Procédures légères

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des molécules par gavage une à deux fois par jour, cinq jours par semaine pendant deux mois, avec des prélèvements de sang à la queue et des photographies de la peau sous anesthésie. Le porteur affirme que les neurofibromes cutanés ne sont pas douloureux et qu'aucune des procédures n'est douloureuse. Il indique qu'à sa connaissance aucun autre modèle animal ni système in vitro ne reproduit le développement de ces tumeurs liées à la neurofibromatose de type 1.

Objectifs

Le but de ce projet est d’utiliser la lignée NF1-KO,et d'identifier de nouvelles molécules qui régressent le développement des neurofibromes cutanés (NFc) dans la neurofibromatose de type 1. La neurofibromatose de type 1 (NF1) est une maladie génétique due à des mutations du gène NF1 codant pour la neurofibromine, régulateur négatif des fonctions cellulaires importantes telles que la prolifération, la différenciation, la survie et le métabolisme des cellules. Tous les patients NF1 développent des NFc, tumeurs bénignes au niveau des terminaisons nerveuses dont le nombre peut atteindre des milliers. A part leur exérèse chirurgicale, ce qui n’est pas possible quand leur nombre est élevé, il n’existe aucun traitement permettant de prévenir ou faire régresser leur développement. Nous avons développé le modèle de souris (NF1-KO), dans leque le gène NF1 est inactivé et qui récapitule le développement des NFc et qui est à l’origine des découvertes de premier plan concernant les mécanismes responsables de leur développement. Ce modèle vient d’être utilisé par notre équipe avec succès pour réaliser des essais précliniques des molécules candidates afin de prévenir/régresser le développement des NFc. Recemment nous avons développé deux versions du modèle, appelées curatif et préventif. Le modèle curatif consiste à traiter les animaux NF1-KO présentant des nombreux NFc afin d’identifier les molécules capables de régresser/bloquer leur développement. Le modèle préventif consiste à traiter les animaux mutants juste avant l’apparition des tumeurs afin d’éliminer les cellules à l’origine des NFc et de prévenir leur développement. Dans cette étude, c'est le modèle curatif qui sera utilisé.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra de : (i) valider le protocole d'analyse qualitative et quantitative de l'efficacité des nouvelles molécules à regresser le développement des NFc. Ce protocole sera par la suite proposé à la communauté scientifique afin de tester les nouvelles molécules dans les mêmes conditions pour pouvoir comparer les résultats, (ii) définir l'efficacité des molécules testées seules ou en combinaison à regresser le développement des NFc (iii) identifier des éventuels effets secondaires liés au traitement.

Procédures

Administration (1 à 2 x/jour, 5 jours/semaine pendant 2 mois) des molécules par gavage sur animaux NF1-KO. Cette procédure ne nécessite pas l'anesthésie des animaux et sera réalisé par le personnel expérimenté. Il faut environ 1 min de contention de l'animal pour l'adminstration par gavage. La prélévement de sang se fera au niveau de la queue sur animaux non anesthésiés. La peau du dos des animaux sera photographiée sous une loupe à épifluorescence et sous anesthésie générale (AG). L'AG est de moins de 5min par souris ( rasage, epilation et prise de photos)

Impact sur les animaux

Récemment, deux études similaires ont été réalisées par notre équipe sans pour autant d'observer des effets indésirables pendant et à la fin du traitement. Les NFc ne sont pas douloureux et aucun effet indésirable n'a été observé liée à leur présence sur plus de 500 animaux NF1-KO. L'administration des nouvelles molécules peut provoquer des effets indésirables. Toutefois, les molécules testées dans ce projet ont déjà fait objet des études toxicologiques et ont été, ou sont, testés dans la cadre des études cliniques. Pour définir la gamme des concentrations des molécules nous nous sommes basées sur des données disponibles chez l'homme. Toutefois, en cas de présence d’effets nuisibles, le traitement sera modifié ou suspendu et si l’effet persiste, l’animal sera mis a mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la fin de la procédure 2 & 3. La peau des animaux sera prélevée puis analyser afin d'evaluer l'efficacité des molécules testées.

Remplacement

A notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, récapitulant le développement des NFc.

Réduction

Nous avons récemment réalisé une étude similaire d’administration systémique et topique d’un autre inhibiteur, qui a permis d'optimiser le protocole de traitement des souris et d’analyse des résultats. Ce travail nous a également permis de définir le nombre minimum d’animaux à traiter afin de réaliser les analyses décrites dans les procédures 2 et 3 et d’obtenir des résultats statistiquement valides. Enfin, la présence des nombreux neurofibromes dans 100% des animaux mutants cela permet de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Aucune des procédures utilisées pour administration des molécules et suivi des animaux n’est douloureuse et ne nécessite l’utilisation des traitements anti-douleurs. Lors de précédente étude (1 mois de traitement) nous n’avons observé aucun effet indésirable sur la perte du poids et le comportement des animaux. Le gavage sera effectué par le personnel expérimenté, qui a déjà réalisé ce type de traitements.

Choix des espèces

A notre conaissance, Il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, récapitulant le développement des NFc. Nous utiliseront les souris NF1-KO males agés d'environ 4 moiscar dans notre modèle les NFc se developpent autour de 4 mois uniquement chez des males.

430 bovins à l'engraissement vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, avant d'être envoyés à l'abattoir pour la vente commerciale des carcasses. Ils subissent un écornage, des prises de sang répétées, deux biopsies de tissu adipeux et un séjour en cases de digestibilité pouvant durer treize jours. Le porteur mentionne un faible risque de troubles digestifs et des risques modérés liés à la manipulation. Il affirme que le recours aux bovins est obligatoire, le projet visant à prédire l'efficience alimentaire et la qualité de la viande selon les régimes.

Objectifs

L'agriculture est depuis toujours en constante évolution. Pour l'aider dans cette mutation la recherche agronomique a initié de nombreux programmes de recherche, auparavant orientée vers l'augmentation des performances et de l'amélioration de la productivité des espèces animales élevées et destinées à produire du lait et/ou de la viande. Aujourd'hui, elle s'orienterait plutôt à maintenir le niveau de production des animaux (ovins, bovins...) tout en prenant plus en compte les contraintes du milieu, les risques environnementaux (production des gaz à effet de serre, polution des sols...) ou attentes sociétales (bien être animal, qualité des produits, traçabilité de l'alimentation...). Pour répondre à une partie de ces enjeux, notre établissement utilisateur a un besoin constant d'animaux. Pour réaliser des études fines des mécanismes physiologiques d'ingestion et de la digestion des aliments chez les ruminants , les animaux modèles utilisés sont ici des bovins issus du troupeau allaitant.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à acquérir des références techniques sur les pratiques en élevage pour engraisser les bovins avec le maximum d’herbe et de fournir des repères sur la qualité des viandes ainsi produites. Ces pratiques seront mises en perspective avec les coûts de production et d’opportunité que leur application engendre. Il s’agira aussi d’identifier au sein de la filière des solutions pour mieux valoriser la qualité des viandes issues d’une finition maximisant l’herbe et porteuses d’une meilleure répartition de la valeur ajoutée.

Procédures

Ecornage : 1 fois /animal en début d'expérimentation et d'une durée de quelques minutes. prises de sang : 4 fois /animal durant l''expérimentation (intervalle entre chaque prélèvement minimum une semaine) et d'une durée de moins d'une minute à chaque fois. Prélèvement de féces : 2 fois /animal en début et milieu d'expérimentation et d'une durée de moins d'une minute à chaque fois. Biopsie de tissu adipeux : 2 fois /animal en début et milieu d'expérimentation et d'une durée d'une dizaine minutes à chaque fois. Digestibilité : 1 fois /animal en milieu d'expérimentation et de maximum 13 jours.

Impact sur les animaux

Faible risque de troubles digestifs (acidose). Risques modérés liés à la manipulation des animaux lors des interventions (accident de pesée etc..)

Devenir

Les animaux seront gardés en vie à l'issu de toutes les procèdures mais seront destinés à l'abattage pour vente commerciale des carcasses à la fin des expérimentations.

Remplacement

Le contexte du projet est l'élevage de ruminants où l'animal est, par conséquent, au centre des préoccupations. Le projet a pour objectif la recherche d’indicateurs peu on non invasifs capables de traduire la variabilité observée chez l’animal en croissance/engraissement. De fait avoir recours à des bovins (animal cible) est obligatoire.

Réduction

Les procédures pour réduire le nombre d'animaux seront mises en oeuvre dès que possible et serviront à limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés et la sévérité des procédures appliquées, l'approche en carré latin est aussi largement utilisée pour réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Tout est mis en oeuvre pour raffiner les procédures expérimentales, les conditions d'hébergement et l'utilisation des animaux par exemple en limitant la durée d'hébergement en stalles de digestibilité, en ayant des temps de repos suffisant entre procédures pour les animaux. De plus les animaux seront suivis quotidiennement pour s'assurer de la bonne santé des animaux.

Choix des espèces

Le contexte du projet est la prédiction de l’efficience et de la qualité des carcasses en fonction des régimes alimentaires en phase d'engraissement, d’où l’intérêt à travailler avec des bovins en croissance/engraissement.

342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Exposées via leur mère au maneb, un pesticide contenant du manganèse, puis pour certaines à un régime gras et sucré, elles subissent perçage des oreilles, gavages d'huile, injections de glucose ou d'insuline et prélèvements de sang à la queue, avant un prélèvement terminal à l'œil. Le porteur affirme que ces actes ne développent pas d'anxiété chez l'animal. Il revendique l'étude sur l'"animal entier" et présente le projet comme apportant des preuves pour réduire l'usage des pesticides.

Objectifs

L’exposition des travailleurs agricoles aux fongicides utilisés pour lutter contre la présence des champignons parasites des fruits et légumes a des effets négatifs en santé humaine. Ainsi, des études préliminaires indirectes suggèrent que le foie et la moelle osseuse (site de production des cellules du sang) sont des tissus cibles en particulier des fongicides contenant du manganèse comme le maneb à des doses compatibles avec une exposition environnementale. Or, en fin de vie fœtale, le foie qui est initialement un organe hématopoïétique (site de fabrication des globules rouges) va acquérir les fonctions retrouvées à l’âge adulte comme des fonctions nutritionnelles (régulations du métabolisme des glucides, des lipides) et antitoxiques (polluants, médicaments). Ces fonctions sont essentielles à la vie. Elles permettent la régulation de la glycémie (taux de sucre dans le sang), la détoxification des polluants et médicaments et elles s’opposent au stockage de lipides appelé stéatose hépatique. Les objectifs sont de démontrer par des preuves directes sur l’animal entier (1) si le foie est une cible du maneb tout au long du développement depuis la vie fœtale jusqu’au stade adulte ; (2) si une exposition à doses faibles pendant la vie fœtale va modifier la fonction hématopoïétique du foie fœtal et l’acquisition des fonctions dites « adultes »; (3) si une exposition au maneb prédispose à la prise de poids et aggrave la stéatose hépatique lorsque les souris sont nourries avec un régime riche en graisses et en sucre à l’âge adulte pour mimer le régime appelé « Western-diet »; (4) Ces études seront réalisées sur des souris mâles et femelles afin de déterminer s’il existe des effets dépendants du sexe. Un total de 342 souris seront nécessaires pour ce projet. Chaque souris sera suivie individuellement afin de collecter un maximum de données biologiques et limiter la quantité totale de souris pour l’obtention de données statistiques fiables et interprétables.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’identifier si l’obésité, les maladies hépatiques liées à l’obésité ou si certaines maladies du sang pourraient être la conséquence d’une exposition au maneb en particulier pendant la vie fœtale. En effet, les doses utilisées dans ce projet sont compatibles avec une exposition environnementale. La réalisation de ce projet pourra avoir de fortes implications en termes de recommandations notamment pour les femmes en âge de procréer et pour la sécurité des marchés alimentaires. Ce projet fournira des arguments et des preuves scientifiques aux autorités politiques pour soutenir la réduction de l'utilisation massive des pesticides contenant du manganèse comme le maneb, dans le monde, et notamment dans les mélanges extemporanés de pesticides appelés « bouillies » qui font l’objet d’une règlementation.

Procédures

Les interventions sont nutritionnelles (exposition au maneb par l’alimentation et exposition à un régime riche en graisses et en sucres, classiquement appelé Western diet). Les interventions incluent des prélèvements sur des animaux vigiles (éveillés) après une mise à jeun de courte durée (6 heures). Il s’agit de prélèvements de sang à la queue et du prélèvement terminal à l’œil (après dépôt d’un analgésique). Cela permet de suivre l’état métabolique de la souris comme le taux de sucre dans le sang ou d’insuline ou des lipides en réponse à une injection soit de glucose (sucre), d’insuline ou un gavage d’huile alimentaire ait été réalisé. La durée totale des tests est de moins de 90 minutes (5 prélèvements pour dosage de la glycémie ou du taux d’insuline) et de moins de 4 heures (4 prélèvements pour dosage des lipides). Chaque prélèvement en lui-même dure quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont de classe légère (procédure 3) ou modérée (procédures 1 et 2). La présence de maneb dans le régime alimentaire est très faible et ne devrait pas perturber la prise alimentaire. La quantité de nourriture contaminée proposée aux souris correspond à la dose sans effet toxique. De même, le régime riche en graisses et en sucres est bien accepté des souris. La souris étant un animal nocturne, la mise à jeun (limitée à 6 heures entre 7h30 et 1 3h30) n’a pas de conséquence sur l'état général, les biberons d’eau n’étant pas enlevés. Les autres nuisances incluent le perçage des oreilles, les gavages d’huile, les injections de glucose ou d’insuline et l'incision très fine au niveau de la queue à l’aide d’un scalpel, ou le prélèvement rétro-orbital après dépôt d’un analgésique. Enfin, les animaux sont anesthésiés avant la mise à mort. Ces actes sont pratiqués par du personnel compétent et ne développent pas d’anxiété chez l’animal.

Devenir

Tous mis à mort en raison des prélèvements d’organes réalisés sur tous les animaux expérimentés

Remplacement

La réalisation de ce projet vise à étudier les conséquences d’une exposition maternelle au fongicide maneb sur le développement des souris jusqu’à l’âge adulte. Ce projet vise aussi à étudier l’effet aggravant d’une exposition maternelle au maneb sur le développement des maladies liées à l’obésité. Enfin, ce projet vise à étudier la transition fonctionnelle du foie dans le fœtus exposé via la mère au maneb en comparaison de fœtus issus de mères non exposées. En conséquence, ce projet implique trop de mécanismes susceptibles d’interagir en même temps, les conséquences sont très nombreuses et ne peuvent donc pas être étudiées autrement que sur l’animal entier. Enfin, la dépendance avec le sexe est un paramètre également difficilement analysable autrement que sur l’animal entier.

Réduction

Le projet est original au sens où il n’a encore jamais été mené. Le nombre de souris est calculé au plus juste pour obtenir des résultats exploitables et tirer des conclusions qui puissent faire poids auprès des évaluateurs du risque pour diminuer l’utilisation des pesticides en France et en dehors de la France. Au total sur les 5 années, le nombre d’animaux sera de 342 animaux

Raffinement

Pendant toute la durée des études, les souris sont surveillées individuellement 3 fois par semaine pour les souris adultes et au moins 5 fois lissés sur la semaine entière au moment de la gestation, la mise-bas et l’allaitement. Du coton est déposé dans la cage pour que la femelle puisse faire son nid et maintenir au chaud sa portée. Les études sont réalisées dans une pièce au calme. Une surveillance accrue sera réalisée chez les mères allaitantes n’ayant pas développé un comportement maternel. Dans ce cas, les petits de la cage seront déplacés dans des cages d’adoption après les avoir mouillés avec de l’urine des petits de la cage naturelle pour qu’ils soient acceptés par la mère d’adoption. Le test métabolique de sensibilité à l’insuline consiste à vérifier que le taux de sucre dans le sang diminue bien après une injection d'insuline; sinon , on parle de résistance à l'insuline. Lors de la réalisation de ce test, il peut arriver qu’une souris soit en hypoglycémie (baisse trop importante du taux de sucre dans le sang). Dans ces conditions, une injection de glucose est immédiatement réalisée et la souris est installée dans du coton supplémentaire pour éviter l’hypothermie (froid). Un analgésique (anti-douleur) est utilisé pour permettre le prélèvement sanguin à l’œil sans souffrance et les animaux sont anesthésiés avant la mise à mort.

Choix des espèces

La souris a de nombreuses caractéristiques « proches » de celles de l’homme. Le projet vise à étudier les effets nocifs liés à l’exposition au maneb dans un modèle souris, en particulier lorsque l’exposition a lieu pendant la période maternelle, une période de haute sensibilité aux polluants. Cela nécessite d’étudier à la fois les fœtus en réponse précoce à l’exposition et les individus une fois devenus adultes, à la fois les mâles et les femelles. Les souris utilisées répondent très bien aux régimes dits obésogènes qui sont riches en graisses et en sucres au sens où les souris vont prendre du poids en les consommant et présenter un certain nombre de désordres métaboliques retrouvés chez l’homme et liés à l’obésité comme le stockage de lipides dans le foie (stéatose hépatique). Or, obésité et stéatose touchent aujourd’hui 20% de la population en France (plus de 35% aux US) ; ce qui en fait aujourd’hui des problèmes majeurs de Santé Publique.

100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque semaine, un prélèvement d'urine les isole une nuit de 14 à 16 heures dans une cage sans litière ni enrichissement, situation que le porteur décrit lui-même comme probablement aversive. Après six semaines de régime cétogène, ils sont anesthésiés pour un prélèvement de liquide céphalorachidien et d'organes ou pour un enregistrement intracérébral de 4 à 6 heures, sans réveil. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de recourir à l'animal vivant, le remplacement in vitro étant selon lui impossible actuellement.

Objectifs

Le métabolisme cérébral s’adapte à la nutrition, ce qui peut avoir des conséquences considérables sur la santé mentale et les maladies neurologiques. Par exemple, les effets bénéfiques du jeûne ont été reconnus dès l’antiquité, notamment sur l’épilepsie. Le jeûne peut être remplacé par des régimes moins contraignants comme le régime cétogène, riche en graisses et appauvri en protéines et en sucres. Ce régime est caractérisé par un apport calorique diminué et une augmentation plasmatique de corps cétoniques, un état interne appelé cétose. Les effets bénéfiques de la cétose s’étendent au-delà de l’épilepsie, à un large ensemble de problématiques comme un meilleur vieillissement, une augmentation de l’espérance de vie et une protection contre les maladies neuro-dégénératives comme les maladies de Parkinson ou d’Alzheimer. Ce projet testera l’hypothèse selon laquelle l’administration de corps cétonique chez des patients ou chez des animaux pourrait constituer une stratégie neuroprotectrice, notamment après un accident vasculaire cérébral ou un traumatisme crânien. Plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer l’effet neuroprotecteur du régime cétogène. D’abord, une modulation de la fonction mitochondriale combinée à une augmentation d’enzymes antioxydantes qui pourraient diminuer le stress oxydant des neurones et des cellules gliales. Ensuite un changement de l’équilibre entre neurotransmetteurs excitateurs et inhibiteurs en faveur de l’inhibition pourrait expliquer une diminution de l’excitabilité des réseaux neuronaux et une amélioration de la fréquence et de la sévérité des crises d’épilepsie.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ce projet permettra de mieux comprendre les effets métaboliques du régime cétogène à la fois sous l’angle des concentrations basales de métabolites, et de façon dynamique, au cours d’une épreuve métabolique modélisée par une dépolarisation corticale envahissante. Cette approche permettra de comprendre dans quelle mesure le régime cétogène affecte le fonctionnement basal du cerveau ainsi que sa capacité à répondre à une stimulation. Elle permettra aussi de tester pour la première fois in vivo l’hypothèse selon laquelle le régime cétogène diminue la disponibilité des neurotransmetteurs excitateurs comme le glutamate et le stress oxydant, représenté ici par le monoxyde d’azote. L’ensemble des connaissances obtenues au cours de ce projet permettra de d’évaluer si le régime cétogène ou la cétose en général peut représenter un état neuroprotecteur et dans quelle mesure induire cet état chez des patients cérébrolésés peut améliorer leur évolution clinique.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements d'urine une fois par semaine pendant sept semaines. Ce prélèvement dure une nuit au cours de laquelle l'animal est isolé sans enrichissement. A la fin des six semaines de régime alimentaire contrôlé, les animaux seront anesthésiés pour prélèvement de liquide céphalorachidien et d'organes ou pour une expérience de monitorage intracérébral durant entre 4h et 6h.

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à six semaines de régime cétogène. Ce régime permet d’induire un état de cétose sans restreindre l’accès à la nourriture et ses effets indésirables sont limités. Toutes les semaines, un prélèvement d’urine sera réalisé. Pour cela, les animaux seront placés seuls dans une cage à métabolisme. Ce dispositif ne comporte pas de litière ni d’enrichissement et permet de récupérer l’urine par un système de gouttière. Le recueil d’urine se fera au cours de la nuit, ce qui représente une période d’isolement de 14-16h qui sera probablement perçue par l’animal comme une situation aversive. A la fin des six semaines de régime cétogène, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane après administration de buprénorphine pour l’analgésie dans le but de prélever le liquide céphalorachidien ou pour effectuer une expérience de monitorage intracérébral pendant 4h à 6h. Les animaux n’étant pas réveillés, les effets indésirables des expériences sont minimes.

Devenir

La survie de l'animal n'est pas compatible avec le prélèvement d'organes ou avec les enregistrements intracérébraux sous anesthésie prévus dans le projet.

Remplacement

Le régime cétogène induit des adaptations lentes du métabolisme au cours des six semaines suivant le changement de régime alimentaire. Ces adaptations impliquent l’ensemble de l’organisme : intestins, foies, pancreas, circulation sanguine, reins, cerveau. Il est donc nécessaire d’avoir recours à l’animal vivant pour étudier ce phénomène. Le remplacement par des approches in vitro n’est pas possible actuellement.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum pour permettre des analyses statistiques fiables. Au cours de ce projet, les analyses statistiques consisteront à comparer les données obtenues dans le groupe d’animaux soumis au régime cétogène à celles obtenues chez des animaux nourris normalement. Des tests de t de Student seront appliqués après une analyse de normalité par le test de shapiro-Wilk. Dans le cas d’échantillons de données non normales, des tests de Mann-Whitney seront pratiqués. Les effectifs sont calculés sur la base de 8 animaux par groupe. Pour les expériences de monitoring intracérébral, des analyses statistiques seront pratiqués dès que six animaux auront été enregistrés. S’ils sont significatifs ou si des calculs de taille d’échantillon par des test beta révèlent qu’aucune différence claire n’apparaît, les expériences seront interrompues sans utiliser l’effectif annoncé au départ, ce qui peut réduire l’effectif.

Raffinement

Tout au long de ce projet, les animaux seront hébergés par paires dans des cages enrichies avec des matériaux de nidification et des baguettes de bois à ronger, afin d’améliorer leur bien-être général. La période d’isolement nécessaire aux prélèvements d’urine est restreinte à une nuit par semaine pendant six semaines et une nuit d’habituation, ce qui minimisera l’inconfort lié à la procédure. De plus, les animaux auront été entrainés à rester dans les cages à métabolisme une fois avant le début du régime cétogène. Toute la phase de prélèvement et d’enregistrements intracérébraux est prévue sous anesthésie après analgésie par la buprénorphine, ce qui réduit le stress ou la douleur à un niveau minimal. Tout au long du projet, l'état général de l'animal sera évalué grâce à une grille de score et des interactions régulières avec la cellule bien-être et la vétérinaire référente permettront éventuellement d’intégrer des mesures supplémentaires permettant d’améliorer le confort des animaux, par exemple l'administration d'analgésique (carprofène, ou Rimadyl 5 mg/kg) en cas de douleur avérée, ou adminsitration de nourriture ramollie en cas de perte de poids.

Choix des espèces

La plupart des études sur les effets du régime cétogène ont été effectuées chez le rongeur, qui représente le modèle animal de prédilection dans ce domaine. Par rapport à la souris, le rat présente une taille plus importante et un volume cérébral plus grand. Les volumes de liquide céphalorachidien et d'urine seront plus facilement récoltés chez le rat que chez la souris.

55 000 animaux non-humains vont être utilisés, en majorité des souris avec 700 rats et 500 lapins, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des composés-tests, des prélèvements sanguins répétés et des immunisations, certaines souris étant irradiées puis greffées de cellules immunitaires humaines, pour sélectionner des candidats médicaments destinés aux dossiers réglementaires. Le porteur indique que les hébergements longs, les doses mal tolérées et l'injection de cellules humaines peuvent provoquer perte de poids et difficultés de déplacement. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reproduit la complexité du système immunitaire.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux composés modulant le développement et la fonction du système immunitaire dans différents modèles de pathologies sur le rongeur. Les informations générées seront indispensables pour permettre la progression du médicament au travers des futures étapes de développement et inclus l’identification des doses minimales produisant une efficacité, détermination de la pharmacocinétique et pharmacodynamie essentielle pour mettre en place les schémas de traitement appropriés et enfin les études d’efficacités. Ces données pré-cliniques sont un préalable aux essais cliniques et à l’enregistrement de molécules candidates et figureront dans les différents dossiers réglementaires.

Bénéfices attendus

Sélectionner de nouvelles entités thérapeutiques innovantes pour des pathologies dont les besoins médicaux et la prise en charge de patients sont non satisfaits aujourd'hui.

Procédures

Administration unique ou répétée (plusieurs fois par jour sans dépasser 3 fois) de composés-tests à des doses pharmacologiquement actives. Prélèvements de sang sériés sur un même animal sans dépasser 7.5% du volume total du sang sur une semaine. Administration d'un antigène afin d'immuniser un animal sous anesthésie. Irradiation non létale de souris hautement immunodéfiscientes afin d'éliminer les cellules immunitaires murines avant de greffer des cellules immunitaires humaines.

Impact sur les animaux

Ces modèles sont de longue durée (1 à 40 semaines) pour se mettre en place. Cela signifie un impact négatif relatif à un hébergement de longues durées en groupe sociaux sur le bien-être des animaux bien que tous les moyens disponibles sont utilisés pour minimiser cet aspect. Les effets indésirables peuvent provenir de niveaux de doses administrées mal tolérées pour obtenir un effet pharmacologique ou d’un effet adverse de l’injection de cellules humaines dans un environnement murin. Les signes en seraient alors une perte de poids, des difficultés à se déplacer. Des administrations de composés à des doses sub-toxiques durant plusieurs jours, des prélèvements de sang sériés pour évaluer l'exposition à un composé peuvent nuire au confort des animaux, peut générer du stress.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des prélèvements de sang terminaux ou des collectes d'organes pour mesurer certains paramètres ou la concentration des composés-test adminsitrés. Les animaux dits "contrôle" sont mis à mort également pour des prélèvements de sangs ou d'organes afin de disposer d'échantillons contrôles au niveau des analyses faites ultérieurement.

Remplacement

A notre connaissance il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui reproduisent l’extrême complexité du rôle du système immunitaire dans le développement des réponses immunitaires anti-tumorales et l’activation du système immunitaire à des fins vaccinales. Les actions du système immunitaire impliquent de nombreux tissus et organes avec des mécanismes sous-jacent encore largement inexpliqués. Le modèle animal est également nécessaire pour recueillir des données pertinentes sur les mécanismes d’action du système immunitaire suite à l’administration d’un composé afin de développer des solutions thérapeutiques innovantes.

Réduction

Les composés passeront des filtres pour réduire le nombre des études in vivo et la quantité d’animaux utilisés dans ce projet. Ces filtres comprennent des tests in vitro et des études pharmacocinétiques chez le rongeur. Seuls les produits à forts potentiels seront testés dans les études d’efficacité in vivo. Les modèles animaux utilisés suivront les protocoles décrits dans la littérature. Nous confirmerons la taille des groupes qui permettrait de détecter un effet statistiquement significatif pour une différence entre les gropes controles et traités de 40% en considérant une puissance de 80% et un risque alpha de 5%.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux standards règlementaires. Les procédures générant douleur, inconfort ou stress se feront sous anesthésie. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Des consignes spécifiques seront mises en place pour définir les procédures à suivre en cas de complications. Les animaux affectés recevront des soins adaptés, par ou sous autorité du vétérinaire ou seront euthanasiés

Choix des espèces

Le modèle animal utilisé est sélectionné en fonction des antigènes évalués, du type de réponse immune analysé et des données de la littérature ou des connaissances scientifiques. Plusieurs critères entrent en ligne de compte pour le choix de l’espèce, voire de la souche : • Espèce développant une maladie identique à celle touchant l’homme (par exemple, la rage) (Souris) • Espèce sensible à l’infection (par exemple l’Herpès Simplex) (Souris, lapin) • Espèce développant une réponse immunitaire similaire à l’homme (par exemple CMV) (Souris, Rat) • Type d’antigènes (protéines, polysaccharides, germes atténués…) ou d’adjuvants D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : taille des animaux (voie ou volume des administrations, volume de prélèvement), disponibilité des outils immunologiques adaptés à l’espèce (cytokines, marqueurs cellulaires…). Les souris mutantes ou transgéniques constituent une opportunité unique pour étudier les mécanismes d’actions et les voies associées à la réponse immunitaire. Dans la plupart des procédures, les rongeurs et les lapins sont tous utilisés après sevrage au stade adulte pour que leur système immunitaire soit mature. Pour des demandes particulières, des animaux âgés peuvent être utilisés pour étudier les phénomènes d’immunosénescence et l’évaluation de candidats vaccins pour les personnes âgées. De même, pour l’évaluation de candidats vaccins pédiatriques des modèles d’animaux juvéniles peuvent être utilisés (souriceaux, ratons ; etc…).

66 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Un régime enrichi en adénine provoque une insuffisance rénale chronique, puis un régime calcique induit des calcifications vasculaires, avant l'administration de fingolimod dont l'effet immunosuppresseur entraîne souvent une baisse persistante des lymphocytes. Les rats sont tués par anesthésie terminale au pentobarbital, avec un prélèvement de sang par ponction cardiaque et une nécropsie. Le porteur affirme qu'une vérification in vivo est nécessaire pour confirmer ses résultats in vitro et espère faire du fingolimod un traitement des patients insuffisants rénaux.

Objectifs

La calcification vasculaire (CV) est un processus actif de formation osseuse par des cellules locales, notamment des cellules du muscle lisse (CML), qui se transdifférencient en cellules calcifiantes entrainant l’apparition des dépôts de cristaux de calcium dans la paroi des vaisseaux. La CV est reconnue comme une complication majeure chez les patients atteints d’une insuffisant rénale chronique (IRC) en augmentant fortement leur morbidité dû à l’apparition des complications cardiovasculaires. Malheureusement, les mécanismes moléculaires impliqués dans la CV restent largement méconnus ainsi que des thérapies ciblées pour éviter sa progression. Nos résultats préliminaires montrent que des patients IRC sous hémodialyse avec un score modéré de calcification abdominale aortique, ont la concentration sérique de la sphingosine 1 phosphate (S1P), un lidpide bioactif, significativement augmentée par rapport aux patients sous hémodialyse sans calcifications. Nous retrouvons également cette augmentation dans le sérum d’un modèle murin d’IRC avec des CV, dans un modèle ex-vivo d’aorte calcifié ainsi que dans le milieu extracellulaire d’un modèle de transdifférenciation des CML en cellules calcifiantes. De plus, nous avons impliqué plusieurs partenaires de la voie métabolique de la S1P, dans le processus de transdifférenciation des CML en cellules calcifiantes. Le but de ce projet de recherche est de déterminer si l’inhibition générale du métabolisme de la S1P avec l’immunomodulateur fingolimod a des effets délétères dans la calcification des aortes de nos modèles in vivo et ex vivo ainsi que dans la transdifférenciation des CML d’origine vasculaire en cellules calcifiantes.

Bénéfices attendus

Notre objectif est d’apporter une contribution importante dans la compréhension de la physiopathologie des CV associées à l’IRC ; l’axe S1P étant potentiellement impliqué dans la transdifférenciation des CML vasculaires ainsi que dans l’apparition et l’entretien de la calcification de l’aorte. La physiopathologie des CV associées à l’IRC est toujours méconnue et peu de données sont disponibles sur les mécanismes de la néoformation osseuse qui a lieu dans les vaisseaux. Aussi, nous allons évaluer l’impact du blocage de l’axe S1P sur les CV dans notre modèle murin d’IRC et particulièrement sur l’ossification ectopique de l’aorte. Le fingolimod, que nous utilisons dans ce projet comme inhibiteur général de la voie de la S1P, pourrait agir à la fois comme un inhibiteur de la CV ainsi que comme un immunomodulateur. A terme, nos données devraient permettre de valider l’intérêt thérapeutique de l'inhibition du métabolisme de la S1P pour prévenir ou traiter les CV chez des patients IRC et fournir des pistes pour améliorer la prise en charge médicamenteuse des patients, qui n’est actuellement pas entièrement satisfaisante.

Procédures

Néphrectomie chimique : Induction d'une IRC par régime enrichi en adénine (0,75% w/w). Un régime enrichi en adénine est une méthode non chirurgicale pour induire une IRC chez le rongeur (néphrectomie chimique). Les animaux seront nourris pendant 4 semaines avec un régime alimentaire A04 supplémenté avec 0,75% (w/w) d'adénine (Sigma Aldrich) Ces régimes sont produits à façon par la société SAFE (Augy, France). Le régime adénine est bien toléré par les animaux et n'induit qu'un léger ralentissement de la croissance pondérale lié à une moindre prise alimentaire résultant d'une nette différence de palatabilité entre les aliments (Skafi et al, J Cell Physiol, 2019). A l'issue du régime adénine, les animaux récupérent ce retard de croissance. Induction des CV chez le IRC - Les animaux seront nourris pendant 4 semaines avec un régime alimentaire A04 supplémenté avec 1% (w/w) de calcium et 0.9%(w/w) de phosphore (Sigma Aldrich). Ce régime est produit à façon par la société SAFE (Augy, France). Ce régime est bien toléré par les animaux et n'induit pas de manifestation observable. Ils recevront 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi) des injections intrapéritonéales de calcitriol (1,25-dihydroxycholécalciférol ou vitamine D3) (Rocaltrol, Roche) à la dose de 80 ng/kg afin de maximiser la fixation du calcium alimentaire. Le calcitriol est dilué dans du propylène glycol (injection 0,3mL/100 g) qui est un véhicule métabolisé et dépourvu de toxicité.

Impact sur les animaux

A cause de son action immunosuppressive, l’effet secondaire le plus fréquent et le plus préoccupant du fingolimod est une lymphopénie qui s’installe chez les animaux dès le début du traitement et qui persiste, très souvent, tout au long de l’étude. Il a été démontré que dans un modèle d’arthrite induite par le collagène, 4 semaines de traitement avec le fingolimod dans l’eau de boisson à 0,1 mg/kg/jour permettent de diminuer l’incidence de la maladie et de restaurer partiellement la qualité osseuse chez le rat. En même temps, cette dose n’affecte pas le nombre de monocytes ou neutrophiles présents dans le sang périphérique. Dans un modèle murin d’Alzheimer, la même dose de 0,1 mg/kg/jour de fingolimod, également administrée diluée dans l’eau de boisson, ne modifie pas le nombre de lymphocytes par rapport au nombre total de leucocytes, même après 28 semaines de traitement. De plus, la présence du fingolimod dans l’eau de boisson, ne modifie la prise d’eau quotidienne par les animaux. Nous attendons donc du traitement avec le fingolimod à faible dose pendant 5 ou 7 semaines, des effets sur les CV, sans induction de lymphopénie. La procédure expérimentale N°1 nous servira à choisir la dose de fingolimod la plus adaptée à utiliser dans la procédure expérimentale N°2 qui ne provoque pas de lymphophénie et qui ne modifie pas a priori la prise d’eau et/ou de la norriture à cause de son gout. Dans la procédure expérimentale N°2 nous utiliserons un regime à base d’adenine pendant 4 semaines pour provoquer une IRC irreversible. Cette procédure à recemment été validé et publiée par notre équipe (Skafi et al, J Cell Physiol, 2019). Le régime adénine est bien toléré par les animaux et n'induit qu'un léger ralentissement de la croissance pondérale lié à une moindre prise alimentaire résultant d'une nette différence de palatabilité entre les aliments. A l'issue du régime adénine, les animaux récupérent ce retard de croissance.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés à l'issue du protocole expérimentale par anesthésie terminale au pentobarbital sodique (60 mg/kg). Nous réaliserons également un prélevement terminal de sang par ponction cardiaque et une nécropsie (prélevement de différents tissus pour des études histologiques et biochimiques).

Remplacement

Nos résultats montrent qu’il existe un lien entre le métabolisme de la S1P et les CV dans l’IRC. Plusieurs partenaires de la voie métabolique de la S1P semblent être impliqués dans la transdifférenciation des CML en cellules calcifiantes. Des manipulations dans un modèle in vivo s’avèrent nécessaires pour vérifier nos résultats préliminaires obtenus in vitro. Le ciblage global du métabolisme de la S1P avec le fingolimod semble être une approche idéale pour l’inhibition de la calcification à la fois in vitro et in vivo. Si les résultats s’avèrent concluants, le fingolimod pourrait devenir un traitement de choix pour les patients IRC dans le but de prévenir, diminuer ou ralentir l’apparition des CV et en conséquence diminuer les accidents cardiovasculaires et la morbidité.

Réduction

La procédure expérimentale N°2 ne sera réalisée que si la procédure expérimentale N°1 donne les résultats attendus. La procédure N°1 nous permettra de vérifier que la présence du fingolimod dans l’eau de boisson ne modifie pas la prise d’eau/croquettes quotidienne par les animaux et n’induit pas une lymphopénie.

Raffinement

Les conditions d’hébergement et d’entretien des rats seront adaptés pour éviter des conditions délétères pour l’animal. Les animaux sont réceptionnés des établissements Janvier, deux semaines avant le début de l’expérimentation. La surveillance de l'environnement, fournitures et équipement auxquels les rats sont exposés est essentiel à l'entretien. L’état de bien-être est évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (perte de poids, aspects du pelage, morsures...). De la nourriture sera disposée au fond de la cage par prévention dès la période de stabulation afin de permettre aux rats de se nourrir en cas d’apparition de douleur au cours des procédures. Une couche importante de litière sera mise au fond de chaque cage, et le non enfouissement des rats étant un signe de mal-être nous y ferons attention.

Choix des espèces

Le présent protocole sera conduit sur des rats Sprague-Dawley. Les rats IRC développent en 4-5 semaines des CV lorsqu'ils sont soumis à un régime enrichi en P/Ca et qu'il recoivent des injections calcitriol. L'incidence des CV dans cette population est supérieure à 60%. Les rats Sprague-Dawley procedant de Janvier arriveront à l’animalerie avec 6 semaines et seront stabulés 2 semaines avant le début des expériences. A 8 semaines, les rats sont considerés comme jeunes adultes en ayant adquis leur maturité séxuelle à environ 6 semaines. Les rats auront un poids d’environ d’environ 200-250 g à l’arrivée à l’animalerie et de 300-350 g au début des manipulations.