Procédures légères

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit une biopsie pour génotypage, et 144 d'entre elles passent 72 heures isolées en cage de mesure, subissent deux tests de glycémie avec sept prélèvements de sang chacun et suivent onze semaines de régime hypercalorique à partir de six semaines d'âge. Les 48 mères reçoivent un gavage les trois premiers jours après l'accouplement, et 32 d'entre elles des antibiotiques pendant 21 ou 36 jours pour supprimer leur microbiote intestinal, l'enjeu étant de mesurer ce que cette suppression fait au métabolisme de leur descendance. Les 48 mères et les 384 souriceaux sont tués pour prélèvement d'organes, tandis que les mâles ayant servi à la reproduction, des souris de réforme d'élevage, sont réutilisés dans l'établissement sans figurer au décompte des 432.

Objectifs

La forte prévalence de l'obésité et du diabète, en particulier chez les enfants, souligne la nécessité de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement de ces pathologies. Des études antérieures ont montré qu’une modification de l’environnement maternel contribue aux maladies métaboliques tout au long de la vie. Le microbiote intestinal constitue une communauté complexe et dynamique de bactéries vivant dans le système digestif. Des changements dans la composition ou la fonction du microbiote intestinal ont été associés au développement de maladies métaboliques. Des données récentes suggèrent que le microbiote intestinal maternel influence le métabolisme, le comportement, le développement du cerveau chez la progéniture. Cependant, il reste à déterminer comment le microbiote maternel exerce ces effets sur la descendance. Chez l’individu adulte, il est connu que le microbiote intestinal exerce des effets anti-obésité et anti-diabète en activant la production de glucose par l’intestin appelée la néoglucogenèse intestinale. Nos résultats récents montrent que l’activation de la néoglucogenèse intestinale pendant la période de gestation ou de lactation améliore durablement la santé de l’individu une fois adulte. Une absence de microbiote maternel pourrait donc bloquer la stimulation de la néoglucogenèse intestinale lors du développement et altérer la santé de l’individu à l’âge adulte. Dans cette étude, réalisée dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2), nous déterminerons si la stimulation génétique de la néoglucogenèse intestinale dès la gestation contrecarre les effets métaboliques induits par l’absence du microbiote maternel.

Bénéfices attendus

Cette étude fait partie d’un projet qui étudie le rôle du microbiote maternel sur le métabolisme de la descendance. L’objectif du projet est de moduler le microbiote uniquement pendant la période de gestation et de lactation. Chez l’homme, l’alimentation maternelle est associée à une stimulation de la néoglucogenèse intestinale en comparaison avec une alimentation utilisant du lait infantile. Si nos résultats démontrent que la stimulation de la néoglucogenèse intestinale dès la gestation programme de manière positive la santé de l’individu adulte, nous pourrons proposer des perspectives efficaces pour contrecarrer le développement des maladies métaboliques. Ces perspectives pourront par exemple se traduire par des modifications de l’alimentation des mamans et de leurs nourrissons destinées à induire la néoglucogenèse intestinale.

Procédures

Pour sélectionner les souris transgéniques, un petit morceau de tissu (biopsie) sera prélevé à toutes les souris du projet pour caractériser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes (EU1). Les 48 femelles subiront un gavage les trois premiers jours après l’accouplement (30 secondes) et un prélèvement de sang (30 secondes) 21 jours après la mise bas (EU1). Parmi ces femelles, 32 recevront un traitement d’antibiotiques : 16 pendant 21 jours et 16 pendant 36 jours. Parmi les 384 descendants, 144 : - seront soumis à un régime hypercalorique dès l’âge de 6 semaines et pendant 11 semaines (EU1 + EU2). - subiront 2 tests pour analyser la régulation de leur glycémie pendant 2h après l’injection de glucose ou d’insuline (injections réalisées en 20 à 30 secondes chez la souris maintenue en contention) chez des animaux mis à jeun pendant 6h (EU1). Pour chaque test, 7 prélèvements de sang seront réalisés à l’extrémité de la queue en 15 secondes maximum sur des souris libres de mouvement. Une seule incision de l’extrémité de la queue sera réalisée avant le premier prélèvement de sang (EU1). - seront soumises à mesure de la composition corporelle par un analyseur dédié (EU2). Cette mesure sera réalisée chez l’animal éveillé mais maintenu immobile. Elle est rapide (2 minutes) et non invasive - seront isolées pendant 72h dans des cages spécifiques pour mesurer leur dépense énergétique (EU2). On mesurera leurs échanges gazeux (respiration), leur prise alimentaire et hydrique et leur activité physique. Cette mesure se fait de manière non-invasive. En fin d’expérience, une prise de sang terminale sera faite rapidement (en moins de 15-20 secondes) après une mise à jeun pendant 6h (EU1). L’animal sera mis à mort immédiatement après la prise de sang pour permettre le prélèvement de certains organes, qui seront ensuite étudiés en laboratoire (EU1).

Impact sur les animaux

Le traitement aux antibiotiques n’entraine pas de modification du comportement maternel, de perte de poids et de mal-être. Le gavage pourrait provoquer une légère irritation de l’œsophage. Les prélèvements sanguins peuvent engendrer une légère douleur de très courte durée au moment de la piqure. La réalisation de certains gestes (biopsie, injections, mesure de la composition corporelle) peut entrainer un léger stress lors de l’immobilisation nécessaire. Les effets indésirables prévus sur les animaux sont également : - une douleur lors de la biopsie. - les symptômes liés à une hypoglycémie liée à l’injection d’insuline, c’est-à-dire une baisse de leur activation jusqu’à leur prostration, un mal-être, voir des convulsions et un coma si l’hypoglycémie est sévère. - un stress léger dû à la privation de nourriture pendant 6h. - un stress pendant l’isolement de 72h pour la dépense énergétique.

Devenir

Les 48 femelles et 384 souriceaux issus des croisements seront mis à mort pour prélèvements d’organes. Les mâles utilisés pour la reproduction seront réutilisés dans l’EU1.

Remplacement

Cette étude ne peut pas être réalisée sur des cellules ou organoïdes car elle concerne l’influence de l’environnement maternel sur un paramètre d’un descendant. Les connaissances actuelles ne permettent pas de reproduire la complexité de l’environnement maternel sur un modèle cellulaire représentant l’organe du descendant.

Réduction

Le nombre de souris utilisées dans la procédure d’étude a été calculé au plus juste à partir des connaissances des modèles animaux et des connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, 8 descendants par condition seront utilisés pour étudier les conséquences de l’absence de microbiote intestinal maternel sur les souriceaux et 12 descendants par condition pour étudier les conséquences sur les descendants adultes. Au total, ce projet réalisé sur 5 ans nécessitera 432 souris transgéniques. Les mâles utilisés pour l’obtention des portées sont des souris de réforme d’élevage.

Raffinement

Pour favoriser l’accouplement, le soir précédent l’accouplement, de la litière des mâles sera introduite dans la cage des femelles et vice et versa. Les portées seront équilibrées à 8 bébés par portées en réalisant des adoptions de souriceaux issus de grandes portées par des mères de petites portées. Pour limiter le stress de séparation des nouveau-nés de leur mère en cas d’adoption, l’expérimentateur se frottera les mains avec la litière et les souriceaux à adopter seront déplacés avec de la litière et une partie du nid. Pour limiter l’irritation, le gavage sera réalisé avec une sonde de gavage souple préalablement trempée dans une solution d’eau sucrée pour favoriser la déglutition de l’animal. Pour les mesures répétées de la glycémie, une petite incision de l’extrémité de la queue sera réalisée après application d’une pommade anesthésiante. Le sang sera ensuite prélevé sans autre incision pour l’ensemble des prélèvements Les volumes de sang prélevés resteront très limités conformément aux recommandations internationales sur le bien-être animal. Les souris seront transportées entre l’EU1 et l’EU2 dans des cages permettant de conserver le confinement, selon les conditions règlementaires. La durée du trajet n’excède pas 10 minutes. Le stress lié à l’isolement pour la mesure du métabolisme énergétique sera atténué en plaçant de la litière souillée de la cage d’origine des souris et par l’ajout d’un tube leur permettant de se cacher. Une période de découverte de ce nouvel environnement sera réalisée pendant 3 h, puis une période d’acclimatation de 24h précédera les mesures. Les animaux seront pesés toutes les semaines et seront observés pour détecter tout signe de mal-être, souffrance, lésions ou de détérioration de l’état de santé général avec la mise en place de points limites précoces. Ces points sont spécifiques au projet et adaptés à l’âge des animaux et aux interventions réalisées.

Choix des espèces

Le rôle de la production endogène de glucose par l’intestin pendant la période néonatale a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Nos études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Nous étudions l’importance du microbiote intestinal maternel sur la descendance donc cette étude concerne des femelles adultes âgées de 14 semaines. Leurs descendants seront étudiés à 10 jours et à l’âge adulte (entre 6 et 17 semaines).

Transportées deux heures, pourvues d'une éponge vaginale puis soumises à huit injections intramusculaires et deux injections intraveineuses sur animal vigile, 40 brebis donneuses d'embryons sont tuées pour que la collecte se fasse sur leurs utérus après la mort. Les 120 receveuses subissent une chirurgie de transfert d'embryon de trente minutes sous anesthésie générale, et 30 des brebis gestantes passent tout leur dernier mois de gestation à 30 degrés le jour et 25 la nuit, avec un risque d'hyperthermie, d'avortement ou de mise-bas précoce que le porteur reconnaît. Les 220 moutons relèvent de procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, les agneaux mâles nés de ces gestations subissant cinq prises de sang entre la naissance et neuf mois, puis trois collectes de semence. Les receveuses non gestantes et les mères après sevrage retournent au troupeau d'origine, 120 au total, tandis que les descendants mâles sont mis à mort pour prélever leurs organes, dont les testicules et la prostate, leur retour au troupeau étant écarté au motif que leur reproduction est compromise.

Objectifs

Dans un contexte de changement climatique, ce projet vise à étudier les conséquences d’une exposition à des températures élevées pendant la fin de la gestation sur le développement de la descendance chez les ovins. L’hypothèse posée par l’étude est qu’une exposition à la chaleur pendant la vie fœtale peut modifier le fonctionnement du placenta et affecter le développement de différents organes chez la descendance. Une attention particulière sera portée au développement de l’appareil reproducteur mâle, car des altérations de la qualité ou de la quantité des spermatozoïdes pourraient avoir des conséquences sur la fertilité et les performances de reproduction. Les analyses porteront notamment sur des mécanismes épigénétiques, qui permettent à notre environnement d'influencer le fonctionnement de certains gènes, sans modifier notre ADN. L’étude repose sur la comparaison d’animaux présentant des capacités différentes de tolérance à la chaleur, élevés dans des conditions climatiques contrastées. Les objectifs scientifiques sont de caractériser les effets du stress thermique sur le fœtus, d’évaluer ses conséquences à long terme sur le développement de la descendance mâle et d’identifier les mécanismes biologiques favorisant l’adaptation aux fortes températures et leur origine. Ce projet se déroulera sur 4 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet cherche à mieux comprendre les conséquences de l’augmentation des températures liée au changement climatique sur les animaux d’élevage. Plus particulièrement, il étudie l’impact d’une exposition à la chaleur pendant la gestation sur le développement fœtal, le poids à la naissance, la croissance des individus et les capacités de reproduction des animaux à l’âge adulte. Les chercheurs souhaitent déterminer si une exposition à des températures élevées avant la naissance peut avoir des effets durables sur le développement des animaux. Ils étudieront également les mécanismes naturels qui permettent à certains animaux de mieux résister à la chaleur que d’autres et chercheront à savoir si cette capacité d’adaptation dépend principalement de la mère ou des échanges entre la mère et le fœtus pendant la gestation. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre comment les animaux s’adaptent aux fortes chaleurs et comment ces adaptations peuvent influencer leur santé et leurs performances de reproduction. À plus long terme, ces connaissances pourraient contribuer au développement de stratégies permettant de limiter les effets négatifs des épisodes de chaleur sur les animaux d’élevage et ainsi aider les filières agricoles à faire face aux conséquences du changement climatique.

Procédures

Les donneuses d’embryons subiront un transport de 2 heures entre l'EU1 et l'EU2, une pose d'éponge par voie intravaginale, une série de 8 injections par voie intra-musculaire et 2 injections intra-veineuses sur animal vigile (EU1). Si les inséminations sont faites avec de la semence congelée, une laparoscopie sera réalisée sur chacune des brebis à inséminer (EU4). Le temps d’intervention de cet acte se compte en minutes (3 à 5 min par brebis). Concernant les receveuses, une pose d'éponge par voie intra-vaginale, une injection par voie intra-musculaire et 2 injections intra-veineuses sur animal vigile et une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie pour le transfert d’embryons (30 minutes) seront réalisées (EU2 et 3). Durée de chaque injection : quelques secondes. 3 prises de sang seront effectuées sur l’ensemble des 60 mères gestantes (à 110 jours, 125 et ~147 jours de gestation). 30 de ces brebis gestantes subiront un stress thermique en bâtiment à ambiance contrôlé durant tout le dernier mois de gestation (30°C en journée et 25°C la nuit). Les descendants mâles subiront 5 prises de sang (naissance, 1, 3, 6 et 9 mois) et des collectes de semence (3 éjaculats par mâles à partir de 8 mois d’âge ; EU2). La durée d'une prise de sang est d'une à deux minutes, contention comprise et celle de la collecte d’un éjaculat de quelques minutes.

Impact sur les animaux

Le transport entre l'EU2 et l'EU1 et la découverte d’un nouvel environnement pourra engendrer un stress transitoire chez les femelles. Certains effets indésirables liés à l’anesthésie et la chirurgie peuvent survenir (hypothermie et douleurs post-opératoires). Le stress thermique pourrait entrainer une hyperthermie sur les brebis avec des difficultés de régulation de température corporelle et respiratoire dues également au dernier stade de gestation. Un risque d’avortement ou de mise-bas précoce pourrait survenir. Un petit hématome pourrait apparaitre à la jugulaire, lié aux quelques prises de sang effectuées. Enfin, le stress généré par l’ensemble des manipulations pourrait également apporter une nuisance supplémentaire.

Devenir

Pour des raisons de compatibilité avec les objectifs de l’étude, la collecte des embryons sera réalisée sur les utérus post-mortem. Les 40 femelles donneuses d'embryons seront donc euthanasiées. Les 120 embryons mâles collectés seront remis en place dans 120 femelles receveuses synchronisées. Toutes celles non gestantes, qui ne seront donc pas intégrées à la suite de la procédure (stress thermique) retourneront au sein du troupeau d’origine (N~60). Toutes celles qui seront gestantes entreront dans l’étape suivante de la procédure (N~60). En fin de procédure, ces mères pourront retourner dans le troupeau d’origine après Le SEVRAGE des descendants. Les descendants mâles seront mis à mort à la fin de l’expérimentation afin de collecter les organes nécessaires à l’étude fonctionnelle de l’impact du dérèglement climatique. L’étude portant sur divers organes, dont les testicules et la prostate, une approche par biopsie n’est pas compatible. Leur retour au sein du troupeau n’est également plus possible (reproduction compromise).

Remplacement

Il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant d’étudier de manière fiable les conséquences d’une exposition à la chaleur pendant la gestation sur le développement des animaux après leur naissance et jusqu’à l’âge adulte. Les objectifs du projet nécessitent d’évaluer les interactions complexes entre la mère, le placenta et le fœtus, ainsi que leurs effets à long terme sur la croissance, la santé et la reproduction de la descendance. Les modèles cellulaires ou les cultures de tissus disponibles aujourd’hui ne permettent pas de reproduire l’ensemble des mécanismes biologiques qui se déroulent au cours de la gestation ni d’évaluer leurs conséquences sur l’organisme entier. Ils ne permettent notamment pas d’étudier les effets de la chaleur sur les échanges entre la mère et le fœtus, ni les répercussions de cette exposition sur le développement futur de l’animal. L’utilisation d’animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet et améliorer les connaissances sur les conséquences du changement climatique pour les animaux d’élevage.

Réduction

Le nombre d’animaux a été optimisé de façon à obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. En ce sens, le nombre d’animaux inclus dans ce projet a été déterminé de manière à obtenir des résultats scientifiquement fiables tout en limitant au maximum leur utilisation. Les connaissances actuelles ne permettent pas encore de prédire précisément les effets d’une exposition à la chaleur pendant la gestation sur le développement futur des animaux. De plus, certaines caractéristiques biologiques étudiées présentent naturellement une forte variabilité entre individus. Le projet prévoit donc le suivi de 60 descendants mâles issus de mères réparties dans différents groupes expérimentaux, avec ou sans exposition à la chaleur pendant la fin de la gestation. Cette organisation permettra de comparer les effets des conditions étudiées tout en tenant compte de la variabilité naturelle observée entre les animaux. Le nombre d’animaux a également été calculé pour compenser les pertes pouvant survenir au cours de l’expérimentation, notamment lorsqu’une gestation n’aboutit pas ou lorsqu’un animal ne peut pas être inclus dans toutes les étapes du suivi. Afin d’obtenir les 60 descendants nécessaires à l’étude, 120 femelles receveuses seront incluses dans le protocole. 40 femelles donneuses seront également nécessaires pour produire les embryons transférés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe, conformément à leur comportement naturel, dans des espaces adaptés avec une litière paillée et différents enrichissements permettant de favoriser leur confort et leurs comportements habituels. Les interventions chirurgicales nécessaires à l’insémination intra-utérine (éventuelle) et au transfert des embryons seront réalisées sous anesthésie générale avec une prise en charge adaptée de la douleur avant, pendant et après l’intervention. Des mesures complémentaires seront mises en place pour assurer le confort des animaux, notamment le maintien de leur température corporelle pendant et après la chirurgie. Les techniques utilisées sont choisies afin de limiter au maximum le caractère invasif des interventions et de favoriser une récupération rapide. Les prélèvements sanguins seront réalisés par du personnel qualifié et expérimenté selon des méthodes couramment utilisées en élevage. Ces actes sont de courte durée et n’entraînent qu’une gêne légère et temporaire. Les animaux seront habitués à la présence des soigneurs et manipulés dans des conditions visant à réduire leur stress. Après chaque prélèvement, une récompense alimentaire leur sera distribuée. L’état de santé et le comportement des animaux seront surveillés quotidiennement pendant toute la durée du projet. En cas d’apparition d’un problème de santé ou de signes de douleur, un traitement approprié sera administré sous la supervision du vétérinaire référent afin de limiter au maximum toute souffrance.

Choix des espèces

Les ovins ont été choisis en raison de leur reproduction saisonnée, soumise au stress thermique soit en fin de gestation, soit en début de gestation (selon les pratiques des éleveurs). De plus les avantages biologiques apportés par cette espèce (temps de gestation court et taille des animaux) permettent aux ovins de servir de modèle pour d’autres espèces et notamment les gros ruminants. Cette étude permettra d'évaluer l'effet d’un stress thermique appliqué en fin de gestation (dernier mois) en environnement contrôlé sur la construction du phénotype de la descendance. Mais également d’identifier les mécanismes de thermo-adaptation et leur origine, en comparant deux races ovines ayant des capacités de résilience différentes au stress thermique (race française vs Brésilienne). Toutes les femelles (donneuses et receveuses) seront des adultes sexuellement matures. Les animaux générés après mise-bas seront des agneaux mâles et ils seront suivi jusqu’à un stade post-puberté (~9 mois d’âge). Ces animaux permettront d'évaluer l'effet d’un stress thermique appliqué en fin de gestation (dernier mois) en environnement contrôlé sur la construction du phénotype de la descendance.

Valider chez la souris un vaccin contre le mélanome en vue d'une publication et d'un dépôt de brevet : 465 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque souris reçoit de trois à neuf injections sous-cutanées sur une durée maximale de 80 jours, certaines recevant en outre des cellules tumorales qui font pousser une tumeur sur leur flanc, mesurée trois fois par semaine. Le porteur classe la douleur de la piqûre comme un "inconfort mineur ne justifiant pas d'anesthésie/analgésie associée", et compte parmi les nuisances les trois heures trente de transport entre l'élevage et le lieu d'expérimentation. Rate et tumeur sont prélevées après la mise à mort, et l'efficacité obtenue doit décider du brevet et du transfert du produit en clinique.

Objectifs

L'objectif du projet est d'évaluer in vivo l'efficacité d'un nouveau type de vaccin contre le cancer. Ce vaccin est constitué de deux éléments qui coopèrent pour aboutir à une meilleure réponse immunitaire. L'avantage attendu de ce type de vaccination est d’augmenter l'efficacité du système immunitaire pour aller détruire la tumeur. Nos résultats préalables ont démontré l'efficacité de ces vaccins sur des expériences en laboratoire et nous devons désormais valider notre approche sur des souris pour pouvoir espérer la mettre en œuvre ensuite chez l'homme. Notre principal modèle d'étude est un modèle de souris vaccinées contre le tétanos auxquelles nous transplanterons une tumeur ressemblant au mélanome. Les souris seront ensuite vaccinées avec les vaccins testés. Nous espérons démontrer ainsi l'efficacité de ce vaccin pour limiter la croissance tumorale chez ces souris.

Bénéfices attendus

L'objectif principal de ce projet est d’obtenir des preuves d’efficacité de vaccins optimisés chez la souris justifiant la mise en place d’immunothérapies dans le traitement des mélanomes. En fonction de l’efficacité obtenue, ces travaux feront l’objet d’une publication scientifique et d’un dépôt de brevet en vue d’un développement clinique du produit.

Procédures

Les animaux sont soumis à des injections par voie sous-cutanée de vaccins d’une composition proche d'un vaccin humain. Les animaux reçoivent entre 3 et 9 injections sous-cutanées, sur une durée totale maximale de 80 jours. L'injection en elle-même dure 3-5 secondes. Certains animaux reçoivent aussi par voie sous-cutanée une petite quantité de cellules tumorales qui vont générer une tumeur sur le flanc de l'animal. Cette injection se fait sous anesthésie générale. Le suivi de la croissance tumorale et le poids des animaux est effectué 3 fois par semaine, les souris sont donc manipulées régulièrement.

Impact sur les animaux

Les nuisances suivantes sont identifiées : 1) stress lié au transport entre le lieu d'élevage et le lieu de l'expérimentation (3h30 de voyage) 2) douleur intrinsèque liée à la piqure (toutes les injections, de peptide et de cellules tumorales sont réalisées par voie sous-cutanée), considérée comme inconfort mineur ne justifiant pas d'anesthésie/analgésie associée. Selon les lots, les souris subiront au maximum 9 injections. 3) développement d'une tumeur de type sarcome sur le flanc dont la croissance sera suivie et qui nécessitera donc 3 manipulations des animaux par semaine (mesure de la croissance tumorale, suivi de poids).

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure car nous avons besoin de prélever des organes pour analyses (rate et tumeur).

Remplacement

Les résultats attendus dans cette étude ne peuvent pas à ce jour être remplacés par des procédures in vitro. Bien que nous développions des méthodes alternatives à l'expérimentation animale, l'évaluation du bénéfice thérapeutique in vivo reste indispensable. Ce projet s'appuie sur des données préliminaires prometteuses obtenues sur cellules, qui justifient de les tester sur des modèles animaux. Notre étude permettra d'évaluer l'efficacité du traitement proposé en conditions physiologiques. Ces résultats seront importants lors de la valorisation du produit et de son transfert espéré en clinique.

Réduction

Le nombre de lot d'animaux est réduit le plus possible : 3 lots pour mesurer la réponse immunitaire et 2 ou 3 lots pour évaluer le bénéfice thérapeutique. Le nombre total d'animaux prévoit l'évaluation de 10 vaccins qui seront testés en séquentiel selon les résultats obtenus. Nous vérifions systématiquement la prise tumorale sur un petit nombre d'animaux avant de lancer une procédure complète ce qui permet d'éviter les expériences non concluantes. Le nombre d'animaux par lot a été estimé initialement à l'aide de tests statistiques et grâce à nos données préliminaires. Nous savons qu'avec 10 souris par groupe, nous pourrons mesurer l’efficacité du vaccin.

Raffinement

Le recours à des expériences préliminaires réalisées sur un petit nombre de souris nous a permis initialement de valider les paramètres expérimentaux et de prendre en main le modèle expérimental. Cette précaution nous permet de limiter le risque de résultats non concluants. Les souris qui vont recevoir les tumeurs sont rasées la veille de l'injection et l'injection se fait sous anesthésie ce qui permet une implantation tumorale plus précise, avec une croissance plus homogène et donc une évaluation de la taille tumorale plus précise. Nous raffinons également nos procédures expérimentales par la définition de points limites adaptés à un modèle de croissance tumorale, ce qui permet un arrêt de la procédure si des souffrances sont suspectées. Nous raffinons également les données collectées : à la fin de l’expérimentation, nous collectons les tumeurs et les cellules immunitaires pour des analyses approfondies..

Choix des espèces

Le modèle animal dont nous avons besoin ici est un modèle de souris dont le génome a été modifié pour produire des réponses immunitaires similaires à celles observées chez l’homme. Selon la disponibilité des animaux, nous faisons en sorte que les lots soient le plus homogène possible en terme de disparité d'âge et la constitution des lots est faite au hasard.

Une injection d'insuline chez des souris mises à jeun six heures peut les conduire jusqu'à la prostration, aux convulsions et au coma si l'hypoglycémie devient sévère, effet que le résumé énonce lui-même. 432 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 48 femelles reproductrices et 384 descendants, certains isolés soixante-douze heures en cage de mesure de la dépense énergétique. Le décompte déclaré les donne toutes tuées et aucune réutilisée, quand la rubrique sur leur destin précise que "Les mâles utilisés pour la reproduction seront réutilisés dans l'EU1". Ces mâles, décrits plus loin comme des "souris de réforme d'élevage", n'apparaissent dans aucun des deux chiffres.

Objectifs

La forte prévalence de l'obésité et du diabète, en particulier chez les enfants, souligne la nécessité de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement de ces pathologies. Des études antérieures ont montré qu’une modification de l’environnement maternel contribue aux maladies métaboliques tout au long de la vie. Le microbiote intestinal constitue une communauté complexe et dynamique de bactéries vivant dans le système digestif. Des changements dans la composition ou la fonction du microbiote intestinal ont été associés au développement de maladies métaboliques. Des données récentes suggèrent que le microbiote intestinal maternel influence le métabolisme, le comportement, le développement du cerveau chez la progéniture. Cependant, il reste à déterminer comment le microbiote maternel exerce ces effets sur la descendance. Chez l’individu adulte, il est connu que le microbiote intestinal exerce des effets anti-obésité et anti-diabète en activant la production de glucose par l’intestin appelée la néoglucogenèse intestinale. Nos résultats récents montrent que l’activation de la néoglucogenèse intestinale pendant la période de gestation ou de lactation améliore durablement la santé de l’individu une fois adulte. Une absence de microbiote maternel pourrait donc bloquer la stimulation de la néoglucogenèse intestinale lors du développement et altérer la santé de l’individu à l’âge adulte. Dans cette étude, réalisée dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2), nous déterminerons si la stimulation génétique de la néoglucogenèse intestinale dès la gestation contrecarre les effets métaboliques induits par l’absence du microbiote maternel.

Bénéfices attendus

Cette étude fait partie d’un projet qui étudie le rôle du microbiote maternel sur le métabolisme de la descendance. L’objectif du projet est de moduler le microbiote uniquement pendant la période de gestation et de lactation. Chez l’homme, l’alimentation maternelle est associée à une stimulation de la néoglucogenèse intestinale en comparaison avec une alimentation utilisant du lait infantile. Si nos résultats démontrent que la stimulation de la néoglucogenèse intestinale dès la gestation programme de manière positive la santé de l’individu adulte, nous pourrons proposer des perspectives efficaces pour contrecarrer le développement des maladies métaboliques. Ces perspectives pourront par exemple se traduire par des modifications de l’alimentation des mamans et de leurs nourrissons destinées à induire la néoglucogenèse intestinale.

Procédures

Pour sélectionner les souris transgéniques, un petit morceau de tissu (biopsie) sera prélevé à toutes les souris du projet pour caractériser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes (EU1). Les 48 femelles subiront un gavage les trois premiers jours après l’accouplement (30 secondes) et un prélèvement de sang (30 secondes) 21 jours après la mise bas (EU1). Parmi ces femelles, 32 recevront un traitement d’antibiotiques : 16 pendant 21 jours et 16 pendant 36 jours. Parmi les 384 descendants, 144 : - seront soumis à un régime hypercalorique dès l’âge de 6 semaines et pendant 11 semaines (EU1 + EU2). - subiront 2 tests pour analyser la régulation de leur glycémie pendant 2h après l’injection de glucose ou d’insuline (injections réalisées en 20 à 30 secondes chez la souris maintenue en contention) chez des animaux mis à jeun pendant 6h (EU1). Pour chaque test, 7 prélèvements de sang seront réalisés à l’extrémité de la queue en 15 secondes maximum sur des souris libres de mouvement. Une seule incision de l’extrémité de la queue sera réalisée avant le premier prélèvement de sang (EU1). - seront soumises à mesure de la composition corporelle par un analyseur dédié (EU2). Cette mesure sera réalisée chez l’animal éveillé mais maintenu immobile. Elle est rapide (2 minutes) et non invasive - seront isolées pendant 72h dans des cages spécifiques pour mesurer leur dépense énergétique (EU2). On mesurera leurs échanges gazeux (respiration), leur prise alimentaire et hydrique et leur activité physique. Cette mesure se fait de manière non-invasive. En fin d’expérience, une prise de sang terminale sera faite rapidement (en moins de 15-20 secondes) après une mise à jeun pendant 6h (EU1). L’animal sera mis à mort immédiatement après la prise de sang pour permettre le prélèvement de certains organes, qui seront ensuite étudiés en laboratoire (EU1).

Impact sur les animaux

Le traitement aux antibiotiques n’entraine pas de modification du comportement maternel, de perte de poids et de mal-être. Le gavage pourrait provoquer une légère irritation de l’œsophage. Les prélèvements sanguins peuvent engendrer une légère douleur de très courte durée au moment de la piqure. La réalisation de certains gestes (biopsie, injections, mesure de la composition corporelle) peut entrainer un léger stress lors de l’immobilisation nécessaire. Les effets indésirables prévus sur les animaux sont également : - une douleur lors de la biopsie. - les symptômes liés à une hypoglycémie liée à l’injection d’insuline, c’est-à-dire une baisse de leur activation jusqu’à leur prostration, un mal-être, voir des convulsions et un coma si l’hypoglycémie est sévère. - un stress léger dû à la privation de nourriture pendant 6h. - un stress pendant l’isolement de 72h pour la dépense énergétique.

Devenir

Les 48 femelles et 384 souriceaux issus des croisements seront mis à mort pour prélèvements d’organes. Les mâles utilisés pour la reproduction seront réutilisés dans l’EU1.

Remplacement

Cette étude ne peut pas être réalisée sur des cellules ou organoïdes car elle concerne l’influence de l’environnement maternel sur un paramètre d’un descendant. Les connaissances actuelles ne permettent pas de reproduire la complexité de l’environnement maternel sur un modèle cellulaire représentant l’organe du descendant.

Réduction

Le nombre de souris utilisées dans la procédure d’étude a été calculé au plus juste à partir des connaissances des modèles animaux et des connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, 8 descendants par condition seront utilisés pour étudier les conséquences de l’absence de microbiote intestinal maternel sur les souriceaux et 12 descendants par condition pour étudier les conséquences sur les descendants adultes. Au total, ce projet réalisé sur 5 ans nécessitera 432 souris transgéniques. Les mâles utilisés pour l’obtention des portées sont des souris de réforme d’élevage.

Raffinement

Pour favoriser l’accouplement, le soir précédent l’accouplement, de la litière des mâles sera introduite dans la cage des femelles et vice et versa. Les portées seront équilibrées à 8 bébés par portées en réalisant des adoptions de souriceaux issus de grandes portées par des mères de petites portées. Pour limiter le stress de séparation des nouveau-nés de leur mère en cas d’adoption, l’expérimentateur se frottera les mains avec la litière et les souriceaux à adopter seront déplacés avec de la litière et une partie du nid. Pour limiter l’irritation, le gavage sera réalisé avec une sonde de gavage souple préalablement trempée dans une solution d’eau sucrée pour favoriser la déglutition de l’animal. Pour les mesures répétées de la glycémie, une petite incision de l’extrémité de la queue sera réalisée après application d’une pommade anesthésiante. Le sang sera ensuite prélevé sans autre incision pour l’ensemble des prélèvements Les volumes de sang prélevés resteront très limités conformément aux recommandations internationales sur le bien-être animal. Les souris seront transportées entre l’EU1 et l’EU2 dans des cages permettant de conserver le confinement, selon les conditions règlementaires. La durée du trajet n’excède pas 10 minutes. Le stress lié à l’isolement pour la mesure du métabolisme énergétique sera atténué en plaçant de la litière souillée de la cage d’origine des souris et par l’ajout d’un tube leur permettant de se cacher. Une période de découverte de ce nouvel environnement sera réalisée pendant 3 h, puis une période d’acclimatation de 24h précédera les mesures. Les animaux seront pesés toutes les semaines et seront observés pour détecter tout signe de mal-être, souffrance, lésions ou de détérioration de l’état de santé général avec la mise en place de points limites précoces. Ces points sont spécifiques au projet et adaptés à l’âge des animaux et aux interventions réalisées.

Choix des espèces

Le rôle de la production endogène de glucose par l’intestin pendant la période néonatale a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Nos études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Nous étudions l’importance du microbiote intestinal maternel sur la descendance donc cette étude concerne des femelles adultes âgées de 14 semaines. Leurs descendants seront étudiés à 10 jours et à l’âge adulte (entre 6 et 17 semaines).

Une partie des souris de ce projet porte, introduite dans son génome, la mutation humaine du syndrome de Noonan, et certaines lignées créées à cette occasion pourraient développer des tumeurs, source de douleur et de perte de poids selon le résumé. Ce second volet, mené dans le premier des deux établissements utilisateurs, déclare lui aussi 1 920 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Injection d'insuline, gavage cinq jours sur sept pendant quatre semaines, huit piqûres pour mesurer la glycémie, irradiation, greffe de moelle osseuse : les gestes s'accumulent sur les mêmes individus, cumul que le porteur inscrit dans sa rubrique sur la réduction. Les seuils retenus pour mettre fin à la vie des souris sont une perte de poids de plus de 20 % en moins d'une semaine, l'hypothermie, ou un score de souffrance supérieur à 9.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre la physiopathologie du syndrome de Noonan (SN), une maladie génétique relativement fréquente principalement causée par des mutations sur le gène codant la proteine tyrosine phosphatase SHP2, qui causent une trop forte activation de cette protéine. Les patients présentent de multiples atteintes développementales (malformations du cœur, du crâne, du squelette, retard de croissance), mais aussi des troubles communément retrouvés chez l’individu âgé dans la population générale : syndrome métabolique, ostéoporose, cancers du sang, inflammation systémique, faiblesse musculaire. A l’appui de ces observations cliniques, de premières données in vitro révèlent un phénomène de vieillissement accéléré (appelé sénescence) dans des cellules exprimant des formes mutées de SHP2. De même, un modèle de la maladie développé chez la souris, en mutant le gène codant SHP2 pour introduire la mutation responsable de la maladie chez l’Homme, présente ce même vieillissement dans ses tissus dès son plus jeune âge. Ces données suggèrent que l’hyperactivation de SHP2 associée au SN pourrait provoquer un phénotype de vieillissement précoce dont nous souhaitons élucider les mécanismes, et qu’en miroir, l’inhibition de SHP2 pourrait freiner le développement de maladies liées à l’âge. Les objectifs du projet sont donc - de caractériser un modèle murin du SN du point de vue des pathologies liées à l’âge et de la longévité. - d’identifier les mécanismes responsables de ce phénotype, en explorant le rôle de la sénescence, des cellules du système immunitaires et de certaines hormones, dont on sait déjà qu’elles présentent des anomalies dans le SN. - d’évaluer si l’inhibition de SHP2 permet d’améliorer les pathologies liées à l’âge. LA MODIFICATION D'UNE PROCEDURE NECESSITE UNE MODIFICATION DU PROJET INITIAL AUTORISE AVEC AJOUT DE 256 ANIMAUX.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre la physiopathologie du SN afin de proposer des stratégies thérapeutiques et un suivi adapté aux patients. Au-delà des maladies rares, ce projet pourrait permettre d’identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans le développement des pathologies liées à l’âge.

Procédures

-La mise à jeun des animaux pendant 6h pour normaliser la glycémie. -L’injection d’insuline et la contention associée sont réalisées une fois, durée max 15s. -Le gavage et la contention associée (durée

Impact sur les animaux

-Effets indésirables liées à l’établissement de nouvelles lignées : Certaines lignées générées dans le cadre de ce projet pourraient développer des tumeurs ce qui peut être source de douleur et de perte de poids mais pourra être anticipé par le suivi de l’expression précoce d’un marqueur fluorescent dans les cellules cancéreuses. -La mise à jeun des animaux représente un stress. -L’injection d’insuline et la contention associée sont source d’inconfort et de douleur légère au point d’injection. -Le gavage et la contention associée (durée

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés

Remplacement

Le syndrome de Noonan (SN) est une maladie génétique pour laquelle les patients portent dans toutes leurs cellules une mutation dite « gain-de-fonction » sur le gène codant pour SHP2, c’est-à-dire qui rend la protéine plus active. Les souris modèles de cette maladie développent les principaux symptômes de la maladie et représentent en ce sens le meilleur modèle d’étude de cette pathologie. Ce projet vise à mieux comprendre la physiopathologie du SN au regard du développement de pathologies liées à l’âge, ce qui nécessite un modèle intégré permettant une étude à l'échelle de l'organisme entier prenant en compte notamment des échanges hormonaux, du dialogue inter-organe et la contribution de cellules sanguines. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche. Les procédures expérimentales présentées à l’appui de ce projet ne peuvent donc pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Toutefois, des tests in vitro sur cellules en culture ont été préalablement réalisés pour limiter au maximum l'expérimentation sur l'animal.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes questions scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant à la fois sur les données bibliographiques et sur des études préliminaires déjà réalisées par le porteur du projet au cours des précédents projets. Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène, des groupes de 8 animaux seront nécessaires afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Pour les suivis tout au long de la vie des animaux, 20% d’animaux supplémentaires seront prévus pour pallier des pertes d’animaux en cours de protocole. Dans un souci de réduction, le projet a été designé afin de réaliser plusieurs expériences sur les mêmes groupes dès lors qu’elles ne sont pas susceptibles d’interférer les unes avec les autres. Les tissus et organes prélevés seront collectés afin de pouvoir réaliser différents types d’analyses.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (igloo, frisure, papier) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause de bagarres ou pour certaines expériences). Les cages sont passées en revue quotidiennement et les animaux sont observés en détail au moins 2 fois par semaine pour repérer les blessures éventuelles, un comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal, maigreur, problème de dentition), et pesés 1 fois par semaine. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale et un analgésique sera utilisé en parallèle de ces procédures pour minimiser toute douleur.Les points limites sont: émaciation ou perte de poids > 20% en moins d’une semaine, hypothermie, cumul de signes de souffrance (prostration, poil hirsute, dos rond, perte d'activité, ou tout autre signe clinique jugé par le technicien expérimenté comme indiquant un état de souffrance auquel nous ne serions pas en mesure de remédier dans les 24h) atteignant un scoring >9. Ceux-ci permettront d’écarter précocement les animaux du protocole ou de les mettre à mort immédiatement en fonction de l’intensité des comportements observés et donc du niveau de souffrance.Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience.

Choix des espèces

Les modèles murins utilisés dans ce projet représentent les seuls modèles de mammifères génétiquement modifiés pour reproduire la maladie humaine SN. De plus, les souris représentent un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques, endocriniennes et cardiaques. Pour la caractérisation d’un éventuel phénotype dommageable des lignées, les animaux seront suivis dès la période de croissance (3-8 semaines). Le reste des expériences, s’agissant de suivre des pathologies liées à l’âge, sera réalisé sur des animaux adultes de 3 à 24 mois.

1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, sur un projet dont la modification a ajouté 256 souris. Elles subissent un jeûne de six heures, une injection d'insuline, un gavage cinq jours sur sept pendant vingt-huit jours, une irradiation et une transplantation de moelle osseuse, certaines passant quarante-huit heures isolées en cage de calorimétrie. Les tests sont nommés, un grip test qui étire l'animal par traction de la queue, répété deux fois, et des tests d'équilibre et de démarche hors de l'environnement familier. Le porteur écrit qu'étudier le vieillissement accéléré lié au syndrome de Noonan réclame "un modèle intégré permettant une étude à l'échelle de l'organisme entier", et conclut : "Le recours à l'animal est donc indispensable".

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre la physiopathologie du syndrome de Noonan (SN), une maladie génétique relativement fréquente principalement causée par des mutations sur le gène codant la proteine tyrosine phosphatase SHP2, qui causent une trop forte activation de cette protéine. Les patients présentent de multiples atteintes développementales (malformations du cœur, du crâne, du squelette, retard de croissance), mais aussi des troubles communément retrouvés chez l’individu âgé dans la population générale : syndrome métabolique, ostéoporose, cancers du sang, inflammation systémique, faiblesse musculaire. A l’appui de ces observations cliniques, de premières données in vitro révèlent un phénomène de vieillissement accéléré (appelé sénescence) dans des cellules exprimant des formes mutées de SHP2. De même, un modèle de la maladie développé chez la souris, en mutant le gène codant SHP2 pour introduire la mutation responsable de la maladie chez l’Homme, présente ce même vieillissement dans ses tissus dès son plus jeune âge. Ces données suggèrent que l’hyperactivation de SHP2 associée au SN pourrait provoquer un phénotype de vieillissement précoce dont nous souhaitons élucider les mécanismes, et qu’en miroir, l’inhibition de SHP2 pourrait freiner le développement de maladies liées à l’âge. Les objectifs du projet sont donc - de caractériser un modèle murin du SN du point de vue des pathologies liées à l’âge et de la longévité. - d’identifier les mécanismes responsables de ce phénotype, en explorant le rôle de la sénescence, des cellules du système immunitaires et de certaines hormones, dont on sait déjà qu’elles présentent des anomalies dans le SN. - d’évaluer si l’inhibition de SHP2 permet d’améliorer les pathologies liées à l’âge. LA MODIFICATION D'UNE PROCEDURE NECESSITE UNE MODIFICATION DU PROJET INITIAL AUTORISE AVEC AJOUT DE 256 ANIMAUX.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre la physiopathologie du SN afin de proposer des stratégies thérapeutiques et un suivi adapté aux patients. Au-delà des maladies rares, ce projet pourrait permettre d’identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans le développement des pathologies liées à l’âge.

Procédures

-La mise à jeun des animaux pendant 6h pour normaliser la glycémie. -L’injection d’insuline et la contention associée sont réalisées une fois, durée max 15s. -Le gavage et la contention associée (durée

Impact sur les animaux

-Effets indésirables liées à l’établissement de nouvelles lignées : Certaines lignées générées dans le cadre de ce projet pourraient développer des tumeurs ce qui peut être source de douleur et de perte de poids mais pourra être anticipé par le suivi de l’expression précoce d’un marqueur fluorescent dans les cellules cancéreuses. -La mise à jeun des animaux représente un stress. -L’injection d’insuline et la contention associée sont source d’inconfort et de douleur légère au point d’injection. -Le gavage et la contention associée (durée

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés

Remplacement

Le syndrome de Noonan (SN) est une maladie génétique pour laquelle les patients portent dans toutes leurs cellules une mutation dite « gain-de-fonction » sur le gène codant pour SHP2, c’est-à-dire qui rend la protéine plus active. Les souris modèles de cette maladie développent les principaux symptômes de la maladie et représentent en ce sens le meilleur modèle d’étude de cette pathologie. Ce projet vise à mieux comprendre la physiopathologie du SN au regard du développement de pathologies liées à l’âge, ce qui nécessite un modèle intégré permettant une étude à l'échelle de l'organisme entier prenant en compte notamment des échanges hormonaux, du dialogue inter-organe et la contribution de cellules sanguines. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche. Les procédures expérimentales présentées à l’appui de ce projet ne peuvent donc pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Toutefois, des tests in vitro sur cellules en culture ont été préalablement réalisés pour limiter au maximum l'expérimentation sur l'animal.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes questions scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant à la fois sur les données bibliographiques et sur des études préliminaires déjà réalisées par le porteur du projet au cours des précédents projets. Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène, des groupes de 8 animaux seront nécessaires afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Pour les suivis tout au long de la vie des animaux, 20% d’animaux supplémentaires seront prévus pour pallier des pertes d’animaux en cours de protocole. Dans un souci de réduction, le projet a été designé afin de réaliser plusieurs expériences sur les mêmes groupes dès lors qu’elles ne sont pas susceptibles d’interférer les unes avec les autres. Les tissus et organes prélevés seront collectés afin de pouvoir réaliser différents types d’analyses.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (igloo, frisure, papier) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause de bagarres ou pour certaines expériences). Les cages sont passées en revue quotidiennement et les animaux sont observés en détail au moins 2 fois par semaine pour repérer les blessures éventuelles, un comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal, maigreur, problème de dentition), et pesés 1 fois par semaine. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale et un analgésique sera utilisé en parallèle de ces procédures pour minimiser toute douleur.Les points limites sont: émaciation ou perte de poids > 20% en moins d’une semaine, hypothermie, cumul de signes de souffrance (prostration, poil hirsute, dos rond, perte d'activité, ou tout autre signe clinique jugé par le technicien expérimenté comme indiquant un état de souffrance auquel nous ne serions pas en mesure de remédier dans les 24h) atteignant un scoring >9. Ceux-ci permettront d’écarter précocement les animaux du protocole ou de les mettre à mort immédiatement en fonction de l’intensité des comportements observés et donc du niveau de souffrance. Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience.

Choix des espèces

Les modèles murins utilisés dans ce projet représentent les seuls modèles de mammifères génétiquement modifiés pour reproduire la maladie humaine SN. De plus, les souris représentent un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques, endocriniennes et cardiaques. Pour la caractérisation d’un éventuel phénotype dommageable des lignées, les animaux seront suivis dès la période de croissance (3-8 semaines). Le reste des expériences, s’agissant de suivre des pathologies liées à l’âge, sera réalisé sur des animaux adultes de 3 à 24 mois.

Six femelles seront stérilisées et gardées dans l'élevage, les autres tuées pour prélever leurs organes : 2 896 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Vingt femelles reçoivent sous la peau, sous anesthésie, un à trois comprimés de ciclosporine, et quatorze d'entre elles subissent ensuite jusqu'à neuf micro-prélèvements sanguins, une contention de dix à quinze minutes pour mesurer leur tension, et un recueil d'urine. Leur descendance passe par les mêmes mesures, le projet cherchant à savoir si l'exposition à cet immunosuppresseur avant la naissance abîme les reins ou la fertilité une fois adulte. Le porteur indique que des cultures de reins fœtaux humains exposés au médicament ont déjà montré une baisse de la fonction rénale après sept jours, et retient la souris parce que ces cultures ne reproduisent pas une exposition longue.

Objectifs

Depuis les années 1980, des femmes ayant reçu une greffe d’organe ou prenant des médicaments qui affaiblissent le système immunitaire peuvent mener une grossesse à terme. Pendant la grossesse, ces médicaments — appelés immunosuppresseurs (IS)— doivent être ajustés avec soin. Ils servent à empêcher le rejet de la greffe et à protéger la mère contre les infections mais exposent le bébé. Parmi les médicaments les plus utilisés figure la ciclosporine. Comme ces traitements ne peuvent pas être arrêtés, le bébé y est forcément exposé pendant la grossesse. Après la naissance, des études ont estimé que les concentrations sanguines de médicaments étaient faibles et sans conséquence pour le développement ultérieur de l'enfant. Mais on ne sait pas encore si cette exposition peut avoir des effets plus tard dans la vie, par exemple sur les reins ou la fertilité. Aucune étude n’a suivi ces enfants jusqu’à l’âge adulte. Pour répondre à ces questions, ce projet étudie chez la souris les effets de la ciclosporine sur la grossesse, les reins de la mère, la fertilité et les risques d’hypertension des petits exposés avant la naissance, et la santé de leurs reins une fois adultes. La souris est un bon modèle, car elle permet d’observer rapidement (en environ 80 jours) les effets du médicament sur la mère et sur sa descendance, tout en limitant les risques liés à l’immunosuppression.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, on ne sait pas encore si le fait d’être exposé avant la naissance à certains médicaments immunosuppresseurs peut augmenter le risque, une fois adulte, de développer de l’hypertension ou une maladie rénale chronique. Pourtant, cette question est très importante pour les parents et les médecins qui suivent les enfants nés de femmes greffées. On ignore également si cette exposition pendant la grossesse peut avoir un impact sur la fertilité des enfants une fois qu’ils deviennent adultes. Ce point n’a encore jamais été étudié. Ce projet se concentre sur un médicament en particulier : la ciclosporine. L’objectif est de vérifier si les enfants exposés pendant la grossesse présentent : • une hypertension artérielle, • des problèmes de fonctionnement des reins, • ou des troubles de la fertilité. Nous analyserons aussi au microscope les tissus des reins et des organes reproducteurs pour voir s’il existe des anomalies. À plus long terme, des études sur d’autres traitements utilisés chez les femmes greffées pourront être menées afin de comprendre leurs effets séparément ou en combinaison. Les résultats attendus permettront d’améliorer le conseil prénatal des femmes qui envisagent une grossesse sous IS, de favoriser le dépistage et la prévention chez les enfants et les jeunes adultes qui ont été exposés pendant la grossesse à ces traitements IS.

Procédures

20 souris recevront sous la peau, 1, 2 ou 3 comprimés de médicament, sous anesthésie et analgésie (1 fois, 20 minutes par animal). Préalablement ces animaux auront reçu une injection sous-cutanée d'analgésique, réalisée sur animal vigile (moins d'une minute par animal). Six de ces femelles seront stérilisées et conservées dans l'élevage. Les 14 femelles restantes auront 1-des micro-prélèvements sanguins (30 secondes) avec 9 prélèvements au maximum, alternés d'au moins 1 semaine, 2-une mesure de la tension artérielle, induisant une contention de 10 à 15 minutes, 1 fois par animal, et 3- un prélèvement d'urine par contention (10 secondes, 1 fois). Les animaux de première génération (nées des 14 femelles traitées) feront l'objet de : 1- plusieurs micro-prélèvements sanguins (30 secondes) avec 3 prélèvements au maximum, alternés d'au moins 1 semaine (24 animaux concernés), 2-une mesure de la tension artérielle, induisant une contention de 10 à 15 minutes, 1 fois par animal (36 animaux concernés) et 3-un prélèvement d'urine par contention (10 secondes, 1 fois) (24 animaux concernés).

Impact sur les animaux

Stérilisation des femelles : douleur modérée suite à la chirurgie, risque d'infection post chirurgie. Implantation des comprimés en sous-cutanée : douleur légère. Effets de l'immunosuppresseur sur les mères traitées et sur leur descendance : -risque de dommages sur les reins qui sera surveillé par des dosages dans le sang et dans les urines. Des micro-prélèvements de sang répétés entraineront du stress et une douleur légère. Recueils d’urine : léger stress de la contention. -risque d'hypertension : léger stress de la contention pendant la mesure de la pression sanguine.

Devenir

Six femelles traitées au médicament seront stérilisées et conservées au sein de l'élevage. Le reste des animaux sera mis à mort afin de collecter les organes qui permettront de mener les analyses biologiques nécessaires pour évaluer l'impact de l'exposition.

Remplacement

Des études réalisées chez des femmes exposées aux IS suite à une transplantation rénale, ont estimé que les concentrations sanguines de médicament chez le nouveau-né étaient très faibles et sans conséquence pour son développement ultérieur dans les premières années de vie. Par ailleurs, des études ex vivo de reins fœtaux humains exposés à l'IS et réalisés au laboratoire, ont montré une diminution de la fonction du rein, après 7 jours d’exposition. Ces cultures ex vivo ne peuvent cependant pas mimer un temps long d’exposition. Pour connaitre l’impact des expositions in utero à la ciclosporine, et mettre en évidence l’existence d’une hypertension artérielle, la présence d’anomalies de la fonction rénale ou de troubles de la fertilité chez les descendants, le modèle souris présente l’avantage de pouvoir réaliser une exposition avant, pendant et après la gestation couvrant toute la période de l’allaitement, ce qui n’est pas possible sur le modèle ex vivo déjà réalisé.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, une première étude préliminaire sera réalisée avec un petit nombre de souris. Trois groupes de 3 souris recevront chacun différentes doses de ciclosporine, et trois groupes de 1 souris recevront un traitement placebo (sans médicament) pour chaque dose étudiée. Au total, 12 souris femelles âgées de 5 semaines seront utilisées lors de cette phase. Ce nombre a été calculé à partir de données obtenues lors d’études précédentes afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en obtenant des résultats exploitables. Dans un second temps, une étude plus complète sera menée. Le nombre de souris nécessaires sera déterminé à l’aide d’un calcul statistique afin de garantir des résultats fiables tout en évitant l’utilisation d’animaux en excès. La première phase permettra d’identifier la dose de ciclosporine la plus adaptée, ce qui évitera de multiplier les groupes de traitement lors de la suite de l’étude.

Raffinement

« Les animaux sont hébergés en groupe (au nombre maximum de 4 par cage). De l’enrichissement est ajouté : matériel de nidification (carré de coton) et un objet pour se mettre à l’abri. Le suivi du poids et une observation clinique quotidienne des souris permettront de prévenir la survenue de problèmes potentiels. Une grille de suivi du bien-être des animaux est établie et inclut les critères de poids corporel, d’apparence générale et de comportement. Le comportement maternel (allaitement, déplacement et toilettage des petits) sera également contrôlé. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques à la procédure seront appliqués, comme la perte de poids ou une altération de l'apparence et du comportement.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour cette étude car elle permet d’observer rapidement les effets du traitement immunosuppresseur sur la mère et sur ses petits. Les chercheurs utiliseront une lignée de souris dont les individus présentent des différences naturelles entre eux, un peu comme chez les êtres humains. Cela permet d’obtenir des résultats plus représentatifs de la réalité. Cette lignée est souvent utilisée pour évaluer les effets de médicaments ou d’autres substances chimiques. Elle présente également des avantages pratiques : chaque portée compte généralement une douzaine de souriceaux qui survivent majoritairement après la naissance. Cela permet d’étudier un plus grand nombre d’animaux et d’obtenir des résultats scientifiques plus fiables. Des souris adultes et matures sexuellement (mâles et femelles) sont suivies pour déterminer leurs capacités reproductrices et seront aussi utilisées pour 1- des mesures de la tension artérielle, 2-des recueils urinaires et 3- des micro-prélèvements sanguins.

1 930 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, alors que le régime riche en graisses qu'elles reçoivent dure de trois à huit jours. Une partie subit une ou deux chirurgies stéréotaxiques du crâne d'environ trente minutes, la seconde servant à fixer une pompe et une canule qui infusent en continu dans le cerveau, et certaines une biopsie de queue pour le tri génétique. Les tests métaboliques ajoutent une injection intrapéritonéale puis jusqu'à six prélèvements de sang à la queue en deux heures. Le porteur annonce des pistes pour prévenir le diabète de type 2, tout en situant l'objectif immédiat dans la confirmation in vivo d'un effet protecteur déjà observé sur des cellules nerveuses cultivées.

Objectifs

Le cerveau, et plus particulièrement l’hypothalamus, joue un rôle majeur dans le contrôle de la prise alimentaire, du poids corporel et de la glycémie. En réponse à une alimentation riche en graisses, cette région cérébrale développe très précocement une réaction inflammatoire, observable dès les premiers jours d’exposition au régime, avant même l’installation de l’obésité. Cette inflammation hypothalamique précoce pourrait contribuer à la dérégulation du contrôle de la glycémie et favoriser l’apparition de troubles métaboliques, notamment l’insulinorésistance et le diabète de type 2. Les mécanismes responsables de cette réponse inflammatoire restent encore mal compris. Nos travaux récents suggèrent qu’une hormone produite localement au niveau cérébral pourrait exercer un effet protecteur sur les neurones hypothalamiques et limiter cette inflammation. L’objectif de ce projet est donc de confirmer cet effet protecteur in vivo, d’identifier les mécanismes impliqués et de déterminer si cette voie de signalisation peut prévenir les altérations métaboliques précoces induites par un régime riche en graisses. Ce projet pourrait ainsi permettre d’identifier de nouvelles cibles centrales d’intérêt pour la prévention des troubles métaboliques associés à l’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre pourquoi l’obésité provoque une inflammation dans l’hypothalamus, une région du cerveau qui joue un rôle essentiel dans le contrôle de l’alimentation et de la glycémie. Cette inflammation peut perturber le fonctionnement de l’organisme et favoriser l’apparition de troubles métaboliques, notamment le diabète de type 2. Nous chercherons en particulier à déterminer si une hormone peut protéger l’hypothalamus contre cette inflammation et à identifier les mécanismes impliqués dans cet effet protecteur. Les résultats obtenus pourraient permettre de mieux comprendre le lien entre obésité, inflammation du cerveau et diabète, et contribuer à identifier de nouvelles pistes pour prévenir ou traiter ces maladies.

Procédures

Les souris nécessitant une sélection génétique subiront au préalable une biopsie de queue afin d’identifier celles présentant l’ADN recherché. Les animaux retenus pourront ensuite être soumis à une ou, au maximum, deux chirurgies stéréotaxiques, chacune d’une durée d’environ 30 minutes. La première chirurgie permettra de réaliser une injection unique dans une région précise du cerveau. Chez une partie des souris, une seconde chirurgie permettra de fixer un système de pompe et de canule destiné à assurer une infusion continue dans le cerveau. Par ailleurs, certaines souris ne subiront aucune chirurgie. Les animaux seront nourris avec un régime normal ou un régime riche en graisses pendant 3 à 8 jours selon les groupes. Toutes les souris seront soumises à des mesures de glycémie à différents temps, après une injection intrapéritonéale rapide, d’une durée de 2 à 3 secondes, de glucose, d’insuline ou de pyruvate, utilisé comme molécule test. Les prélèvements seront répétés au maximum 6 fois sur 2 heures, à partir d’une petite goutte de sang prélevée à l’extrémité de la queue, soit 6 × 5 µL au maximum, correspondant à un volume total maximal de 30 µL. Une seule petite incision sera réalisée au début du test ; le même site sera ensuite utilisé pour l’ensemble des prélèvements effectués aux différents temps de la cinétique, sans nouvelle incision.

Impact sur les animaux

Les interventions prévues peuvent entraîner des effets indésirables transitoires chez les animaux. Les principaux effets attendus sont liés aux chirurgies réalisées au niveau du crâne et à la pose éventuelle d’un dispositif d’infusion dans le cerveau. Ils peuvent se traduire par une douleur ou une gêne locale, une baisse temporaire de l’activité, une diminution de la prise alimentaire, une perte de poids, un défaut de toilettage, une prostration ou une réaction accrue lors de la manipulation. Les animaux concernés par une sélection génétique subiront également une biopsie de queue, susceptible d’entraîner une douleur brève, un léger saignement ou une gêne locale transitoire. Les tests métaboliques nécessiteront une injection rapide d’une molécule test ainsi que plusieurs prélèvements d’une petite goutte de sang à l’extrémité de la queue sur une durée maximale de deux heures. Ces manipulations peuvent entraîner un stress ponctuel, une gêne locale limitée et un léger saignement au niveau du site de prélèvement. Une seule incision sera réalisée au début du test, puis le même site sera utilisé pour les prélèvements suivants afin de limiter la gêne. Ces effets sont attendus comme étant de sévérité modérée et généralement de courte durée. Chaque souris fera l’objet d’une surveillance quotidienne à l’aide d’une fiche de suivi individuelle incluant l’évaluation du poids, de la prise alimentaire, du comportement général et de l’aspect du site chirurgical ou du site de prélèvement. Des points limites prédéfinis permettront de mettre en place rapidement des mesures de soutien, de sortir l’animal de la procédure ou, si nécessaire, de procéder à une mise à mort anticipée afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Devenir

à l'issue de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort pour prélèvements des tissus

Remplacement

L’étude du contrôle du poids, de l’alimentation et du taux de sucre dans le sang nécessite d’observer le fonctionnement de l’organisme dans son ensemble. En effet, le cerveau communique en permanence avec plusieurs organes, notamment le foie, les muscles et les tissus graisseux. Ces échanges complexes ne peuvent pas encore être reproduits complètement à l’aide de cellules cultivées en laboratoire ou de modèles informatiques. Cependant, les méthodes ne nécessitant pas l’utilisation d’animaux sont privilégiées chaque fois qu’elles permettent de répondre à la question étudiée. Une grande partie du projet a ainsi déjà été réalisée sur des cellules nerveuses cultivées en laboratoire. Ces expériences ont permis d’identifier les mécanismes susceptibles de participer à l’inflammation et de vérifier la pertinence des hypothèses avant leur étude chez l’animal. Le recours à la souris est donc limité aux expériences nécessitant d’étudier les interactions entre le cerveau et les autres organes dans un organisme vivant.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, toutes les expériences pouvant être réalisées sur des cellules cultivées en laboratoire ont été effectuées ou planifiées en priorité. Le nombre d’animaux nécessaire pour chaque expérience a été déterminé à l’avance à l’aide d’un calcul statistique, qui tient compte de résultats déjà obtenus au laboratoire et de notre expérience avec ce type de modèle. Selon les analyses prévues, 5 à 10 animaux par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats fiables, tout en évitant l’utilisation d’animaux en nombre excessif. Lorsque cela est compatible avec le bien-être des animaux et avec les objectifs scientifiques, plusieurs mesures seront réalisées sur les mêmes animaux.

Raffinement

Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé et expérimenté afin de limiter le stress, la douleur et l'inconfort des animaux. Les interventions chirurgicales seront effectuées sous anesthésie générale adaptée et accompagnées d'une analgésie préventive et post-opératoire selon les recommandations en vigueur. Les animaux feront l'objet d'une surveillance renforcée après les chirurgies et les injections afin de détecter rapidement tout signe de souffrance ou d'altération de l'état général. De plus, les injections seront réalisées selon des volumes et des voies d'administration adaptés à l'espèce et à l'âge des animaux, afin de minimiser la douleur, le stress et le risque de complications. Des points limites adaptés seront appliqués et tout animal présentant des signes de douleur ou de détresse non contrôlables sera pris en charge ou mis à mort. Les manipulations seront optimisées pour réduire leur durée et leur fréquence, et les animaux seront hébergés dans des conditions favorisant leur bien-être c’est-à-dire dans des milieux enrichis (maison, nid, bâtons de bois, cotons).

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle constitue un modèle bien adapté à l’étude des effets d’une alimentation déséquilibrée sur le fonctionnement de l’organisme. Elle permet notamment d’étudier les variations du taux de sucre dans le sang, la prise de poids et les troubles métaboliques associés. De nombreuses méthodes sont déjà validées chez la souris pour mesurer ces paramètres. Cela permet d’obtenir des résultats fiables et comparables à ceux d’autres études. La souris permet également d’étudier le rôle de gènes précis grâce à des lignées adaptées et à des outils expérimentaux bien maîtrisés. Les animaux seront âgés de 8 semaines au début des procédures. À cet âge, leur développement est suffisamment avancé pour étudier de manière fiable les fonctions cérébrales et métaboliques.