et modérés. Entre 7 et 12 jours de vie, chaque souriceau subit un tatouage des phalanges et le prélèvement d'un morceau de queue de moins de 0,5 mm pour le génotypage. Celles qui portent les mutations neuromusculaires étudiées peuvent présenter une atteinte locomotrice, une polypnée ou des signes de déshydratation, et le porteur écrit les tuer avant l'apparition des symptômes quand aucun protocole ne les réclame. Le champ structuré du devenir compte ces 25 400 souris comme mortes, alors que le texte annonce qu'une partie reste en vie pour la reproduction ou pour d'autres projets, sans en donner la proportion.

Objectifs

Ce projet a pour but de produire et de génotyper des animaux d'élevage à des fins d'utilisation scientifique. Il permettra l’élevage de 7 souches de souris génétiquement altérées nécessaires à la mise en œuvre de différents projets de recherche ayant pour but de comprendre la physiopathologie des maladies étudiées dans notre Laboratoire et de trouver des approches thérapeutiques innovantes pour des maladies neuromusculaires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices devant découler de ce projet concernent le domaine de la santé humaine. Ils visent à valider l’effet thérapeutique de molécules d’intérêt ou de produits de thérapie génique pour un groupe de maladies humaines rares et orphelines de médicaments, sur des modèles de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de maladies neuromusculaires rares.

Procédures

Les prélèvements de tissus à partir d'un très petit morceau de queue sont réalisés sur animaux vigiles. Cet acte est réalisé en même temps que le tatouage des phalanges et n’est pratiqué qu’une seule fois. Au total, moins de 5 minutes sont nécessaires pour réaliser ces deux actes par animal. En effet, si les prélèvements de tissus s'executent en moins d'une minute, les instruments doivent être désinfectés entre chaque animal ce qui peut prendre 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont liées à la méthode de prélèvement de tissu sur jeunes animaux vigiles pour le génotypage. La contention d’animaux jeunes pour se faire peut entrainer un stress et une douleur légère passagère ne dépassant pas quelques heures. Les animaux porteurs des pathologies étudiées dans notre Laboratoire peuvent présenter un phénotype dommageable de type atteinte locomotrice, polypnée ou signes de déshydratation. Ces symptômes peuvent correspondre à un degré d'inconfort jugé modéré.

Devenir

Euthanasie des animaux ou maintien en en vie pour la reproduction ou une utilisation continue dans des projets applicatifs.

Remplacement

Un effort de remplacement est réalisé en amont voire en parallèle du programme d'élevage. En effet, nous essayons dans un premier temps de répondre aux questions biologiques qui se posent à nous à l'aide de modèles cellulaires. L’utilisation d’animaux dans des études n'est effective que lorsque les modèles cellulaires ne peuvent pas répondre aux questions biologiques. Par exemple, lorsqu'il est nécessaire d’étudier les symptômes liés à des troubles du comportement moteur caractéristiques des maladies neuromusculaires que nous étudions ou encore pour étudier la biodistribution d’un traitement dans l'organisme.

Réduction

Nous avons prévu d’utiliser un total de 25400 souris pour fournir les animaux nécessaires à l'ensemble des expériences pour les 5 années d'études à venir sachant que nos besoins peuvent évoluer en fonction d'éventuelles ré-orientations des objectifs scientifiques à l'appui de nouvelles publications scientifiques et de nouveaux résultats. Aussi nous sommes-nous basés sur les données statistiques de 2022 et 2023 ainsi que sur l'historique des données de production des lignées maintenues dans notre établissement pour faire cette estimation. Cette base d'estimation nous amène à envisager une moyenne de 5080 souris par année pour les 7 lignées de souris objet de ce dossier, soit un total de 25400 souris sur 5 ans. Les deux sexes seront utilisés dans les protocoles lorsque la maladie n’est pas liée au sexe ou que le projet n’est pas dépendant d’un des deux sexes.

Raffinement

Dans ce programme d’élevage, les animaux mimant les pathologies étudiées seront utilisés pour les projets applicatifs ou seront euthanasiés avant l’apparition des symptômes. Nous évitons ainsi l’expression du phénotype dommageable quand il n’est pas associé à un besoin expérimental. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi (maisonnette en cellulose, bâtonnets en bois, élément pour la confection des nids, copeaux, tunnel, autres éléments spatiaux d'enrichissement) et sont observés quotidiennement. Au moment du sevrage, nous ne séparons les fratries que par sexe et ne regroupons pas les mâles (frères et germains) à plus de 2 semaines d'écart d'âge pour limiter le risque d’agressivité. De la nourriture est ajoutée directement sur le sol de la cage et des pipettes d’eau plus longues sont mises en place pour que les juvéniles sevrés ou les animaux présentant une atteinte locomotrice aient facilement accès à l'eau et à l'aliment. Le cas échéant, un aliment hydratant et nourrissant peut être placé à même le sol dans une coupelle pour les animaux déshydratés. Pour ne plus attraper les animaux par la queue lors du change des litières, les zootechniciens utilisent leurs mains jointes en creux ou des tubes pour inciter les animaux à passer d’une cage à l’autre par eux-mêmes. Concernant les biopsies de tissu pour l'identification génétique des animaux, elles sont effectuées une seule fois entre 7 et 12 jours de vie par prélèvement d'un très petit bout de queue (moins de 0,5 mm). Ce prélèvement de tissu est réalisé à un âge où l’ossification et l’innervation des tissus ne sont pas encore bien différenciées.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies comme animaux modèles car ces animaux ont pu être modifiés génétiquement afin de présenter les mutations génétiques responsables des différentes maladies étudiées dans notre Equipe, ce qui en font le plus petit modèle animal présentant les signes cliniques et pathologiques mimant ces maladies. Les animaux de ce projet d’élevage seront utilisés à un stade précoce pour les identifications individuelles (microtatouage) et l'identification génétique ; et à un stade plus tardif de maturité sexuelle pour le renouvellement des reproducteurs.