Procédures légères
Développement d’un modèle expérimental d’infection et établissement d’un rapport de causalité entre le pathogène et le déclenchement d’une maladie chronique chez une espèce domestique. AVENANT à l’autorisation 2018111410235568 v2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
45 chats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 30 d'entre eux et léger pour 15. Ils sont infectés par le Morbillivirus Félin par voie nasale ou veineuse, puis subissent des prélèvements sanguins, urinaires et nasaux répétés pour guetter l'apparition d'une insuffisance rénale. Le porteur reconnaît qu'après deux ans la première étude n'a montré aucun signe rénal, l'examen des tissus à dix-huit mois restant normal, et cet avenant prolonge l'expérience de deux ans de plus. Les chats seront tués en fin d'étude par risque de dissémination du virus, l'objectif étant de développer des produits immunologiques à mettre sur le marché.
Objectifs
Le projet concerne le développement d’un modèle expérimental permettant de mettre en évidence un rapport de causalité entre la présence d’un pathogène et le déclenchement d’une maladie chronique chez une espèce de carnivore domestique. Il comporte une procédure expérimentale de gravité sévère et permet de suivre après infection l’apparition de la pathologie. Ce modèle pourra être utilisé par la suite pour tester des produits immunologiques permettant la prévention de cette dernière, pour laquelle aucun traitement préventif n’existe. L’insuffisance rénale chronique affecte le chat avec une prévalence supérieure à 30 % conduisant à la mort de l’animal. Les causes du déclenchement de la maladie ne sont pas identifiées et les traitements ne permettent pas de soigner l’animal. Le Morbillivirus Félin a été identifié en 2012 chez des chats présentant une atteinte rénale. La littérature établit un lien entre la présence du virus et la pathologie. Il est une cause potentielle de son déclenchement . Le but de ce projet est de développer un modèle d’infection du Morbillivirus Félin chez le chat et de suivre l’apparition de signes cliniques et biochimiques permettant le diagnostic de la maladie. Selon l’International Renal Interest Society et l’International Society of Feline Medicine, aucun des symptômes n’est pathognomique, la coexistence de plusieurs signes persistant dans le temps conduit au diagnostic. Procédure expérimentale de mise au point d’un modèle d’infection du Morbillivirus Félin : Une publication établit un lien entre l’infection virale et l’apparition de signes rénaux, les auteurs concluent qu’un essai plus long permettrait d’établir définitivement la causalité. Notre première première étude teste deux voies d’inoculation (intraveineuse ou intranasale), prévue pour deux ans, nous souhaitons la poursuivre car la pathologie est chronique, longue à apparaître. Aucun signe rénal n’a été observé en 24 mois: une évaluation histopathologique à 18 mois ne montre aucune anomalie et le virus est présent dans les urines de cinq animaux sur dix, positifs en anticorps spécifiques contre le morbillivirus. Relancer un nouvel essai et utiliser d’autres animaux alors que l'infection est une réussite, n’est pas souhaitable sur un projet exploratoire (aucune connaissance scientifique). Cet avenant permet de prolonger l’étude initiée de deux ans maximum pour permettre le développement de la pathologie et l’obtention de conclusions.
Bénéfices attendus
Ce projet contribue au développement et à la mise à disposition de produits immunologiques pour une maladie incurable qui touche l’espèce de destination, auprès des vétérinaires et des propriétaires d’animaux de compagnie en accord avec les requis pour la mise sur le marché de ces produits. A long terme, les produits immunologiques ensuite développés protégeraient le chat contre une pathologie mortelle sans traitement préventif ou curatif à ce jour. Dans le cadre du développement de nouveaux produits, les bénéfices envisagés de cette procédure seront la possibilité d’établir un modèle d’infection sur espèce cible. Ce dernier serait ensuite utilisé dans le cadre d’un autre projet afin de tester des produits pour les mettre sur le marché dans le futur.
Procédures
Les animaux seront soumis à une inoculation virale en début de chaque essai: 10 animaux maximum/essai, selon une voie d’administration intranasale ou intraveineuse et sous anesthésie pour ne pas générer de l'inconfort (la durée de l'inoculation est maximum 5 minutes par animal) Les prélèvements suivants seront effectués pendant l’essai: 15 animaux maximum par essai, prélèvements sanguins (durée 5 minutes/animal), urinaires (durée 10 minutes/animal) et nasaux (durée 3 minutes/animal) sous anesthésie pour ne pas générer de l'inconfort. La fréquence des prélèvements sera de 8 prélèvements sanguins et 6 prélèvements urinaires et nasaux par animal le premier mois puis au maximum d’une fois par mois chaque type de prélèvement pour la durée de l’étude. Les animaux sont pesés une fois par semaine (1 min /animal) et leur température mesurée en intrascapulaire (15 secondes /animal) par lecture d’une puce implantée en début d’étude.
Impact sur les animaux
L’apparition d’une maladie chronique rénale sera surveillée par les changements hématologiques et biochimiques qui permettent l’identification de la pathologie (serum phosphate, potassium, calcium, SDMA, protéinurie, créatinine….selon les normes définies pour le chat). Des symptômes cliniques peuvent apparaître: vomissements, déshydratation, perte d'appétit, douleur abdominale, anémie, perte de poids.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin d’étude car aucune connaissance n’existe à ce jour concernant la propagation de ce virus et ses effets à long terme sur l’organisme. Il existe donc un risque potentiel de dissémination du virus et contamination d’autres animaux.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucun modèle in vivo ou in vitro qui permettrait d’étudier le rôle de l’infection du Morbillivirus Félin dans le déclenchement d’une atteinte rénale chronique. Le développement de cette maladie complexe ne peut s’étudier qu’à travers l’organisme complet de l’espèce cible et tout modèle in vitro serait trop restrictif.
Réduction
Le nombre d’animaux envisagés dans cette procédure à été défini à son minimum dans le but d’obtenir des données valides et d'identifier clairement la pathologie à un stade le plus précoce possible. Les stratégies d’expérimentation et d’observation s’appuient sur une synthèse bibliographique, les recommandations IRIS et guidelines de l’ISFM. La première étude permet de mettre au point le modèle d’infection (voie d’administration et temps d’apparition de la pathologie) afin d’établir le lien entre le virus et la maladie. Le nombre d’animaux par groupe a été pensé pour réaliser un diagnostic par histologie si aucun signe n’était observé. Ce projet est exploratoire et la maladie complexe, après deux ans aucun signe pathologique n’est observé et l’étude comporte 10 animaux dont 5 infectés par le pathogène. Le but de l’avenant est de prolonger cette étude de deux ans maximum afin de ne pas lancer un autre essai et de permettre l’atteinte de l'objectif sans utiliser d’autres animaux. Sur les deux études suivantes, la réduction du nombre de témoins est envisagée à 3 animaux au lieu de cinq.
Raffinement
Les mesures de raffinement utilisées sont : Une période d’acclimatation adaptée aux conditions de l’étude Hébergement des animaux en groupe de manière à ne pas induire un stress d’isolement et renforcer le comportement social intra-espèce. Habituation et socialisation des animaux (renforcement positif) Enrichissement des box afin d’améliorer le confort des animaux (musique, jouets adaptés, périodes de jeux de 15 minutes/Box/jour…). Possibilité d’utiliser un sédatif/anesthésique pour l’administration, les prélèvements, selon les caractéristiques du produit et l’instruction d’utilisation en vigueur. Une surveillance sera mise en place jusqu’au réveil complet de l’animal Adaptation du type de nourriture afin de faciliter l’alimentation des animaux (pâtée). Observation quotidienne des animaux et examen/suivi clinique effectué aussi souvent que cela sera jugé nécessaire avec une fréquence qui pourra être augmentée en cas de besoin (en particulier si apparition de signes cliniques) Mise en place de points limites adaptés et précisément définis qui pourront être réévalués en fonction des observations recueillies.
Choix des espèces
Le chat est l’espèce la plus atteinte par le développement d’insuffisance rénale chronique, un chat sur trois meurt des suites de cette pathologie. Le Morbillivirus Félin a été identifié sur des chats présentant la pathologie et le lien entre la présence de ce virus et une insuffisance rénale déclarée a été l’objet de publications. Aucun traitement préventif ou curatif n’existe pour cette maladie. Le virus est spécifique de l’espèce choisie et les normes établies pour les paramètres mesurés le sont également. Ceci justifie que le modèle soit développé sur le chat. Jeunes chats sevrés à animaux adultes. Les chats adultes compensent moins facilement la perte de néphrons ce qui accélère le développement de la pathologie. Les modèles expérimentaux d’insuffisance rénale ont été développés sur des chats d’âge variable, en général adulte. Nous utiliserons préférentiellement des chats de plus de 6 mois. La possibilité d’utiliser de jeunes chats sevrés afin de mettre au point le modèle d’infection est également envisagée.
Pacage en Polyculture d’étang : séparer les espèces pour optimiser la productivité et maintenir la biodiversité II
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
1 446 poissons, carpes, tanches, gardons et sandres, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart réutilisés l'année suivante et cent vingt tués pour prélever du muscle. L'expérience, zootechnique, teste une séparation temporaire des espèces dans des étangs pour optimiser la productivité aquacole tout en observant la biodiversité. Le porteur indique que les seules manipulations sont des mesures de biométrie sous anesthésie à la benzocaïne, en début et fin d'expérience. Il décrit un travail sur des espèces d'élevage classiques, dont les données doivent alimenter des modèles censés limiter à l'avenir le recours aux animaux.
Objectifs
L’expérience présentée s’inscrit dans le cadre d’un projet financé par l’Europe, qui a pour objectif d’établir de nouvelles pratiques alliant le respect de l’environnement, la biodiversité et la productivité des polycultures de poissons en étang. La définition de la composition de la polyculture est le thème central de ce projet, c’est-à-dire d’être capable de définir les différentes espèces de poissons à élever et d’en établir les effectifs. Ces propositions de pratiques prendront en compte l’ensemble des compartiments biologiques du système et la diversité qui le compose pour produire des poissons de manière plus durable. L’expérience Pacage en étang II vise à tester l’effet d’une segmentation temporaire de l’étang, permettant la séparation des poissons (carpes, tanches, gardons, sandres), d’un espace protégé supportant biodiversité et ressource alimentaire, sur la productivité totale en poisson, la croissance de chaque espèce, le recrutement en juvéniles, les paramètres physicochimiques du milieu et la biodiversité en invertébrés (macro-invertébrés et zooplancton) et en macrophytes. Le projet vise à caractériser les interactions entre les facteurs du milieu, les différentes espèces et la biodiversité aquatique, dans la conduite de la polyculture de poissons en étang. Nous cherchons en parallèle à caractériser les relations trophiques entre les différentes espèces de l’étang
Bénéfices attendus
L’expérience pacage en étang doit permettre d’éclairer les interactions entre espèces dans le cadre de polycultures de poissons en étang. Le rôle de ces espèces et l’effet de leur conduite sur la biodiversité sera mis en évidence, dans l’objectif d’optimiser les pratiques d’élevage pour améliorer les impacts sur l’environnement et préserver la richesse en invertébrés, tout en maintenant une production rentable pour l’exploitant. De façon plus générale, ce travail doit contribuer aux réflexions en cours sur le rôle de la diversité sur la robustesse et la résilience des systèmes d’élevage.
Procédures
Aucune intervention sur animaux vivants ne sera réalisée, hormis des manipulations de biométrie sur animaux anesthésiés.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances pour les animaux consistent en la manipulation en début et fin d’expérience, afin de réaliser des mesures (poids, longueurs) individuelles et les répartir dans leurs structures d’accueil (étangs expérimentaux en début d’exprience, étangs de stockage en fin d’expérience).
Devenir
Les poissons font partie du cheptel de l'Unité Expérimentale et seront réutilisés dans de futurs protocoles, l'années suivante.
Remplacement
Cette expérience est principalement à vocation zootechnique. Elle nécessite le recours aux espèces utilisées en élevage classique. Le manque de recul et de modèles sur les interactions entre les espèces aquatiques d’élevage, ne permet pas de réaliser ce type d’expérience in silico. Néanmoins, les données récoltées dans le cadre de l’expérience, ont vocation à alimenter des démarches de modélisation qui vont dans le sens de la limitation au recours aux animaux à l’avenir.
Réduction
Les proportions des différentes espèces et leurs effectifs ont été déterminées pour représenter les pratiques d’empoissonnement en polyculture d’étang courrantes. Il est n’est pas possible de les diminuer sans perdre le caractère plausible des pratiques. Le nombre de trois répliquats est le minimum que nous pouvons admettre pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Par ailleurs, le nombre de 5 individus mis à mort par espèce et par étang pour prélèvement de muscle est le nombre minimum recommandé pour analyser les structures trophiques dans les systèmes naturels.
Raffinement
Afin de limiter les nuisances envers les poissons, les conditions de contention sont surveillées, notamment en maintenant un renouvellement d’eau lors des tockages temporaires et le contrôle des comportements. Avant chaque manipulation pour mesures (non invasives), les poissons sont anesthésiés à la benzocaïne, à raison de 4ml/10l d’eau, afin de limiter le stress, les risques de chute, limiter la durée hors d’eau en augmentant la rapidité des mesures de biométrie. La phase de réveil est controlée dans des bassins séparés par espèce, avec renouvellement d’eau.
Choix des espèces
Les espèces choisies : Carpe commune (Cyprinus carpio), tanche (Tinca tinca), gardons (Rutilus rutilus) et sandre (Sander lucioperca), sont représentatives des polycultures de poissons d'étang extensif en France. Ce sont par ailleurs, des espèces particulièrement tolérantes aux bas niveaux de qualité d’eau ce qui les rend tolérantes aux manipulations. Les carpes sont de petites tailles (un an), afin d’optimiser leur croissance dans le dispositif. Les tanches et les gardons sont des géniteurs afin d’optimiser leur reproduction. Les sandres ont 2 ans et finront leur croissance dans le dispositif.
Effet neuro protecteur et neuro régénérateur de nouvelles biomolécules dans un modèle souris de glaucome
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
2 670 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 638 d'entre elles et modéré pour 2 032. Chaque souris subit un pincement du nerf optique qui provoque la cécité d'un œil, puis des injections dans l'œil de biomolécules censées protéger et régénérer les neurones, avant la mise à mort pour prélever rétines et nerfs optiques. Le porteur reconnaît que le pincement et les injections causent une douleur, mais la rubrique censée détailler l'anesthésie et les analgésiques reste occupée par une consigne de rédaction non remplie. Il indique tester ces molécules d'abord sur cultures et explants de rétine et vise à terme un médicament du glaucome amené en essai clinique.
Objectifs
Le glaucome est une des principales causes de déficit visuel. Les neurones présents dans la rétine (RGC, Cellules Ganglionnaires Rétiniennes) transmettent les informations captées par les photorécepteurs sous forme de signal électrique par via leur fibre nerveuse (axone) qui parcourt le nerf optique (NO) jusqu’au cerveau. Dans le glaucome, ces axones et les RGC dégénèrent, provoquant une cécité irréversible. Un modèle robuste de cette pathologie est obtenu chez la souris par un pincement maitrisé du NO provoquant la dégénérescence des axones qui le composent. Nous souhaitons tester dans ce modèle les propriétés neuroprotectrices et neurorégénératrices de biomolécules « NV » Sur des cultures de neurones, les NV favorisent la survie des cellules, l’élongation des prolongements cellulaires qui permettent les connections entre neurones et leur repousse après lésion. Ces résultats suggèrent que les NV pourraient être utilisés pour protéger les RGC de la mort cellulaire (effet neuroprotecteur) dans le glaucome et favoriser la repousse de leurs axones dans le NO (effet neurorégénérateur). Nos études ont montré que l’injection intraoculaire de vecteurs AAV2 (virus adéno-associé 2) codant pour le peptide NV de première génération (AAV2-NV1) favorise la survie des RGC et la repousse de leur axone, efficacité renforcée en présence de CNTF (ciliary-derived neurotrophic factor), un facteur de croissance neuroprotecteur et neurorégénérateur (effet synergique d’AAV2-NV1 et AAV2-CNTF). De plus, ces travaux ont permis de montrer l’absence de toxicité ou d’effets secondaires lors de l’injection intraoculaire d’AAV2-NV1. Nous avons développé de nouvelles générations de NV, modifiées pour augmenter leur affinité pour leur cible et donc leur efficacité, et conjuguées à des CPM (Cell Penetrating Molecules) tels que les VHH (molécules dérivées de chaines lourdes d’immunoglobulines de lama capables de franchir les membranes cellulaires) ou des peptides étiquettes (ciblage préférentiel des neurones en fixant le récepteur de l’acétylcholine) afin d’augmenter leur stabilité et leur adressage aux neurones. Nous souhaitons tester ces nouvelles générations de NV dans le modèle souris de glaucome afin d’identifier la molécule ayant l’efficacité maximale avec une toxicité minimale pour ensuite développer ce candidat comme médicament pour le glaucome en l’amenant à l’essai clinique.
Bénéfices attendus
Les biomolécules NV développées dans notre laboratoire possèdent des propriétés neuroprotectrices et neurorégénératrices susceptibles d’apporter une réponse à de nombreuses pathologies dégénératives. Dans le glaucome, l’augmentation de la pression intraoculaire cause une dégénérescence des axones dans le nerf optique, une mort des cellules ganglionnaires rétiniennes et à terme la cécité. Dans le cadre de ce projet, l’administration de ces molécules a pour but d’induire la régénération des fibres axonales dans le nerf optique après lésion, ce qui aura pour bénéfice de reconnecter l’œil au cerveau et donc d’éviter la cécité causée par cette lésion. Leur effet neuroprotecteur devrait quant à lui permettre la survie des cellules ganglionnaires rétiniennes dans la rétine, dont les axones forment le nerf optique.
Procédures
Afin d’étudier l’effet neuroprotecteur et neurorégénérateur de nos biomolécules NV, un pincement du nerf optique sera pratiqué chez des souris. Ce pincement provoquera une cécité unilatérale. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes) et est réalisé sous anesthésie profonde et analgésie. L’injection intravitréenne de nos biomolécules NV est réalisée sous anesthésie profonde et analgésie. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes). L’injection intraveineuse de NV est réalisée sous anesthésie profonde et analgésie. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes).
Impact sur les animaux
Afin d’étudier l’effet neuroprotecteur et neurorégénérateur des biomolécules NV, un pincement du nerf optique sera pratiqué chez des souris. Ce pincement provoquera une cécité unilatérale. Il est attendu que le pincement du nerf optique et l’injection des biomolécules NV dans l’œil causent une douleur chez la souris. Il est approprié d’écrire ici si une anesthésie et des analgésiques post-opératoires sont prévus, et leur dosage La surveillance des animaux sera quotidienne durant les 3 jours suivant les pincements/injections, puis bihebdomadaire. Les animaux seront mis à mort en cas de dépassement des points limites fixés pour les différentes procédures. Une administration d’analgésique sera réalisée dès l’apparition de signes de douleur.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, toutes les procédures requièrent la récupération de tissus (rétines, nerfs optiques) destinés à être analysés en vue de démontrer l’effet thérapeutique de notre molécule NV.
Remplacement
Les biomolécules NV utilisées dans ce projet sont préalablement validées in vitro pour leur efficacité et leur absence de toxicité sur des cultures de cellules neuronales, des cellules épithéliales rétiniennes et des explants de rétines. Les cellules neuronales et épithéliales rétiniennes ne nécessitent pas l’utilisation d’animaux (lignées cellulaires). Les explants de rétine, réalisés à partir de rétines de souris, permettent de tester plusieurs constructions et concentrations de NV avec un nombre réduit de souris, ce qui permet par la suite de ne tester in vivo que les molécules NV efficaces in vitro. Les explants de rétine constituent un modèle in vitro très proche du modèle in vivo (même espèce, même tissu) et facilite l’extrapolation.
Réduction
Le nombre d’animaux requis pour établir l’efficacité des biomolécules dans ce modèle a été calculé par un test de puissance statistique à partir de nos résultats antérieurs. La mise à mort des animaux pour la récupération des yeux et des nerfs optiques étant nécessaire au projet, la réutilisation des animaux n’est pas envisageable. Les deux yeux des souris seront valorisés quand cela sera possible afin de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Les techniques de chirurgie de l’œil nécessaires à la réalisation du projet ont été acquises auprès d’un laboratoire de référence. La maîtrise des bons gestes chirurgicaux limitera les risques d’altération de la lentille lors des injections intraoculaires et augmentera la probabilité de créer des lésions du nerf optique bien calibrées et donc exploitables. Les animaux recevront des antalgiques avant et après lésion ainsi qu’une anesthésie locale juste avant le pincement du nerf optique. Les gestes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale à l’isoflurane. La surveillance des animaux sera quotidienne durant les 3 jours suivant les pincements/injections, puis bihebdomadaire. Les animaux seront mis à mort en cas de dépassement des points limites fixés pour les différentes procédures. Après le réveil des animaux, les animaux sont remis dans leur cage et gardés pour une durée variable dépendante de la procédure (entre 1 heure et 44 jours pour la procédure la plus longue).
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle souris pour sa taille et son anatomie, particulièrement adaptées à la chirurgie ophtalmique. De plus, certains de nos tests seront réalisés avec des souris génétiquement modifiées existantes. Souris adultes âgées de 8 semaines. Les expériences sont réalisées à un stade où les rétines sont matures et dans lesquelles les neurones ont une capacité régénératrice minime afin de reproduire des conditions semblables à celles de la pathologie chez l’homme.
Etude fonctionnelle des monocytes sanguins dans l’espèce bovine : comparaison des cellules du veau avec celles de l’adulte
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
24 bovins, veaux et vaches, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous replacés dans leur élevage à l'issue. Chaque animal subit deux prises de sang de 80 mL à la veine jugulaire sous contention, répétées à une semaine d'intervalle, le sang servant à comparer in vitro la réponse immunitaire des jeunes et des adultes. Le porteur indique un léger stress de contention et des hématomes possibles, et présente cette étude sur sang prélevé comme une première étape. Il affirme que ces données justifieront ensuite des études in vivo pour lutter contre deux maladies bovines, cryptosporidiose et leptospirose.
Objectifs
La cryptosporidiose et la leptospirose sont deux zoonoses négligées et ré-émergentes particulièrement importantes dans les pays en voie de développement. Elles sont également des maladies de l’élevage bovin, la cryptosporidose étant responsable de diarrhées sévères chez le veau naissant et la leptospirose provoquant des hépatites, néphrites et des avortements chez la vache adulte. Que ce soit pour l’humain ou l’animal, les moyens de lutte contre ces pathogènes ou la vaccination sont inexistants, la recherche de nouveaux moyens de contrôle est donc indispensable. La stimulation du système immunitaire inné est une approche prometteuse pour contrôler de manière non spécifique des maladies infectieuses. En effet, elle induit une réponse immunitaire non spécifique à la fois immédiate (quelques heures) ainsi qu’une réponse mémoire (plusieurs mois) décrite très récemment sous le concept « d’immunité entrainée ou trained immunity ». Dans un objectif très général de stimuler le système immunitaire de l’animal de manière non spécifique dès son plus jeune âge pour lui fournir un potentiel immunitaire efficace tout au long de sa vie, il est nécessaire d’évaluer si une immunité innée entrainée peut être induite chez les jeunes individus. Dans un premier temps, des approches in vitro, telles que celles réalisées chez l’humain, peuvent être mises en place pour répondre à cette question. Ainsi l’objectif du projet est de comparer le potentiel de réponses à court terme et long terme (immunité entrainée) des monocytes sanguins de jeunes veaux à celui des monocytes sanguins de vaches adultes lors d’une stimulation de la réponse immunitaire innée.
Bénéfices attendus
Cette approche in vitro pour évaluer la capacité des jeunes animaux à développer un réponse immunitaire innée mémoire (ou immunité entrainée) apportera des données préliminaires solides qui justifieront de réaliser des études in vivo par la suite pour valider l’efficacité des réponses induites par la stimulation des récepteurs de la réponse immunitaire innée pour lutter contre les infections. L'objectif de comparer les réponses immunes entre les cellules sanguines de veau à celles d'adulte, est une première approche in vitro servant à évaluer si une stimulation du système immunitaire innée du jeune veau pourrait être aussi efficace que celle réalisée in vivo chez l'adulte.
Procédures
Des prélèvements de sang à la veine jugulaire seront réalisés sur les animaux sous légère contention (cornadis pour les vaches adultes). L’intervention dure de 4 à 5 minutes par animal avec un opérateur entrainé (sur chaque animal, deux prélevements de sang (8 x 10mL)). Pour chaque animal, ce même prélèvement sera réalisé à deux reprises, à une semaine d'intervalle.
Impact sur les animaux
Lorsqu'elle est réalisée par du personnel qualifié, la prise de sang (80 mL) dure maximum 5 minutes. La contention pendant la prise de sang peut générer un léger stress. La prise de sang peut aussi générer des hématomes.
Devenir
Les animaux sont replacés (dans leur élevage d’origine), il seront ré-utilisés pour d'autres éxpérimentations.
Remplacement
Etudier le potentiel de réponses immunitaires du sang d’un individu est une première approche en immunologie avant de pouvoir étudier une réponse immunitaire dans un site infecté tel que les muqueuses pour lequel un sacrifice ou un prélèvement invasif serait nécessaire. Comme chez l’humain, le prélèvement de sang est une méthode courante et peu invasive qui permet de ne pas porter atteinte à l’intégrité de l’individu lorsqu’il est réalisé par du personnel qualifié, en respectant l’individu et en respectant les volumes et les fréquences de prélèvements préconisés.
Réduction
6 veaux et 6 adultes seront utilisés (par an) pour réaliser (1) des comparaisons de compositions cellulaires (variable quantitative = nombre de cellules) entre les jeunes et les adultes (2) des incubations des cellules sanguines pour les stimuler ensuite avec différents ligands des récepteurs de l'immunité innée . Le nombre d'animaux (n=6) pour cette étude a été choisi à l'identique de ce qui est réalisé avec du sang humain pour analyser la "trained immunity".
Raffinement
Pour réaliser les prélèvements de sang, les animaux seront manipulés en douceur et seront bien massés sur la zone de ponction. Pour les attirer et les récompenser après les prélèvements, ils recevront du concentré. Ils sont maintenus dans leur environnement habituel (en groupe, logement sur paille, avec foin de qualité).
Choix des espèces
Ce projet est basé sur les bovins car les maladies étudiées dans le cadre du projet (cryptosporidiose et leptospirose) sont deux zoonoses qui affectent l’élevage des bovins et pour lesquels les moyens prophylactiques et thérapeutiques sont peu efficaces ou inexistants. Pour contrôler la cryptosporidiose des jeunes veaux (3 premières semaines de vie), aucun vaccin n’est disponible et l’Halocur est efficace mais uniquement lorsqu’il est administré en préventif, ce qui réduit son utilisation par les éleveurs. Aucun vaccin ni aucun traitement spécifique ne sont disponibles en France pour lutter contre la leptopsirose bovine. Ainsi, pour l'étude nous demandons à avoir accès à du sang de veaux femelles qui seront agées entre 6 et 15 jours (période de sensibilité à la cryptosporidose) et de vaches adultes (au même stade physiologique (idéalement génisses avant première lactation)).
Mise au point d’un modele murin de carcinogenèse hepatique sur cirrhose metabolique en vue d’évaluer le rôle de l’inhibition de TREM-1 sur la prévention et le traitement du carcinome hépatocellulaire. (1/3 EUs)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
63 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 58 d'entre elles et léger pour 5. Un cancer du foie est induit dès le deuxième jour de vie par une injection de streptozotocine suivie d'un régime gras, avec un suivi par scanner et IRM sous anesthésie avant la mise à mort pour prélever le foie. Le porteur indique une mortalité prévisible d'environ 40 % en fin de protocole et classe la procédure en sévère à ce titre, tout en envisageant de la reclasser en modérée selon les données. L'objectif se limite à mettre au point ce modèle, cette première étape sur 63 souris devant servir à de futurs projets d'évaluation d'une cible thérapeutique.
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est classe comme le sixième cancer le plus fréquent et la troisième cause de décès par cancer. Le développement du carcinome hépatocellulaire est étroitement lié à la présence de la maladie du foie gras non alcoolique appelée « steato-hepatite non alcoolique » ou NASH en anglais. Cette maladie est caractérisée par une inflammation chronique du foie conduisant à une mauvaise cicatrisation appelée fibrose dont le stade ultime est la cirrhose. Or, la réponse inflammatoire des cellules immunitaires est amplifiée par triggering receptor expressed on myeloid cells1 (TREM-1). L’inhibition de TREM-1 dans un modèle murin de NASH diminue l’inflammation du foie et restaure les capacités de «recyclage » cellulaire. Ces résultats sont confirmés chez les souris génétiquement invalidées pour le gène TREM-1. Néanmoins, les limites de ces modèles animaux de NASH sont l’absence d’évolution vers la cirrhose et le CHC. Afin d’évaluer à terme l’inhibition de TREM-1 dans le CHC, il nous faut d’abord développer un modèle de NASH évoluant jusqu’au stade CHC. Le modèle de souris C57BL/6 traitées par streptozotocine et soumises a un régime riche en graisse a l’avantage d’induire une véritable NASH avec toutes les composantes évolutives : excès de graisse semaine 6 (S6) ; NASH avec fibrose sévère a S8-10 et CHC entre S16-S20. Ces CHC sont constants et sont très proches des CHC humains sur le plan moléculaire. Dans ce projet, l’objectif est de mettre au point ce modèle, d’en caractériser les évolutions par imagerie IRM et Scanner et d’en adapter la résolution de façon à disposer des outils de suivi dans les futurs projets
Bénéfices attendus
Le développement du carcinome hépatocellulaire est étroitement lie à la présence d'une maladie chronique du foie conduisant à une cirrhose. Une des causes la plus fréquente est la steato-hepatite non alcoolique liée au syndrome métabolique. TREM-1 pourrait être un déterminant essentiel du développement, de la progression et du mauvais pronostic du CHC comme suggéré dans un modèle murin de steatohepatite non alcoolique mais cela reste à confirmer. L’inhibition de TREM-1 dans un modèle murin de NASH précoce diminue les lésions histologiques hépatiques (steatose, inflammation, ballonnisation, fibrose) via une diminution de l’inflammation et la restauration des capacités d’autophagie cellulaire. Ces résultats sont confirmés chez les souris génétiquement invalidées pour le gène TREM-1. Néanmoins, les limites de ce modèle animal de NASH sont l’absence d’évolution vers la cirrhose et le CHC.
Procédures
- Induction de la stéato-hépatite par une injection de streptozotocine de 10 secondes à J+2 de vie sur 58 souris avec un régime riche en graisse. - Imagerie par paliers du cancer du foie sous anesthésie générale à l’isoflurane : 1) Réalisation d’une imagerie par scanner avec et sans injection : réalisé par des personnes compétentes et avec le matériel adapté à la souris (plaque chauffante, monitoring des paramètres vitaux) avec une durée totale de 15 minutes par animal sous anesthésie par isoflurane. L’injection d’un produit de contraste aura une durée de 2 minutes par souris. Les séquences seront obtenues à 0,5 min, 4,5 minutes et 8 minutes de l’injection de produit de contraste iodé. 2) Réalisation d’une IRM (imagerie par résonnance magnétique) : la durée totale de l’acte sera de 30 minutes par animal réalisé par des personnes compétentes et avec le matériel adapté à la souris (plaque chauffante, monitoring des paramètres vitaux). - Injection de bromodeoxyuridine 2 heures avant la mise à mort des souris concernées (marquage cellulaire non toxique) d’une durée de 3 secondes par animal.
Impact sur les animaux
Dans la littérature, il existe une mortalité induite par le régime et par la maladie du foie à partir de la semaine 11 d’environ 5% par semaine soit 40% de mortalité en fin de protocole. Cliniquement, certaines souris vont perdre du poids en raison du manque d’appétit et de la fatigue. Néanmoins, ce régime n’induit pas de douleurs pour l’animal. Nous ne savons pas encore si notre procédure de raffinement permettra d’endiguer suffisamment la perte de poids et permettre une survie prolongée des souris. Par conséquent, la procédure a été jugée sévère en raison du taux de mortalité prévisible mais pourrait être effectivement reclassifiée en modérée en fonction des données du protocole. Le protocole ne sera pas réalisé d’une traite sur les 58 souris mais plutôt par étape ce qui permettra d’adapter la suite du protocole et de reclassifier la procédure si besoin. Des nuisances (stress) provoquées par les anesthésies nécessaires pour l’imagerie, ainsi que des douleurs légères lors des injections de bromodeoxyuridine, un marquage cellulaire, sont également à mentionner.
Devenir
Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à différentes semaines selon les groupes d'étude et les procédures. Les mises à mort sont réalisées pour récupérer les organes afin d’analyser les tissus et en particulier hépatiques (présence de cancer, degré de fibrose, d’inflammation et de graisse).
Remplacement
Il n’existe aucune approche in vitro pour étudier l’évolution d’une pathologie inflammatoire multifactorielle comme la stéato-hépatite non alcoolique vers la fibrose sévère et le carcinome hépatocellulaire. Une étude chez un organisme vivant est indispensable.
Réduction
Le nombre total d’animaux est de 63, il a été calculé à l'aide d'analyses statistiques intégrant, la mortalité potentielle (basée sur notre expérience des modèles de fibrose), la variabilité entre chaque souris et leur sexe. Nous suivrons dans le temps le développement de la pathologie à l'aide de l'imagerie, nous obtiendrons donc un volume important de données sans avoir besoin de mettre à mort les animaux à différents temps. L'utilisation de l'imagerie offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux.
Raffinement
Dès leur réception, les animaux auront une période d’acclimatation d’une semaine pour s’adapter à leur nouvel environnement. Ils seront hébergés dans une animalerie dotée de tous les paramètres nécessaires (température, hygrométrie, filtration de l’air, ...) à leur bien-être. Le cancer du foie se développera de manière insidieuse et indolore. Il sera induit par une injection sous-cutanée unique d’un antibiotique associé à un régime riche en graisse. Les stades de la maladie seront évalués de manière non invasive par imagerie : scanner avec injection de produits de contrastes et IRM. Les examens d’imageries prévus dans ce protocole (IRM et Scanner) ne produisent aucune forme de douleur, ils sont non-invasifs et réalisés sous anesthésie générale. Cette dernière peut tout de même être source de stress pour l’animal. Les animaux sont surveillés durant l'examen : si l'animal présente une détresse respiratoire (dont le stade le plus sévère est la capacité à compter à l’œil nu le rythme respiratoire de l’animal), il sera immédiatement retiré de l'appareil, soigné et surveillé jusqu’au réveil. Une injection sera effectuée à la fin du protocole 2h avant la mise à mort. Celle-ci ne génère pas de souffrance chez l’animal car ce n’est ni un produit toxique ni corrosif, ni nauséeux. La piqure, qui peut être légèrement douloureuse, est effectuée par un zootechnicien entrainé, ce qui limite grandement le risque d'erreur et la douleur qui pourrait être infligée aux animaux. D’autre part cette injection protocolaire est prévue juste à l’issue des examens d’imagerie chez un animal encore endormi et qui sera mis à mort quelques heures plus tard limitant encore le risque de souffrance inutile. Les animaux seront surveillés plusieurs fois dans la journée jusqu'au moment de la mise à mort, et si un animal montrait des signes de ralentissement net de sa motricité, de sa respiration, ou tout autre signe évoquant un stress, il serait mis à mort immédiatement.
Choix des espèces
Les principaux modèles de stéato-hépatites non alcoolique ont été validés internationalement sur des souris ou des rats. Nous avons une bonne connaissance des modèles murins et de plus, le choix de l’espèce « souris » se justifie par l’existence du modèle transgénique (KO TREM-1) permettant d’étudier le(s) rôle(s) spécifique(s) du récepteur TREM-1 dans la pathogenèse de la NASH et du CHC sur projets futurs en cas de mise au point réussie de ce modèle. Les souriceaux débuteront le protocole à J+2 de vie et seront issues de souris gestantes. Comme mentionné dans la description du projet, le pancréas des jeunes souriceaux possède des capacités régénératives de ses îlots pancréatiques. Cette propriété nous permet d’utiliser la streptozotocine et son action toxique sur les îlots sans induire un vrai diabète mais plutôt un état d’insulinorésistance qui caractérise la NASH.
Contrôle de la réparation de l’ADN par l’horloge circadienne dans la rétine
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 32 d'entre elles et modéré pour 160. Leur rétine est endommagée soit par une exposition à une lumière très intense jusqu'à deux heures, soit par une toxine détruisant les photorécepteurs, puis leur vision est suivie par électrorétinographie sous anesthésie avant la mise à mort pour prélever les yeux. Le porteur indique que ces expositions altèrent la santé de la rétine et que l'examen lui-même peut provoquer inflammation, rougeur et opacité de l'œil. Il développe des organoïdes rétiniens mais affirme qu'il reste "nécessaire" de passer par l'œil entier, les retombées pour les maladies rétiniennes humaines restant conditionnelles.
Objectifs
Les photorécepteurs rétiniens sont des cellules neuronales spécialisées, photosensibles, responsables de la vision. L'exposition excessive à la lumière peut endommager ces cellules (phototoxicité) à cause de l'accumulation de produits toxiques secondaires au traitement de l'information lumineuse ou phototransduction. Ces produits peuvent engendrer des dommages à l'ADN et la mort cellulaire. Un mécanisme fondamental permettant de contrecarrer les effets délétères de la lumière ou de stress chimiques sur les photorécepteurs est la réparation de l'ADN. Parmi les photorécepteurs, les bâtonnets sont les plus susceptibles aux dégâts causés à l'ADN car ils sont sélectivement déficients dans certains mécanismes moléculaires de réparation de l'ADN. Par ailleurs, les bâtonnets sont de loin les photorécepteurs les plus nombreux dans la rétine des rongeurs nocturnes; c'est pourquoi la souris constitue le modèle de choix pour étudier les mécanismes conduisant aux dommages de l'ADN, ainsi qu'à leur réparation, dans les bâtonnets. Nos données, ainsi que celles de la littérature, indiquent que l'horloge circadienne jour un rôle dans la réparation de l'ADN dans la rétine. Par exemple, l'exposition à forte intensité lumineuse induit davantage de dommages lorsqu'elle a lieu de nuit que de jour. De plus, nos données de séquençage ARN montrent que les gènes de réparation de l'ADN sont activés en fin de jour dans les photorécepteurs de souris sauvages. Par contre, cette régulation temporelle est absente chez des souris dont l'horloge circadienne est inactivée. L'objectif de ce projet est d'investiguer la capacité de l'horloge circadienne à mobiliser les mécanismes de réparation de l'ADN, spécifiquement dans les bâtonnets. Dans ce but, nous allons 1, évaluer si l'exposition à une lumière intense pouvant générer la phototoxicité, est capable d'activer le fonctionnement de l'horloge circadienne rétinienne. 2, évaluer les effets "phototoxiques" de l'exposition à la lumière intense chez une souris dont l'horloge est spécifiquement inactivée dans les bâtonnets. 3, de la même façon, léser l'ADN par une méthode chimique afin de comparer la capacité réparatrice chez des souris sauvages et des souris dont l'horloge des bâtonnets a été inactivée. La réalisation de ce projet permettra d'optimiser les traitements de pathologies rétiniennes mettant en jeu des déficiences dans la réparation de l'ADN.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'établir le lien moléculaire entre horloge circadienne des bâtonnets et réparation de l'ADN, et d'identifier les plages de vulnérabilité maximale à des dommages chimiques ou dus à la lumière. Si un tel lien est établi les résultats obtenus permettront potentiellement d'élargir les thérapies pharmacologiques des dégénérescences rétiniennes aux nombreux composés capables de cibler sélectivement les rouages moléculaires de l'horloge circadienne.
Procédures
Afin d'induire chez les souris des stress toxiques pour l'ADN nous allons utiliser 2 méthodes: 1, l'exposition à une lumière très intense pendant maximum 2h, connue pour endommager durablement la rétine. 2, l'exposition à une toxine capable de détruire sélectivement (en quelques jours) les photorécepteurs . 48h et 10j après ces expositions, la fonction visuelle des animaux sera évaluée par électrorétinographie: il s'agit de la même technique que celle utilisée chez l'humain, mais les animaux doivent être anesthésiés pendant un total d'une heure.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront différentes interventions susceptibles de causer des nuisances: 1, exposition à la lumière intense visant à altérer la santé rétinienne. 2, exposition à une toxine capable de faire dégénérer les photorécepteurs et altérant donc la santé de la rétine. 3, enregistrements ERG pour suivre l'évolution de la vision: cette technique d'exploration peut endommager l'oeil (inflammation, rougeur, opacité).
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure et les yeux seront prélevés pour analyses post mortem.
Remplacement
Le but de ce projet est d'évaluer les effets d'un dommage à l'ADN sur l'horloge circadienne et la réponse cellulaire en termes de réparation de l'ADN. Des modèles de culture cellulaire existent pour faire ce type de tests mais n'ont pas les propriétés d'une rétine comme unité fonctionnelle de la vision. Par ailleurs, ces derniers ne permettent pas pour le moment d'évaluer les effets néfastes sur la fonction visuelle. Bien que nous développions la technique des organoides rétiniens, pour la réalisation de ce projet il est nécessaire dans un premier temps de travailler dans le contexte de l'oeil (l'organisme) entier. La souris est l'espèce la plus adaptée pour l'analyse des bâtonnets rétiniens. Chaque souche de souris génétiquement modifiée est choisie selon sa pertinence pour répondre à la question posée.
Réduction
Le nombre d’animaux a été choisi, dans le respect des règles statistiques en vigueur, sur la base de notre connaissance du modèle souris et des techniques utilisées, ainsi que sur la littérature scientifique, de sorte à générer des résultats fiables et robustes. Une première procédure nous permettra de valider le protocole d'exposition à la lumière intense afin de l'utiliser pour les procédures suivantes. De plus afin de réduire le nombre total d'animaux nous utilisons l'ERG une approche non invasive pour suivre l'évolution de la fonction visuelle dans les jours qui suivent les traitements, sans nécessiter la mise à mort de l'animal.
Raffinement
Des mesures seront mises en oeuvre pour optimiser le bien-être des animaux tout au long des procédures. -maintien des animaux en groupe avec enrichissement (matériel de nidification, bâton à ronger) et isolement uniquement pendant le temps d'exposition à la lumière intense. Pour pallier à l'isolement pendant l'exposition, un enrichissement sera apporté (bâton à ronger). L'ERG, considéré comme procédure non invasive sera réalisé sous anesthésie et analgésie. Durant ces procédures la température de l’animal sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Les temps de survie post-traitement sont typiquement courts, de 1 à 10 jours. Les animaux seront suivis tous les 2 jours à l’aide d’une grille de score permettant d’objectiver différents paramètres (apparence, poids, examen clinique, comportement, aspect des yeux) et permettant de définir des points limites au-delà desquels les animaux seront soustraits à la souffrance. L’aspect des yeux – inflammation, irritation, opacité cornéenne ou cataracte, – sera examiné attentivement, et si nécessaire les yeux seront traités par application d’analgésiques. Nos études précédentes en conditions similaires n’ont révélé aucune anomalie.
Choix des espèces
La dégénérescence rétinienne est à la base de nombreuses maladies oculaires humaines qui conduisent à un handicap visuel permanent. Les maladies principales - glaucome, dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), rétinite pigmentaire - touchent des millions de personnes à travers le monde. Leurs origines sont à la fois génétiques et environnementales, et les souffrances morales occasionnées ainsi que les coûts médicaux générés sont très élevés. Les pathologies rétiniennes touchent les deux types des photorécepteurs, bâtonnets et cônes. Nos données récentes indiquent néanmoins que les bâtonnets, indispensables pour la survie de l'ensemble de la rétine, sont plus vulnérables que les cônes. Dans ce projet nous allons utiliser une exposition à la lumière intense - connue pour provoquer la dégénérescence rétinienne et souvent utilisée pour modéliser la pathologie rétinienne. Chez la souris les bâtonnets consituent 97% des photorécepteurs. De plus les différents variants génétiques requis pour le projet existent chez la souris. Pour l'ensemble de ces raisons, la souris est le modèle le plus adapté pour la réalisation de ce projet. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes, âge auquel la plupart des mises au point expérimentales ont été faites.
Effets d’une supplémentation nutritionnelle naturelle sur la régénération musculaire chez la souris âgée
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
38 souris âgées de 22 à 26 mois vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Elles subissent un gavage quotidien pendant quinze jours, une électrostimulation musculaire sous anesthésie et jusqu'à trois mesures de force, avant d'être tuées pour prélever leur muscle. Le porteur décrit lui-même des nuisances modérées liées à l'âge avancé et au cumul des actes, alors que la procédure reste enregistrée en gravité légère. Il indique que l'efficacité des molécules a déjà été observée sur cellules en culture et chez des animaux jeunes, mais affirme que la coordination de la régénération ne peut s'étudier qu'in vivo, l'application à la personne âgée restant renvoyée au conditionnel.
Objectifs
Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Ce processus, habituellement efficace, peut être compromis notamment avec le vieillissement. Des travaux précédents ont montré qu’une supplémentation nutritionnelle d’une combinaison de molécules X et Y améliore la régénération du muscle chez des animaux jeunes. Aucune toxicité n’a été rapportée pour ces deux molécules. L’objectif de cette étude est d’évaluer si cette stratégie thérapeutique est efficace pour améliorer la régénération musculaire après un protocole d’électrostimulation chez des souris âgées. A terme, l'utilisation de cette combinaison de molécules pourrait être envisagée pour un traitement permettant d'accélérer le processus de régénération musculaire chez la personne âgée.
Bénéfices attendus
Le processus de régénération musculaire, bien qu'habituellement très efficace, peut être ralenti avec l’âge. Une supplémentation nutritionnelle en molécules X et Y accélère la réparation du muscle après un protocole d’électrostimulation chez des animaux jeunes. Le projet vise à valider si cette stratégie thérapeutique est efficace chez des animaux âgés
Procédures
Les souris subiront un gavage journalier sur une période de 15 jours (durée 1 minute maximum), un protocole d’électrostimulation (sous anesthésie générale, durée 10-15 minutes), une mesure de force musculaire (3 au maximum, anesthésie générale de 5-10 minutes).
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables modérés sont attendus du fait de l’âge avancé des animaux et d’un cumul d’actes (gavage, anesthésies, blessure musculaire), qui induisent du stress
Devenir
Les animaux sont mis à mort en vue de récupérer le tissu musculaire pour des analyses histologiques
Remplacement
L’efficacité des molécules X et Y a déjà été évaluée sur des cellules musculaires en culture. L'analyse de la régénération musculaire peut être en partie étudiée in vitro. Cependant, la coordination des processus biologiques qui la régule ne peut se faire qu'in vivo. L'étude de composés favorisant la régénération musculaire ne peut se faire qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale
Réduction
L'expérience du laboratoire permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour les analyses. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des protocoles d’électrostimulation et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors du protocole d’électrostimulation et de la mesure de la force musculaire. Notre expérience sur ce modèle de dommage musculaire et de gavage montre que l'ensemble (100%) des animaux est inclus pour réaliser des analyses fonctionnelles et biologiques.
Choix des espèces
Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme. Le projet porte sur l’impact d’une stratégie nutritionnelle dans un contexte de vieillissement musculaire. Les animaux sont utilisés entre 22 et 26 mois.
Modèles d’ACLF associant CCl4, éthanol et divers évènements précipitants. Application à l’évaluation de l’efficacité de molécules.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 5124
10 248 rongeurs, à parts égales souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 6 648 d'entre eux, modéré pour 2 664 et léger pour 936. Une cirrhose est induite par injections répétées de tétrachlorure de carbone et d'alcool sur sept à neuf semaines, puis une défaillance hépatique aiguë est déclenchée par un agent inflammatoire ou de l'alcool, avant la mise à mort pour analyse des organes. Le porteur décrit à ce stade des vocalises spontanées, une perte d'équilibre, des difficultés respiratoires, une incapacité à se retourner, une absence de réflexe pupillaire et une pâleur prononcée. Il conclut que le modèle "s'avère sévère" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la défaillance multi-organe.
Objectifs
La décompensation aiguë de la cirrhose hépatique est une évolution majeure dans le développement de la cirrhose hépatique. Celle-ci se subdivise en deux catégories, la décompensation traditionnelle dont le pronostic vital à court terme n’est pas engagé et l’ACLF (Acute on chronic liver failure) avec une défaillance multi-organes, beaucoup plus complexe et où le pronostic vital est clairement défavorable. Il n’existe pas de traitement à ce jour afin de permettre de bloquer l’évolution fatidique de la pathologie et permettre d’orienter le patient vers une greffe de foie. La transplantation hépatique restant la seule thérapie pour l'ACLF une fois que les fonctions vitales sont préservées mais l'allocation adéquate des organes représente un défi croissant Notre projet consiste à reproduire dans un modèle expérimental chez le rat et la souris, le processus de décompensation aigue observé chez les patients cirrhotiques. Ce processus entraine la perte de capacités d’un ou plusieurs organes ou de fonction : foie, rein, cerveau, coagulation, … La cirrhose hépatique est caractérisée par la présence de tissus cicatriciels au niveau du foie en réponse à une agression répétée de l’organe (alcoolisme, hépatite virale, NASH, …). Ce tissu de réparation est non fonctionnel et n’a pour but que de combler les zones détériorées. La mise en place de la défaillance hépatique et l’épisode aigue de décompensation peuvent avoir différentes origines. L’une des premières causes de défaillance hépatique est l’alcoolisme chronique. Le précipitant le plus courant est l’infection bactérienne qui ouvre la voie à une décompensation hépatique aiguë se manifestant par l'ACLF. La cirrhose est un facteur de risque d'infection avec une prévalence de 30 % chez les patients hospitalisés contre 5 à 7 % chez les patients hospitalisés sans cirrhose. IL existe d’autres précipitants courants dont les saignements gastro-intestinaux, les lésions hépatiques d'origine médicamenteuse et la thrombose aiguë de la veine porte. En dehors de ces précipitants, une forte consommation d'alcool répétée est à l’origine de plus de 22 % des cas d'ACLF.
Bénéfices attendus
La prévalence de la cirrhose est d’environ 2000 à 3500 cas par million d’habitants, soit en France 700 000 cas avec 10 à 15 000 décès par an. Le passage d’une cirrhose compensée vers une cirrhose décompensée est associé à une diminution de la survie à court terme (3-5 ans). L’ACLF est associée à une forte mortalité à court terme (mortalité à 28 jours après l’admission à l’hôpital) de l’ordre de 20–25 % chez les patients ayant une défaillance d’organe à plus de 75 % chez les patients présentant trois défaillances d’organe et de fonction ou plus. L’ACLF est présent chez 26 % des patients cirrhotiques hospitalisés et 8 % le développent au cours de leur hospitalisation. Ce projet vise donc à bloquer et reverser le processus qui conduit au décès prématuré du patient ou à une dégradation majeure de ses fonctions vitales, et de lui permettre d’avoir accès à une transplantation hépatique (seul recours actuel à la décompensation hépatique).
Procédures
Au cours des procédures décrites dans ce dossier d'autorisation, -Période d’induction (Rat : 9 semaines -Souris 7 semaines): 2 injections hebdomadaires (15 secondes). 1 prélèvement de sang (durée 1 minute) sous anesthésie à l’isoflurane (durée 3minutes) - Phase de déclenchement et traitement avec les composés (rats : 11eme semaine-souris 9eme semaine) : Prétraitement par injections du composé à tester, 1 à 3 injections au maximum avant le déclenchement. (15 secondes par injection), Déclenchement de l’inflammation: Soit 1 seule injection (15 seconde) d’agent inflammatoire, soit 3 administrations quotidiennes au cours de 3 jours consécutifs d’alcool (9 x15 secondes chacune).
Impact sur les animaux
Les modèles d’étude ne présentent pas de douleur ou d’inconfort pendant la phase d’induction de la fibrose ou de la cirrhose. On s’attend donc après administration des agents précipitants de la défaillance hépatique à des signes d’inconfort chez l’animal, notamment des troubles de la vigilance et de la respiration. Il est à noter par contre que certains signes comme la perte d'équilibre sont attendus notamment lorsque le déclencheur est l’éthanol. Des signes comme des vocalises spontanées, des difficultés respiratoires une incapacité à se retourner, une absence de réflexe pupillaire et une pâleur prononcée peuvent être observés.
Devenir
L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et poumons) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux
Remplacement
Les modèles développés et décrits dans ce projet tente de reproduire une cascade d’événements conduisant à la défaillance successive de plusieurs organes comme cela se produit chez le patient cirrhotique en phase de décompensation aigue. Il n’existe pas de modèle in vitro permettant de reproduire la globalité ni la chronologie de la progression de la rupture multi organe. Les premières étapes du programme de recherche seront réalisées dans des tests in vitro pour évaluer les activités intéressantes sur des paramètres connus ayant un rôle dans l’évolution de la pathologie étudiée (par exemple l’inflammation, le stress oxydatif, ou la prolifération ou mort cellulaire etc )
Réduction
Le nombre d’animaux estimé pour chaque procédure tient en compte de l’hétérogénéité associée aux modèles d’induction de la défaillance hépatiques. La première réalisation d’une procédure permet d’évaluer la reproductibilité de réponse des animaux et donc in fine de réduire ensuite les effectifs dans les groupes des étude suivantes. L’ajustement du nombre d’animaux a pour but de permettre une analyse robuste et fiable de l’effet des composés étudiés sur la pathologie.
Raffinement
L’ACLF est une pathologie sévère, qui chez l’humain entraîne le décès à 28 jours de 20 à 70% des patients hospitalisés. Le modèle expérimental s’avère donc lui aussi sévère sur la phase finale de la procédure (administration de l’agent précipitant). Nous avons établi une liste de signes cliniques de manière à ne pas conserver des animaux ayant atteint ces points limites. La liste de ces points limites pourra être réajustée après les procédures de caractérisation des modèles et afin d’éviter toute souffrance non nécessaire à l’établissement des résultats. Les procédures se feront avec un hébergement adapté au bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, tunnel ou igloo et éléments de nidification). Au cours des procédures, nous appliquerons pendant les périodes qui suivent les prélèvements sanguins, un apport d’aliment gélifié enrichi qui favorise la récupération des animaux suite à l’anesthésie. Etant une pathologie multi-organe, l’étude de la maladie requiert l’utilisation d’animaux et ne peut être remplacée par des expérience in vitro
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie ou celles qui lui sont associées. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce souris a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. De jeunes adultes offrent une meilleure homogénéité et une meilleure réponse aux inductions de la pathologie, leur système immunitaire étant mâture. Nous utiliserons des souris ayant 7- 8 semaines d'âge et des rats d'environ 300g à l'arrivée. Pour les études ccl4 rats avec utilisation du phénobarbital, nous utiliserons des animaux de 75-100 gr (condition optimale préconisée dans la littérature)
Amélioration de la tolérance des matériaux implantables par couverture avec une membrane biologique non inflammatoire
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
30 rats nude vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit sous anesthésie une incision et l'implantation de matériaux sur six sites dorsaux, puis est tué pour l'analyse histologique de la réaction inflammatoire. Le porteur décrit une douleur postopératoire très faible et un isolement temporaire après l'opération, qualifiant l'ensemble des atteintes de "très légères". Il teste une membrane biologique censée réduire les complications des implants, dont l'innocuité avait déjà été montrée in vitro, et affirme qu'il n'existe "pas d'autre méthode" que l'organisme vivant pour évaluer la réaction inflammatoire.
Objectifs
L’objectif du projet est d’évaluer les réactions inflammatoires vis-à-vis de différents matériaux après couverture par la membrane CAM (Cell-Assembled extracellular Matrix), une membrane biologique synthétisée in vitro par des fibroblastes cutanés humains. La membrane CAM est connue pour la très faible réaction inflammatoire lors de son implantation. La couverture d’un matériau par cette membrane permettrait d’éviter les réactions inflammatoires défavorables et donc les complications fonctionnelles ou les pertes d’implants liées à ces réactions. Le modèle d’implantation sous-cutané chez le rat est la première étape pour valider la démarche de couverture par membrane CAM.
Bénéfices attendus
Cette approche innovante a pour but de masquer les matériaux synthétiques en les couvrant par une membrane biologique en matrice extracellulaire dont les capacités d’intégrations et la très faible inflammation ont déjà été démontrés. Cela permettra d’éliminer les nombreuses complications liées à l’inflammation chronique : fibrose cicatricielle, encapsulation, inflammation pathologique, douleurs chroniques, mobilisation voire extrusion de l’implant seraient évitées. Il y aurait donc une diminution importante de la morbidité liée à l’implantation d’un matériau synthétique et une diminution des interventions secondaires. Ces interventions secondaires peuvent être particulièrement complexes puisqu’outre le retrait de l’implant, il s’agit également de combler la perte de substance initiale dans un contexte plus défavorable. En chirurgie orbitaire, par exemple, les complications comme la vision double (9 à 52% des cas) ou le recul du globe oculaire (7 à 27% des cas) sont liées à la fibrose cicatricielle, à l’atrophie des graisses ou aux adhérences cicatricielles entre les muscles oculo-moteurs et l’implant. La couverture de l’implant par la membrane CAM, en diminuant drastiquement l’inflammation, devrait diminuer l’occurrence de ces complications fréquentes et sources d’interventions secondaires. Le bénéfice en chirurgie orbitaire devrait être l’objet d’une recherche ultérieure. La problématique des réactions inflammatoires péri-implantaires et d’intégration aux tissus mous est toutefois généralisable à tous les implants. Ces implants sont utilisés de façon très fréquente au niveau du squelette et des tissus mous craniofaciaux : reconstruction du crâne, reconstruction orbitaire, reconstruction des mâchoires. L’implantation en condition « biologique » de matériaux synthétiques simplifiera la prise en charge des patients tout en diminuant les complications.
Procédures
Tous les animaux sont soumis à une chirurgie très légère : incision de la peau et insertion d’un matériau puis suture.
Impact sur les animaux
Les nuisances potentielles sont les suivantes : - Douleur : La douleur peropératoire est gérée par l’association d’anesthésie générale et locale. La douleur postopératoire engendrée par cette intervention est très faible. Les cicatrices sont situées au niveau dorsal ce qui ne gêne pas le rat dans ces activités. Les infections postopératoires sont évitées par l’asepsie chirurgicale. - Peur : le protocole nécessite une manipulation des animaux ce qui peut induire de la peur. Toutefois le nombre de manipulations est très limité : geste chirurgical et sacrifice. L’animal sera immédiatement anesthésié ou euthanasié, la possibilité d’expression de la peur ne sera donc que très brève. - Expression des comportements normaux de son espèce : Il n’y a pas de contrainte vis-à-vis du comportement de l’animal. L’animal est isolé de façon temporaire en postopératoire pour éviter les complications, notamment les désunions cicatricielles. Ces nuisances sont donc toutes très légères.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés afin de procéder à des analyses histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas d’autre méthode pour évaluer les réactions inflammatoires vis-à-vis de matériaux implantés. Des études in vitro ont déjà été réalisées démontrant l’innocuité de la membrane CAM. La poursuite de la recherche translationnelle nécessite une étude au sein d’organismes vivants.
Réduction
L’étude d’une réaction tissulaire de type inflammatoire nécessite une analyse histologique et donc le sacrifice des animaux. Un nombre minimal est nécessaire afin d’obtenir un résultat fiable (risque de variabilité inter-individuelle). Toutefois, le nombre de rats est réduit au maximum par l’implantation sur 6 sites différents chez un même animal.
Raffinement
Tous les animaux sont élevés en environnement enrichi et par groupes de 3 rats. Après le réveil des animaux suivant la suture, les animaux seront hébergés en cages individuelles pendant 5 jours. Ils seront regroupés comme avant l’intervention par 3 dans des cages appropriés au terme de ce délai. Des éléments d’enrichissement seront placés dans les cages à tout moment. Ils seront replacés dans la même pièce de l’animalerie conventionnelle. Tous les animaux sont soumis à une anesthésie légère lors de l’intervention. Aucun analgésique n’est nécessaire pour ce type d’opération. Toutefois, si des signes de souffrance étaient constatés, une injection ponctuelle sera réalisée.
Choix des espèces
L’espèce choisie est le rat (Rattus norvegicus) nude. Il est plus grand que la souris (Mus musculus), ce qui permet de réaliser l’implantation sur 6 sites chez le même animal (Réduction du nombre d’animaux). Il est nécessaire qu’il soit nude afin de ne pas rejeter la membrane CAM humaine. En effet, ils ne possèdent pas de système immunitaire adaptatif (spécifique). Par contre, ces animaux sont tout à fait capables de monter une réponse immunitaire innée, comme une réaction à corps étranger, et possèdent des macrophages capables de dégrader des matrices perçues comme dénaturées. Les rats seront âgés de 2 mois. A cet âge, la taille du rat facilite la manipulation expérimentale et l’implantation sous-cutanée.
Evaluation de l’activité anthelminthique d’extraits de deux plantes halophytes contenant des phénols chez des petits ruminants
- Recherche appliquée
- Maladies animales
24 agneaux de trois mois vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous replacés à l'issue. Ils sont volontairement infestés par deux parasites intestinaux, dont un ver hématophage pouvant provoquer une anémie, puis reçoivent par voie orale des extraits de plantes halophytes, avec huit prises de sang et dix prélèvements de fèces sur quarante-cinq jours. Le porteur indique que l'anémie devrait rester légère à modérée et les troubles digestifs non systématiques, une valeur d'hématocrite de 16 % déclenchant l'arrêt. Le projet teste in vivo une alternative végétale aux vermifuges chimiques, dont l'efficacité avait été observée in vitro, et le porteur juge le passage par l'animal "nécessaire".
Objectifs
Les nématodes gastro-intestinaux (NGI), parasites du tube digestif des ruminants, demeurent une menace majeure dans les élevages ayant recours au pâturage, en raison de leur effet néfaste sur le bien-être et la santé des ovins et caprins, pouvant se traduire par de graves conséquences économiques. La maitrise usuelle de ces vers a été, depuis plus de 50 ans, basée sur l'utilisation de molécules chimiques anthelminthiques (AH). Cependant, cette approche est de moins en moins efficace du fait du développement de nombreuses populations de NGI résistantes aux AH. Par aillleurs, il existe aussi une demande sociétale accrue pour la recherche de modes de maitrise plus agroécologiques et plus durables de ces parasites. Des données in vitro sur l'activité antiparasitaire de plantes extrêmophilles, adaptées à des taux élevés de sel dans les sols, ont été obtenues précédemment, laissant entrevoir la possibilité de les utiliser in vivo, à la place de molécules chimiques de synthèse. Dans ce contexte, l'objectif principal du projet est de comparer in vivo l'efficacité AH d'extraits de 2 plantes halophytes riches en phénols (Cladium mariscus, Limoniastrum monopetalum).
Bénéfices attendus
Selon les résultats obtenus, ce projet peut aider à consolider l'exploration de ressources naturelles pour limiter le parasitisme par les NGIs grâce à des alicaments, des extraits phytothérapeutiques ou de nouvelles molécules de synthèse à partir des molécules naturelles.
Procédures
Individuellement, les animaux, à l'état vigile, feront l'objet de 3 types d'intervention : 1/ des drogages par voie orale (n = 4) : un lors de l'administration d'un vermifuge à l'arrivée des animaux, un lors de l'infestation expérimentale avec des larves de parasites (Haemonchus contortus et Trichostrongylus colubriformis) contenues dans 10 mL de liquide, un lors de l'administration de 10 grammes d'extraits de plantes halophytes (Cladium mariscus, Limoniastrum monopetalum), dilués dans 20 mL d'eau et un lors de l'administration d'un vermifuge en fin de projet ; 3 minutes par drogage, 2/ des prélevements sanguins à la veine jugulaire (n = 8 prises de sang au total), 10 mL de sang et 2 minutes par prélévement, 3/ des prélèvements de fèces dans le rectum (n =10 prélèvements au total), 10 à 15 g de fèces et 5 minutes par prélèvement.
Impact sur les animaux
Haemonchus contortus est un parasite hématophage. L'infestation expérimentale des animaux par cette espèce parasitaire peut provoquer une anémie, notamment lorsqu'elle est établie de manière chronique. L'infestation par Trichostrongylus colubriformis a, quant à elle, été occasionellement associée à des perturbations digestives (diarrhée). Dans ce projet, la durée d'infestation (45 jours) est limitée et les niveaux d'infestations sont modérés. D'après l'expérience que nous avons de ces modèles, le niveau d'anémie devrait donc être léger à modéré et les perturbations digestives ne devraient pas être systématiques.
Devenir
A l'issue de la procédure expérimentale, les animaux ne devraient conserver aucune séquelle. Par conséquent, ils seront tous replacés.
Remplacement
L'activité antiparasitaire de plantes extrêmophilles a déjà été démontrée in vitro. Avant d'envisager l'utilisation d'extraits de ces plantes en élevages de petits ruminants, il est nécessaire de tester leur activité anthelminthique in vivo et donc d'avoir recours à des animaux.
Réduction
Le nombre total d'animaux a été calculé de manière à 1/ pouvoir comparer grâce à des tests statistiques (analyse de variance en données répétées) les valeurs d'excrétion d'oeufs de parasites par gramme de fèces et les valeurs d'hématocrite entre le groupe témoin et les 2 groupes traités, 2/ pouvoir se permettre l'éventuelle exclusion d'un animal par lot expérimental pour des raisons sanitaires, sans mettre en péril l'interprétation des données ; en pratique cela signifie qu'un animal a été rajouté dans chaque lot expérimental par rapport au nombre minimal nécessaire calculé pour atteindre l'objectif 1.
Raffinement
Une période d'acclimatation d'au moins 15 jours sera accordée aux animaux avant le démarrage de la procédure expérimentale. Tous les animaux seront élevés ensemble, sur aire paillée (1,5 m²/animal) ; des colliers de couleurs différentes permettront de distinguer les 3 lots expérimentaux. Leur box sera équipé de brosses contre lesquelles ils pourront se frotter. Une surveillance sanitaire accrue sera organisée après l'infestation expérimentale, de manière à détecter précocément les points limites associés aux parasitoses à Trichostrongylus colubriformis et Haemonchus contortus : en plus de l'observation clinique quotidienne visant à détecter une diarrhée persistante ou associée à une déshydratation, des prélevements sanguins hebdomadaires permetront de surveiller les valeurs d'hématocrite de chaque agneau (seuil limite : 16 %). L'infestation par voie orale et les prélèvements (prises de sang et collecte de crottes intra-rectale) seront effectués par des opérateurs expérimentés. Les ovins étant des animaux grégaires qui paniquent rapidement lorsqu'ils sont isolés, l'inoculation et les prélèvements seront réalisés de manière à ce qu'ils puissent conserver un contact visuel avec leurs congénères, tout en étant contenus.
Choix des espèces
Les parasites gastro-intestinaux utilisés ont une forte spécificité d'hôtes. Les hôtes naturels de Haemonchus contortus et de Trichostrongylus colubriformis sont les ovins et les caprins. Agneaux sevrés, âgés de 3 mois. A cet âge, les animaux sont très réceptifs aux infestations par les nématodes gastro-intestinaux.
Rôle du métabolisme one-carbone dans la mise en place du neocortex
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
1 356 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 248 d'entre elles et sévère pour 108. Des femelles gestantes subissent une chirurgie de quarante minutes visant à modifier l'activité d'enzymes dans le cerveau de leurs embryons, ou un régime appauvri en méthionine, avant que tous les animaux soient tués pour prélever embryons ou néocortex. Le porteur reste succinct sur les atteintes, évoquant surtout la douleur de la chirurgie, sans détailler ce qui justifie la gravité sévère de 108 souris. Les bénéfices se limitent à "mieux comprendre" la maturation de neurones liés à la sclérose latérale amyotrophique, et le porteur affirme qu'aucune méthode ne remplace complètement la souris.
Objectifs
L’objectif du projet est de caractériser les conséquences de déficits en micronutriments sur le développement du système nerveux. Il est basé sur deux approches complémentaires : une approche génétique et une approche nutritionnelle.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent les étapes de production et maturation des neurones corticospinaux. Ces neurones sont nécessaires pour effectuer les mouvements volontaires, et leur dégénerescence est associée à la sclérose amyotrophique latérale.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux types d'interventions: 1) des femelles gestantes seront soumises à une procédure chirurgicale pour modifier l'activité de certaines enzymes dans le cerveau des embryons. Cette intervention dure environ 40 minutes; 2) des femelles gestantes seront alimentées pendant 3 jours avec un régime pauvre en methionine.
Impact sur les animaux
La procédure chirurgicale peut entrainer de la douleur, elle sera réalisée sous anesthésie en présence d'analgésiques. Le régime pauvre en methionine sera limité à 3 jours pour éviter toute incidence sur le poids des souris gestantes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, soit pour prélever les embryons, soit pour prélever leur neocortex.
Remplacement
Il n'existe pas de méthodes qui permettent de remplacer complètement l'utilisation de souris puisque les études nutritionelles et/ou sur le métabolisme sont par définition systémiques.
Réduction
Afin de limiter les nombre d’animaux utilisés, nous concentrerons nos analyses sur 4 stades clés du développement du neocortex et un stade postnatal P21. -Les analyses seront réalisées sur 6 individus pour chaque génotype à chaque stade et pour chaque type d'analyse ce qui est le minimum nécessaire pour obtenir des données statistiquement fiables. – Nous réaliserons des coupes fines des cerveaux embryonnaires ce qui nous permet de collecter un grand nombre de coupes pour chaque cerveau et ainsi réaliser toute la série d'expériences nécéssaires à la caractérisation des défauts de développement.
Raffinement
Un état prostré et/ou une perte de poids anormale seront considérés comme des signes de stress/de souffrance et de tels individus seront mis à mort pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
L’espèce utilisée est la souris car c’est un modèle mammifère chez qui on peut introduire des mutations génétiques ciblées. De plus, en dehors des primates, c’est le modèle animal le plus proche de l’homme. Dans ce contexte, les résultats obtenus à la suite des expériences proposées pourront potentiellement être utilisés pour des études en recherche clinique. Nous étudierons 4 stades développementaux et un stade postnatal, chez des individus mâles et femelles.
Effet de différents candidats médicaments sur l’activité motrice spontanée dans le test d’actimétrie chez le rat et la souris.
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 750
1 250 animaux non-humains, 500 souris et 750 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 625 d'entre eux tués à l'issue pour des prélèvements terminaux et les autres réutilisés dans un autre projet. Ils reçoivent des candidats médicaments puis sont placés seuls dans une cage d'actimétrie de une à vingt-quatre heures pour mesurer leur activité motrice, avec un jeûne pouvant aller jusqu'à vingt-quatre heures et des prélèvements sanguins. Le porteur décrit le stress lié à l'isolement sans enrichissement et à la privation d'eau et de nourriture. Il présente le passage par l'animal comme un "passage obligatoire" avant toute administration à l'homme et affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution suffisante.
Objectifs
Le développement de nouveaux médicaments s'accompagne d'une évaluation de leurs potentiels effets secondaires chez l'animal avant toute administration chez l'homme. L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets d'un candidat médicament sur l'activité locomotrice spontanée chez les rongeurs (rat et souris) pour détecter ses potentiels effets secondaires stimulants (augmentation de l’activité motrice et/ou des redressements) ou sédatifs (baisse de l’activité motrice et/ou des redressements) en utilisant le test d’actimétrie.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments avec peu d'effets secondaires pour le patient. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Du fait de la cible thérapeutique, ce composé pourrait avoir aussi une application en médecine vétérinaire.
Procédures
Les animaux seront administrés avec les composés à tester par différentes voies (-2 min par administration) puis seront placés dans les cages de l'actimètre pour une durée de 60 minutes à 24h. Il pourra être mis à jeûn avant le test pour une durée maximale de 24h. Des prélèvements de sang sur animal vigile pourront être effectués (2 minutes par prélèvement). Et l'animal pourra être anesthésié en fin d'expérience pour les prélèvements terminaux de fluides corporels et tissus.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront des administrations de candidats médicaments et des prélèvements de sang (douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille). Ils subiront un stress lié à l'isolement sans enrichissements dans une cage pour un temps précis qui peut varier entre 60 minutes et 24 heures. Ils pouuront également subir un stress lié à la privation d’eau et de nourriture sur une période de 120 min maximum. Ils pourront également être mis à jeun (accès à l’eau) sur une période de 24h maximum. Les animaux pourront de même ressentir une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille suite à des prélèvements de sang pouvant être réalisés sur animal vigile ou anesthésié.
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal et / ou réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur l'activité motrice. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat et la souris sont les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. L’analyse statistique sera adaptée au modèle
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse. • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
La souris et le rat sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur l'activité motrice spontanée. Seuls des animaux adultes seront utilisés dans ce projet puisqu'il n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.