Procédures légères
Travaux pratiques en Neurobiologie en troisième année de Licence : étude de l’effet d’une douleur chronique sur la neurogenèse hippocampique adulte chez le rat.
- Enseignement supérieur
40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit dans la cheville une injection d'adjuvant de Freund qui déclenche une douleur inflammatoire chronique de six à huit semaines, avec boiterie et hypersensibilité, avant d'être tué au vingt et unième jour pour prélever son cerveau. Cette douleur chronique est provoquée non pour produire des connaissances mais pour fournir à des étudiants de licence un modèle sur lequel s'exercer à une technique d'immunohistochimie, durant deux jours de travaux pratiques. Le porteur suit les animaux par pesée quotidienne et mesure des articulations, et affirme qu'aucune méthode sans animaux ne remplace ce protocole, la douleur chronique impliquant selon lui de nombreuses régions du système nerveux.
Objectifs
Le projet concerne la production d’un modèle de douleur chronique inflammatoire qui sera utilisé par des étudiants en 3ème année de Licence ayant choisi de suivre le parcours « Neurosciences » lors d’une séance de 2 jours de travaux pratiques. Les étudiants ne sont pas chargés de la mise en œuvre du modèle animal en raison des impératifs de formation réglementaire. Sur les cerveaux de rats, ils évalueront l’impact d’une douleur chronique inflammatoire sur la neurogenèse adulte hippocampique (gyrus denté). Les étudiants seront formés à la technique d’immunohistochimie : coupe de cerveaux, révélation immunohistochimique, quantification de la neurogenèse. La technique d’immunohistochimie est largement utilisée en laboratoire de Neurosciences permettant de localiser des protéines à l’aide d’anticorps spécifiques. L’objectif est de leur permettre d’acquérir une connaissance pratique complémentaire de la connaissance théorique qu’ils ont en cours magistral (la neurogenèse, la douleur, les techniques expérimentales) et la conduite d’une technique d’expérimentation (révélation immunohistochimique) dans des conditions réglementaires de sécurité. Les données collectées chez l’animal durant ce TP seront remises en perspective par rapport aux données humaines existantes.
Bénéfices attendus
Ce modèle de douleur chronique inflammatoire induit une diminution de la neurogenèse hippocampique adulte. Ce projet permettra au étudiants d’acquérir une connaissance pratique complémentaire de la connaissance théorique qu’ils ont en cours magistral (la neurogenèse, la douleur, les techniques expérimentales) et la conduite d’une technique d’expérimentation (révélation immunohistochimique) dans des conditions réglementaires de sécurité.
Procédures
Les animaux modèles subiront une injection unique d’adjuvant de Freund complet (50µl) dans l’articulation de la cheville de la patte postérieure droite. L’injection se fera sous anesthésie à l’isoflurane (après un pré-traitement antalgique) et durera environ 5 minutes. Ils seront ensuite laissés 20 jours en stabulation , manipulés uniquement pour le suivi de l’inflammation et de leur état général, afin que la douleur chronique inflammatoire se développe. Le 20eme jour, ils subiront deux injections intrapéritonéale du marqueur de neurogenèse espacées de 2 heures. Les injections sont réalisées sur animal éveillé et sont très rapides (1 minute de contention au maximum). Le 21eme jours, l’ensemble des animaux (modèles et contrôles) sera anesthésié puis euthanasié par une méthode réglementaire et le cerveau sera ensuite prélevé (45 minutes).
Impact sur les animaux
Suite à l’injection de l’Adjuvant Complet de Freund dans l’articulation de la cheville, les animaux développeront une douleur chronique inflammatoire. Le lendemain de l’injection, une réaction immunitaire va se développer, strictement localisée à la patte injectée. Cette réaction va s’accompagner d’une inflammation de la cheville, d’un gonflement et d’une rougeur modérés et d’une hypersensibilité qui dure de 6 à 8 semaines et qui débute le lendemain de l’injection. Durant la période de douleur chronique, la mobilité des animaux est légèrement diminuée (apparition d’une boiterie) mais pas de façon significative. Ceci entraine une tendance à la diminution du comportement exploratoire mais sans significativité. La mise en position debout est diminuée mais pas abolie, l’animal portant son poids sur la patte non inflammée. Le comportement de toilettage n’est pas modifié.
Devenir
L’euthanasie utilisée en fin de procédure pour l’ensemble des animaux est nécessaire 1/ pour pouvoir réaliser des coupes fines (50µm) d’hippocampe qui nécessitent un cerveau fixé et 2/ pour retirer l’ensemble des globules rouges du cerveau afin de réaliser la révélation immunohistochimique.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de développer une douleur chronique car une douleur aiguë n’induit pas de modulation de la neurogenèse hippocampique adulte. Il est nécessaire de réaliser ce modèle in-vivo car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique.
Réduction
Les étudiants travailleront en binôme. 1 membre du binôme traitera le cerceau contrôle et l’autre membre traitera le cerveau modèle de douleur chronique (coupe et révélation immunohistochimique). Ils pourront ainsi comparer la quantification des cellules neo-formées entre les rats controles et modèles, à l’intérieur du binôme et entre les différents binômes. Chaque étudiants prélèvera 4 coupes frontales d’hippocampe de rat, à différents niveaux de l'hippocampe. De ce fait, au vu de la sélection d’étudiants pour ces unité d’enseignement, 1 cerveau contrôle et 1 cerveau modèle sont suffisants par groupe. Ils présenteront les résultats sous forme d’un mini article scientifique. Les résultats seront regroupés afin qu’ils puissent réaliser des analyses statistiques, mettre en forme et discuter les résultats obtenus. Sur 5 ans, 40 animaux maximum seront utilisés.
Raffinement
Durant toute leur période de présence à l’animalerie, l’état général des animaux sera très attentivement suivi. Les animaux seront observés et pesés quotidiennement. Le poids de référence de l’animal sera celui à J0. Une signalétique adaptée (étiquette de suivi post-opératoire) sera placée sur les cages. Un suivi particulier sera fait pour les animaux modèles de douleur inflammatoire chronique en s’attachant à leur état général et à l’aspect de la patte injectée. Ils feront l’objet de tests aux jours J0 (avant l’injection), J4, J8, J12, J16 et J20. Les tests incluront la mesure du diamètre des articulations (mesuré à l’aide d’un calibre à coulisse) et une évaluation clinique reposant sur l’évaluation de l’inflammation (points limites). Un soin particulier sera apporté à la limitation de toute souffrance non liée au modèle ainsi qu’à leur bien-être (enrichissement de l’environnement, paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation d’une semaine à la pièce de stabulation, litière souple). Des points limites précoces et spécifiques sont définis qui conduiront si nécessaire à l’interruption de l’expérimentation si les critères d’arrêt sont atteints. L’injection de l’agent inflammatoire se fera sous anesthésie générale avec un prétraitement antalgique. Pour l’acte terminal, les animaux recevront une injection d’antalgique suivi de l’injection du mélange anesthésique.
Choix des espèces
Ce projet pédagogique porte sur la modulation de la neurogenèse hippocampique chez le rat adulte. J’utiliserai donc des rats mâles Spague-Dawley âgés de 7 semaines, comme généralement utilisés par la communauté scientifique. Le choix du rat se justifie également au regard de la taille du cerveau et de l’hippocampe. L’étendue rostro-caudale de l’hippocampe est suffisante chez le rat pour que l’ensemble des étudiants d’un groupe puisse récupérer 4 coupes chez un seul animal (limitation du nombre d’animaux utilisé). Choix de la souche Sprague-Dawley : c’est un bon modèle car les animaux sont 1/naturellement peu stressés (le stress est un des meilleurs modulateurs de neurogenèse) et les marquages contrôles de la neurogenèse donnent d’excellents résultats reproductibles et 2/ répondent bien au développement de la douleur chronique inflammatoire garantissant une modulation de qualité de la neurogenèse.
Impact de l’obésité sur les vaisseaux lymphatiques dans les différents territoires adipeux et métaboliques.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
1 944 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Selon les groupes, elles reçoivent des injections, un gavage ou une application cutanée quotidiens, puis sont soumises ou non à un régime gras, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur indique qu'une dysfonction lymphatique intestinale peut provoquer un amaigrissement, surtout chez les nouveau-nés, et prévoit d'abandonner cette procédure le cas échéant. Il affirme qu'aucun système in vitro ne préserve l'intégrité des vaisseaux et présente le poisson zèbre comme un remplacement seulement partiel, faute d'un nombre suffisant de valves lymphatiques.
Objectifs
Le système lymphatique joue aussi un rôle important dans l’initiation de la réponse immunitaire en transportant les cellules immunes vers les ganglions lymphatiques. Or, une altération de ce réseau lymphatique induit des désordres au niveau métabolique (expansion du tissu adipeux, lipides inflammatoires) et inflammatoires (inflammation chronique des tissus). Par ailleurs, l'obésité est connue comme un facteur de risque à l'altération du système lymphatique. L’architecture du système lymphatique et sa fonction sont étroitement dépendantes du tissu dans lequel il se trouve. C’est pour cela, que ce projet vise à cibler le système lymphatique de manière tissu-spécifique. Nous souhaitons dans un premier temps, visualiser l’architecture du système lymphatique in vivo, et comprendre les modifications et l'adaptation des cellules endotheliales lymphatiques dans les modèles d'obésité. Dans un deuxième temps, nous souhaitons établir le rôle de nouveaux gènes impliqués dans le développement et/ou le maintien du système lymphatique dans des contextes physiologiques et pathologiques. Ces études nous permettront de déterminer in vivo les conséquences d’une altération de ce gène sur le système lymphatique et sur le tissu environnant.
Bénéfices attendus
Une altération du système lymphatique est connue pour engendrer une pathologie, le lymphœdème. Par ailleurs, cette maladie est aggravée par l'obésité. Or, les mécanismes moléculaires et cellulaires ne sont pas compris, et il n’existe à ce jour aucun traitement pour limiter une dysfonction lymphatique. Ces modèles permettront une approche intégrée permettant l’étude du système lymphatique et ses communications avec le microenvironnement. En combinant nos approches in vitro et in vivo, nous souhaitons déchiffrer finement les mécanismes moléculaires et cellulaires mis en jeu dans la communication des cellules endothéliales lymphatiques avec les cellules du microenvironnent (cellules de l'immunité, pre-adipocytes ou adipocytes...) dans les différents territoires adipeux et métaboliques (foie, intestin). Le but est d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques visant à restaurer la fonction lymphatique et/ou limiter les aspects inflammatoires et métaboliques, qui sont délétères dans des contextes pathologiques.
Procédures
selon les groupes d'animaux, les types d'interventions seront soit des injections intrapéritoneales (1 fois par jour pendant 4 jours) ou un gavage oral (1 fois par jour pendant 5 jours) ou une application locale sur la peau (1 fois par jour pendant 5 jours). Les animaux seront ensuite ou non mis sous régime alimentaire riche en lipides.
Impact sur les animaux
Une dysfonction importante du système lymphatique au niveau intestinal peut altérer la prise alimentaire des lipides au niveau intestinal entrainant un amaigrissement des animaux, notamment au niveau postnatal dans la procédure 1. Dans ce cas, nous abandonnerons la procedure 1 et nous retarderons l'invalidation du gène après le sevrage ou chez l'adulte. Les autres procédures ne devraient pas entrainer d'effet indésirables.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélévements d'organes/tissus à la fin du projet.
Remplacement
Nous étudions le système vasculaire et lymphatique dans plusieurs organes dont notamment la peau, le tissu adipeux, l'intestin et le foie. A ce jour, il n'existe pas de système 3D, d'organoïdes ou d'explants permettant de garder l'intégrité et la fonctionnalité des vaisseaux. Une des alternatives qui est envisagée pour des questions relatives au développement des vaisseaux est d'utiliser le modèle du zébrafish. Ce modèle est à l'étude afin de déterminer si ce modèle répond de manière identique à nos hypothèses nous permettant de transposer nos résultats de la souris vers le zébrafish. Cependant ce remplacement ne sera que partiel car le nombre de valves lymphatiques chez le zebrafish est tres limitant.
Réduction
Le modele d'obésité entraine une variabilité des résultats qui est aussi augmentée par la différence des sexes femelles/mâles. Nous avons donc compté n=12 pour avoir des résultats statistiques pour chaque groupe d'animaux c'est à dire pour chaque génotype (contrôle ou gene invalidé), par sexe, et par traitement (Normal diet/high fat diet). Cependant, certaines expérimentations nous demandent de regrouper le nombre de tissus pour faire l'analyse, notamment les analyses par Tri cellulaire ou single cells. Afin de minimiser le nombre d'animaux, plusieurs organes seront prélevés pour chaque experimentation.
Raffinement
Critères d'arrêt par rapport à la souffrance: dans le cas où l’animal ne répond plus à des besoins physiologiques énoncés ci-dessus, l’arrêt de l’expérimentation sera préconisé par l’expérimentateur ou toute personne en charge du suivi des animaux. Les animaux seront observés par le chercheur ou les personnels de l’animalerie tous les jours pendant 1 semaine puis 3 fois par semaine pendant le reste de l’expérimentation. Ce suivi aura pour but de détecter la douleur (signes tels que le dos encourbé, poils hérissés, isolement...), détecter la capacité de s'alimenter, de boire, de se déplacer selon une grille de lecture par score. Dans le cas où l’animal ne répondrait plus à ses besoins physiologiques, l'animal sera anesthésié par anesthésie chimique (mélange kétamine/xylazine 150 mg/kg et 10 mg/kg respectivement) et après perte de conscience, les animaux seront euthanasiés. Une observation quotidienne sera réalisée pendant la durée du projet. Dans nos connaissances actuelles, les procédures ne doivent pas changer le comportement des animaux et leur bien-être, même si les animaux sont gardés jusqu’à l’âge adulte.
Choix des espèces
L'étude des souris génétiquement modifiées est largement répandue et partagée dans la communauté scientifique internationale ce qui est un avantage en termes de transmission et de validité de nos résultats. Nous avons choisi les stades de développement au niveau postnatal et adulte afin de comprendre le rôle et la fonction du système lymphatique dans les pathologies cardiovasculaires liées à l'obésité.
Étude de composés anti-virulence dans un modèle murin d’infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
4 064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance jusqu'à sévère. Elles sont infectées aux poumons par Pseudomonas aeruginosa au moyen d'injections intratrachéales et intranasales sous anesthésie, pour tester des composés anti-virulence et un candidat vaccin. Le porteur indique que l'infection non traitée provoque perte de poids, catarrhe oculaire, baisse de température et repli, les souris trop atteintes selon un score clinique étant mises à mort. Il affirme que les lignées cellulaires ne peuvent pas remplacer totalement le modèle murin pour étudier les interactions hôte-pathogène et justifie l'euthanasie de toutes les souris par le risque de dissémination des pathogènes.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie opportuniste multi-résistante qui représente la troisième cause d’infections acquises à l’hôpital en France. P. aeruginosa est responsable de pneumonies aiguës chez le patient bénéficiant d’une ventilation mécanique ou d’infections chroniques chez les patients présentant une pathologie respiratoire chronique suppurative comme la mucoviscidose. La morbi-mortalité importante, l’incidence croissante de souches multi-résistantes associées à l’absence de développement à court terme de nouvelles molécules antibiotiques d’intérêt a conduit à classifier cette bactérie parmi les pathogènes prioritaires pour la recherche de nouvelles thérapeutiques par l’OMS. L'incidence élevée, la sévérité et la résistance croissante sont caractéristiques des infections à P. aeruginosa et soulignent la nécessité d'ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Une première possibilité serait de cibler un des nombreux mécanismes pathogéniques dont est doté P. aeruginosa grâce à son génome de grande taille codant pour de nombreux facteurs de virulence et de régulation. La seconde voie thérapeutique choisie serait le développement d’un candidat vaccinal potentiellement bispécifique ciblant 2 facteurs respectivement impliqué dans les infections aiguës et chroniques et utilisant un adjuvant constitué d’une structure en nanodiamant comme thérapeutique préventive des infections à P. aeruginosa aiguës et chroniques.
Bénéfices attendus
Ce projet consiste à évaluer l’efficacité de nouvelles molécules permettant d’inhiber la virulence de P. aeruginosa et d’un nouvel agent vaccinal, pour un transfert vers une filière de développement pharmaceutique.
Procédures
Les injections intratrachéales seront effectuées sous anesthésie générale,d’une durée de 30 minutes, via une injection de kétamine-xylazine tandis que les injections intranasales et sous-cutanées le seront sous anesthésie générale gazeuse, d'une durée de 5 minutes, par isoflurane. Les injections intra-péritonéale seront administrées sur animaux vigile. De même le suivi du poids et du score clinique se fera sur animaux vigile. Aucune prélèvements sur animaux vigiles ni procédures chirurgicales ne seront fait dans ce projet.
Impact sur les animaux
L'infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa non traité se traduit chez la souris par plusieurs effets délétères. L'animal perd du poids, peut présenter une inflammation des muqueses notamment un catarrhe oculaire, sa température corporelle peut baisser et son comportement également (dos courbé et réduction de l'activité et de la mobilité).
Devenir
Tous les animaux devront être euthanasiés à l'issue de chaque procédure du fait du double risque de dissémination dans le milieu extérieur des pathogènes et des souris, génétiquement modifiés ou non .
Remplacement
La sélection des composés ayant la meilleure efficacité contre P.aeruginosa sera réalisée grâce à des modèles in vitro. Des lignées cellulaires épithéliales pulmonaires et des lignées immunitaires (lymphocytes, cellules dendritiques et macrophages) seront utilisées pour évaluer l’innocuité des composés, la production d’anticorps spécifiques, la protection contre l’infection bactérienne.Il n’est pas possible de totalement remplacer l’utilisation d’un modèle murin par l’utilisation de lignées cellulaires seules. En effet, nous nous intéressons aux interactions hôte pathogènes lors d’une infection pulmonaire pour lesquels l’interaction de nombreux acteurs de l’immunité innée et adaptatives sont mises en jeu simultanément.
Réduction
Il n’est pas possible de remplacer l’utilisation d’un modèle murin par l’utilisation de lignées cellulaires seules. En effet, nous nous intéressons aux interactions hôte pathogènes lors d’une infection pulmonaire pour lesquels l’interaction de nombreux acteurs de l’immunité innée et adaptatives sont mises en jeu simultanément. Pour réduire le nombre de souris nécessaires au strict minimum, nous nous appuierons sur les méthodes statistiques suivantes. Pour pouvoir mettre en évidence une différence au niveau des résultats microbiologiques, il nous faudra inclure 15 sujets par groupe. Une comparaison entre les groupes Pour respecter le principe des 3R, les mesures de raffinement suivantes seront employées : les souris seront hébergées en armoire ventilée sous conditions de température contrôlées. Elles auront accès à un enrichissement pendant toute la durée de l’expérience. Une surveillance clinique quotidienne est réalisée afin d’identifier les potentiels signes de douleur engendrée par le protocole durant toute la durée de l’étude. En cas de besoin, un traitement antalgique sera instauré́, et adapté au type de procédure invasive.
Raffinement
Durant toute la durée des expérimentations, les animaux seront surveillés pluri-quotidiennement. Des critères d’évaluation de leur état clinique seront utilisés afin d’établir un score de maladie. Cela nous permettra de déterminer le besoin de me mettre en place un traitement analgésique pour garantir le bien-être des animaux. Si ce score devient trop élevé, notamment lié à une perte de poids trop importante, la mise à mort de l’animal devra avoir lieu. Durant les phases d’anesthésie ou d’injection, une surveillance particulière d’une quinzaine de minutes suivant l’acte sera réalisée pour s’assurer d’un réveil normal. Dès réveil des souris avec reprise d’une déambulation, elles réintégreront leur cage.
Choix des espèces
La validation de nouvelles molécules anti-infectieuses est classiquement effectuée chez la souris du fait d’un recul important en termes de données et d’outils de suivi disponibles sur les infections respiratoires et digestives. C’est le seul modèle officiellement validé et nécessaire au préalable sur le plan pharmaceutique avant un transfert pour un éventuel essai chez l’humain. Dès la réception de souris mâles âgées de 6 à 7 semaines, une stabulation d’une semaine dans l’animalerie sera respectée. Ces dernières seront alors utilisées à un âge compris entre 7 et 10 semaines. Les animaux utilisés doivent avoir atteint la maturité sexuelle pour éviter les biais dus à la perturbation hormonale. Le protocole expérimental a une durée maximale de 28 jours.
Mise au point d’un modele murin de carcinogenèse hepatique sur cirrhose metabolique en vue d’évaluer le rôle de l’inhibition de TREM-1 sur la prévention et le traitement du carcinome hépatocellulaire. (2/3 EUs)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
63 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance jusqu'à sévère. Dès le deuxième jour de vie, les souriceaux reçoivent une injection de streptozotocine puis un régime gras destiné à faire évoluer une stéatohépatite vers la cirrhose et le cancer du foie, avec suivi par scanner et IRM sous anesthésie. Le porteur indique une mortalité prévisible d'environ 40 % en fin de protocole liée au régime et à la maladie, et classe la procédure sévère sur ce motif, tout en envisageant un reclassement en modéré selon les données. Il affirme qu'aucune approche in vitro n'existe pour ce type de pathologie et juge le recours à un organisme vivant "indispensable".
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est classe comme le sixième cancer le plus fréquent et la troisième cause de décès par cancer. Le développement du carcinome hépatocellulaire est étroitement lié à la présence de la maladie du foie gras non alcoolique appelée « steato-hepatite non alcoolique » ou NASH en anglais. Cette maladie est caractérisée par une inflammation chronique du foie conduisant à une mauvaise cicatrisation appelée fibrose dont le stade ultime est la cirrhose. Or, la réponse inflammatoire des cellules immunitaires est amplifiée par triggering receptor expressed on myeloid cells1 (TREM-1). L’inhibition de TREM-1 dans un modèle murin de NASH diminue l’inflammation du foie et restaure les capacités de «recyclage » cellulaire. Ces résultats sont confirmés chez les souris génétiquement invalidées pour le gène TREM-1. Néanmoins, les limites de ces modèles animaux de NASH sont l’absence d’évolution vers la cirrhose et le CHC. Afin d’évaluer à terme l’inhibition de TREM-1 dans le CHC, il nous faut d’abord développer un modèle de NASH évoluant jusqu’au stade CHC. Le modèle de souris C57BL/6 traitées par streptozotocine et soumises a un régime riche en graisse a l’avantage d’induire une véritable NASH avec toutes les composantes évolutives : excès de graisse semaine 6 (S6) ; NASH avec fibrose sévère a S8-10 et CHC entre S16-S20. Ces CHC sont constants et sont très proches des CHC humains sur le plan moléculaire. Dans ce projet, l’objectif est de mettre au point ce modèle, d’en caractériser les évolutions par imagerie IRM et Scanner et d’en adapter la résolution de façon à disposer des outils de suivi dans les futurs projets
Bénéfices attendus
Le développement du carcinome hépatocellulaire est étroitement lie à la présence d'une maladie chronique du foie conduisant à une cirrhose. Une des causes la plus fréquente est la steato-hepatite non alcoolique liée au syndrome métabolique. TREM-1 pourrait être un déterminant essentiel du développement, de la progression et du mauvais pronostic du CHC comme suggéré dans un modèle murin de steatohepatite non alcoolique mais cela reste à confirmer. L’inhibition de TREM-1 dans un modèle murin de NASH précoce diminue les lésions histologiques hépatiques (steatose, inflammation, ballonnisation, fibrose) via une diminution de l’inflammation et la restauration des capacités d’autophagie cellulaire. Ces résultats sont confirmés chez les souris génétiquement invalidées pour le gène TREM-1. Néanmoins, les limites de ce modèle animal de NASH sont l’absence d’évolution vers la cirrhose et le CHC.
Procédures
- Induction de la stéato-hépatite par une injection de streptozotocine de 10 secondes à J+2 de vie sur 58 souris avec un régime riche en graisse. - Imagerie par paliers du cancer du foie sous anesthésie générale à l’isoflurane : 1) Réalisation d’une imagerie par scanner avec et sans injection : réalisé par des personnes compétentes et avec le matériel adapté à la souris (plaque chauffante, monitoring des paramètres vitaux) avec une durée totale de 15 minutes par animal sous anesthésie par isoflurane. L’injection d’un produit de contraste aura une durée de 2 minutes par souris. Les séquences seront obtenues à 0,5 min, 4,5 minutes et 8 minutes de l’injection de produit de contraste iodé. 2) Réalisation d’une IRM (imagerie par résonnance magnétique) : la durée totale de l’acte sera de 30 minutes par animal réalisé par des personnes compétentes et avec le matériel adapté à la souris (plaque chauffante, monitoring des paramètres vitaux). - Injection de bromodeoxyuridine 2 heures avant la mise à mort des souris concernées (marquage cellulaire non toxique) d’une durée de 3 secondes par animal.
Impact sur les animaux
Dans la littérature, il existe une mortalité induite par le régime et par la maladie du foie à partir de la semaine 11 d’environ 5% par semaine soit 40% de mortalité en fin de protocole. Cliniquement, certaines souris vont perdre du poids en raison du manque d’appétit et de la fatigue. Néanmoins, ce régime n’induit pas de douleurs pour l’animal. Nous ne savons pas encore si notre procédure de raffinement permettra d’endiguer suffisamment la perte de poids et permettre une survie prolongée des souris. Par conséquent, la procédure a été jugée sévère en raison du taux de mortalité prévisible mais pourrait être effectivement reclassifiée en modérée en fonction des données du protocole. Le protocole ne sera pas réalisé d’une traite sur les 58 souris mais plutôt par étape ce qui permettra d’adapter la suite du protocole et de reclassifier la procédure si besoin. Des nuisances (stress) provoquées par les anesthésies nécessaires pour l’imagerie, ainsi que des douleurs légères lors des injections de bromodeoxyuridine, un marquage cellulaire, sont également à mentionner.
Devenir
Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à différentes semaines selon les groupes d'étude et les procédures. Les mises à mort sont réalisées pour récupérer les organes afin d’analyser les tissus et en particulier hépatiques (présence de cancer, degré de fibrose, d’inflammation et de graisse).
Remplacement
Il n’existe aucune approche in vitro pour étudier l’évolution d’une pathologie inflammatoire multifactorielle comme la stéato-hépatite non alcoolique vers la fibrose sévère et le carcinome hépatocellulaire. Une étude chez un organisme vivant est indispensable.
Réduction
Le nombre total d’animaux est de 63, il a été calculé à l'aide d'analyses statistiques intégrant, la mortalité potentielle (basée sur notre expérience des modèles de fibrose), la variabilité entre chaque souris et leur sexe. Nous suivrons dans le temps le développement de la pathologie à l'aide de l'imagerie, nous obtiendrons donc un volume important de données sans avoir besoin de mettre à mort les animaux à différents temps. L'utilisation de l'imagerie offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux.
Raffinement
Dès leur réception, les animaux auront une période d’acclimatation d’une semaine pour s’adapter à leur nouvel environnement. Ils seront hébergés dans une animalerie dotée de tous les paramètres nécessaires (température, hygrométrie, filtration de l’air, ...) à leur bien-être. Le cancer du foie se développera de manière insidieuse et indolore. Il sera induit par une injection sous-cutanée unique d’un antibiotique associé à un régime riche en graisse. Les stades de la maladie seront évalués de manière non invasive par imagerie : scanner avec injection de produits de contrastes et IRM. Les examens d’imageries prévus dans ce protocole (IRM et Scanner) ne produisent aucune forme de douleur, ils sont non-invasifs et réalisés sous anesthésie générale. Cette dernière peut tout de même être source de stress pour l’animal. Les animaux sont surveillés durant l'examen : si l'animal présente une détresse respiratoire (dont le stade le plus sévère est la capacité à compter à l’œil nu le rythme respiratoire de l’animal), il sera immédiatement retiré de l'appareil, soigné et surveillé jusqu’au réveil. Une injection sera effectuée à la fin du protocole 2h avant la mise à mort. Celle-ci ne génère pas de souffrance chez l’animal car ce n’est ni un produit toxique ni corrosif, ni nauséeux. La piqure, qui peut être légèrement douloureuse, est effectuée par un zootechnicien entrainé, ce qui limite grandement le risque d'erreur et la douleur qui pourrait être infligée aux animaux. D’autre part cette injection protocolaire est prévue juste à l’issue des examens d’imagerie chez un animal encore endormi et qui sera mis à mort quelques heures plus tard limitant encore le risque de souffrance inutile. Les animaux seront surveillés plusieurs fois dans la journée jusqu'au moment de la mise à mort, et si un animal montrait des signes de ralentissement net de sa motricité, de sa respiration, ou tout autre signe évoquant un stress, il serait mis à mort immédiatement.
Choix des espèces
Les principaux modèles de stéato-hépatites non alcoolique ont été validés internationalement sur des souris ou des rats. Nous avons une bonne connaissance des modèles murins et de plus, le choix de l’espèce « souris » se justifie par l’existence du modèle transgénique (KO TREM-1) permettant d’étudier le(s) rôle(s) spécifique(s) du récepteur TREM-1 dans la pathogenèse de la NASH et du CHC sur projets futurs en cas de mise au point réussie de ce modèle. Les souriceaux débuteront le protocole à J+2 de vie et seront issues de souris gestantes. Comme mentionné dans la description du projet, le pancréas des jeunes souriceaux possède des capacités régénératives de ses îlots pancréatiques. Cette propriété nous permet d’utiliser la streptozotocine et son action toxique sur les îlots sans induire un vrai diabète mais plutôt un état d’insulinorésistance qui caractérise la NASH.
Identification de gènes de E. coli importants pour la colonisation de l’intestin de la souris par criblage CRISPRi et RecordSeq
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
648 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance jusqu'à modéré. Elles reçoivent un gavage puis une inflammation du côlon déclenchée par du dextran sulfate de sodium ajouté à l'eau de boisson pendant sept jours, avec prélèvement quotidien de fèces, avant d'être tuées pour prélever côlon, iléon, rate, ganglions et foie. Le porteur indique que la colite peut provoquer diarrhées, déshydratation et perte de poids, et que le gavage peut irriter l'œsophage. Il affirme qu'un système vivant est nécessaire pour reproduire les interactions entre bactéries et hôte et retient la souris comme espèce de référence, les retombées thérapeutiques étant renvoyées au long terme.
Objectifs
L’implication du microbiote intestinal dans la physiologie intestinale mais aussi dans la santé humaine de façon plus générale a largement été démontrée. Par exemple, la prolifération de certaines bactéries, telles que des souches de E. coli Adhérentes et invasives (AIEC), a été associée aux maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Dans ce contexte, le but de notre projet est d'identifier, chez les différentes souches de E. coli, les gènes importants pour leur survie dans l’intestin. De tels résultats fourniront également des informations sur l’environnement intestinal et pourront donc nous permettre de mieux comprendre comment le microbiote, mais aussi l’alimentation et le mode de vie impactent la physiologie intestinale.
Bénéfices attendus
Connaître les gènes importants pour la survie de bactéries (pathogène ou non) dans l’intestin nous permettra de mieux comprendre comment le microbiote impacte la physiologie intestinale. De tels résultats de recherches fondamentales pourront permettre de mieux comprendre les mécanismes de pathogénicité de certaines souches impliquées dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Ces connaissances pourront à long terme contribuer au développement de thérapies pour ces maladies.
Procédures
- Gavage (quelques secondes sur chaque souris, une seule fois au cours de l’expérience) - Prélèvement de fèces (quelques secondes, une fois par jour sur chaque animal, pendant toute la durée de l’expérience) - Induction d’une inflammation de l’intestin (ajout du produit inflammatoire dans l’eau de boisson pendant 7 jours)
Impact sur les animaux
Ce projet occasionnera quelques effets néfastes pour les animaux. Notamment lors des gavages, dont le niveau de sévérité attendu est léger, et qui peuvent causer des irritations de l’œsophage dues à la sonde. Ou lors de l’induction de la colite au dextran sodium sulfate, dont le niveau de sévérité attendu est modéré, et qui pourra causer une inflammation du colon, des diarrhées, une déshydratation et donc une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de prélever les organes et tissus d’intérêt (colon, iléon, rate, ganglion mésentériques, foie) et effectuer des analyses complémentaires.
Remplacement
Remplacement : Dans la mise en œuvre de ce projet, un système vivant est nécessaire pour reproduire les interactions entre les bactéries étudiées et l’hôte dans l’environnement intestinal, qui n’est pas possible de reproduire avec exactitude in vitro dû à sa complexité et au nombre d’acteurs impliqués (système immunitaire, microbiote, etc…). Nous travaillons avec un modèle animal (modèle de colite induite au dextran sodium sulfate) reconnu pour l’étude des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et déjà bien caractérisé.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 12 (4 cages : 2 cages de femelles et 2 cages de mâle, 3 souris par cage) souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Un total de 648 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Approche statistique : Le plan d'expérience envisagé permet une analyse à deux niveaux : une étude qualitative pour l'étude d'effets forts (screening des guides présents/absents entre les groupes expérimentaux) et une analyse raffinée permettant le recherche d'effets plus fins par des méthodes de type ANOVA à 3 facteurs (condition, sexe, éventuellement cage) en prenant en compte la nature des données (comptage).
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et quotidienne (point limite) et des soins adaptés (gels, anesthésie, analgésie si les actes le nécessitent). De plus, le fait que le gavage sur animal vigile soit pratiqué par une personne formée et expérimentée ainsi que l’utilisation de matériel adapté (telles que des sondes de gavage souples) permettent de réduire significativement les nuisances liées au geste technique lui-même.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence pour étudier les relations hôte-microbiote. De plus, la souris, et notamment le modèle de colite induite au dextran sodium sulfate, est un modèle couramment utilisé pour étudier les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et donc bien caractérisé. Le microbiote de la souris est aussi bien étudié et caractérisé. Les protocoles et procédures de colonisation de l’intestin de la souris et d’induction de l’inflammation intestinal sont aussi déjà mis au point, nous savons donc ce qu’ils impliquent sur le bien-être des animaux et comment réduire la douleur et les effets néfastes sur l’animal. Nous utiliserons des souris jeunes adultes avec un début d’expérience situé entre 8 et 10 semaines de vie afin qu’elles aient atteint leur poids adulte et que leur microbiote se soit stabilisé. Ce stade est couramment utilisé dans la littérature pour ce type de modèle.
Etude de la réponse immunitaire chez la souris lors d’une infection expérimentale par les microsporidies Encephalitozoon cuniculi et Encephalitozoon intestinalis
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
848 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu'à modéré, certaines menées sous anesthésie sans réveil. Elles sont infectées par des microsporidies (Encephalitozoon cuniculi et E. intestinalis) dans l'oreille ou par gavage, puis observées par imagerie intravitale sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélever oreille, ganglion et muqueuse intestinale. Le porteur décrit une réponse inflammatoire locale qu'il qualifie de minime et indique que tout signe de souffrance, poil hérissé ou baisse de motricité, entraîne l'euthanasie immédiate. Il affirme que l'analyse in vitro reste largement insuffisante pour saisir la réponse immunitaire in vivo et renvoie au futur les retombées, des stratégies immunothérapeutiques.
Objectifs
L’immunobiologie des microsporidioses est un domaine encore peu exploré. Parmi les composants cellulaires de la réponse immunitaire anti-microsporidie, les cellules dendritiques et les macrophages représentent des cellules clés qui vont faciliter la transition entre la réponse immunitaire innée et adaptative chez l’hôte infecté. Or, le parasite est capable de moduler cette réponse. Parmi les mécanismes d’échappement immunitaire décrits in vitro, citons l’exemple d’Encephalitozoon avec E. cuniculi qui se réplique à l’intérieur des macrophages par inhibition de l’acidification du phagosome et absence de fusion phagolysosomale. E. intestinalis interfère quant à lui avec différents aspects de la physiologie des cellules dendritiques : leur différenciation, leur maturation, la production de cytokines, induisant ainsi un « priming » aberrant des lymphocytes T. Ainsi, les microsporidies « piratent » le système immunitaire de l’hôte, mais peu de données existent encore sur la mise en place de ces stratégies d’échappement in vivo. Notre projet vise à explorer in vivo, chez la souris, la mise en place de la réponse immunitaire anti-microsporidie, en étudiant en temps réel les interactions entre les microsporidies et les composantes cellulaires de la réponse immunitaire innée (macrophages, polynucléaires neutrophiles, cellules dendritiques). Le modèle du pavillon de l’oreille de la souris comme support pour l’analyse de la dynamique de la réponse immunitaire par imagerie intra-vitale est un des plus utilisés. Un travail récent a étudié les interactions entre les cellules de l’immunité innée et le staphylocoque doré. L’objectif est ici d’adapter ce modèle à l’étude de l’immunobiologie des microsporidioses. Nous proposons également d'étudier la réponse immunitaire anti-microsporidie au niveau de la muqueuse intestinale, dans le modèle de l'anse iléale de la souris. En infectant avec l’espèce E. Cuniculi, puis E. intestinalis plus fréquemment retrouvée chez l’homme, le modèle murin intestinal mis au point mimera au mieux la physiopathologie de l’infection humaine par ce parasite intestinal.
Bénéfices attendus
De façon globale, ce projet nous apportera des connaissances nouvelles pour une meilleure compréhension de la réponse immunitaire dirigée contre les espèces microsporidiennes E. cuniculi et E. intestinalis, un domaine encore peu exploré à ce jour. L’objectif in fine sera de développer des stratégies immunothérapeutiques permettant de mieux contrôler ces infections dans le futur.
Procédures
-Expériences d'imagerie intravitale sur le tissu de l'oreille : le tissu cutané de l'oreille est imagé en microscopie confocale (imagerie intravitale) après inoculation des parasites (spores infectieuses) chez l'animal anesthésié (de quelques heures à 6 jours après l'infection)(durée: 2h, 5 interventions au total). Les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérience. -Expériences avec biopsies de tissu : les tissus (oreille, ganglion) sont prélevés chez des animaux euthanasiés à différents temps après l'infection. -Expériences d'imagerie intravitale de la muqueuse intestinale : la muqueuse intestinale est imagée chez des animaux infectés par gavage (inoculation de spores infectieuses par voie orale) et anesthésiés (durée : 2h, 1 intervention). Les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérience d'imagerie (temps 2-4h ou 24h).
Impact sur les animaux
* Expériences dans le modèle du pavillon de l’oreille : toutes les interventions sont réalisées sur animal anesthésié, ce qui évite tout stress, inconfort ou douleur chez l’animal. Les animaux sont pesés chaque jour après l’injection des spores dans l’oreille, et ce pendant toute la durée de l’expérience. Les expériences sont de courte durée (6 jours maximum) et la réponse inflammatoire observée localement au point d’injection est minime. Toute souffrance apparente de l’animal repérable en surveillance journalière : poil hérissé, baisse de la motricité, mènera cependant à l’arrêt immédiat de l’expérimentation avec euthanasie des animaux. * Expériences dans le modèle de la muqueuse intestinale : toute souffrance apparente de l’animal repérable en surveillance journalière après l'inoculation des spores d’E. cuniculi ou d' E. intestinalis par gavage : poil hérissé, baisse de la motricité, conduira à l’arrêt immédiat de l’expérimentation avec euthanasie des animaux. Toutes les expériences d'imagerie intravitale de la muqueuse intestinale seront réalisées sur animal anesthésié, ce qui évite tout stress, inconfort ou douleur chez l’animal. L'animal est euthanasié à la fin de chaque expérience.
Devenir
Les animaux inoculés avec les spores d’E. cuniculi ou d’E. intestinalis sont gardés en vie (quelques heures ou quelques jours) en vue de l'imagerie de la muqueuse intestinale ou du tissu de l’oreille. A la fin de chaque session d’imagerie et ainsi à la fin du projet, tous les animaux sont euthanasiés en vue des prélèvements de tissus infectés (oreille, ganglion auriculaire, muqueuse intestinale).
Remplacement
Notre approche expérimentale inclut une première analyse in vitro avec des lignées cellulaires et des cultures primaires de cellules immunitaires, mais elle reste largement insuffisante pour connaitre les interactions fines mises en jeu entre parasites et cellules immunitaires. En effet, elle n’englobe que très partiellement la complexité de la réponse immunitaire in vivo, à l'échelle tissulaire.
Réduction
Expériences de microscopie confocale dans le modèle du pavillon de l’oreille (expériences I) ou de la muqueuse intestinale : le nombre d’animaux par lot (n=1) a été défini selon la puissance statistique et la variabilité des paramètres étudiés. Dans le modèle de l’oreille, le même animal est suivi au cours de 6 points de cinétique différents (faible nombre d’animaux utilisés). Dans le modèle intestinal, l’expérience est de courte durée (observation soit au temps 2-4H, soit au temps 24h) et l’animal est euthanasié à la fin de chaque expérience. L’expérience est répétée 20 fois (modèle de l’oreille) ou 30 fois (modèle intestinal) car une grande variabilité de la réponse immunitaire peut être observée d’un individu à l’autre, et selon le modèle utilisé. Ce nombre est justifié par la variabilité des réponses in vivo dues à la variation de l'inoculum parasitaire et à une réponse immunitaire individuelle hétérogène. Une analyse statistique par Anova ou test de Student sera réalisée, une différence au niveau du recrutement cellulaire ou de la charge parasitaire sera généralement considérée comme statistiquement significative lorsque la P value sera inférieure à 0,05.
Raffinement
Les animaux sont stabulés dans une salle climatisée (22 ± 2°C) avec un cycle 12/12 h (jour/nuit, 7h00 à 19h00) et un taux d’humidité maintenu à 55%. Les animaux ont libre accès à la boisson et à la nourriture. Le régime alimentaire est composé de croquettes (A04-Safe, Epinay/Orge, France). Dans les deux modèles d’étude (modèle oreille, modèle intestinal), toutes les interventions sont réalisées sur animal anesthésié, ce qui évite tout stress, inconfort ou douleur chez l’animal. *Modèle du pavillon de l’oreille : Après imagerie du tissu de l’oreille et pendant la phase de réveil, l'animal est placé sur un tapis chauffant thermorégulé pour éviter l'hypothermie, et gardé en observation pendant 2 heures puis remis dans sa cage initiale si tout va bien (pas de poil hérissé, respiration régulière, recouvrement d'une motricité normale, alimentation normale). Les animaux sont pesés chaque jour après l’injection des spores dans l’oreille, et ce pendant toute la durée de l’expérience. Les expériences sont de courte durée (6 jours maximum) et la réponse inflammatoire observée localement au point d’injection est minime. Toute souffrance apparente de l'animal repérable en surveillance journalière : poil hérissé, baisse de la motricité, mènera cependant à l’arrêt immédiat de l’expérimentation avec euthanasie des animaux. Les biopsies de tissus seront toujours réalisées sur des animaux euthanasiés, après dislocation cervicale. Après vérification de la mort de l’animal par arrêt total, rapide et durable des mouvements cardio-respiratoires et par l’absence de réflexes (pincement de la patte), les tissus (oreille ou ganglion lymphatique) sont prélevés très rapidement. * Modèle de la muqueuse intestinale : le recours à l'anesthésie profonde permet d'éviter tout stress ou douleur chez l’animal. Les expériences sont de courte durée (quelques heures). L'animal est sacrifié après observation de la réponse inflammatoire au niveau du sommet des villosités intestinales (anses iléales).
Choix des espèces
La souris est actuellement le modèle de vertébré couramment utilisé pour étudier in vivo la réponse immunitaire anti-microsporidie. Des souris C57BL6 mâles ou femelles de 8 à 12 semaines seront utilisées. Le poids (âge) choisi correspond à celui d’un jeune animal adulte qui a un système immunitaire mature. Les animaux seront utilisés à l'âge de 8 à 12 semaines, ce qui correspond à l'âge d'une souris possédant un système immunitaire mature.
Etude des mécanismes physiopathologiques de la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO) et de ses exacerbations
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
5 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance jusqu'à sévère. Elles inhalent de la fumée de cigarette, des particules de polluant et du tabac chauffé quarante minutes par jour pendant douze semaines, puis sont infectées par des pathogènes respiratoires par instillation nasale ou trachéale sous anesthésie, avec des mesures de fonction respiratoire par trachéotomie. Le porteur indique que l'infection peut provoquer perte de poids, baisse de mobilité et poil hérissé, les souris atteignant un score clinique de 6 ou perdant plus de 20 % de leur poids étant mises à mort. Il affirme que le réseau de médiateurs et de cellules en jeu ne peut pas être reproduit in vitro et conclut à la nécessité du modèle murin, les retombées thérapeutiques restant renvoyées à d'éventuelles études cliniques.
Objectifs
L’objectif de notre projet est d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement de la bronchopneumopathies chroniques obstructives (BPCO), et de ses exacerbations dans le but de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques qui manquent cruellement actuellement. Ces exacerbations surviennent principalement à la suite d'infections pulmonaires. La BPCO étant une pathologie multifactorielle faisant suite à l’exposition à des polluants et pouvant se présenter sous différentes formes, il est nécessaire de développer plusieurs modèles conduisant à différents présentation cliniques de la pathologie et de ses exacerbations. Nos travaux antérieurs nous ont permis d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques que nous devons tester dans nos différents modèles et en parallèle, l’identification de nouvelles cibles sera envisagée afin de proposer de nouveaux traitements. Suite à l’exposition à la fumée de cigarettes, aux particules de polluant et au tabac chauffé, l’inflammation pulmonaire se traduit par le recrutement et l’activation de plusieurs types de cellules immunitaires. Cette réaction est sous la dépendance d'un réseau complexe de médiateurs et de cellules de l’hôte qui ne peut pas être reproduit in vitro. Il en est de même pour les infections par les pathogènes à tropisme respiratoire qui sont responsables des exacerbations. Ce type d'études constitue le seul moyen de tester l’efficacité de nouveaux traitements dans ce contexte particulier de développement et de l’exacerbation de la BPCO. Cette difficulté associée actuellement au manque de traitement, justifie l’utilisation de modèles animaux.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront de mieux définir les caractéristiques de l’inflammation pulmonaire et de la réponse immune chez les souris exposées à la fumée de cigarette, aux particules de polluant et au tabac chauffé Nous ferons secondairement le lien avec les altérations de la fonction pulmonaire. Par la suite, ces données permettront d’identifier les mécanismes physiopathologiques responsables des altérations de la fonction pulmonaire, en particulier le rôle de populations cellulaires ou de médiateurs spécifiques et le lien avec l’inflammation pulmonaire. Cette étude est rendue possible par l’utilisation de souris génétiquement modifiées ou l’administration de molécules agonistes ou antagonistes des facteurs préalablement identifiés. Cette définition des mécanismes physiopathologiques nous permettra de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à prévenir l’inflammation et à empêcher le développement de la BPCO induits par la cigarette, les particules polluantes ou encore le tabac chauffé. Différentes stratégies sont déjà envisagées ciblant la réponse immunitaire et faisant intervenir des immuno-modulants ou des agents vaccinaux. Ces nouveaux traitements pourraient être associés au traitement de référence de l’exacerbation que représente l'antibiothérapie. A terme, notre objectif est d’utiliser ces données pour appuyer la mise en place d’études cliniques chez les patients BPCO.
Procédures
Pour la mesure de la fonction respiratoire, les animaux sont anesthésiés et une trachéotomie est pratiquée pour faire les mesures sur une durée de 15 minutes. Pour les infections, l’instillation nasale est réalisée sous anesthésie générale . Après anesthésie, une surveillance des animaux est pratiquée pendant la phase de réveil et pour les traitements, ceux-ci se font directement par voie intrapéritonéale. Pour induire une altération pulmonaire, les souris sont soumises à 40min d’inhalation pour jour.
Impact sur les animaux
Au cours des différentes procédures, nous effectuons sur les animaux des contentions qui engendre un stress, des inhalations régulières et nombreuses de fumée, ce qui peut entrainer à long terme une diminution de la prise de poids et irritation oculaire temporaire. Nous pratiquons les infections par instillation intra nasale ou intra trachéale, sous anesthésie et des injections péritonéales de traitement. Les piqures peuvent provoquer une douleur. Au pic de l’infection, les animaux malades perdent du poids, sont moins mobiles et leur pelage est moins lisse, elles sont stressées. Pour la mesure de la fonction respiratoire, une trachéotomie est pratiquée sur la souris anesthésiée (douleur de la piqure).
Devenir
L'ensemble des animaux, à la fin des différentes procédures, sera euthanasié pour analyser l'impact sur les différents organes.
Remplacement
Afin de minimiser le nombre d’animaux, l’évaluation des différents paramètres recherchés est préalablement réalisée in vitro sur cellules primaires et lignées cellulaires humaines et murines avant validation dans nos modèles murins.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, dans la plupart de nos protocoles, un seul groupe témoin est utilisé et permet la comparaison avec les différentes souris génétiquement modifiées. De plus les analyses statistiques effectuées dans nos travaux précédents nous ont permis de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser, soit 6 souris par groupe, en répétant l’expérience 4 fois afin d’obtenir suffisamment de cellules à analyser ainsi que des résultats statistiquement corrects.
Raffinement
Afin de réduire le stress et la souffrance, un enrichissement de l’environnement est pratiqué dans notre animalerie (maison rouge dans toutes les cages, possibilité de rajouter du carton, des boule de cotonet papier Kraft). Pour diminuer la douleur, les infections se font sous anesthésie et analgésie. De plus, une surveillance régulière et la pesée (journalière ou bi-hebdomadaire en fonction des protocoles) des animaux est effectuée, pour suivre la souffrance due à l'infection. Nous avons mis en place une grille de calcul qui permet d'attribuer un score à l'état clinique général de la souris, et suivre l'évolution quotidienne de l'animal après l’infection. Ce score clinique est compris entre 1 et 6 points, 6 étant le score de gravité le plus élevé. • Niveau d’activité : mobile = 0, mobilité réduite = 1, prostrée = 2 • Catarrhe oculaire : absence = 0, 1 œil = 1, 2 yeux = 2 • Aspect fourrure : lisse = 0, hérissée = 1 • Perte de poids : aucune = 0, 5-10% = 1, 10-15% = 2, 15-20% = 3 • Posture : normale = 0, dos courbé = 1 • Température : normale = 0, froide = 1 Donc : • Les animaux ayant un score de 4 devront être suivis avec une attention toute particulière • Les animaux ayant un score clinique de 6 seront immédiatement euthanasiés. • Les animaux présentant une perte de poids > 20% seront immédiatement euthanasiés
Choix des espèces
L’étude des pathologies pulmonaires est facilitée chez la souris du fait de la grande disponibilité des outils d’exploitation et d’analyse, ce dont les autres espèces sont dépourvues. De plus, nous avons accès à des souris déficientes pour certains de nos gènes d’intérêt ou anticorps spécifiques existent, permettant d’identifier des molécules ou cellules impliquées et des cibles thérapeutiques pertinentes chez l’homme. Comme la pathologie humaine de la BPCO touche les adultes, et non les populations jeunes ou les enfants, les souris utilisées dans le cadre de ces expérimentations seront adultes. Les souris commencent à être exposées à la fumée de cigarettes à partir de 8 semaines d’âge. Le protocole d’exposition à la fumée de cigarettes est de 12 semaines, afin de reproduire une inflammation pulmonaire chronique associée à une altération fonctionnelle pulmonaire. Les souris exposées à la fumée sont donc infectées par les pathogènes à l’âge de 20 semaines. Pour les particules de polluant, l’intranasal se fait sur trois jours, et les souris sont infectées à 8 semaines.
Investigation du rôle du cervelet et de l’ocytocine intracérébelleuse dans la cognition sociale chez la souris, étude préliminaire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
396 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance jusqu'à sévère, 264 tuées à l'issue et 132 réutilisées comme stimulus social. Les 264 souris expérimentales reçoivent des canules implantées dans le cerveau lors d'une chirurgie de deux à quatre heures, des injections cérébrales répétées, puis dix tests comportementaux, avec isolement social de trois semaines et restriction alimentaire jusqu'à six semaines. Le porteur prévoit leur mise à mort pour vérifier les sites d'injection et étudier le rôle de l'ocytocine du cervelet dans la cognition sociale. Il écarte simulations et cultures cellulaires et retient des souris adolescentes et adultes pour suivre la maturation cérébrale.
Objectifs
Le cervelet est une région cérébrale historiquement associée au contrôle du mouvement. Cependant, depuis plusieurs décennies, son rôle s’est élargi à de nombreuses autres fonctions. Il contribue ainsi aux émotions, à la cognition (savoir se repérer dans son environnement, par exemple), aux addictions et aux comportements sociaux. Parallèlement, dans le cerveau, un neuropeptide, l’ocytocine (OXT), a pour fonction principale de contrôler ces liens sociaux. L’OXT intervient ainsi dans l’attachement aux autres, la confiance ou l’empathie. Si ce rôle a été mis en évidence dans des réseaux neuronaux classiquement associés aux émotions et aux interactions sociales, il n’a toutefois pas encore été exploré au niveau du cervelet. Il est probable que l’OXT contribue à l’adaptation fine des comportements et réactions physiologiques, et ce particulièrement dans les contextes sociaux. Cette adaptation pourrait ainsi être liée à une modulation très fine, dans le cervelet, des fonctions sensorimotrices ou d’apprentissage en conditions socialement dépendantes, à une augmentation de la saillance des stimulations sensorielles pertinentes en contexte social, ou à une contribution spécifique aux interactions avec son environnement lors des contacts sociaux. Pour tester ces différentes hypothèses et déterminer le rôle de l’OXT dans le cervelet dans les contextes sociaux, nous manipulerons d’abord, à l’aide de molécules et chez la souris, l’activité du cervelet (blocage), puis le lien entre cervelet et cortex préfrontal (autre structure-clé de la cognition sociale) et enfin nous activerons ou bloquerons spécifiquement les effets de l’OXT directement dans le cervelet. Nous évaluerons l’effet de ces inactivations/activations spécifiques par de multiples tests comportementaux ciblant les interactions sociales, mais aussi d’autres fonctions (émotions, orientation dans l’environnement, fonctions motrices ou sensori-motrices). Ce projet sera réalisé chez des souris adultes et chez des adolescents (mâles et femelles). En effet les compétences sociales se développent avec la maturation du cortex préfrontal, structure cérébrale qui n’atteint son plein développement qu’au début de l’âge adulte, c’est-à-dire en dernier chez l’homme. Nous évaluerons ainsi l’évolution du rôle de l’OXT dans le cervelet dans les contextes sociaux au cours du développement.
Bénéfices attendus
L’ocytocine est devenue une molécule de grand intérêt en neuroscience en raison de ses effets pro-sociaux. En effet, elle dispose d’un potentiel prometteur comme nouvelle cible thérapeutique pour les troubles neurodéveloppementaux dans lesquels les comportements sociaux sont perturbés ou mal adaptés (troubles du spectre autistique, schizophrénie, troubles déficitaires de l’attention…). L’ocytocine régule la confiance, l'empathie, l'agressivité, l'excitation sexuelle, le sommeil, le stress, l'anxiété, la douleur et le système sensoriel, et ce tout au long de la vie et chez les deux sexes. Elle permet ainsi aux individus d'adapter leurs interactions sociales de manière flexible et en lien avec le contexte. Pourtant, si le rôle de l’ocytocine a été investigué dans les régions cérébrales impliquées dans ces interactions sociales, il ne l’est pas ou peu dans le cervelet. En effet, ce dernier n’était pas considéré durant longtemps comme faisant partie de ces réseaux spécifiques. Or, ces quinze dernières années, de multiples travaux ont démontré que le cervelet n’intervient pas seulement dans le contrôle du mouvement : il participe aussi aux émotions, à nos capacités d’orientation dans l’environnement, aux addictions ou aux comportements sociaux. Grâce à sa vaste connectivité avec le reste du cerveau, le cervelet amorcerait ou orienterait, au niveau du cortex, le traitement des informations motrices, sensorielles, émotionnelles et cognitives dans des directions pertinentes, en particulier dans les contextes sociaux. Avec ce projet, nous serons en mesure de mieux cerner le rôle que jouerait l’ocytocine dans cette structure dans ces contextes sociaux et, potentiellement, de mettre ainsi en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement des troubles du comportement social.
Procédures
264 souris seront utilisées pour implantation de canules intracérébrales. L'implantation se fera sous anesthésie générale et locale, pour une durée comprise entre 2 et 4h. Les mêmes 264 souris auront des injections cérébrales répétées (entre 3 et 12 injections en fonction des protocoles et groupes). Cette partie se fera sous anesthésie générale courte (5 minutes) . Ces 264 animaux seront soumis à une batterie de tests comportementaux. Dix tests seront utilisés au total. Chaque animal, selon son groupe, ne sera testé que dans un nombre limité de tests (3 ou 4) sur une durée de 4 à 8 semaines. Ces tests évalueront le comportement social (3 tests différents), l'état émotionnel des animaux (3 tests), les fonctions sensori-motrices (2 tests), les capacités de discrimination sensorielles (1 test) et les capacités de mémoire et d'apprentissage (1 test).
Impact sur les animaux
- Stress au réveil de l’animal pendant quelques minutes après injections de drogues ou procédure Sham - Stress au réveil dû à l’implantation des canules d’injection intracérébrale - Difficulté pour se déplacer, se nourrir et s’abreuver dans les 2 premières heures suivant le réveil après implantation des canules - Douleur liée à la pose des canules - lsolement des animaux à l’âge adulte pour renforcer leur motivation pour les contacts sociaux dans le test d’interaction sociale. L’isolement débute 3 semaines avant les tests et se prolonge jusqu’à complétion des tests sociaux. - Privation/restriction alimentaire dans le test cognitif spatial (labyrinthe en croix, test basé sur un renforcement alimentaire) et le Novelty suppressed feeding (conflit entre motivation alimentaire et anxiété). La restriction alimentaire dure 6 semaines maximum (diminution progressive du poids sur 15 jours puis apprentissage de la tâche et tests) pour le labyrinthe en croix. La privation se fait sur 24h (NSF).
Devenir
Les 264 souris expérimentales concernées par les 3 procédures (celles ayant des canules guides implantées) feront l'objet d'une étude histologique post-mortem. La totalité des souris visiteurs (stimulus social) seront réutilisées (soit 132 souris).
Remplacement
Les objectifs de ce projet étant d’étudier le rôle d’une molécule (l’ocytocine) au sein de certaines régions cérébrales dans les comportements sociaux, nous devons pouvoir observer et analyser ces comportements chez des animaux sains. Nos travaux de recherche ne peuvent donc se faire que sur animaux vivants, les autres types de procédures expérimentales (simulations informatiques ou cultures cellulaires par exemple) ne permettant pas de répondre à nos questions
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux et optimiser nos résultats, les animaux serviront à plusieurs mesures chaque fois que possible. Ainsi, dans chacune des expériences proposées, les mêmes animaux feront l’objet de tests comportementaux qui seront réalisés dans deux conditions expérimentales. Pour réduire le nombre d’animaux visiteurs nécessaires pour nos tests d’interaction sociale, nous passerons plusieurs fois le même animal en tant que visiteur. Le nombre d’animaux est choisi pour tenir compte des difficultés inhérentes au placement des canules d’injection, de minimiser la répétition des injections intracérébrales, de réduire la durée totale d’expérimentation pour chaque individu et de prendre en compte la variabilité inter-individuelle. Les différentes procédures expérimentales ont ainsi été pensées et élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants. Les analyses statistiques conduites utiliseront des tests statistiques ANOVA ou non paramétriques en fonction de la normalité de la distribution des valeurs.
Raffinement
Pour minimiser la souffrance et l’angoisse des animaux, les procédures qui le nécessitent se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie (chirurgies implantatoires de canule). Ils seront anesthésiés après induction gazeuse et suivis jusqu’au réveil. Ensuite, chaque animal sera surveillé quotidiennement et le traitement analgésique poursuivi au-delà du réveil si besoin. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s), y compris lors des tests comportementaux. Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions et en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal durant toute l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant /anesthésie/analgésie).
Choix des espèces
Le choix de la souris est dû au fait que ces animaux ont des capacités cognitives et sociales adaptées aux questions posées dans le projet. Ces mammifères ont par ailleurs un fonctionnement cérébral qui peut être comparé à celui de l’homme pour les questions abordées dans ce projet (rôle du cervelet et de l’OXT). Notre projet vise à étudier le rôle du cervelet et de l’ocytocine dans ce dernier dans les comportement sociaux à différents stades du développement : avant maturation complète du système nerveux et après. Nous utiliserons donc des souris adolescentes (âge inférieur à 50 jours Post-Natal (PN)) d'une part et des animaux à l’âge adulte (PN> 70 J) d'autre part. Cela se justifie par le fait que le cortex préfrontal est la structure cérébrale dont le développement est le plus tardif chez l'homme (il n'atteint son plein développement qu'au début de l'âge adulte) or ce dernier est une structure-clé de la cognition sociale. La mise en jeu de la voie cérébello-frontale que nous investiguons ici en contexte social particlièrement pourrait donc potentiellement se traduire par des effets différents en fonction de l'âge des animaux.
Rôle de la minipuberté dans la différentiation sexuelle du système nerveux femelle chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
160 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections hormonales dès la période néonatale, la moitié subissant à l'âge adulte l'ablation des ovaires et la pose d'implants hormonaux, avant des tests comportementaux. Le porteur prévoit la mise à mort pour prélever le cerveau et étudier le rôle de la minipuberté dans la différenciation sexuelle. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'étudier ce réseau neuronal dans l'"organisme entier" et retient la souris pour les outils disponibles.
Objectifs
Ce projet vise à identifier le rôle de la minipuberté dans l'organisation permanente des structures nerveuses impliquées dans la reproduction femelle. La minipuberté est une période postnatale pendant laquelle l'axe gonadotrope, qui régit la reproduction, s'active. Or, jusqu'à présent le rôle et les conséquences de cette activation précoce et transitoire, qui existe également chez l'espèce humaine et qui précède de loin l'initiation de la puberté, sont encore mal connus. Il s'agira donc d’abolir pendant cette période la production ovarienne en hormones en utilisant un modèle de souris transgénique et de mesurer les conséquences de cette perturbation, ainsi que de la supplémentation d'hormones ovariennes sur les fonctions neuroendocrines et comportementales liés à la reproduction chez la souris femelle.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à comprendre les mécanismes cérébraux qui régissent l’organisation de la fertilité chez les femmes. Alors que cette question a été largement étudiée chez le mâle, les données sur les femelles manquent Ce projet qui se concentre sur la compréhension des mécanismes cérébraux chez la femelle permettra d’approfondir les connaissances scientifiques sur la reproduction féminine, en particulier sur le rôle des hormones ovarienne sur son organisation au cours du développement. Cela est d’autant plus important qu’une avancée de l’âge de la puberté a été observée ces dernières années chez les filles, associée à des problèmes sociaux et psychologiques. La perturbation hormonale au cours de la minipuberté peut avoir un impact indirect sur les réponses neuroendocrines et comportementales liées à la reproduction, par le biais des altérations de l'axe gonadotrope à l'âge adulte. Elle peut également affecter directement l'organisation précoce et l'expression des voies de signalisation neurales clés qui régulent ces réponses. Cette étude évaluera les effets des hormones ovariennes produites pendant la minipuberté sur les composants clés des comportements sexuels et maternels. Ce projet permettra ainsi une meilleure compréhension des voies de signalisation sous-tendant l’organisation cérébrale des fonctions de reproduction par les hormones ovariennes.
Procédures
L’ensemble des animaux sera soumis à une injection unique intra-péritonéale d'hormones en période postnatale. Ces injections sont très rapides (1 minute). Après les injections, les souris retournent dans leurs cages habituelles avec leurs mères respectives jusqu’au sevrage. A l’âge adulte, 80 animaux seront soumis à une procédure chirurgicale rapide (ovariectomie et pose d’implants hormonaux). Cette procédure est d’une durée maximale de 10 minutes sur animaux anesthésiés ayant reçu une injection d’analgésique 20 minutes au préalable.
Impact sur les animaux
Les souris femelles seront soumises à des injections intrapéritonéales et sous-cutanées au cours du développement. Les produits administrés n’ont pas d’effet douloureux connus, les animaux auront le seul inconfort de la contention et de l’injection. Les femelles de la première cohorte seront ensuite, à l’âge adulte, ovariectomisées et supplémentées en hormones afin de mimer la séquence naturelle de réceptivité de la souris en s'affranchissant des variations hormonales des femelles et en assurant des niveaux d'imprégnation hormonale identiques. Après la récupération post-opératoire, l’ovariectomie et la supplémentation n’entrainent pas d’inconfort des animaux. Les paramètres de leur comportement de reproduction, de leur activité locomotrice et leur niveau d’anxiété spontané seront ensuite analysés. Les femelles de la deuxième cohorte ne subiront pas de procédure chirurgicale. Après les traitements postnataux, elles seront testées pour leur comportement maternel et leur capacité à apporter des soins aux petits. Les tests comportementaux se font pendant la phase obscure, respectant la phase d'activité des souris, et sont filmés en lumière rouge afin d'interférer le moins possible avec leur activité quotidienne. Ces analyses comportementales consistent à observer des comportements spontanés : cela n’engendre pas d’inconfort des animaux.
Devenir
L'ensemble des 160 souris sera euthanasié à l’issue de chaque procédure afin de prélever le cerveau des animaux. Les analyses immunohistochimiques et moléculaires de ces cerveaux nous permettrons de mieux comprendre les voies de signalisation sous-tendant l’organisation cérébrale des fonctions de reproduction femelle, et tout particulièrement le rôle de la période de minipuberté dans ces processus.
Remplacement
L'étude du rôle de la minipuberté dans la mise en place des structures nerveuses impliquées dans la reproduction nécessite des modèles animaux pour pouvoir étudier le réseau neuronal complexe au sein de l’organisme entier. Des animaux vivants seront donc nécessaires pour ce projet. Ce projet comporte des analyses comportementales et neuroendocrines. Il n'est donc pas possible de le développer par des méthodes alternatives et/ou substitutives.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans cette étude est de 160. Il a été calculé au plus juste pour garantir la puissance statistique de l'étude. Afin de réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons les mêmes cohortes d'animaux pour les analyses comportementales et moléculaires. Par ailleurs, plusieurs zones du cerveau (cortex, bulbe olfactif, striatum...) seront collectées et stockées pour des études futures, les autres organes (hypophyse, ovaire, squelette, dents...) seront proposés aux collaborateurs de l'équipe.
Raffinement
Les animaux seront hébergés sous la supervision de soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. L'hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010/63/UE en termes d'espace et d'environnement. Les souris seront soumises à un cycle lumière- obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l'enrichissement, un nid sera placé dans la cage. Les résultats du phénotypage reproductif antérieur de la lignée de souris utilisée n'a pas révélé de phénotypes présentant une souffrance inhérente. Avant chaque procédure chirurgicale, une analgésie sera effectuée par l’injection d’un analgésique 20 minutes avant la procédure. Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement afin de s'assurer que toute souris présentant un ou plusieurs points limites sera euthanasiée. Les points suivants sont considérés comme points limites ; - tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible de se nourrir ou de boire - toute modification comportementale caractéristique d’une douleur intense, d’une détresse ou d’une souffrance (absence de locomotion, prostration, dos vouté, pelage hérissé et/ou terne, affection cutanée…) - perte de poids supérieure à 20% du poids initial. Toutes les euthanasies des animaux seront effectuées sous anesthésie générale. forts. La mort de l’animal est avérée par l’arrêt des battements cardiaques. Le prélèvement du cerveau ne laisse aucun doute sur la mort de l'animal.
Choix des espèces
La souris est l'un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et comportementales grâce à la disponibilité d'outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques...), et de données dans la littérature permettant d'une part de comparer les résultats obtenus avec ceux des autres laboratoires et d'autre part d'implémenter les connaissances sur cette thématique. Les souris femelles seront injectées au 7ème jour postnatal afin de perturber la production hormonale qui a lieu pendant la période de minipuberté, et qui est peut-être responsable de la différenciation sexuelle du cerveau femelle. Les femelles seront soumises aux procédures décrites seulement à partir de l'âge adulte (8 semaines d'âge). En effet, le but de ce projet est d'analyser les effets de la perturbation de la minipuberté sur la différenciation sexuelle du cerveau et donc des effets à long-terme qui peuvent interférer avec l'expression à l'âge adulte des comportements de reproduction.
Flairer des indices pour porter attention : l’olfaction comme un modèle de choix pour explorer les bases neurales de l’attention chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
115 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dont 70 tués à l'issue et 45 réutilisés ou proposés au placement. Ils sont soumis à un rationnement en eau et à une tâche olfactive, une partie recevant en plus une chirurgie du cerveau de une à trois heures pour implanter une fibre optique ou des électrodes. Le porteur nomme les tests, une tâche d'attention aux odeurs dans un pléthysmographe, et prévoit la mise à mort des animaux implantés pour vérifier les sites d'injection. Il écarte l'étude chez l'humain pour des raisons éthiques liées au caractère invasif et retient le rat pour ses capacités cognitives et la taille de son cerveau.
Objectifs
L'attention est une fonction cognitive complexe et multi-facettes. Ce projet de recherche fondamentale a pour objectif de tester les bases comportementales et les mécanismes neuronaux impliqués dans l’attention aux odeurs. L'attention aux odeurs et les mécanismes neuronaux la supportant, restent à ce jour très peu étudiés. Le but général de ce projet est de déterminer si ces mécanismes sont similaires à ceux retrouvés dans les autres modalités sensorielles (notamment l'attention visuelle). Le projet vise notamment à déterminer 1) s'il y a un lien entre performances attentionnelles et respiration et 2) quelles sont les zones cérébrales impliquées dans l'attention aux odeurs. Dans ce projet, nous avons choisi d'aborder cette question chez le rat, une espèce macrosmate qui utilise principalement le sens olfactif pour la perception de son environnement. Notre projet vise à : 1) tester si l’attention aux odeurs fluctue chez le rat et si ces fluctuations sont liées à la respiration en combinant tout d’abord une tâche d’attention aux odeurs dans un pléthysmographe (enregistrement non invasif de la respiration) et ensuite en combinant une tâche d’attention à l’optogénétique, une technique permettant de disséquer les fondements des performances attentionnelles et 2) déterminer le réseau cérébral sous-tendant l’attention aux odeurs en combinant tâche comportementale, pharmacologie et électrophysiologie.
Bénéfices attendus
L’attention est une fonction cognitive majeure et les déficits attentionnels se retrouvent dans plusieurs troubles du neurodéveloppement (par exemple Trouble du déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité) et neuropsychiatriques (par exemple la schizophrénie). Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents aux processus attentionnels dans des conditions non pathologiques constitue une étape indispensable pour guider la mise en oeuvre d’outils thérapeutiques pour le traitement des déficits attentionnels. Les résultats de cette étude permettront également de tester l'implication de la respiration dans les processus attentionnels et si nous montrons que cela est le cas, des thérapies de remédiation des troubles attentionnels par la respiration pourront être envisagées chez l'humain.
Procédures
Dans ce projet, nous allons utiliser une tâche comportementale d’attention avec un rationnement hydrique progressif. Les animaux réaliseront la tâche dans une cage de pléthysmographie permettant d’enregistrer leur respiration de façon non invasive. La tâche comportementale dure 30 min tous les jours du lundi au vendredi (1 session par jour pendant 5jours) et ce sur plusieurs semaines pour l’apprentissage (2 à 3 mois). Dans une partie du projet, nous testerons la contribution du système cholinergique dans cette tâche d’attention en réalisant des injections intrapéritonéales d’une molécule anticholinergique (scopolamine ou saline) . Pour déterminer le réseau neuronal impliqué dans l’attention aux odeurs, nous allons aussi combiner la tâche comportementale soit à l’optogénétique soit à l’électrophysiologie. Dans les premier cas, les animaux recevront un virus en intracérébral et seront implantés d’une fibre optique sous anesthésie générale profonde et analgésie. La durée totale de la chirurgie est d'environ 1h30. Quand les animaux auront récupéré (minimum 20 jours pour l'expression du virus), ils réaliseront ensuite la tâche comportementale. Dans le deuxième cas (électrophysiologie), les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale profonde et analgésie visant à implanter les électrodes intracérébrales et poser le connecteur. Cette chirurgie devrait avoir une durée totale de 3h.
Impact sur les animaux
La première partie du projet concerne seulement une tâche comportementale avec rationnement hydrique. Seul un léger stress au début du rationnement hydrique est donc attendu. Pour tester la contribution du système cholinergique, cette tâche comportementale sera combinée avec des injections en intrapéritonéale de scopolamine ou saline. La nuisance sera donc, dans ce cas, liée à l'injection de scopolamine qui pourra induire un stress à l'animal mais nous ne nous attendons pas à des effets stéréotypiques. Pour les animaux implantés, la nuisance sera liée à la chirurgie (soit pour injection de virus soit pour des enregistrements électrophysiologiques) et ces interventions peuvent engendrer une douleur post-opératoire qui sera évaluée et contrôlée à l'aide d'analgésique.
Devenir
Les animaux non implantés et ayant seulement réalisés la tâche comportementale pourront être réutilisés dans un autre projet ou proposés au placement (45 animaux). Pour les animaux implantés, les sites d'injection et diffusion des virus et d'implantation des électrodes devant être vérifiés, les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les problèmes éthiques liés aux enregistrements intra-cérébraux et à l’utilisation de l’optogénétique rendent ces expériences non envisageables chez le sujet humain. L’étude des rythmes cérébraux et plus particulièrement l’étude de la corrélation entre la respiration, ces rythmes et le comportement nécessitent l’utilisation d’animaux vivants et ne peut s’envisager sur modèles strictement in vitro.
Réduction
Pour mener ce projet, nous aurons besoin d’utiliser 115 rats pendant la durée du projet. Ce nombre a été réduit au minimum en nous basant sur les données bibliographiques antérieures et permettant de réaliser des analyses statistiques. La première partie du projet a été développée pour mettre au point tous les paramètres de la tâche de sorte de réduire le nombre d'animaux utilisés par la suite. Mais si les paramètres optimaux de la tâche sont rapidement trouvés, ce nombre pourra être réduit.
Raffinement
Nous avons choisi d’enregistrer la respiration de façon non-invasive en utilisant une cage de pléthysmographie. Cette technique permet d’étudier très finement un ensemble de paramètres respiratoires comme la fréquence et les volumes inspiratoires et expiratoires de manière spontanée ou en présence d’une stimulation odorante. Ces enregistrements ont lieu sans aucune contrainte chez l’animal comme c’est le cas, par exemple, avec l’utilisation d’une ceinture placée autour de la cage thoracique. L’animal est libre de ses mouvements. Le rationnement hydrique est mis en place de façon progressive pour limiter le stress de l'animal. De plus, les animaux auront accès à l’eau ad libitum durant les weekends (jusqu’au dimanche soir). Les animaux recevront du tickling dès le début du projet pour être mieux habitués à l’expérimentateur et cela facilitera et diminuera également le stress pour les injections. Pour les animaux implantés, ces derniers ne subiront qu’une seule chirurgie durant laquelle ils seront correctement anesthésiés et analgésiés. La douleur post-opératoire sera quantifiée, avec une surveillance accrue des animaux, et une couverture analgésique adéquate sera mise en place. Tous les animaux sont gardés par deux dans la cage pour diminuer leur stress.
Choix des espèces
Bien que certaines espèces d'invertébrés puissent être utilisées comme alternatives, elles ne peuvent pas être utilisées pour étudier les questions proposées ici (bases comportementales et neurales de l'attention olfactive). Les rongeurs sont l'une des espèces de mammifères qui peuvent être utilisées pour étudier la relation entre les circuits neuronaux, la respiration et le comportement. De plus, le modèle du rat est particulièrement approprié pour ce projet car : -Nous souhaitons enregistrer plusieurs aires cérébrales, le cerveau du rat est assez large pour pouvoir faire des enregistrements multi-sites simultanés. -Nous allons moduler de façon sélective l’activité de certaines zones du cerveau grâce à l’optogénétique pour disséquer les mécanismes de l’attention aux odeurs. -Les rats ont des capacités cognitives très bonnes et peuvent donc réaliser des tâches comportementales complexes similaires à celles utilisées chez l’Homme. Nous utiliserons des animaux adultes car l'étude des rythmes cérébraux nécessite que la maturité cérébrale soit atteinte.
Évaluation de la biodisponibilité relative de contaminants métalliques des sols sur un modèle porcelet
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
144 porcelets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont enfermés seuls jusqu'à quatre heures par jour et exposés pendant quatorze jours à des sols contaminés au chrome et au nickel, puis mis à mort pour prélever leurs muscles et leur foie. Le porteur présente le projet comme la validation d'une méthode alternative in vitro destinée à évaluer l'exposition des enfants aux métaux lourds du sol. Il affirme qu'il ne peut y avoir de remplacement à l'heure actuelle pour ces éléments et retient des porcelets pour la proximité de leur digestion avec celle de l'enfant.
Objectifs
Le but de ce projet est de valider in vivo l’intérêt d’une méthode alternative à l’utilisation d’animaux : utiliser un test in vitro pour prédire la biodisponibilité relative du Chrome III, le Chrome VI et du Nickel II, contaminants les sols. Cette étape de validation in vivo est indispensable pour intégrer le test in vitro dans les futures démarches d’évaluations d'exposition sur sites et sols pollués par ces Eléments Traces (sols représentatifs de sites contaminés en France et de certains pays européens)
Bénéfices attendus
Le présent projet permettra de valider une méthode alternative in vitro, qui sera ensuite utilisée pour l'évaluation des risques d'exposition des enfants aux métaux lourds suite à l’ingestion de sol contaminé (comportement main - bouche).
Procédures
Les animaux subiront une claustration individuelle temporaire (
Impact sur les animaux
Les porcelets seront maintenus pendant une période limitée de 1 à 4 heures par jour en logement individuel pour contrôler l’exposition de ces derniers à des doses non dommageables de polluants métalliques. Cette procédure aura une conséquence légère sur le comportement social des animaux en induisant un stress causé par un environnement non adapté du fait de cet isolement.
Devenir
Du fait des prélèvements envisagés (prélèvement d'organes comme des muscles, le foie) et de leur importance pour l'animal la mise à mort est rendue nécessaire
Remplacement
La stratégie de l'expérience consiste à comparer et à corréler les données prédites par un test in vitro avec les données de biodisponibilité in vivo afin de remplacer à terme les essais sur animaux sur cette problématique. Il ne peut y avoir de remplacement à l'heure actuelle pour les éléments trace métalliques objet de la présente étude.
Réduction
Un calcul de puissance a été réalisé en vue de définir le nombre nécessaire et suffisant d'animaux en amont de l'étude. Une étude de la linéarité entre la dose d'exposition et les concentrations retrouvées dans les organes des porcelets sera réalisée en 1° étape ce qui permettra de limiter le nombre d'animaux de la 2° étape. Seuls les sols les plus intéressants pour la validation du test in vitro seront utilisés ici, ce qui réduit également le nombre d'animaux. Au total, 144 porcelets seront utilisés dans ce projet.
Raffinement
L'hébergement sera réalisé en groupes sociaux de 3 porcelets par box pourvu d'enrichissement avec ballons, cordes. Lors de l'application de la procédure de mise en cage individuelle, un isolement limité sera appliqué et des enrichissements supplémentaires (cordes, ballons) seront rajoutés pour chaque individu. Des points limites adaptés à cette étude ont été définis.
Choix des espèces
Les porcelets ont une physiologie digestive proche de celle des humains, en particulier de l’enfant (6 mois à 3 ans), ce qui permettra d'étudier la biodisponibilité des contaminants. Les porcs consomment régulièrement de grandes quantités de sols dans leur environnement naturel, cette ingestion n'impactera pas leur bien-être. Nous n’avons aucune raison de supposer un effet du sexe des animaux, mais nous avons choisi des porcelets mâles castrés pour permettre de mieux comparer cette étude à celles précédemment réalisées et disponibles dans la littérature. Les porcelets auront 30 à 40 jours et seront sevrés. Ces conditions sont en adéquations avec la précédente étude menée sur d'autres éléments traces métalliques.
Validation préclinique d’un nouveau radiopharmaceutique pour l’imagerie de l’Hypoxie par Tomographie d’Emission de Positons dans le cancer du poumon en vue d’un essai clinique de phase 0/1.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. On leur implante des cellules de cancer du poumon sous la peau ou dans le poumon, puis on répète deux fois des séances d'imagerie TEP et IRM sous anesthésie pour évaluer un nouveau radiotraceur de l'hypoxie. Le porteur indique que le modèle intra-pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires et un essoufflement. Les retombées annoncées, un premier essai clinique de phase 0/1, restent formulées comme une perspective, l'objectif immédiat étant de valider le radiotraceur.
Objectifs
Le cancer du poumon représente un problème de santé publique majeur, en étant le 2ème cancer le plus fréquent chez l’homme et le 3ème chez la femme. Il est aussi le plus meurtrier en représentant à lui seul 20% des décès par cancer. Le pronostic vital est directement corrélé au stade de la maladie ainsi qu’à la rapidité de la prise en charge diagnostique et thérapeutique. L’imagerie TEP (Tomographie par Emission de Positons) de l’hypoxie est considérée comme pouvant être un outil pertinent pour cartographier avec précision et une grande sensibilité les cellules cancéreuse. Elle est particulièrement recherchée pour, outre le diagnostic précoce, la détection des récidives et le suivi des traitements afin de mieux les adapter et les optimiser, en particulier dans le cadre de programmes de radiothérapie. Cependant, les radiopharmaceutiques usuels ciblant l’hypoxie, tels que le [18F]FMISO qui a déjà fait l’objet de plusieurs essais cliniques chez des patients atteints de cancers du poumon, conduisent à des images avec des très faibles contrastes et les délais d’acquisition sont très longs. Le projet consiste en l’évaluation d’un nouveau radiotraceur pour l’imagerie TEP de l’hypoxie, le [18F]FLUSONIM, dans des modèles précliniques de cancer du poumon, dans la perspective d’un futur transfert clinique. Notre équipe de recherche travaille depuis de nombreuses années au développement de nouveaux radiotraceurs pour l’imagerie TEP. Les études antérieures de développement du [18F]FLUSONIM ont montré des performances encore inégalées pour l’imagerie de l’hypoxie en termes de contrastes (1,5 à 9 fois plus élevés que ceux obtenus avec le [18F]FMISO) et de délais d’acquisition (20-60 min versus 2,5-3,5 h pour le [18F]FMISO) dans plusieurs modèles animaux de cancers hypoxiques (rhabdomyosarcome, glioblastomes et mélanome) par rapport aux animaux sains. Cette demande d’autorisation de projet inclut deux modèles précliniques avec implantation des cellules cancéreuses LLC (Lewis Lung Carcinoma) en sous-cutané ou en intra-pulmonaire chez la souris. Le caractère hypoxique de ces deux modèles est bien attesté. Le modèle sous-cutané est un modèle classique et largement utilisé en recherche préclinique. Le modèle intra-pulmonaire se rapproche de la pathologie humaine et il n’a jamais été utilisé en TEP.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus concernent la validation du radiotraceur pour l’imagerie TEP de l’hypoxie spécifique et performante dans les deux modèles de cancer du poumon dans le but d’un premier essai clinique en phase 0/1.
Procédures
L'ensemble des interventions qui suivent sont réalisées sous anesthésie générale: 1) Implantation de cellules tumorales en sous cutané ou en intra-pulmonaire (environs 5 min par animal). 2) Pour le modèle intra-pulmonaire uniquement, suivi de la croissance tumorale tous les 2 à 3 jours par IRM (environ 10 min). 3) Injection intraveineuse d'un radiotraceur suivi d'une imagerie TEP (durée de 75 min) puis d'une série d'acquisitions IRM (environ 20 min). Chaque animal est soumis à ce protocole deux fois à environs une semaine d'intervalle.
Impact sur les animaux
Le modèle sous-cutané est de classe légère. Les effets indésirables attendus sont faibles: stress à l’induction de l’anesthésie et au réveil, éventuelle douleur au point d’injection (mais encore jamais observée jusqu’à aujourd’hui dans nos expériences antérieures). Le modèle intra-pulmonaire est de classe modéré car l'implantation est plus complexe à réaliser et à suivre. Les nuisances peuvent être des difficultés respiratoires et un essoufflement excessif nécessitant une surveillance accrue durant la croissance tumorale et pendant l’anesthésie.
Devenir
Les animaux sont porteurs d'une tumeur, il est donc impossible de laisser en vie ou de les réutiliser à l'issu des procédures expérimentales.
Remplacement
L’imagerie TEP préclinique in vivo utilisée en mode dynamique est la seule technique qui permet d’accéder à l’ensemble des données pharmacocinétiques des radiopharmaceutiques, avec une grande fiabilité. Aucune étude in vitro ne peut être utilisée en remplacement.
Réduction
L’imagerie TEP dynamique est un outil puissant pour évaluer un nouveau radiotraceur avec un nombre limité et minimisé d’animaux. Le protocole étant peu invasif, un même animal peut être réutilisé pour plusieurs sessions d'imagerie, réduisant ainsi le nombre total d'animaux nécessaire. Le projet est organisé de façon à optimiser le nombre d'animaux par groupe. Le nombre d’animaux prévu par condition expérimentale est restreint (au moins 8, maximum 10 par lot, sachant qu’un seul lot peut être suffisant) et reste suffisant pour les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations interindividuelles.
Raffinement
Tous les animaux seront hébergés en animalerie conventionnelle respectant leurs besoins physiologiques et comportementaux. Ils ont accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Les cages sont enrichies par la présence d’un dôme de cellulose et de lanière de papier kraft permettant de réaliser des abris. Les imageurs TEP/IRM ainsi que l'ensemble de l'environnement technique, sont adaptés aux rongeurs. Afin de limiter leurs mouvements durant l'imagerie et de maintenir des conditions physiologiques correctes, les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse avec un monitoring de température et un suivi de la fréquence respiratoire. Les injections se feront sans recours à la chirurgie, et aucune douleur n'est attendue. Les animaux seront surveillés durant les 24 heures suivant les expériences d’imagerie afin de contrôler l'absence de signes visibles de douleur (prostration, perte de poids, état anormal du poil ou des yeux) ou de problème au niveau du point d'injection (démangeaisons, état anormal de la peau). En cas d’apparition de ces signes, il est prévu un traitement antidouleur pendant 2 jours. La non-résolution de cette douleur est considérée comme un point limite et entrainera une mise à mort de l'animal. Nous n’avons jamais eu besoin de recourir à des antidouleurs dans les protocoles d’imagerie TEP réalisés jusqu’à ce jour.
Choix des espèces
Les cellules LLC sont syngéniques des souris C57Bl/6 qui sont donc choisies comme espèce animale. Les cellules LLC étant issues de souris mâles, les animaux utilisés seront tous de sexe masculin. Le laboratoire dispose de l’infrastructure nécessaire pour les expérimentations chez les rongeurs. L’imageur TEP préclinique est adapté pour l’imagerie corps entier de la souris permettant d’accéder aux données de biodistribution générale du nouveau radiotraceur. Le modèle tumoral, qu’il soit sous-cutanée ou intra-pulmonaire, est bien maitrisé, reproductible, tout en étant de classe légère, et surtout pertinent vis-à-vis de la pathologie cancer du poumon et des propriétés hypoxiques. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes (à partir de 8 semaines), de tailles et poids raisonnables et compatibles avec le volume du berceau de l’imageur.