Procédures légères
Modèles d’ACLF associant Thioacétamide, éthanol et divers évènements précipitants. Application à l’évaluation de l’efficacité de molécules.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 5268
5 268 souris et 5 268 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance jusqu'à sévère. Ils reçoivent pendant sept à neuf semaines un agent toxique pour le foie deux fois par semaine, puis un agent déclencheur dont des administrations massives d'alcool, avant des prélèvements sanguins sous anesthésie. Le porteur décrit des effets invalidants, ataxie, détresse respiratoire, vocalises et incapacité à se retourner, pour reproduire l'insuffisance hépatique aiguë sur cirrhose et tester des molécules. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la défaillance simultanée de plusieurs organes et conclut à la nécessité du rat et de la souris.
Objectifs
La décompensation aiguë de la cirrhose hépatique est une évolution majeure dans le développement de la cirrhose hépatique. Celle-ci se subdivise en deux catégories, la décompensation traditionnelle dont le pronostic vital à court terme n’est pas engagé et l’ACLF (Acute on chronic liver failure) avec une défaillance multi-organes, beaucoup plus complexe et où le pronostic vital est clairement défavorable. Il n’existe pas de traitement à ce jour afin de permettre de bloquer l’évolution fatidique de la pathologie et permettre d’orienter le patient vers une greffe de foie. La transplantation hépatique restant la seule thérapie pour l'ACLF une fois que les fonctions vitales sont préservées mais l'allocation adéquate des organes représente un défi croissant Notre projet consiste à reproduire dans un modèle expérimental chez le rat et la souris, le processus de décompensation aigue observé chez les patients cirrhotiques. Ce processus entraine la perte de capacités d’un ou plusieurs organes ou de fonction : foie, rein, cerveau, coagulation, … La cirrhose hépatique est caractérisée par la présence de tissus cicatriciels au niveau du foie en réponse à une agression répétée de l’organe (alcoolisme, hépatite virale, NASH, …). Ce tissu de réparation est non fonctionnel et n’a pour but que de combler les zones détériorées. La mise en place de la défaillance hépatique et l’épisode aigue de décompensation peuvent avoir différentes origines. L’une des premières causes de défaillance hépatique est l’alcoolisme chronique. Le précipitant le plus courant est l’infection bactérienne qui ouvre la voie à une décompensation hépatique aiguë se manifestant par l'ACLF. La cirrhose est un facteur de risque d'infection avec une prévalence de 30 % chez les patients hospitalisés contre 5 à 7 % chez les patients hospitalisés sans cirrhose. IL existe d’autres précipitants courants dont les saignements gastro-intestinaux, les lésions hépatiques d'origine médicamenteuse et la thrombose aiguë de la veine porte. En dehors de ces précipitants, une forte consommation d'alcool répétée est à l’origine de plus de 22 % des cas d'ACLF.
Bénéfices attendus
La prévalence de la cirrhose est d’environ 2000 à 3500 cas par million d’habitants, soit en France 700 000 cas avec 10 à 15 000 décès par an. Le passage d’une cirrhose compensée vers une cirrhose décompensée est associé à une diminution de la survie à court terme (3-5 ans). L’ACLF est associée à une forte mortalité à court terme (mortalité à 28 jours après l’admission à l’hôpital) de l’ordre de 20–25 % chez les patients ayant une défaillance d’organe à plus de 75 % chez les patients présentant trois défaillances d’organe et de fonction ou plus. L’ACLF est présent chez 26 % des patients cirrhotiques hospitalisés et 8 % le développent au cours de leur hospitalisation. Ce projet vise donc à bloquer et reverser le processus qui conduit au décès prématuré du patient ou à une dégradation majeure de ses fonctions vitales, et de lui permettre d’avoir accès à une transplantation hépatique (seul recours actuel à la décompensation hépatique).
Procédures
Au cours des procédures décrites dans ce dossier d'autorisation, les animaux recevront, deux administrations hebdomadaires d’un agent hépatotoxique (durée 9 semaines pour les rats et 7 semaines pour les souris-durée d’une administration : 15 secondes). Après une semaine sans traitement l’agent déclenchant, sera administré selon la procédure soit une seule fois, soit pendant 3 jours (3 injections par jour). Chaque administration dure 15 secondes. Au cours de la dernière semaine de la procédure, les animaux subiront un prélèvement de sang (durée 30 secondes) sous anesthésie à l’isoflurane (durée 3 minutes). Les composés à tester seront administrés (chaque administration dure 15 secondes) pendant une période de 1 à 7 jours max . Un prélèvement de sang sous anesthésie à l’isoflurane sera réalisé au moment de la mise à mort des animaux.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont produites par les administrations par voie orale qui ne sont pas douloureuses mais stressantes, elles sont classées légères. La période d’administration est longue et une sorte d’habituation au geste estompe rapidement ce stress. L’induction de la fibrose n’induit pas de douleur elle-même, la pathologie est silencieuse (pas de douleur perceptible par le foie qui n’a pas de nocicepteurs) . L’administration des agents précipitants de la défaillance hépatique comme les administrations massives d’alcool produisent les effets d’une ivresse importante (perte d’équilibre, ataxie). Ces effets sont invalidant (trouble de la mobilité, perte de repères, ou altération des interactions sociales). L’administration unique ou répétée des agents inflammatoires ont des effets notoires sur les animaux dans les heures qui suivent les inductions. On note une baisse d’activité, une diminution de la vigilance, des déperditions thermiques et une détresse respiratoire. Dans les phases aigues, des signes plus marqués peuvent apparaitre tels que des vocalises spontanées, des difficultés respiratoires (dyspnée), une incapacité à se retourner, une absence de réflexe pupillaire, une ptose palpébrale avec larmoiements et une pâleur prononcée. Ces troubles connus et déjà observés sont monitorés. Leur fréquence et intensité de leur apparition permet selon le cas de les apprécier au niveau de gravité modéré ou sévère.
Devenir
L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et poumons) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux
Remplacement
Les modèles développés et décrits dans ce projet tente de reproduire une cascade d’événements conduisant à la défaillance successive de plusieurs organes comme cela se produit chez le patient cirrhotique en phase de décompensation aigue. Il n’existe pas de modèle in vitro permettant de reproduire la globalité ni la chronologie de la progression de la rupture multi organe. Les premières étapes du programme de recherche seront réalisées dans des tests in vitro pour évaluer les activités intéressantes sur des paramètres connus ayant un rôle dans l’évolution de la pathologie étudiée (par exemple l’inflammation, le stress oxydatif, ou la prolifération ou mort cellulaire etc )
Réduction
Le nombre d’animaux estimé pour chaque procédure tient en compte de l’hétérogénéité associée aux modèles d’induction de la défaillance hépatique. Cette estimation s’appuie sur nos expériences antérieures durant de nombreuses années des modèles murin et sur la connaissance de la variabilité des paramètres d’efficacité que nous mesurons. ( paramètres sanguins qui sont assez labiles) A l’aide de ces données, un calcul de puissance et la déduction par le calcul théorique des effectifs est possible. Le test de Welsh permet de définir cet effectif théorique permettant d’atteindre la significativité recherchée. Cette approche statistique permet d’affiner les plans d’expérience pour lesquelles une étude pilote préalable par exemple a permis d’approcher un résultat très proche de la significativité.
Raffinement
L’ACLF est une pathologie sévère, qui chez l’humain entraîne le décès à 28 jours de 20 à 70% des patients hospitalisés. Le modèle expérimental s’avère donc lui aussi sévère sur la phase finale de la procédure (administration de l’agent précipitant). Nous avons établi une liste de signes cliniques de manière à ne pas conserver des animaux ayant atteint ces points limites. La liste de ces points limites pourra être réajustée après les procédures de caractérisation des modèles et afin d’éviter toute souffrance non nécessaire à l’établissement des résultats. Les procédures se feront avec un hébergement adapté au bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, tunnel ou igloo et éléments de nidification). Au cours des procédures, nous appliquerons pendant les périodes qui suivent les prélèvements sanguins, un apport d’aliment gélifié enrichi qui favorise la récupération des animaux suite à l’anesthésie. Etant une pathologie multi-organe, l’étude de la maladie requiert l’utilisation d’animaux et ne peut être remplacée par des expérience in vitro
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie ou celles qui lui sont associées. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce souris a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. De jeunes adultes offrent une meilleure homogénéité et une meilleure réponse aux inductions de la pathologie, leur système immunitaire étant mâture. Nous utiliserons de jeunes adultes, à savoir 7 à 8 semaines (20-25g) pour les souris et 6 à 7 semaines (250 à 300 g) pour les rats à l'arrivée.
Caractérisation des effets du tamoxifène sur la fonction musculaire chez un modèle murin reproduisant une forme récessive de myopathie centronucléaire causée par des mutations dans le gène Ryr1
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
310 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont une partie atteint un niveau de souffrance sévère. Ce modèle transgénique de myopathie congénitale développe dès quatorze jours, selon le porteur, une perte de poids, une scoliose, une cyphose et une atrophie musculaire, la plupart des animaux mourant avant sept semaines. Les souris subissent des tests moteurs répétés et des mesures de force sous anesthésie pour évaluer le tamoxifène comme traitement, le porteur affirmant qu'aucune douleur n'a été rapportée malgré ces atteintes. Il conclut qu'aucune méthode ne permet d'évaluer une molécule sur un "organisme entier" et euthanasie les souris pour prélever leurs organes.
Objectifs
Les myopathies congénitales sont des maladies génétiques rares qui affectent notamment la fonction des muscles squelettiques. A ce jour aucun traitement n’est disponible pour les patients atteints de ces maladies qui impactent grandement leur survie ou qui sont handicapantes au quotidien. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique d’un agent pharmacologique déjà utilisé en clinique dans d’autres maladies pour le traitement de myopathies congénitales.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de fournir des informations relatives aux effets d’une molécule pharmacologique déjà approuvée et utilisée en clinique dans d’autres pathologies pour le traitement de myopathies congénitales. Ce projet permettra de proposer un traitement pouvant avoir une application en clinique rapide.
Procédures
Des tests de comportement peu invasifs, qui permettront d’évaluer les performances et capacités motrices de l’animal, seront réalisés une fois par semaine chez l’animal vivant à partir de 3 semaines pendant 5 semaines (i.e. jusqu’à l’âge de 8 semaines). Chaque test sera réalisé 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque essai. Chaque essai durera entre 10 secondes et 5 minutes selon le test comportemental. L’activité locomotrice spontanée et la posture debout de l’animal seront acquises pendant 24h, période au cours de laquelle les animaux seront hébergés individuellement. La production de force sera mesurée sur une durée maximale de 30 minutes chez l’animal anesthésié par inhalation d’un mélange gazeux ou par injection intrapéritonéale d’un anesthésique et d’un anti-douleur dont l’administration ne durera pas plus de 5 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux présentent une perte de poids à partir de 14 jours après la naissance, une scoliose et une cyphose, une atrophie musculaire, une faiblesse musculaire et une durée de vie réduite par rapport à des animaux contrôles (les animaux ne survivent pas plus de 57 jours). Les mâles et les femelles sont affectés. Aucune douleur n'a été rapportée chez ces animaux. Les animaux seront identifiés et génotypés à partir d’une biopsie prélevée à partir de 14 jours suivant la naissance. Les animaux seront isolés. Les animaux seront mis sous anesthésie générale.
Devenir
Les animaux utilisés pour les tests seront euthanasiés après prélèvement des organes nécessaires pour les analyses au niveau cellulaire et moléculaire.
Remplacement
Dans ce projet qui consiste à évaluer les effets d’un agent pharmacologique sur le muscle, le modèle murin est privilégié car l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer la contractilité du muscle. D’autre part, il n’existe pas de méthode alternative qui permette d’évaluer sur l’organisme entier et dans des conditions in vivo les effets d’une molécule. L’évaluation des effets d’un agent pharmacologique in vivo est un prérequis indispensable avant toute application clinique.
Réduction
Pour la partie accouplement, le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle et en faisant plusieurs portées par femelle. Pour la partie expérimentale, les tests comportementaux peu invasifs offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Ce point est essentiel car il permet de réduire de manière drastique le nombre d’animaux. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement en fin de traitement, ce qui permet non seulement de collecter les différents tissus sur ces mêmes animaux mais également de s’affranchir de générer une cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. Ce point est important car il est à l’origine de la réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, la couleur de la peau, la présence d'une poche de lait seront évalués chez le nouveau-né tous les 2 à 3 jours. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. Les tests comportementaux seront peu invasifs et permettront un suivi longitudinal. Afin de diminuer le stress lié à ces tests, une session de familiarisation sera effectuée. Pour les tests nécessitant une anesthésie générale de l’animal, la respiration sera contrôlée visuellement, la température de l’animal sera régulée et maintenue à sa valeur basale à l’aide d’une lampe chauffante et un gel ophtalmique sera appliquée sur les yeux de l’animal afin de limiter l´assèchement des cornées. La phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé est modèle transgénique non disponible sur le marché qui reproduit les caractéristiques principales de la maladie étudiée. Le modèle développe des symptômes de myopathie dès 14 jours après la naissance. La durée de vie maximale est de 57 jours et la majorité des animaux meurt avant l’âge de 7 semaines, nécessitant la mise à mort entre 5 et 8 semaines du fait de la perte de poids et de la faiblesse musculaire sévère. Les tests comportementaux seront réalisés une fois par semaine sur des animaux âgés de 3 semaines sur une période de 5 semaines (donc jusqu’à l’âge de 8 semaines). Les animaux utilisés pour l’évaluation de l’espérance de vie seront maintenus en vie jusqu’à l’âge de 7 mois.
Impact de la voie d’administration sur l’incorporation cérébrale d’un acide gras oméga3 (DHA)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
202 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qualifié de léger à modéré. Elles reçoivent des administrations répétées d'un acide gras oméga3 par voies orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intranasale, précédées d'un jeûne de quatre heures, puis une ponction intracardiaque terminale sous anesthésie, pour comparer les voies d'acheminement du DHA vers le cerveau. Le porteur présente ce travail comme une piste de prévention de la maladie d'Alzheimer, avec un éventuel essai clinique renvoyé à terme. Il affirme qu'une étude de biodistribution dans l'organisme ne peut se réaliser autrement que sur un modèle vivant, et prévoit la mise à mort de toutes les souris pour prélever fluides et tissus.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est la forme la plus fréquente de maladie neurodégénérative associée à une démence chez les sujets âgés. L'élaboration et la mise sur le marché de nouveaux traitements pour lutter contre ce fléau est un défi sanitaire et économique majeur. Le stress oxydant induit par de nombreux facteurs environnementaux (notamment l'exposition à des polluants chimiques) est un évènement extrêmement précoce et jouant un rôle majeur dans la dégénérescence neuronale observée chez les malades d’Alzheimer. Notre projet a pour objectif de reconsidérer l’utilisation des acides gras de la famille oméga3 dans une approche de prévention de la MA, en contournant l’obstacle de leur faible biodisponibilité cérébrale par le biais de leur nanovectorisation et de l’utilisation de la voie d’administration intranasale. Cette étude consistera à évaluer et comparer la cinétique de biodistribution d'une forme nanovectorisée de l'acide docosahexaénoïque (DHA, un acide gras omega3) après administration par voie orale, intrapéritonéale, sous-cutanée, ou intranasale chez la souris. Nous pourrons ainsi déterminer la pertinence de l'administration intranasale par rapport aux autres voies d'administration afin d'enrichir le cerveau en DHA.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'évaluer l'impact de la voie d'administration du DHA sur sa biodistribution et de déterminer si la voie d'administration intranasale offre un bénéfice pour cibler le cerveau par rapport à la voie orale classiquement utilisée (compléments alimentaires). A terme, ce projet a pour objectif de développer une formulation de DHA destinée à une administration par voie intranasale dans le cadre de la prévention de la maladie d'Alzheimer et pourrait donc déboucher sur la mise en place d'une étude clinique.
Procédures
Les animaux, en fonction de leur groupe, pourront être soumis à : -une ou plusieurs administrations de DHA par voie orale -une ou plusieurs administrations de DHA par voie intrapéritonéale -une ou plusieurs administrations de DHA par voie sous-cutanée -une ou plusieurs administrations de DHA par voie intranasale - En fin de procédure, une ponction intracardiaque sera effectuée sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Les administrations seront effectuées par une personne qualifiée et après une période d'habituation à l'expérimentateur. Les nuisances attendues sont liées au jeûn de 4 heures précédent l'administration de DHA ainsi qu' à l'administration (ou aux administrations répétées) de la solution de DHA.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés afin de pouvoir récupérer les fluides biologiques et tissus pour le dosage du DHA.
Remplacement
S'agissant d'une étude de l'impact de la voie d'administration du DHA sur sa cinétique de biodistribution dans l'organisme, il n'est pas envisageable de la réaliser autrement qu'en ayant recours à un modèle vivant. Des études préalables ont été réalisées in vitro afin de sélectionner la forme chimique du DHA (phospholipide, ester de cholestérol, triglycéride, libre) la plus adéquate pour favoriser son incorporation dans les cellules.
Réduction
Le nombre d’animaux (184) est réduit au minimum pour répondre aux objectifs du projet. Le nombre d'animaux dans chaque groupe, ainsi que le nombre de groupes est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe et a été déterminé par une analyse de puissance statistique basée sur nos études précédentes Ici, 8 animaux par groupe seront nécessaires pour observer d’éventuels changements. A ce nombre d’animaux une marge de 10% (+18) sera ajoutée afin de compenser les aléas expérimentaux. Nombre total de souris : 202.
Raffinement
Afin de minimiser les effets du stress, mais également de contrôler l’état général des animaux, les souris seront manipulées chaque jour par l’expérimentateur en charge de l’expérience, avant chaque procédure. Durant la phase expérimentale, les animaux seront observés afin de déceler immédiatement toute souffrance et d'évaluer les potentiels effets indésirables. Les administrations par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intranasale seront effectuées par une personne qualifiée et après une période d'habituation.Tous les incidents et toutes observations anormales (comportement, poids, pelage, plaie,…) seront transmis à l’expérimentateur afin d’être traités dans les plus brefs délais et seront notés dans un tableau de suivi expérimental. Un animal sera euthanasié s’il présente : 1- une perte de poids > 15%; 2- une attitude inhabituelle traduisant un mal être (prostration, agressivité...); 3- l’apparition de toute altération de l’état général (altération du pelage, tumeur, excroissance, prolapsus…).
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études pharmacocinétiques. Ces études de biodistribution chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender la distribution des composés bioactifs chez l'homme dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (6 mois) étant donné que notre projet s'inscrit dans le cadre du développment d'une stratégie de prévention de la maladie d'Alzheimer destinée à être testée chez l'adulte.
Etude des réseaux impliqués dans l’anorexie et la perte d’appétit associée aux états de maladie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 113
281 animaux non-humains, 168 souris et 113 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, une partie sous anesthésie sans réveil, le reste en souffrance légère à modérée. Une partie subit une chirurgie stéréotaxique du cerveau pour l'injection de traceurs ou de virus, l'ensemble reçoit des injections de chlorure de lithium qui provoquent délibérément douleurs abdominales et diarrhée, avant la mise à mort pour prélever les cerveaux. Le porteur présente une partie des travaux comme préliminaires, destinés au dépôt d'une demande de financement ANR, et situe l'interprétation en lien avec l'anorexie humaine au conditionnel. Il affirme qu'aucune alternative n'existe et que les résultats "ne nécessitent l'utilisation d'aucun test statistique".
Objectifs
Récemment, notre équipe a caractérisé un réseau neuronal impliqué dans le contrôle cognitif et intéroceptif de la prise alimentaire. Ce projet vise à poursuivre ce travail. Différentes expériences seront mises en œuvre afin de poursuivre l’analyse anatomique du réseau (intégrant d’autres structures cérébrales), à en identifier certains types cellulaires et son développement. Ce projet est effectué en collaboration avec des chercheurs des Etats-Unis et de Suisse. L’objectif de ces travaux dont certains sont préliminaires est le dépôt d’un projet ANR PRCI en 2023/2024.
Bénéfices attendus
Nous prévoyons d’obtenir des données anatomiques et fonctionnelles originales afin d’améliorer notre compréhension du réseau d’une région de l’hypothalamus postérieur : le PSTN (noyau parasousthalamique). Nous étendrons nos connaissances de l’organisation des connexions neuronales qui impliquent diverses régions du télencéphale et diencéphale. Les données fonctionnelles associées concerneront le contrôle cognitif de la prise alimentaire (par la compétition entre stimuli hédoniques et aversifs de divers ordres) et ces résultats pourront être interprétés dans le cadre de troubles psychiatriques du comportement alimentaire observés chez l’Homme (Ex : anorexie, boulimie, …).
Procédures
Une procédure chirurgicale (Chirurgie stéréotaxique) sera utilisée pour l’injection intracérébrale de traceurs ou de virus pour traçage génétique. Cette procédure, d’une durée de 45 min, sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse complémentée par un analgésique en pré-opératoire. Les animaux ne seront opérés qu’une fois soit au total 25 rats et 80 souris. Les autres nuisances notifiables pour ce projet seront des injections intrapéritonéales une à deux fois selon les types de procédures. Les 281 animaux sont concernés.
Impact sur les animaux
Les expériences d’injection stéréotaxique de traceur/virus seront susceptibles d’entrainer un disconfort temporaire et de faible intensité, particulièrement au niveau des sutures. Ce disconfort disparait avec la cicatrisation. Lors des injections de Chlorure de Lithium (LiCl), des douleurs abdominales et une diarrhée mimant une intoxication alimentaire se déclarent dans l’heure suivant l’injection chez les animaux. Ces symptômes temporaires sont nécessaires à la réussite de l’expérience. Certains animaux seront euthanasiés une heure après l’apparition des premiers signes (poil hérissé, réduction de la mobilité, étirement de l’abdomen, dos creusé, apparition de diarrhées). Ceux qui ne seront pas euthanasiés, seront surveillés jusqu’à complète guérison (5-6h).
Devenir
Ce projet contient 5 procédures. Pour les 4 premières procédures, une partie des animaux subiront une chirurgie stéréotaxique, et l’autre partie, des injections intrapéritonéales. Ils resteront tous en vie pour intégrer la dernière procédure. En effet, nos recherches étant menées sur le système nerveux central, tous les animaux seront euthanasiés à la fin des expériences afin d’extraire les cerveaux qui seront ensuite traités pour des approches histologiques et ainsi obtenir les résultats à interpréter.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de modèles animaux pour ces travaux. Toutes les études visant à comprendre l’organisation des réseaux cérébraux impliqués dans l’expression des comportements et l’influence de paramètres cognitifs et sensoriels susceptibles de modifier/perturber cette expression, nécessitent l’utilisation d’animaux vivants.
Réduction
Les résultats obtenus ne nécessitent l’utilisation d’aucun test statistique. La réduction du nombre d’animaux utilisés pour des expériences de traçage de voies nerveuses est dépendante de la qualité du matériel et de l’expérience des expérimentateurs aux méthodes stéréotaxiques (le responsable de projet a presque 40 ans d’expérience dans ce domaine et forme de jeunes exprimentateurs depuis 30 ans). Le nombre d’animaux utilisés dépendra de la précision des injections, qui ne peut être évaluée qu’au moment de l’examen des coupes histologiques des cerveaux. Il faut un nombre suffisant d’injections pour couvrir l’ensemble du territoire d’intérêt, ce qui complique beaucoup l’évaluation du nombre d’animaux requis. La technique BrdU repose sur l’injection de cette molécule à des femelles en gestation ; le nombre d’animaux utilisés sera donc dépendant du nombre de petits issus de ces portées. Au total, il nous faut au minimum 5 animaux par stade issus de 2 portées différentes afin d’obtenir des résultats fiables. Nous allons pratiquer des injections à des rats et des souris à 6 stades de gestation. Il faut savoir qu’il peut y avoir une légère différence de maturité entre des embryons aux deux extrémités des trompes utérines, donc si 5 est un minimum, plus nous observons d’animaux, meilleurs seront nos résultats. En tout état de cause, deux portées par stade et l’analyse des mâles et femelles issues de ces portées font que nous aurons toujours un nombre suffisant de données (Nous attendons de 4 à 12 petits par portée). Les portées n’ont pas à être égalisées à la naissance puisque seul compte le stade auquel l’injection de BrdU est effectuée.
Raffinement
Les principales mesures de raffinement concerneront les soins pré-, per-et post-chirurgicaux apportés aux animaux. Les expériences d’injection stéréotaxique de traceur/virus seront susceptibles d’entrainer un disconfort temporaire. La gestion de la douleur sera traitée de deux manières : 1) injection d’un analgésique ¼ d’heure l’anesthésie. L’injection stéréotaxique étant de courte durée, l’analgésique continuera d’agir pendant la phase de réveil (pendant 3 heures au minimum après la chirurgie) et 2) un analgésique plus léger (Paracétamol, 1g/L) pourra être donné aux animaux au moindre signe de souffrance passé le délai de 24 h. En post-opératoire, le disconfort se situe particulièrement au niveau des sutures. Une application de lidocaïne analgésique sur la cicatrice, juste avant le réveil de l’animal, diminuera les démangeaisons. Par ailleurs, les animaux devant recevoir des injections de LiCl ou de BrDU seront habitués à être manipulés par les expérimentateurs ce qui diminuera le stress lié à ces injections le jour de l’expérience. Les injections de BrDU ne provoquent aucune douleur. Pour le LiCl, des douleurs abdominales et une diarrhée mimant une intoxication alimentaire se déclarent dans l’heure suivant l’injection chez les animaux. Ces symptômes transitoires sont nécessaires à la réussite de l’expérience. Certains animaux seront euthanasiés une heure après l’apparition des premiers signes (poil hérissé, réduction de la mobilité, étirement de l’abdomen, dos creusé, apparition de diarrhées). Ceux qui ne seront pas euthanasiés, seront surveillés jusqu’à complète guérison (5-6h). Un analgésique (Paracétamol, 1g/L) pourra être donné aux animaux au moindre signe de souffrance (prolongation des symptômes cités ci-dessus) passé le délai de 6 h.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les modèles les plus utilisés pour la recherche en Neurosciences. Nos connaissances sur l’organisation du système nerveux central sont les plus approfondies chez ces espèces. Les rats sont des animaux sur lesquels les données anatomiques sont les plus nombreuses : la taille du cerveau facilite l’analyse microscopique et ce modèle permet aussi des observations pour une meilleure extrapolation de ce qui peut être observé chez des espèces plus complexes. La Souris est de plus en plus utilisée car elle permet l’obtention de modèles génétiquement modifiés afin d’obtenir des informations nouvelles qu’il serait impossible d’obtenir autrement. Concernant le stade de développement, seuls des animaux adultes entre 8 et 10 semaines seront utilisés que ce soient les animaux achetés ou nés/élevés dans notre établissement. Les animaux de cet âge ont fini leur croissance et la maturation de leur cerveau. Cela permet d’avoir une reproductibilité pour les structures cérébrales et des poids d’animaux adéquats pour réaliser notamment les expériences de stéréotaxie.
Apprentissage de gestes techniques de base de zootechnie par des étudiants
- Formation professionnelle
Rats : 600
Lapins : 50
1250 animaux non-humains vont être utilisés, 600 souris, 600 rats et 50 lapins, dont 1190 tués à l'issue et 60 adoptés. Chaque souris ou rat sert de support à une vingtaine d'actes, injections, gavages, prélèvements de sang, tests comportementaux, chaque lapin jusqu'à cinquante, pour former des élèves techniciens animaliers, la mise à mort faisant elle-même partie des gestes enseignés et les corps servant ensuite aux dissections. Le porteur reconnaît que des élèves peu familiers des techniques peuvent provoquer hématomes, fausses routes ou perforations du tube digestif. Il indique commencer chaque séance par des méthodes de remplacement, cartons, fausses peaux, vidéos, mannequins, mais juge "impossible" de se passer totalement d'animaux vivants pour former du personnel.
Objectifs
Ce projet décrit les séances de travaux pratiques d'un programme d'enseignement secondaire destiné à la formation diplomante de techniciens animaliers. Le recours à l'animal vivant n'a lieu que dans le cadre global d'une progression pédagogique qui inclut bien d'autres moyens d'enseignement. Les élèves de notre formation doivent devenir des techniciens animaliers de laboratoire en 3 an avec une progression des apprentissages pratiques. Chacune de nos 3 classes sont divisées en 2 groupes d'élèves dont la progression est suivie par un enseignant. Les animaux utilisés changent entre chaque groupe de TP pour respecter des temps de repos définis. Les élèves réalisent les travaux pratiques en binomes, et ils sont noté individuellement dans l'acquisition de la théorie, de la connaissance de la technique et la réussite dans la réalisation de la technique. Quelle que soit l'espèce, chaque séance d'apprentissage se déroule de la même manière, une première partie est consacrée à l'explication des objectifs et des conditions de réalisations illustré par des vidéos ou des essais sur mannequins. Cette phase est nécessaire pour l'acquisition des automatismes. Elle permet également d'espacer les passages sur animaux vivants facilitant les encadrements. A terme, ainsi, nos élèves peuvent être embauchés dans les laboratoires de recherche animale, avec une dextérité suffisante, et une bonne connaissances des règles éthiques, pour réaliser les protocoles expérimentaux qui leurs sont demandés dans les meilleures conditions. Cette progression pédagogique bénéficie à la fois à la qualité des résultats pédagogiques et à l'amélioration du sort des animaux utilisés en recherche.
Bénéfices attendus
Lors de ce projet, les apprentissages permettent d'aborder et de réaliser différentes procédures expérimentales. Il a pour but de raffiner les procédures de prélèvement et d'injection afin d’éviter la souffrance des animaux, de réduire le nombre d’animaux. Les bénéfices sont multiples : le premier concerne l'objectif pédagogique puisqu'il s'agit de former des personnes compétentes et habilitées à travailler avec des animaux de laboratoire : les élèves formés deviennent des professionnels des techniques enseignées et donc peuvent réaliser les procédures dans des conditions normalisées pour le respect de l’animal. Le deuxieme bénéfice est d'inculquer la culture du soin qui est de faire prendre conscience aux jeunes que l'on travaille avec du vivant et que l'on doit tout mettre en œuvre pour favoriser son bienêtre et pour respecter totalement l'animal. Cette culture du soin tient également compte du manipulateur car un personnel à l'aise et en confiance car bien formé sera d'autant plus respectueux de l'animal.
Procédures
Le projet est prévu pour 5 ans avec un renouvellement total des animaux à chaque année scolaire. Les animaux sont donc utilisés entre septembre et juin en n+1. Durant cette période, ils participent au programme de formation des jeunes. Pour les 120 souris par année scolaire, chacune va participer au maximum à 20 interventions parmi la liste suivantes injection sous cutanée, intra péritonéale,intra musculaire, intra veineuse, gavage, prélèvement sanguin (Saphène, submaxillaire, sinus rétro orbitaire, caudale, cardiaque) et tests comportementaux Pour les 120 rats par année scolaire, chacun va participer au maximum à 20 interventions parmi la liste suivantes injection sous cutanée, intra péritonéale,intra musculaire, intra veineuse, gavage, prélèvement sanguin (Saphène, jugulaire, caudale, cardiaque) et tests comportementaux. Pour les 12 lapins par année scolaire, chacun va participer au maximum à 50 interventions parmi la liste suivantes injection sous cutanée,intra musculaire, intra veineuse, gavage, prélèvement sanguin (Saphène, auriculaire, cardiaque). L’ordre des actes peut varier en fonction des années et surtout de l’habilité des jeunes en vue de pratiquer les actes les plus simples en premier pour un meilleur respect de l’animal. Quelque soit l'animal, un délai minimum de 7 jours est respecté avant son utilisation lors d'une autre scéance de TP. Les séances de TP durent 1 h, et chaque animal est utilisé pendant quelques minutes, avec un nombre limité de tentatives pour chaque étudiant. Si l'élève échoue, l'a nimal est laissé tranquille.
Impact sur les animaux
Le maximum de précautions sont prises pour que les animaux ne subissent pas d’effets indésirables. Néanmoins, les élèves n'étant pas familiers des techniques enseignées, peuvent provoquer des nuisances sur les animaux. Elles peuvent être de différentes natures : stress du à des appréhensions des élèves , contention trop lache ou trop ferme, ou erreurs de manipulations pouvant conduire à des blessures (hématome, fausse route ou perforation du tube digestif) ou des douleurs (intramusculaire, intradermique) . Une autre source de stress peut provenir de la succession des actes invasifs même si des délais entre chaque acte sont respectés. D'autres nuisances peuvent également survenir, il s'agit des blessures infligés par des congénères Vu que les animaux sont surveillés et observés chaque jour, la détection d’un effet indésirable sur un animal conduit immédiatement à la mise en place d’une procédure adaptée : information au responsable, recherche de la cause de cet effet, avis vétérinaire si besoin, et si cela est possible : soulagement de l’animal sinon mise à mort pour éviter les souffrances inutiles.
Devenir
Chaque procédure correspond à une espèce, elles sont donc totalement indépendantes l'une des autres. Les animaux à l'issue de chacue des procédures ont le même sort quelque soit l'espèce. La plupart des animaux sont mis à mort pour différentes raisons. Les élèves doivent être formés sur les techniques de mises à mort. Les animaux morts sont réutilisés l'année suivante pour les dissections et les entrainements à la réalisation de points de suture. Un vide sanitaire de l'animalerie est ainsi possible pendant la période sans animaux permettant de maintenir un statut sanitaire propre. Une faible partie des animaux sont adoptés par les élèves car ceux qui sont en seconde et première doivent faire encore des stages en laboratoires animaliers. Il se pose donc des problème de logistique du à la quarantaine du personnel pour rentrer en zone.
Remplacement
Plusieurs méthodes sont utilisées pour éviter d’avoir recours aux animaux : La première consiste à travailler sur des supports inertes tels que des cartons, fausses peaux... qui permettent de s’entrainer à la manipulation des seringues et aiguilles pour trouver les bons angles, pour apprécier la force de pénétration de l’aiguille et pour rester fixe pendant la manipulation du piston. La deuxième méthode permet de visualiser la procédure grâce à la diffusion de vidéos réalisées en interne en précisant les difficultés et solutions. La troisième permet pour certaines manipulations de la réaliser plusieurs fois sur mannequins avant de passer sur animaux vivants. Quelle que soit la séance de TP, elle débute toujours par au moins une des méthodes de remplacement, mais il est impossible de remplacer totalement les animaux car l'apprentissage des gestes techniques pour former des personnes compétentes et habilitées nécessite de se confronter à des situations réelles où l'animal interagit. La vidéo est utilisée en amont mais également en aval de la manipulation. Cette dernière permet de pointer du doigt les difficultés de chaque apprenant pour qu'il prenne conscience de ses erreurs et qu'il les corrige pour les prochaines scéances.
Réduction
Comme chaque année de formation ne travaille pas sur la même espèce chaque semaine, nous pouvons considérer que nous formons 28 élèves par semaine les souris sont utilisées en actes invasifs pendant 20 TP nécessitant donc 120 souris par année scolaire Il en est de même pour les rats. Pour les lapins, le nombre de TP avec actes invasifs est de 15, les élèves travillent par binome et ou trinome permettant de réduire les animaux à 12 car entre chaque TP, au minimum, une semaine de repos est possible, le plus souvent, ce delai de repos est de 15 jours. De plus, le nombre d'actes invasifs est limité à 3 par TP et par animal. La rotation des espèces entre les années de formations et le suivi individuel des animaux permet de réduire au maximum le nombre d'animaux de chaque espèce.
Raffinement
Le raffinement peut être évalué grâce à plusieurs points par un suivi journalier avec sensibilisation à la détection des comportements des animaux et vérification des résultats des procédures précédentes par la mise en place d’un tableau de suivi individuel de chaque procédure réalisée sur l’animal, ce suivi individuel évite également l'utilisation des mêmes animaux car les apprenants prennent l'habitude de vérifier ceux qu'ils peuvent utiliser. Par un apprentissage progressif des techniques en commençant par les plus simples (identification, injection, prélèvement) ; par la prévention de la douleur pour des actes Par le recours à l’anesthésie pour des prélèvements sanguins difficiles (sinus rétro orbitaire, sub mandibulaire, jugulaire) Par le recours à des prélèvements sanguins tels que l’intra cardiaque sans réveil de l’animal Par une alternance des manipulations au cours des semaines Par un encadrement précis (14 élèves par tp) : surveillance rapprochée de l’enseignant pour des nouvelles procédures avec arrêt de la manipulation de l’élève si danger, aide à la réalisation dans les premiers temps (l'encadrant divisent le groupe en 2 pour pouvoir surveiller les actes de chaque apprenant) Par le travail en binôme pour une entraide et par la mise en place de tutorat entre élève lorsque l’enseignant a validé les compétences des élèves tuteurs Par la participation des élèves à la cellule de Bien être animal pour le développement de la culture du soin Par un suivi vétérinaire Par le respect de l’hébergement en groupe unisexe, les paramètres physicochimiques sont contrôlés et surveillés chaque jour. Si après une session de pratique, un animal présente des signes de douleurs ou présente des différences par rapport à son comportement avant la séance, il sera intégré dans un processus de suivi pour verifier régulièrement l'évolution des signes et prendre les mesures approrpiées (description des signes, chronologie de la surveillance avec délai entre chaque observation, avis vétérinaire..). Par le respect de points limite définis (nombre maximal d'utilisation avec acte invasif, delai entre les utilisation, perte de poids, changement morphologique du corps, masse, blessure, examination physique des yeux orifices, grille de score, …). En fonction du type de point limite atteint, trois possibilités de soulagement sont possibles : arret des actes invasifs, analgésie et soins pour soulager l'animal ou mise à mort immédiate en cas d'impossibilité de soulagement.
Choix des espèces
La souris, le Rat et le Lapin sont les mammifères les plus couramment utilisés en laboratoire de recherche. Nous formons nos élèves à l'utilisation de ces animaux, et pour cela que nous les utilisons. Nous recevons des animaux jeunes adultes, qui sont soit utilisés en travaux pratiques, soit mis à la reproduction. Par la suite, nous utilisons en général des animaux jeunes adultes parce que ce sont qui sont le plus couramment inclus dans des protocooles.
Etude pilote pour évaluer le phénotype d’une lignée de souris porteuses d’une nouvelle mutation humaine du gène TAF8
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de souffrance légère. L'intervention se limite à un génotypage avant l'âge de dix jours, puis à une simple observation jusqu'à seize semaines, huit mutantes et huit témoins étant suivies, les autres tuées dès le sevrage. Il s'agit d'une étude pilote destinée à vérifier qu'une mutation humaine du gène TAF8, reproduite chez la souris, ne provoque pas de "phénotype dommageable" avant d'engager une analyse comportementale ultérieure. Le porteur affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer ces animaux" et prévoit d'en prélever les organes pour des analyses moléculaires.
Objectifs
Nous nous intéressons aux protéines qui sont associées avec l'expression des gènes. Une étape importante est la reconnaissance des gènes par des protéines particulières qui sont présentes dans toutes les cellules. De manière surprenante, des mutations dans les gènes codant pour ces protéines ont été identifiées chez des patients humains présentant un retard de croissance et du développement moteur, une microcéphalie, des difficultés d'alimentation, et une déficience intellectuelle sévère. Nous avons développé un modèle de souris qui reproduit unede ces mutations humaines. Nous souhaitons dans un premier temps valider l'absence de phénotype dommageable des souris homozygotes adultes.
Bénéfices attendus
Ce projet est un projet préliminaire qui nous permettra de confirmer l'absence de phénotype dommageable chez les souris homozygotes Taf8PH/PH. Une fois, l'absence de phénotype dommageable avérée, nous soumettrons une autre saisine pour l'analyse des capacités intellectuelles des animaux mutants. A terme, ces projets apporteront des connaissances fondamentales sur le fonctionnement de la transcription et permetteront de mieux comprendre la cause de déficiences intellectuelles chez l'homme.
Procédures
Les souriceaux seront génotypés avant l'âge de 10 jours (1 prélèvement durant 1 seconde).
Impact sur les animaux
Les patientes étudiées présentent des difficultés d'alimentation, un retard de croissance et du développement moteur (hypotonie axiale, spasticité progressive) et une déficience intellectuelle sévère. Des crises d'épilepsie pendant l'enfance ont également été observées. Aucun effet indésirable sévère n'est attendu chez les animaux Taf8PH/PH mais une attention sera portée au suivi du développement moteur, de l'alimentation et à l'occurrence éventuelles de crises d'épilepsie chez les nouveaux nés.
Devenir
Le but de cette saisine est l'observation des animaux de leur naissance jusqu'à 16 semaines qui correspond à l'âge maximal prévu pour les analyses futures. Tous les animaux seront génotypés mais seules 8 souris Taf8PH/PH et 8 souris contrôles (+/+ ou PH/+) seront conservées pour l'observation jusqu'à l'âge de 16 semaines: les autres souris seront euthanasiées au moment du sevrage. les animaux suivis seront eux euthanasiés à 16 semaines.
Remplacement
Le but de ce projet pilote est de vérifier qu'une mutation qui a été identifiée chez des patientes humaines n'induit pas, à l'état homozygote, de phénotype dommageable ou affectant le bien être des souris, avant d'initier un projet d'analyse comportementale. Il n'est donc pas possible de remplacer ces animaux. Ce modèle murin servira à moyen terme à dériver des lignées cellulaires permettant de faire une analyse moléculaire, permettant, à plus long terme de minimiser le nombre d'animaux utilisés.
Réduction
Le nombre de 6 portées minimum contenant en tout au moins 8 animaux Taf8PH/PH homozygote a été choisi pour nous assurer de l'absence de phénotype. Les mêmes animaux seront analysés tout au long de leur vie (naissance jusqu'à 16 semaines) pour minimiser le nombre d'animaux utilisés. Les organes de ces animaux seront prélevés en fin de procédure pour des analyses moléculaires.
Raffinement
Le but de cette saisine est de vérifier que la mutation Taf8PH à l'état homozygote ne provoque pas de phénotype dommageable, même si aucun problème n'est attendu puisque les patientes humaines sont viables et se caractérisent principalement par une déficience intellectuelle. L'élevage des animaux sera fait par un personnel compétent dans des conditions du respect du bien être animal, par du personnel compétent sensibilisé à la possibilité de l'apparition d'un phénotype délétère chez les mutants. Cette évaluation sera faite en conditions normales d'hébergement avec enrichissement et en maintenant les liens sociaux entre les animaux. A la naissance, la capacité d'alimentation de tous les souriceaux sera évaluée par la présence de lait dans l'estomac. L'état des animaux sera évalué 3 fois par semaine (propreté, déplacement, vivacité et posture) jusqu'à l'âge de 16 semaines. En cas de souffrance animale, l'avis du vétérinaire sera démandé pour une éventuelle action avant euthanasie si aucune solution ne se présente..
Choix des espèces
Nous souhaitons modéliser une mutation découverte chez l'homme et associée à des problèmes cognitifs. La souris est un modèle de choix qui nous permettra de dériver des lignées cellulaires utiles pour les études moléculaires in vitro tout en analysant le développement du système nerveux et le comportement des animaux mutants. Le but de cette saisine est de nous assurer de l'absence de phénotype délétère chez les homozygotes: les animaux seront donc observés de la naissance jusqu'à 16 semaines où ils seront euthanasiés.
Génération d’une collection de xénogreffes dérivées de lymphomes primaires ou PDX chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1500 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de lymphome humain par injection ou après une petite chirurgie, incision de la peau et du péritoine près de la rate ou du rein, puis des prélèvements de sang à la joue toutes les deux semaines, pour constituer une collection de tumeurs greffées appelées PDX servant à tester des molécules antitumorales. Le porteur situe les bénéfices pour les patients à long terme, l'objectif immédiat étant de reproduire chez la souris des lymphomes humains qu'il qualifie de "modèle formidable". Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de maintenir un lymphome humain en culture et juge "indispensable" de générer ces modèles.
Objectifs
Ce projet vise à améliorer les connaissances et la prise en charge des lymphomes chez l’homme. Les lymphomes sont des cancers du système lymphatique. Ils sont responsables du développement de tumeurs au niveau des organes lymphatiques (ganglions, rate, …). Ces lymphomes ont une grande diversité et une classification complexe. Ils proviennent de cellules transformées du système immunitaire, comme les lymphocytes B ou T. Le but de ce projet est de développer des modèles pré-cliniques chez la souris de lymphomes humains, afin de tester de nouvelles molécules antitumorales. Le développement de modèles animaux est indispensable, seules des études in vivo permettent de valider l’effet antitumorale d’une molécule car les effets que peuvent avoir le microenvironnement et l’architecture même de la tumeur d’origine du patient sont pris en compte. Les modèles pré-cliniques développés ici sont des xénogreffes chez la souris de lymphomes provenant de patients. Ces xénogreffes dont l'anglicisme très utilisé est PDX (Patient-derived xenograft) sont la transplantation d'un greffon de lymphome de patient dans une espèce biologique différente ici la souris. Elle s'oppose ainsi à l'allogreffe où le greffon du donneur vient de la même espèce que le receveur. Les greffes sont réalisées dans des souris très immunodéficientes, particulièrement propices à la survie et à multiplication des cellules tumorales des patients, évitant ainsi le rejet de greffe. Un panel représentatif de PDX pour chaque type de lymphome sera développé, afin de tester l’activité antitumorale de molécules à visée thérapeutique. Le nombre de souris impliquées dans le projet est réduit au minimum, grâce à l’étude approfondie des données de la littérature et aux données déjà obtenues lors de projets précédents réalisés in vitro avec des lignées cellulaires, sans toutefois mettre en péril l’obtention d’un panel de PDX représentatifs des lymphomes connus. Les conditions d’hébergement et les soins donnés aux animaux sont faits dans le respect du bien-être animal, ceci afin de limiter au maximum le stress et de garantir le bien-être de chaque animal. Les méthodes utilisées dans les différentes procédures de ce projet ont été étudiées afin réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux. Une définition précise des points limites, associée à une surveillance adaptée des animaux ont été définis afin de limiter toute souffrance animale. Au maximum, 1500 souris seront nécessaires pour ce projet.
Bénéfices attendus
Bénéfices à court terme : ce projet fera progresser la connaissance scientifique dans le domaine du lymphome, car il permettra d’avoir un modèle formidable que sont les PDX, qui permettent de reproduire chez la souris un lymphome possédant toutes les caractéristiques phénotypiques, moléculaires et environnementales de la tumeur du patient. Bénéfices à long terme : grâce à ce projet, de nouvelles cibles thérapeutiques et/ou médicaments pourront être testés afin d’améliorer les traitements actuels, de prévenir la résistance aux médicaments et les rechutes et donc prolonger la vie des patients.
Procédures
Les souris auront pour certaines une greffe par une injection unique d’un fragment d’une biopsie de lymphome humain ou de cellules tumorales humaines, injection réalisée après anesthésie et d’une durée totale de moins de 5 minutes. Certaines autres greffes nécessitent une étape de chirurgie. Les souris recevront donc les médicaments nécessaires pour obtenir une anesthésie et une analgésie préopératoire (médicaments aux propriétés antalgique, antipyrétique et anti-inflammatoire). Il sera fait une toute petite incision de la peau puis du péritoine au niveau de la rate ou du rein afin de réaliser une petite ouverture permettant l’injection des cellules tumorales ou l’introduction d’une biopsie tumorale. Les sutures sont réalisées au niveau du péritoine puis de la peau (durée totale de 10 minutes environ pour l'ensemble de l'intervention). Dans tous les cas, 1 mois post-greffe et ensuite toutes les 2 semaines, il sera réalisé un prélèvement sanguin non invasif (2 gouttes de sang) au niveau de la joue afin de vérifier la présence des cellules tumorales humaines (durée d'une à deux minutes environ pour ce prélèvement).
Impact sur les animaux
Nuisances légères attendues dues au stress de la contention et des piqures réalisées lors des greffes ou des analgésies, durant quelques secondes ou quelques minutes (temps requis pour effectuer les injections). Nuisances modérées attendues dues au stress et à une légère douleur, du fait d'un cumul des piqures, des étapes de petite chirugie et dues au développement du lymphome lui-même.
Devenir
L'ensemble des souris utilisées dans ces différentes procédures seront mises à mort car elles auront été soit remplacées en élevage après 6 mois de vie, soit car elles auront été greffées avec des lymphomes humains. En cas de non prise des greffes, les souris seront quand même mises à mort après 1 an post-greffe car au delà elles développent généralement de façon spontanée des pathologies diverses dues à leur âge avancé.
Remplacement
Il n'existe actuellement pas de modèle in vitro ou ex vivo permettant de maintenir à long terme un lymphome primaire humain en culture. Quelques modèles de PDX de lymphome ont été générés aux USA mais ces modèles restent rares et ne sont pas représentatifs des différentes entitées de lymphome. La demande pour ces modèles pertinents afin de tester l'efficacité de nouvelles thérapies est de plus en plus grande. Il est donc indispensable de générer ces nouveaux modèles précliniques afin d'améliorer la prise en charge clinique des patients atteints de lymphome.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux utilisé dans ce projet : 1/ il a été estimé que la greffe de 3 souris pour chaque voie est suffisante pour permettre l’obtention d’une prise de greffe à T0. De même que la greffe de 2 souris pour les T1 et T2 suffit ; 2/ la génération effective de PDX sera limitée à 10 patients par type de lymphome et donc pour 8 entités différentes ; 3/ quand cela sera possible en fonction du type de lymphome à greffer, la ou les voies utilisées pour réaliser les greffes et générer un PDX seront toujours les voies les moins invasives, avec le moins d'effet indésirables, afin de réduire à son minimum la souffrance ou le stess des animaux ; 4/ les ressources cellulaires post-mortem seront mutualisées au sein de l’équipe de recherche afin qu’un même échantillon puisse être exploité pour différents projets et ainsi éviter l'utilisation itérative de souris.
Raffinement
Élevées dans des conditions d'hygiène strictes, les souris immunodéficientes NSG ne présentent pas de signes de souffrance particuliers (classe légère). Les différentes injections médicamenteuses ainsi que les greffes de lymphome de patients chez ces souris par voie intraveineuse ou par voie sous-cutanée n’induisent pas de souffrance particulière (classe légère). Les souris avec une petite chirurgie pour les greffes par voie S.C.R. et I.S. seront anesthésiées avant l'intervention. L'endormissement sera contrôlé avant l'intervention et surveillé tout au long de la chirurgie. Pendant l'intervention chirurgicale et ensuite, les souris seront laissées sur plaque chauffante pour qu'elles ne se refroidissent pas pendant l’endormissement et surveillées jusqu’aux premiers signes de réveil, puis replacées dans leur cage. Une goutte de gel hydratant sera également appliquée sur chaque œil avant et après l'étape de chirurgie afin d'éviter un dessèchement. Les sutures seront surveillées pendant les deux jours suivant afin de prévenir tout risque d’infection. S'il est constaté une infection cutanée, la plaie sera désinfectée deux fois par jour pendant deux jours jusqu’à disparition des signes d’infection ou l’animal sera mis à mort si l'infection persiste. A ce jour, aucune infection cutanée n'a été observée lors de projets précédents. Ces animaux seront observés trois fois par semaine pendant toute la durée du développement du PDX avec la mise en place d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés. Si après 1 an post-greffe aucune prise tumorale n’est observée l'expérience de sera pas poursuivi, les animaux seront alors mis à mort afin d'éviter aux animaux des souffrances dues au vieillissement. Les souris qui développeront un lymphome seront mise à mort rapidement selon une grille de score et les points limites définis.
Choix des espèces
Nous avons accès à des modèles de souris très immunodéficientes, présentant des déficits complets en cellules immunitaires de type lymphocytes T, B et NK. Ces souris sont donc un modèle de choix pour greffer des tumeurs humaines telles que des lymphomes chez la souris (xénogreffes) et donc éviter le rejet de greffe des cellules humaines. Les souris immunodéficientes seront utilisées à partir de l'âge de 8 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte de ces animaux. La greffe sur des animaux adultes permet d’avoir un taux idéal de greffe d’après les données de la littérature et d'après nos résultats expériences réalisées précédemment dans le cadre d’un autre projet de recherche.
Analyse de modèles de souris pour l’étude des déficits cognitifs
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 160 d'entre elles tuées à l'issue pour prélever organes et tissus, les 40 autres, utilisées comme compagnes, gardées vivantes pour de futures mises au point. Elles subissent une biopsie de l'oreille, la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie, puis cinq semaines de tests comportementaux mesurant apprentissage, mémoire, prise de décision et coordination motrice dans un modèle de trisomie, les souris compagnes subissant en plus des frottis vaginaux. Le porteur situe les retombées pour les patients dans des études ultérieures, l'objectif immédiat étant de sélectionner les tests les plus pertinents pour tester plus tard des molécules. Sur le remplacement, il affirme que comprendre ces maladies génétiques exige l'étude d'un "organisme vivant dans son intégrité" et conclut à la "nécessité" de recourir à la souris.
Objectifs
Le projet consiste à comprendre les mécanismes des déficiences intellectuelles associées à des trisomies. Nous nous intéressons plus spécifiquement dans cette étude à la caractérisation de déficits cognitifs (apprentissage, mémoire, prise de décision et organisation du comportement) et de coordination motrice dans un modèle de trisomie. Sa caractérisation permettra de compléter les descriptions précédentes par l’étude de fonctions cognitives encore non explorées et ainsi de décrire précisément la perturbation des fonctions cognitives et exécutives dans un modèle de trisomie. Cette caractérisation constitue donc la base d’un projet général qui vise à comprendre les mécanismes de la trisomie. Elle va permettre de sélectionner les tests les plus pertinents pour évaluer les effets de traitements potentiels dans une étude ultérieure. Elle est donc primordiale pour bien identifier les niveaux de référence dans les études futures. C’est pourquoi nous répétons certains tests qui ont été conduits précédemment pour nous servir de référence et nous complétons cette caractérisation par de nouveaux tests comportementaux qui permettront de préciser la nature et l’amplitude des déficits.
Bénéfices attendus
Cette étude vise à mieux caractériser les défauts cognitifs d’un modèle animal de trisomie. Elle permettra de sélectionner les tests comportementaux les plus pertinents afin de tester des molécules à effets thérapeutiques visant à réduire ces défauts dans des études futures. Cette étude constitue donc la base pour des études ultérieures pour la recherche de voie d’amélioration pour les patients.
Procédures
Tous les animaux seront évalués lors d’un ensemble de tests comportementaux visant à observer leurs performances cognitives. Ces tests seront réalisés pendant une durée totale de 5 semaines, chaque test durant entre 3 min et une heure. Les animaux subissent uniquement une biopsie à l'oreille pour permettre le génotypage (2 s), et l'insertion en sous-cutanée d'une puce d'identification par radio-fréquence à l'âge de 6 semaines. Cette intervention sous anesthésie gazeuse est très rapide (2 min) et est réalisée après injection d'un analgésique local en sous-cutané (5 s, pendant l’anesthésie gazeuse). Les souris utilisées comme compagnons pour l'interaction sociale subissent un frottis vaginal (rinçage du vagin pendant 20 s) pour suivre leur cycle sexuel.
Impact sur les animaux
Aucun phénotype dommagable n’a été rapporté lors d’études précédentes de la lignée de souris étudiée. Une légère douleur très ponctuelle lors de l’injection sous cutanée d’une puce RFID sera contrôlée par l’utilisation d’un anti-douleur local. Une surveillance de la cicatrisation est réalisée et si un suintement est observé, un antispetique local et/ou pommade cicatrisante est/seront appliqué(s). Les souris seront soumises à un stress léger ou modéré lors des tests comportementaux (stimuli lumineux et changement ponctuel du pH de l’eau (acidification de l’eau de boisson en cage d’hébergement, qui rend plus appétente l’eau lors des tests d’apprentissage réalisés en dehors de la cage d’hébergement)) afin de favoriser l’apprentissage et ainsi réduire la durée des tests. Cela permet d’optimiser la durée de la procédure globale. L’apparence des animaux (état du pelage qui doit rester brillant et propre, perte de poids visible par saillie des hanches) sera surveillée au cours des manipulations quotidiennes des animaux pendant les tests comportementaux.
Devenir
Tous les animaux de la lignée transgénique étudiée seront mis à morts car nous allons faire des prélèvements (organes, tissus…) pour faire des études approfondies des tissus et des processus moléculaires. Les animaux utilisés comme nouvel arrivant dans l’interaction sociale ne subissent que l’insertion de puce RFID et l’interaction sociale. Ils seront donc conservés pour une réutilisation dans les mises au point de tests comportementaux non invasifs.
Remplacement
La compréhension des mécanismes de maladies génétiques associées à des retards mentaux requiert l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire notamment pour évaluer les processus cognitifs et moteurs. La souris est une espèce suffisamment proche de l’Homme, physiologiquement et génétiquement, chez laquelle nous pouvons modéliser des pathologies humaines.
Réduction
Les effectifs nécessaires ont été calculés par rapport aux études précédentes afin d’obtenir des résultats robustes. Nous analyserons les résultats de chaque test avec des tests statistiques adaptés. Nous prélèverons un maximum d’échantillons (organes, tissus…) sur chaque animal afin de pouvoir créer une banque pouvant être utilisée dans d’autres études.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes sociaux stables. Pour l’identification, la douleur lors de l’injection sous-cutanée de la puce est gérée par une injection sous-cutanée préalable d’un anti-douleur local. Une partie des animaux aura une eau de boisson quotidienne légèrement aversive afin de faciliter l’apprentissage du test par renforcement positif (la récompense dans le test d’apprentissage est constituée par de l’eau mélangée à du sirop de fraise) sans à avoir subir de privation ou de renforcement négatif. L’eau sucrée présentée dans le test devient d’autant plus appétente que l’eau de boisson quotidienne est acide ; cela renforce donc l’apprentissage des animaux, sans les priver. Des études précédentes ont montré que les souris ne perdent pas de poids malgré l’acidité de l’eau quotidienne. Des points limites sont mis en place pour surveiller le maintien de l'état de santé des animaux pendant toute la durée des procédures.
Choix des espèces
La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des transgéniques est liée à l'absence de tout mutant spontané dans une espèce de mammifères qui correspond à la pathologie humaine étudiée (trisomie). Les souris seront testées une fois adultes (8 semaines). Nous avons choisi cet âge car il correspond à une période hors développement. Les patients porteurs de trisomie montrent des défauts cognitifs à l’âge adulte.
Comparaison du fitness et de la pathogénicité de souches d’Haemonchus contortus résistantes et sensibles à l’éprinomectine
- Recherche appliquée
- Maladies animales
70 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour dix d'entre eux et modéré pour soixante, soixante étant tués et autopsiés et dix témoins réutilisés. Chaque animal est infesté par voie orale par un ver hématophage, puis subit des prélèvements de fèces et de sang hebdomadaires et des pesées, l'infestation provoquant une anémie modérée. Le porteur compare des souches du nématode Haemonchus contortus résistantes et sensibles à un antiparasitaire, pour adapter les recommandations de traitement aux éleveurs. Les moutons infestés sont tués pour dénombrer les vers adultes dans la caillette et comparer les souches entre elles.
Objectifs
Les objectifs du projet sont de comparer les fitness (capacité à survivre et à se reproduire) et les pathogénicités (capacité du parasite à induire des signes cliniques chez son hote) de souches résistantes et sensibles aux avermectines et d’évaluer ainsi le coût éventuel de la résistance des nématodes à ces anthelminthiques. En effet, la résistance des strongles gastro-intestinaux aux anthelminthiques est une problématique croissante actuellement. Certains élevages ne disposent plus de molécules efficaces pour traiter contre les strongles pendant la période de lactation des brebis. Il est admis que la capacité d’un parasite à resister induit un coût pour celui-ci, donc une faiblesse sur d’autres traits de vie (par exemple la capacité à se reproduire). Cette question du fitness et du coût de la résistance est importante car une des recommandations pour limiter l’apparition et la diffusion des résistances est basée sur la notion de refuge qui consiste à maintenir des animaux parasités par des populations de parasites sensible, snon soumises à la pression de sélection. Pour cela, on fait appel au traitement ciblé sélectif (TCS). Cependant, l’efficacité du TCS repose notamment sur l’hypothèse qu’il y a une différence de fitness entre les souches sensibles et résistantes et donc un coût de la résistance pour les nématodes. Ce projet a permis de récolter des isolats de terrain, matériel biologique d’un grand intérêt. Nous disposons à ce jour de 6 isolats purifiés, 3 sensibles et 3 résistants à l’éprinomectine. Ces 6 isolats sont contemporains et proviennent d’un même bassin de production et peuvent ainsi servir de base à une comparaison de phénotypes incluant le « fitness ». Le fitness d’une souche correspond à sa capacité à survivre et à se reproduire. On pourra également comparer la différence de pathogénicité entre ces isolats, autre question d’un grand intérêt dans le domaine. Ce type d’expérimentation est d’autant plus originale que ce sont les premiers isolats d’Haemonchus contortus résistants à l’éprinomectine disponibles. De plus, ces isolats sont d’un grand intérêt pour la comparaison de fitness car ils proviennent de la même zone géographique et sont contemporains.
Bénéfices attendus
L’intérêt de ce travail est d’évaluer le comportement des souches en conditions expérimentales en faisant varier les conditions de développement des stades libres (température et hygrométrie) et d’observer s’il existe des différences de comportements des souches dans les stades parasitaires (taux d’implantation, ponte d’œufs, durée de la période prépatente…). Cela permettra de mimer les évolutions climatiques et voir si une catégorie de souches a des faiblesses dans certaines conditions mais pas dans les autres. L’objectif est d’observer s’il existe une différence de fitness entre les souches et si celle-ci est commune pour les souches résistantes. Cela permettra de pouvoir adapter les recommandations de gestion aux éleveurs. On observera également s’il existe une différence de pathogénicité entre les souches. C’est une information importante pour les éleveurs, notamment s’il s’avère que les souches résistantes sont également les plus pathogènes ou en termes d’impact et de gestion s’il s’avère que les souches résistantes sont moins pathogènes que les sensibles.
Procédures
Infestation par voie orale (volume administré = 10 mL) : n =1/animal, 2 minutes maximum par drogage, contention comprise. Prélèvements rectaux de fèces : n = 14/animal (un par semaine de J0 à J18 post-infestation puis 2 fois par semaine de J18 jusqu’à l’euthanasie des animaux), 3 minutes maximum par prélèvement, contention comprise. Prises de sang (volume maximal = 5 mL) : n = 9/ animal (une à J0, puis une par semaine), 3 minutes maximum par prélèvement, contention comprise. Pesées : n =9/animal (une à J0 puis une par semaine), 3 minutes maximum par pesée.
Impact sur les animaux
H. contortus étant un nématode hématophage, la dose infestante administrée va induire une anémie modérée chez son hôte, bien tolérée par l'animal. Stress modéré lors de l'infestation par voie orale, des prélèvements fécaux et sanguins et des pesées. Douleur légère lors des prises de sang et des prélèvements fécaux.
Devenir
Les animaux des lots infestés seront euthanasiés et autopsiés afin de pouvoir étudier la population de vers adultes présents dans la caillette et comparer les souches entre elles. Les animaux du lot témoins pourront être réutilisés.
Remplacement
Le cycle biologique d’H. contortus passe obligatoirement par le mouton qui est l’hôte définitif au sein duquel la reproduction sexuée s’effectue ; le petit ruminant ne peut donc pas être remplacé.
Réduction
Le nombre d’animaux prévus dans cette expérimentation est limité au maximum pour avoir un effectif permettant d’observer une différence de fitness et de pathogénicité entre les souches de parasite, grâce à des tests statistiques. Il faut prendre en compte les interactions complexes entre l’hote et le parasite, variables d’un individu à l’autre, ce qui nécessite d’avoir des lots suffisamment étoffés afin aussi de ne pas avoir à renouveller l’expérimentation. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux necessaires, nous avons homogénéisé certains facteurs liés à l’hote et connus pour influer sur le cycle du parasite tel que le sexe, l’age, la race et l’historique de contact avec les strongles gastro-intestinaux.
Raffinement
Les agnelles seront hébergées sur une litière paillée et en lots d’infestation, de manière à pouvoir exprimer leurs comportements sociaux, et leur environnement sera enrichi avec des ballons et des brosses. Progressivement, elles s’habitueront à être manipulées et les prélèvements seront toujours réalisés par du personnel expérimenté. Elles feront l'objet d'une surveillance clinique quotidienne, complétée par une mesure hebdomadaire de l'hématocrite, de manière à détecter précocément les points limites associés aux conséquences de l'infestation parasitaire ou à d'éventuelles maladies intercurrentes.
Choix des espèces
L’espèce ovine est l’espèce cible d’H. contortus (application ensuite en élevage). Il n'existe pas d'autre espèce modèle ni de système alternatif que le mouton pour permettre au parasite H. contortus d’effectuer son cycle biologique. Le choix de l’espèce parasitaire repose à la fois sur sa fréquence, sa pathogénicité et sa capacité à développer rapidement une réponse immune chez son hôte mais aussi des multirésistances aux anthelminthiques. C’est pourquoi, l’espèce Haemonchus contortus a été choisie. Agnelles âgées de 3 mois. A cet âge, elles seront déjà sevrées, naïves vis-à vis d'Haemonchus contortus et donc pleinement réceptives à une infestation par ce parasite. En outre, elles auront atteint un poids leur permettant de supporter une infestation avec 5000 larves du parasite et l'anémie modérée en résultant, sans que cela ait un impact majeur sur leur santé et leur développement.
Etude de la fonction de différents gènes dans le contrôle du temps durant le développement du cerveau dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
6774 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles gestantes reçoivent des injections intrapéritonéales sur animal vigile en contention puis sont tuées pour prélever le cerveau de leurs embryons, et des souriceaux âgés de sept à vingt et un jours sont tués pour prélever le leur, afin d'étudier des gènes du développement cérébral. Le porteur indique que l'injection provoque une douleur limitée à sa durée et que la contention est source de stress. Il affirme que ces mécanismes doivent être étudiés in vivo, les retombées pour des maladies du développement comme la microcéphalie ou l'autisme restant hypothétiques.
Objectifs
Le développement du cerveau se produit par une succession d’étapes de prolifération et de spécialisation cellulaire très contrôlées dans le temps. Nous nous intéressons aux mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent la façon dont les cellules perçoivent le temps (déclenchement, durée et arrêt de chacune de ces étapes comme la division ou la différenciation). Notre objectif est d’identifier des gènes codant pour des protéines qui contrôlent ces processus et de les étudier dans un contexte in vivo, au cours du développement d’un cerveau de Mammifère. Dans ce but, nous utiliserons des souris transgéniques afin de modifier, à des moments précis du développement, nos gènes d’intérêt et nous étudierons comment ces modifications altèrent le temps de génération et de maturation des neurones dans 2 régions du cerveau : le cortex cérébral et le cervelet. Nous en étudierons les modifications comme la prolifération, le nombre de cellules générées, le type cellulaires, la morphologie et taille des neurones…, ainsi que les modifications d’expression des gènes et de la conformation de l’ADN, afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués. Cette étude chez la souris permettra de compléter avec un modèle in vivo de mammifère, des études réalisées chez la mouche et sur des modèles sur cellule humaine.
Bénéfices attendus
Cette étude in vivo permettra d’acquérir des connaissances précieuses sur les facteurs qui codent la perception du temps par les cellules lors du développement du cerveau de Mammifère et d’en comprendre les mécanismes. Elle sera mise en perspective avec d’autres études menées en parallèle chez la mouche et dans des cultures de cellules humaines, afin de comprendre comment ces mécanismes se sont ajustés au cours de l'évolution, dans différentes espèces. De plus, cette étude constituera un socle pour de futures découvertes permettant de comprendre certaines maladies développementales du cerveau. Par exemple, la microcéphalie qui peut être due à des altérations de la durée de certaines étapes clés lors du développement. De plus en plus d’études montrent que des conditions comme le syndrome du X fragile et les troubles du spectre autistique seraient dus à un déséquilibre des neurones excitateurs et inhibiteurs. Il est probable que ce déséquilibre soit dû à des altérations subtiles de la chronologie de la génération de ces neurones. Les mécanismes explorés dans cette étude pourraient donc apporter des pistes de réflexion voire des réponses pour parvenir à mieux expliquer ces troubles du développement.
Procédures
Pour ce projet, il est prévu de soumettre des souris à des injections intrapéritonéales de produits sur animal vigile, en contention. Cette procédure doit durer quelques secondes. Les animaux recevront 2 injections maximum. L’euthanasie des animaux est requise pour les analyses et les prélèvements.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons à ce que cette procédure entraine une douleur lors de l’injection. Cette douleur ne doit pas durer plus que le temps de l’injection faite en intrapéritonéal. La contention entraine également un stress à l’animal.
Devenir
Les femelles gestantes seront euthanasiées dans le but de prélever et d’analyser les cerveaux des embryons afin d’étudier le développement des cellules. Les souriceaux (P7-P14-P21) seront euthanasiés dans le but de prélever et d’analyser leur cerveau afin d’étudier le développement des cellules.
Remplacement
Notre projet vise à comprendre les mécanismes de développement du cerveau en prenant en compte toute sa complexité (diversité des cellules, interactions, contraintes physiques…). Suivant le principe de remplacement, des études sur d’autres modèles (mouches), ainsi que sur cellules humaines en culture sont réalisées et permettent de disséquer certains aspects et mécanismes impliqués dans les processus étudiés. En revanche, il est indispensable dans le cadre de cette étude, de passer par une approche chez le Mammifère afin de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. De plus, les outils génétiques disponibles chez la souris nous permettent de contrôler avec précision le moment d’inactivation du gène d’intérêt.
Réduction
Les recherches effectuées en amont chez la mouche et les cellules humaines (en culture) nous permettent d’affiner les pistes de recherche et d’ainsi réduire le nombre d’animaux murins utilisés. Le nombre d’animaux utilisés évalué à 6774 sera limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables et sera calculé pour chaque type d’analyse. Toutes les quantifications se feront en aveugle. Nous travaillons en étroite collaboration avec des statisticiens présents dans notre unité pour définir toutes les tailles d'échantillons et les tests statistiques appropriés.
Raffinement
L’animalerie est agréée, les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage et espace) et les conditions d’enrichissement de l’environnement (maison et neslet, papier craft), d’alimentation et de soins quand nécessaires seront contrôlées. Une période d’acclimatation d’une semaine sera effectuée avant toute procédure expérimentale. Ils seront maintenus en portoirs ventilés et dans des conditions de température et d’hygrométrie maintenues dans les références recommandées. Les femelles gestantes seront regroupées (2 par cages) afin d’éviter leur isolement et auront une alimentation adaptée à leur stade physiologique. En cas d’observation de la moindre douleur, les animaux seront euthanasiés pour éviter toute souffrance inutile. Des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués. Un recours à l'analgésie pourra être prévue. Tout au long de la vie des animaux, un suivi rigoureux sera réalisé pour s’assurer de leur bien-être en collaboration avec la structure chargée du bien-être animal et du vétérinaire.
Choix des espèces
Pour notre étude, nous utiliserons des modèles de mouches, ainsi que des modèles de cellules humaines en culture. Cependant, il est indispensable de comparer ces données avec un modèle de cerveau de Mammifère. Nous avons fait le choix de la souris car les outils génétiques et moléculaires développés dans notre domaine de recherche ont été réalisés pour des travaux chez la souris. Les animaux génétiquement modifiés qui sont nécessaires à cette étude sont uniquement disponibles chez la souris. Notamment, certaines de ces lignées disponibles chez la souris nous permettent de contrôler avec précision l’inactivation de nos gènes d’intérêt. Les animaux utilisés seront des adultes d’au moins 2 mois. Afin d’inactiver nos gènes d’intérêt au stade embryonnaire, les injections d’un produit, appelé tamoxifène, seront pratiquées sur la femelle gestante. Une injection supplémentaire sera réalisée sur ces femelles gestantes dans le cas où les tissus seront prélevés au stade embryonnaire. Dans le cas où les tissus seront prélevés sur souriceaux, l’injection se fera sur les souriceaux de 7, 14 ou 21 jours.
Étude de la pharmacocinétique d’anticorps humain-spécifiques dans un modèle de souris humanisées
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal, porteur d'une protéine humaine humanisée, reçoit une injection d'anticorps puis subit cinq prélèvements sanguins sous anesthésie en une semaine, avant d'être tué. Le porteur reconnaît que les prélèvements répétés peuvent provoquer douleur, inflammation, induration voire infection cutanée. Il affirme que les essais de pharmacocinétique ne sont "pas substituables" par des tests in vitro, en raison du "besoin" de mesurer la substance dans un organisme aux organes fonctionnels.
Objectifs
L’objectif du projet est l’étude de la pharmacocinétique de différents anticorps ciblant une protéine humaine dans un modèle animal de souris exprimant cette protéine humanisée. Ces anticorps ont déjà montré leur potentiel pour le traitement de maladies du foie, et seront prochainement tester pour d’autres pathologies, notamment les cancers tête-cou, la fibrose rénale et le cancer colorectal. Le but du projet est donc de déterminer pour chaque anticorps le temps de vie dans le sang des animaux humanisés, à différentes doses afin d’optimiser leur utilisation future en clinique. Ces anticorps humanisés sont construits sur différentes types d’anticorps qui possèdent des caractéristiques propres à chacun et qui les amèneront à être utilisés pour différentes applications.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre la pharmacocinétique de ces différents anticorps spécifiques de cette protéine humaine chez l’animal exprimant la protéine humanisée et ainsi de déterminer dose et fréquence optimale d’injection en vue de prochain essais cliniques. Ces anticorps seront utilisés pour différentes pathologies (cancer tête-cou, colorectal, fibrose rénale…) pour lesquelles les options thérapeutiques sont très insatisfaisantes.
Procédures
Les animaux recevront une injection unique d’anticorps sur animaux vigils Cette injection est réalisée en moins d’une minute. Les animaux subiront 5 prélèvements de sang en une semaine. Chaque prélèvement est réalisé sur animaux anesthésiés et prend environ une minute à être réalisé. Les animaux recevront une injection de solution physiologique pour réhydratation qui sera faite sur animaux anesthésiés, suite au 3ème prélèvement de sang. Cette injection est réalisée en moins d’une minute.
Impact sur les animaux
Des nuisances directement liées aux manipulations et aux prélèvements répétés peuvent être attendues, notamment le stress pour les animaux lors des manipulations, une douleur liée au prélèvement et injection pouvant induire inflammation et induration. L’apparition d’une infection cutanée aux points de prélèvement n’est pas à exclure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le sang sur lequel nous pourrons réaliser différentes analyses. Les organes seront également récupérés afin de réaliser des études histologiques.
Remplacement
Les anticorps ont été validés et sélectionnés par des tests in vitro. Néanmoins, dans les essais de pharmacocinétiques pour toutes substances thérapeutiques, les tests sur animaux entiers ne sont pas substituables par des tests simplifiés in vitro. Cela en raison du besoin de mesurer les variations de concentration de la substance thérapeutique dans le plasma d’un organisme ayant des organes et des systèmes pleinement fonctionnels.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux inclus dans cette étude, nous n’utiliserons que des groupes pertinents nous permettant d’arriver à une conclusion claire. La taille des effectifs a été déterminée auparavant en se basant sur les résultats d’une expérience menée par des collaborateurs. Ainsi des groupes de 4 animaux devraient être suffisants pour déterminer la durée de vie dans le sang de nos anticorps. De plus, cette étude de pharmacocinétique aura elle-même un rôle dans la réduction du nombre des animaux concernés par les procédures expérimentales future, car elle nous permettra de mieux concevoir les expériences futures, en choisissant la dose et le schéma thérapeutique les mieux adaptés.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre de manière précoce la procédure permettant de soustraire les animaux à la souffrance si besoin. Une méthode anesthésique est appliquée lors des prises de sang. Une analgésie est appliquée en cas d’apparition des signes de souffrance ou de douleur. Les animaux sont observés quotidiennement. Afin de limiter la souffrance des animaux, le sang sera collecté par une voie à saignement minimale. Les animaux auront accès sans restriction à la nourriture et à l’eau pendant toute la durée de l’expérience. Les animaux sont hébergés par 3 minimum en cages ventilées.
Choix des espèces
Les anticorps que nous nous proposons d’étudier sont spécifiques d’une protéine humaine. Afin de réaliser des tests précliniques, nous avons établi un modèle de souris exprimant cette protéine humanisée, à la place de la protéine de souris, et présentant les mêmes capacités de fixation des anticorps que la protéine humaine. Les souris seront utilisées un âge adulte (8 à 10 semaines). L’utilisation ultérieure des anticorps se fera chez le sujet adulte.
Etude de l’impact et choix de l’enrichissement du milieu sur l’élevage de lignées de souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
36 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis replacées et réutilisées par d'autres équipes, sans mise à mort prévue. Chaque animal est isolé jusqu'à six semaines pour mesurer l'effet de différents enrichissements sur l'élevage, l'isolement affectant l'expression du comportement social. Le porteur présente ce projet comme un moyen d'améliorer le bien-être des animaux non-humains de l'animalerie et de répondre à la réglementation. Il affirme qu'aucun remplacement n'est possible puisqu'il s'agit d'étudier l'enrichissement lui-même, et indique avoir déjà obtenu des résultats sur un effectif identique.
Objectifs
Cette étude consiste à réaliser des observations afin de comparer différents moyens d'enrichisssements du milieu (2 matériels de nidification ainsi que 3 enrichissements pour se cacher type tunnels ou igloos plastique ou carton) sur 3 lignées à différents âges et différentes conditions d'hébergement. Nous allons analyser chaque cage avec 7 conditions d'enrichissements (6 conditions avec les différents enrichissements + 1condition controle). Elle permettra de répondre au mieux à la réglementation en vigueur, tout en raffinant (3Rs) les conditions d 'élevage de souris améliorant ainsi leur bien-être. L'objectif est de fournir à nos lignées l'enrichissement le mieux adapté pour leur bien être en fonction des conditions d'hébergements.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de répondre au mieux à la réglementation en vigueur , tout en raffinant (3Rs) les conditions d 'élevages de souris impactant ainsi leur bien-être. Le but de ce projet est de permettre de mieux connaître l'impact de l'enrichissement sur le bien être animal . Le même moyen d'enrichissement est utilisé par les souris de la même façons différentes selon qu'elles soient hébergées en groupes sociaux ou de sexes différents (souris mâles isolés, en groupe de souris femelles ou mâles, en groupe reproducteur). Les résultats de notre étude seront valorisés à l'extérieur de notre structure par des présentations à d 'autres Structures de Bien Etre Animal (SBEA).
Procédures
Isolement de 36 mâles pour une durée maximale de 6 semaines.
Impact sur les animaux
Ces animaux devraient avoir un stress mineur au maximum si l'enrichissement n'est pas adapté à l'expression de leurs comportements physiologiques naturels. Les animaux seront également isolés pour les besoins de notre étude, ce qui impacte l'expression de leur comportement social.
Devenir
Les animaux ne subiront aucune procédure expérimentale juste des observations et un isolement pour certains, ce qui est classé en léger. Tous les animaux seront replacés , ils pourront être réutilisés par d'autres équipes de recherche. Notre responsable de la Strucutre de Bien Etre Animal (SBEA) a réussi a replacer tous les individus de ce projet.
Remplacement
Aucun remplacement ne pourra être envisagé puisque ce projet sert à étudier l'impact et le choix de l'enrichissement du milieu sur l'élevage et il est impossible de le réaliser in vitro ou in silico.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d'animaux, nous aurons 4 groupes de 3 mâles et de 3 femelles pour reprendre les mêmes conditions du précédant projet réalisé par notre équipe . Pour analyser l'impact des enrichissements sur les groupes d'accouplement hébergés généralement en trio (2femelles + 1 mâle), nous allons ré-utiliser les mâles et les femelles ce qui nous permettra de réduire le nombre d'animaux utilisés. Ayant deja des résultats significatifs sur les groupes de males et femelles avec ce nombre de n=4, nous savons que cette quantité d'animaux est suffisante pour nos analyses. Nous prévoyons de tester 3 séries d'enrichissements d'où notre demande de 36 males isolés maximum (3x12). Les autres animaux de l'étude (groupes de 3 mâles , groupes de 3 femellles ou trio) ne sont pas comptabilisés dans cette demande d'autorisation de projet car sous le seuil.
Raffinement
Les animaux feront l'objet d 'une surveillance journalière , les animaux sont hébergés en groupe dans un environnement enrichi avec plusieurs objets leur permettant de faire leur nid, de se cacher. Des points limites ont été définis afin de prendre en compte d'éventuels effets inattendus pour lesquels il sera décidé de mettre en place un traitement approprié ou une euthanasie. Lorsque les mâles sont isolés, ils conservent la possibilité de communication avec leurs congénères par la vue puisque les cages sont hébergées sur un portoir ventilé dont les cages sont transparentes. Les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi et contrôlé (cages connectées) et observés quotidiennement afin d'anticiper l'apparition des points-limites fixés.
Choix des espèces
Les lignées et animaux présents au sein de notre plateforme de recherche sont essentiellement des souris. De plus, ce projet à pour but de répondre à la volonté permanente d'améliorer le bien-être animal au sein de notre animalerie de recherche et servira également pour d'autres animaleries de recherche hébergeant des lignées murines. Les animaux seront analysés à l'age de 13 semaines (pour garder les mêmes conditions qu'une étude effectuée précédemment dans notre animalerie), juste après une semaine d'acclimatation Les animaux rentreront dans le projet pour une durée de 6 semaines + 1semaine d'acclimatation .