Procédures légères

66 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures classées en gravité légère, puis réintégrées dans le troupeau non expérimental. Les animaux sont suivis neuf semaines avec des prélèvements de lait et des prises de sang à la veine de la queue, sans autre intervention. Le porteur compare des modes de conduite alternant bâtiment et pâturage pour mesurer les émissions de gaz et les flux d'azote des élevages laitiers. Il affirme qu'aucun modèle ne permet de simuler l'ensemble des processus à l'échelle de la vache et de la parcelle.

Objectifs

Les bovins seraient les principaux contributeurs des émissions du secteur élevage avec 63% des émissions d’ammoniac (par ailleurs précurseur de particules), 51 % des émissions de N2O et 87 % des émissions de CH4 (CITEPA, 2021). A l’échelle française, les émissions d’ammoniac et de particules fines (PM2.5) doivent être réduites respectivement de 13% et 57% à l’horizon 2030 (PREPA, 2017). Lorsque le système d’élevage le permet (parcellaire adapté), le pâturage peut être considéré comme une stratégie permettant de réduire les émissions d’ammoniac par rapport à des systèmes de conduite exclusive en bâtiment, tout en constituant un maillon du bouclage des cycles C-N-P et en contribuant à la fourniture de services écosystémiques (dont le stockage du carbone dans les sols). Or au printemps, lors de la reprise de la pousse de l’herbe, et à l’automne, avant que les animaux ne rentrent au bâtiment, les vaches passent systématiquement par une phase de transition nécessaire pour leur éviter un changement drastique de ration qui aurait des conséquences néfastes sur leur santé. De plus, à certaines périodes de l’année, la ressource en herbe n’est pas toujours suffisante pour satisfaire leurs besoins (été, automne, parfois printemps ). Il arrive également que certains éleveurs cherchent à « sécuriser » les apports de la ration lors de ces périodes d’incertitude. De nombreux élevages sont alors concernés par la distribution de fourrages conservés et de concentrés au pâturage ou au bâtiment en complément de l’herbe pâturée. Les conséquences de ces associations de fourrages conservés et pâturés sur les performances animales, l’efficience d’utilisation de l’azote et la composition des effluents sont encore peu connues. De plus, le partage du temps entre prairie et bâtiment a des conséquences sur la gestion des effluents (en partie émis au bâtiment, stockés et épandus et/ou en partie déposés au pâturage), sur leur composition (e.g. teneur en azote ammoniacal variable selon la part d’herbe dans la ration) et les émissions à risque pour l’environnement (vers l’air et vers l’eau). Une meilleure compréhension de l’influence de ces régimes contrastés et de la combinaison de ces fourrages complémentaires sur les flux de nutriments et de gaz est aujourd’hui nécessaire pour une meilleure conduite des animaux, des prairies et des effluents au service de la multi performance des élevages laitiers et d’une réduction de leurs impacts sur l’environnement.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de fournir de nouvelles références sur des modes de conduite mixtes alternant des phases de bâtiment et de pâturage, ayant des conséquences sur la valorisation des rations offertes aux animaux, sur leurs performances, sur la production d'effluents et sur les émissions gazesues associées. Ces données sont à ce jour très parcellaires dans la littérature car peu d'études les mesurent de façon concomitante et intégrée. Ces informations doivent permettre d'établir des recommandations quant aux conduites les moins émétrices tout en assurant des niveaux de performance correspondant aux attentes des éleveurs.

Procédures

Ces procédures concernent des animaux vigiles qui seront suivis durant 9 semaines au printemps et à l'automne. Des échantillons de lait seront prélevés à la traite 3 jours par semaine (soit 6 traites) et des prises de sang seront réalisées (2 jours par période pour la procédure 1 et 1 jour par cycle de pâturage pour la procédure 2).

Impact sur les animaux

Les traitements comparés sont des modes de conduite courants dans les élevages. Ils n'entrainent à priori pas d'effets indésirables sur les animaux. Les rations offertes (incluant l'herbe au pâturage) seront de bonne qualité et distribuées à volonté. Les effluents seront collectés et leur gestion n'aura pas de conséquence directe sur les animaux. Les seuls prélèvements qui seront faits sur les vaches seront les prises de sang à la veine caudale, justifiant la classe de sévérité légère des procédures 1 et 2.

Devenir

Suite à l’estimation de l’état général des animaux en fin d’essai, la décision pourra être prise par le responsable de l'installation de réintégrer ces vaches dans le troupeau non expérimental. Si une alerte au niveau de l’état général d’un animal le justifiait, la cellule bien-être (SBEA) et le vétérinaire seraient consultés.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer l'utilisation des animaux par une autre approche dans ce projet qui a pour but de mesurer les conséquences de différents modes de conduite des vaches laitières. Il n'existe à ce jour pas de modèle permettant de simuler l'ensemble des processus associés (à l'échelle de la vache, du bâtiment d'élevage, du stockage des effluents et de la parcelle pâturée).

Réduction

La première procédure n'utilisera que deux lots de 3 vaches chacun. En effet, les salles à ventilation dynamique permettant de mesurer les émissions gazeuses ne permettent pas d'accueilir plus de vaches lorsqu'elles sont conduites en étable libre (surface offerte de 13m²/vache). Le schéma experimental en inversion testant deux traitements sur 3 périodes doit permettre de répondre aux objectifs scientifiques et obtenir une puissance statistique suffisante pour monter les effets des traitements expérimentaux. L'utilisation d'analyses de variance permettra de tester l'influence du mode de conduite sur les variables de production (ingestion, production laitière...) et les émissions gazeuses à l'échelle du lot de vaches, en corrigeant de l'effet période. La deuxième procédure s'appuiera sur des lots de vaches plus conséquents (2 lots de 30 vaches) ce qui s'avère être un minimum pour la mesure des émissions gazeuses au pâturage qui sont par nature beaucoup plus faibles qu'au bâtiment. En dessous de ce nombre, les concentrations de gaz mesurées peuvent descendre sous le seuil de détection des appareils de mesure utilisés.

Raffinement

Les modes de conduites testés, tout à fait classiques en élevage, n'induiront a priori aucune douleur ou souffrance. Les animaux seront élevés et suivis conformément aux règles d’élevage et de bonnes pratiques en place dans l’élevage. Un suivi régulier du comportement des animaux sera mis en place pour détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou de douleur. Les animaliers chargés du suivi ont tous une solide formation en élevage laitier et sont sensibilisés à la douleur animale. Le suivi régulier par le vétérinaire sanitaire assure également la bonne santé des animaux. Des points limites adaptés ont été définis afin d’éviter au maximum toute forme de souffrance des animaux. En cas de problèmes détectés, les animaux seront isolés et soignés selon les prescriptions du vétérinaire.

Choix des espèces

Les vaches laitières utilisées seront de race Prim’Holstein. Pour diffuser et comparer les résultats, la race Prim’Holstein, qui est la race la plus répandue dans le monde en bovin lait, est la race appropriée. Les vaches seront en lactation afin de déterminer les effets des traitements sur les performances zootechniques et la composition du lait.

570 oiseaux de 57 espèces vont être utilisés dans des procédures classées en gravité légère, sans prélèvement ni chirurgie, puis tous rendus à leur établissement. Les oiseaux sont placés en volière ou dans une caisse transparente pour des tests de perception visuelle du mouvement et des contrastes, avec un stress possible pour seul effet déclaré. Le porteur cherche à comprendre comment les oiseaux voient les éoliennes afin d'en réduire les collisions, qui tueraient selon lui environ 59 000 oiseaux par an en France. Il affirme qu'il n'est pas envisageable de remplacer les oiseaux par un modèle non biologique pour ces tests de vision.

Objectifs

La Programmation Pluriannuelle de l’Energie vise un doublement de l’énergie produite par les éoliennes, alors qu’en moyenne 59000 oiseaux sont tués par collision chaque année en France, dont 81% d’espèces protégées. Dans le cadre des politiques de protection de l’environnement, les exploitants de parcs éoliens ont pour obligation de réduire la mortalité aviaire liée aux collisions, en particulier lorsqu’ils affectent des espèces au statut de conservation défavorable ou des espèces protégées. Actuellement, pour répondre à ces injonctions réglementaires, les exploitants de parcs éoliens utilisent des dispositifs automatisés (caméras) de détection des oiseaux à proximité du parc dans le but de réduire les collisions en les effarouchant ou en arrêtant les turbines. L’efficacité de ces systèmes est débattue et variable selon les groupes d’oiseaux. Une manière plus directe pour réduire les collisions serait de rendre les éoliennes plus facilement détectables par les oiseaux afin qu’ils puissent les éviter. Pour cela une compréhension globale des capacités visuelles des oiseaux est nécessaire, or certaines informations essentielles sont encore manquantes. Dans la littérature scientifique, il est mis en évidence une sensibilité à la collision accrue chez les rapaces diurnes (Accipitriformes et Falconiformes), les calaos (Bucerotiformes), les martinets (Apodiformes), les cigognes, flamants et ibis (Ciconiiformes), certains corbeaux (Passeriformes), certains limicoles et goélands (Charadriiformes) et certains pigeons (Columbiformes). Les espèces d’intérêts pour cette étude font partie des différentes familles fortement impactées par ces collisions. Des espèces non concernées par ce problème seront également étudiées en tant qu’espèces témoins. Il sera donc possible de comparer les capacités visuelles des espèces en fonction de leur sensibilité à la collision. L’objectif ultime de cette étude est de comprendre comment les oiseaux perçoivent les éoliennes, afin de proposer des solutions pour augmenter la détectabilité de celles-ci par les oiseaux et, éventuellement, pouvoir se passer des dispositifs de détection/effarouchement. Ce projet de thèse de doctorat propose d’étudier ces différents éléments via 2 axes de recherche : l’étude de la perception visuelle (1) du mouvement rotatif et (2) des contrastes.

Bénéfices attendus

Dans le cas de la PROCEDURE EXPERIMENTALE N°1 les seuils limites de perception du mouvement rotatif, définis sur un certain nombre d’espèces, permettront de proposer un nouveau cahier des charges aux constructeurs d’éoliennes afin d’élaborer des modèles de pâles et rotors ne dépassant pas cette vitesse tout en maintenant une production d’énergie électrique rentable. Dans le cas de la PROCEDURE EXPERIMENTALE N°2, si le contraste proposé par les éoliennes par rapport à l’environnement n’était pas perceptible par la majorité de l’avifaune, il serait judicieux de proposer une teinte différente accentuant ce contraste.

Procédures

Aucun prélèvement ou intervention chirurgicale ne sera réalisé sur les animaux au cours des différentes procédures. Au cours des procédures les oiseaux seront vigiles. En cas de stress les oiseaux seront sortis du dispositif et remis dans leur volière. Sur 57 espèces d'oiseaux, au maximum 10 individus par espèces seront utilisés dans chaque procédure. Les individus utilisés dans la première procédure ne seront pas ré-utilisés dans la deuxième. Dans le cadre de la PROCEDURE EXPERIMENTALE N°1 les oiseaux seront placés dans la volière d'expérimentation entre 30 minutes et deux heures par jour, tous les jours, pendant deux mois. Dans cette volière les oiseaux devront effectuer un choix entre deux stimuli. Selon le choix réalisé l'oiseau sera récompensé avec de la nourriture ou non. Les oiseaux seront libres de leur mouvement. Dans le cadre de la PROCEDURE EXPERIMENTALE N°2 les oiseaux seront placés dans une caisse transparente pendant une à trois heures consécutives. La caisse sera placé devant des écrans sur lesquels seront diffusés différents patterns. Au cours de la PROCEDURE EXPERIMENTALE N°2 chaque oiseau passera au maximum 3 heures dans le dispositif, découpable en plusieurs séances de quelques minutes si besoin. Les dimensions de la caisse transparente sont adaptables pour chaque espèce de manière à ce que l'oiseau soit libre de ses mouvement, mais dans un espace restreint : l'oiseau pourra se tenir debout, se coucher et se retourner.

Impact sur les animaux

Les oiseaux ne souffriront pas de la faim ou de la soif, d’inconfort, de douleurs, de blessures ou de maladies au cours des procédures. Le seul effet indésirable possible serait du stress au moment de l’expérimentation, qui devrait disparaitre dès la fin de la procédure.

Devenir

Tous les animaux seront gardé en vie et replacé au sein de leur établissement utilisateur.

Remplacement

S’agissant d’études comportementales sur la vision des oiseaux, il n’est pas envisageable de remplacer les oiseaux par des modèles non biologiques.

Réduction

Le nombre d’oiseaux utilisés sera réduit au minimum pour donner des résultats statistiquement corrects, soit 10 individus par espèces. Ce chiffre est basé sur des études similaires et permettront d’acquérir les informations suffisantes en relation avec les questions posées. La personnalité et la motivation de chaque individu rentrant en jeu dans toute expérience, ce chiffre permettra de prendre en compte la variabilité individuelle.

Raffinement

Ces expériences nécessiteront peu de manipulation et n’engendreront aucune douleur ou souffrance des animaux. Toutes les précautions seront prises pour limiter toute forme de stress. Le protocole est notamment conçu pour pouvoir arrêter l’expérience à tout moment en cas de signes de stress. Les expériences menées étant basées sur le comportement, les résultats ne seraient pas exploitables si les oiseaux étaient stressés.

Choix des espèces

Pour étudier la perception des éoliennes par les oiseaux afin de réduire les collisions aviaires avec les éoliennes, nous étudierons 57 espèces, réparties entre celles impactées par ces collisions, et des espèces témoins non concernées par les collisions. Afin de limiter le nombre d’individus étudié, seules quelques espèces de chaque famille seront utilisées, en privilégiant des espèces accessibles en captivité et étant d’intérêt majeur la filière éolienne. La taille de l’œil et les capacités visuelles sont dépendantes du stade de développement et se stabilisent au moment de l’envol quand l’individu a atteint sa taille adulte. Les expériences seront donc menées uniquement sur des oiseaux de taille adulte.

160 médakas vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère. Les poissons, dont le gène auts2a est modifié par CRISPR, sont isolés huit heures pour des tests comportementaux d'apprentissage, puis tués par surdose d'anesthésique. Le porteur étudie la transmission à la descendance d'effets liés à ce gène qu'il dit impliqué dans plusieurs pathologies humaines dont l'autisme. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative à l'animal vivant pour observer des réponses comportementales issues d'une fécondation naturelle.

Objectifs

Des températures suboptimales lors de la période de reproduction ont montré une baisse de l’expression maternelle d’un gène, auts2a, impliqué dans de nombreuses neuropathologies humaines : Trouble du spectre autistique, schizophrénie, Retard mental, etc … . Ce projet vise à comprendre les mécanismes moléculaires des stades précoces du développement embryonnaire qui entrainent des modifications des phénotypes comportementaux chez une espèce de poisson modèle, le médaka (Oryzias latipes). Par une approche d’édition de génome (CRISPR/Cas9) nous réaliserons deux lignées de médaka n’exprimant pas la protéine auts2a, ce qui nous permettra de réaliser des phénotypages comportementaux et moléculaires.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les effets intergénérationnels de stress parentaux, par exemple thermiques liés au réchauffement climatique, sur les comportements adaptatifs de la descendance chez des poissons d'élevage. L'identification du rôle clé joué par le gène auts2 dans cette transmission chez un poisson modèle contribuera à renforcer les connaissances scientifiques sur la transmission maternelle et/ou paternelle de ce gène impliqué dans de nombreuses pathologies humaines.

Procédures

Les animaux seront isolés pendant 8h afin de s'habituer à un nouvel environnement (nous déterminerons ainsi leurs capacités d'apprentissage des caractéristiques nouvelles de cet environnement). Cet isolement entraîne un stress modéré pour le médaka puisque son activité de nage redevient régulière et le poisson remonte en surface (indicateur d'absence de stress) après moins d'une heure.

Impact sur les animaux

Les phénotypes entraînés par la mutation n’induisent pas de souffrance et ne sont donc pas dommageables pour l’animal (il s’agit essentiellement de modifications des réponses émotionnelles et cognitives bénignes).

Devenir

Mise à mort selon la réglementation en vigueur pour l'espèce (surdose d'anesthésie)

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation des animaux dans cette expérimentation car nous recherchons précisément des mécanismes intervenant pendant une fécondation naturelle perturbée par la modification ou l’absence d’une protéine impliquée dans le neurodéveloppement ainsi que les réponses comportementales des poissons (vivants donc) issus de cette fécondation.

Réduction

Concernant les tests comportementaux, nous comparerons 4 génotypes différents, avec un nombre équitable de femelles et de mâles par génotype, ce qui nécessite un minimum de 20 poissons (10 femelles et 10 mâles) par génotype pour réaliser des tests statistiques robustes.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau, densité). Les manipulations des animaux seront réalisées le plus rapidement possible pour limiter le stress. Pour les tests comportementaux, les conditions environnementales seront les mêmes qu’en condition d’élevage hormis un isolement obligatoire pour l’analyse du comportement. Il n’y aura aucune procédure douloureuse. A la fin des tests, ils seront euthanasiés selon la procédure de mise à mort réglementaire.

Choix des espèces

L’analyse de l’expression du transcriptome à différents stades de développement embryonnaire est rendue possible par les spécificités biologiques du médaka. En effet, Il produit une trentaine d’œufs de manière quotidienne, ce qui permet un grand échantillonnage. Son développement embryonnaire est plus lent que celui du zebrafish (9 jours contre 2 jours), ce qui permet une meilleure précision lors de l’étude et l’observation du développement des œufs (qui sont translucides). De plus, le médaka ne possède que le paralogue auts2a (comme l’homme) tandis que le zebrafish possède les paralogues auts2a et auts2b (dont on ne connaît pas la fonction). Les injections auront lieu sur des œufs au stade 1 cellule (15 minutes après leur fécondation) et seront issus de poissons matures de souche sauvage. Les études comportementales porteront sur des poissons âgés entre 3 et 5 mois. Avant 2 mois les médakas montrent une activité plus importante et une grande variabilité inter-individuelle et avant 3 mois leur phénotype adulte n’est pas atteint ce qui rend leur détection par le logiciel ethovision XT plus difficile (la couleur des médakas s’assombrissant avec le temps).

750 civelles d'anguille européenne, espèce menacée, vont être utilisées dans des procédures classées en gravité légère, marquées par immersion dans une solution d'alizarine après un choc osmotique. À l'issue de la stabulation, 390 individus sont tués pour mesurer l'intensité de la fluorescence au microscope, les 360 restants étant relâchés sur les sites de repeuplement. Le porteur vise une lecture externe du marquage qui permettrait, à terme, d'évaluer le repeuplement sans tuer d'individus. Il affirme que le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette recherche menée sur la civelle.

Objectifs

Dans le cadre du plan de gestion de l’anguille, des opérations de captures de civelles en estuaire et de repeuplement des fleuves côtiers sont réalisées chaque année. L’évaluation de cette pratique est basée sur une technique de marquage de masse des civelles à l’alizarine Red S, un colorant fluorochrome qui génère une marque détectable durablement dans les structures calcifiées, notamment dans les otolithes, concrétions de l’oreille interne. La détection de la marque fluorescente requiert le sacrifice d’un échantillon d’individus capturés dans le milieu naturel, afin de déterminer la contribution de l’alevinage dans la population d’anguilles. La possibilité d’une détection externe des marques fluorescentes sur des civelles a été démontrée dans la littérature à partir d’un autre marqueur fluorescent, mais pas avec l’alizarine Red S. Des tests préliminaires réalisés selon le protocole de marquage couramment employé ont montré la présence de marques légères dans la mâchoire et les nageoires des civelles, mais souvent de courte durée. L’objectif de la présente étude est la mise au point d’un protocole de marquage à l’alizarine Red S, permettant spécifiquement une détection externe et durable des marques fluorescentes, qui pourrait à termes permettre l’évaluation de la contribution de l’alevinage, sans sacrifice d’individus.

Bénéfices attendus

La lecture externe des marques permettrait en premier lieu une simplification du protocole de détection, et ouvrirait d’autre part des perspectives intéressantes vers de la détection des marques sur animaux vivants, permettant notamment de ne plus sacrifier d’individus, réduire le temps de lecture et d’augmenter la taille de l’échantillon analysé.

Procédures

Marquage par immersion dans une solution de marqueur fluorescent. 2 types de marquage par balnéation seront testées : - Balnéation Longue : Balnéation des poissons dans 20L de solution d’Alizarine Red S à la concentration de 150 mg/l pendant 3h (lot n°1) ou 9h (lot n°2). - Balnéation Courte : Un choc osmotique est préalablement réalisé afin de favoriser l’assimilation rapide du marqueur fluorescent pendant 3.5 minutes puis une balnéation de 10 minutes dans 2L de solution d’alizarine à 1000ppm (lot n°3) ou 2000ppm (lot n°4).

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables potentiels sur les animaux concernent le transport après capture, le marquage et le maintien en captivité. Toutefois, ces effets peuvent être considérés comme légers au vu de l’expérience des opérateurs dans le transport et le marquage des civelles, communément réalisés dans le cadre des transferts de civelle destinées au repeuplement.

Devenir

Transport, marquage puis stabulation de 750 civelles. A l'issue de la stabulation (3e et dernière procédure), mise à mort de 390 individus et replacement en liberté du restant des individus encore en vie. La mise à mort se justifie pour pouvoir mesurer précisément l’intensité de la fluorescence à l’aide d’un microscope à épifluorescence et d’un dispositif de détection portatif et mettre au point une procédure de lecture.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette expérience de recherche de fluorescence externe qui implique de travailler nécessairement sur la civelle.

Réduction

L’effectif prévu (50 individus / lot) tient compte de la mortalité attendue en milieu contrôlé au stade civelle (maximum 25-30% avec le traitement BL3 ). A l’issue des 60 jours, un minimum de 30 individus par lot doit être analysé, sauf pour les témoins pour lesquels 10 individus par lot seront analysés (12*30 + 30 = 390 individus) en raison de la faible variabilité au sein de ce lot de référence non marqué. Ainsi 90 individus par traitement et 30 témoins seront analysés pour la fluorescence, afin de prendre en compte la diversité des stades pigmentaires dans l’échantillon (pouvant influer sur la détection de fluorescence) et la variabilité inter-individuelle de la fluorescence, potentiellement importante si l’on se réfère à d’autres études sur la rétention des marquages fluorescents. Les individus non analysés seront relâchés dans le milieu naturel sur les sites de repeuplement (au maximum 360 individus).

Raffinement

Les mésocosmes seront enrichis à l’aide de flottangs tout au long de l’expérience, dispositifs permettant aux civelles de s’abriter. Des daphnies seront ensemencées pour leur alimentation. La concentration en déchets du métabolisme azoté sera contrôlée chaque semaine, la concentration en oxygène sera également contrôlée quotidiennement. Des changements d’eau seront réalisés si besoin. Toutefois cela ne devrait pas être nécessaire vu la très faible densité d’individus dans le volume d’eau.

Choix des espèces

L’anguille est une espèce menacée au niveau européen, qui fait l’objet d’un plan de conservation à l’échelle nationale. L’évaluation des pratiques de repeuplement par une méthode de détection externe non létale représente un fort enjeu pour la gestion future. Les animaux seront utilisés au stade civelle car c'est le stade utilisé en France pour réaliser les opérations de repeuplement d'anguille.

1536 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère. Chaque animal reçoit une injection dans l'œil de molécules inflammatoires sous anesthésie, puis des injections dans l'abdomen dont une destinée à provoquer une dégénérescence de la rétine. Le porteur cherche à réveiller les capacités de régénération des cellules de la rétine en modulant l'inflammation, avec l'espoir renvoyé au long terme de traitements pour les patients. Il décrit un modèle d'explants ex vivo mais affirme qu'il ne remplace pas l'animal vivant, la physiologie de l'œil entier n'y étant pas reproduite.

Objectifs

La rétine est soumise à des pathologies dégénératives dont la plupart restent non traitables jusqu'à ce jour. La stimulation de la capacité de régénération des cellules souches de la rétine des mammifères, qui est naturellement limitée, pourrait constituer une stratégie thérapeutique innovante. Les cellules souches de la rétine, les cellules gliales de Müller, possèdent un potentiel de régénération extraordinaire chez les amphibiens et les téléostéens, mais celui-ci est très limité chez les mammifères. Cependant, elles ne sont pas dépourvues de propriétés régénératives puisque l’on peut les forcer à se reprogrammer et à générer de nouveaux neurones. L'une des différences entre les deux espèces est la réponse inflammatoire aux dommages. Dans le système nerveux central des mammifères (cerveau et rétine), il est considéré que l'inflammation empêche la régénération du tissu. Dans la rétine du poisson, les médiateurs de l’inflammation favorisent la reprogrammation et la prolifération des cellules gliales de Müller après une blessure. En ce sens, il a été montré que les cellules immunes de la rétine (les microglies) favorisent la régénération chez le poisson, bien qu'elles deviennent préjudiciables si l’inflammation se prolonge. Chez les mammifères, l'inflammation favorise la gliose, la fibrose et la cicatrisation, mais pas la régénération. Ceci suggère une interaction microglie-Müller différente selon l’espèce. L’ensemble de ces résultats indiquent que chez la souris, des propriétés régénératives existent mais sont restreintes soit par des mécanismes intrinsèques aux cellules de Müller, soit par leur environnement (par exemple environnement pro- ou anti-inflammatoire défavorable). Que ce soit chez la souris ou le poisson, les cellules de Müller expriment YAP. Ce n’est donc a priori pas son expression qui est le facteur limitant mais cela pourrait être son activité. Nous souhaitons nous concentrer sur l’environnement inflammatoire et ses relations avec l’activité de YAP qui pourraient bien être la clef vers la réactivation du processus régénératif chez la souris. Dans ce contexte, nous souhaitons chez la souris, moduler l’inflammation via l’injection intraoculaire de molécules pro- ou anti-inflammatoires, et étudier les conséquences sur le réveil régénératif des cellules de Müller avec un focus particulier sur la régulation de l’activité de YAP dans différents contextes inflammatoires.

Bénéfices attendus

A ce jour, les différences d'efficacité de régénération observées entre espèces restent inexpliquées. La régénération rétinienne très efficace des espèces telles que les poissons nécessite une régulation fine de l'inflammation. Notre projet vise à reproduire des conditions inflammatoires favorisant la régénération chez la souris. Nous déterminerons également si le co-activateur de transcription YAP dont on connaît déjà les propriétés pro-régénératives vis-à-vis des cellules de Müller est nécessaire à l’induction de la prolifération induite par les molécules inflammatoires. Notre ambition est de réussir à débloquer les propriétés régénératives latentes des cellules souches de la rétine en modulant l'inflammation. Si le projet aboutit, cela ouvrirait la voie vers le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour soigner les patients atteints de dégénérescence rétinienne.

Procédures

Les animaux du présent projet seront soumis à trois actes expérimentaux : (i) anesthésie : une fois pendant la procédure juste avant l'injection intraoculaire afin d'éviter la douleur qui aurait été générée par l'injection. La durée de l'anesthésie est d'environ 30 minutes. (ii) injection intraoculaire : une fois pendant la procédure. L'injection s'effectue rapidement en 5 minutes maximum en comptant le temps nécessaire à placer correctement l'animal anesthésié pour réaliser l'injection. Les molécules injectées sont soit un véhicule (tampon Phosphate Buffer Saline, ou PBS), soit des molécules pro-inflammatoires (Lipopolysaccharides (LPS), Zymosan, Interleukine-6 (IL-6), ou Tumor Necrosis Factor (TNF-α)), soit une molécule anti-inflammatoire (anticorps anti-TNF-α). Ces molécules sont toujours injectées en présence d’un analogue nucléotidique (5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) pour suivre la prolifération des cellules de Müller)), (iii) injection intrapéritonéale : selon l'expérience, chaque animal recevra au minimum 3 injections : 2 injections de 4-Hydroxy-Tamoxifen (ou 4-OHT) pour induire la déplétion de notre protéine d’intérêt (YAP), une injection de N-Méthyl-N-Nitrosurée (ou MNU) pour induire la dégénérescence rétinienne puis de façon journalière 1 à 4 injections d'EdU pour suivre la prolifération des cellules de Müller selon le nombre de jours nécessaires à la procédure.

Impact sur les animaux

- Les phénotypes des animaux utilisés dans nos expériences sont restreints à la rétine. - Les différentes procédures ont un niveau de sévérité de classe légère et sont couramment utilisées dans le domaine de la recherche ophtalmologique. La technique d’injection intraoculaire est utilisée couramment en clinique chez l’homme dans le cadre du traitement anti-VEGF de la dégénérescence maculaire liée à l’âge et n’a pas de conséquence néfaste.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront gardés en vie (4h, 24h, 48h, 72h) selon l'expérience puis euthanasiés pour réaliser des expériences d'analyses phénotypiques.

Remplacement

En amont du présent projet, des expériences seront réalisées ex vivo sur des cultures explants de rétines provenant d'animaux euthanasiés sans manipulations préalables. Cette technique est un bon modèle alternatif de dégénérescence rétinienne pour tester l’effet de molécules pro- ou anti-inflammatoires sur la capacité régénérative des cellules de Müller. Ce modèle ex vivo va permettre de sélectionner les molécules inflammatoires les plus efficaces. Cependant, il ne se substitue pas au modèle in vivo chez l’animal car il ne récapitule pas toute la physiologie d’un œil.

Réduction

Nous avons estimé à 12 souris le nombre minimum d’animaux par groupe. Ce nombre correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des effets biologiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides et prenant en compte les aléas techniques. A noter également que dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses en même temps, de sorte que les deux rétines de chaque individu seront utilisées.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans un environnement contrôlé et enrichi (litière, abri en cellulose, tunnel en carton, frisures de papier, carré de coton, croquettes et biberon d’eau ad libitum). Nous aurons recours aux procédures anesthésiques appropriées. Les points limites de nos expériences sont déterminés grâce au suivi de l’état des yeux suite à l’injection, et en fonction de la santé générale des animaux ayant subi des manipulations de leur vivant. Les doses d’agents inflammatoires injectés seront réajustées à la suite de la survenue de manifestations extérieures de mal-être. Nous nous baserons sur les doses définies précédemment dans la littérature. Chacune des injections intraoculaires sera effectuée sous anesthésie afin de limiter la douleur et le stress des animaux.

Choix des espèces

Les souris sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines y compris dans le domaine de l'ophtalmologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins présentant de manière spontanée une dégénérescence rétinienne mimant les pathologies humaines. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Nos expériences visent à tester la capacité de l’inflammation à réveiller les propriétés régénératives des cellules gliales de Müller dans différents contextes dégénératifs, et à déterminer si YAP joue un rôle dans ce processus. Les lignées de souris utilisées permettent de choisir le moment auquel la délétion du gène Yap sera réalisée, ainsi que le type de cellules dans lesquelles nous souhaitons effectuer la délétion. Les animaux seront donc utilisés à partir du stade auquel les cellules de Müller de la rétine sont matures (i.e. 10 jours après la naissance). Ainsi, le gène Yap sera délété spécifiquement dans les cellules gliales de Müller à partir de 10 jours après la naissance. Les stades auxquels les expériences de modulation de l’inflammation seront réalisées dépendent du modèle choisi : - soit 21 jours après la naissance : cas de la lignée de souris présentant une mutation spontanée induisant naturellement une rétinite pigmentaire à partir de 16 jours après la naissance jusqu’à 30 jours. 21 jours après la naissance, 40% des photorécepteurs ont disparu, ce qui correspond à une dégénérescence moyenne modélisant bien la pathologie, - soit à deux mois : cas de la lignée de souris dans laquelle nous induisons la dégénérescence des photorécepteurs par injection de MNU.

1 500 bars vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur décrit un marquage par puce, une biopsie de nageoire et trois mesures de croissance sous anesthésie. Il indique que tous les poissons sont tués à la fin pour être sexés par observation des gonades, le bar n'ayant pas de caractères sexuels externes. Le projet vise à mieux maîtriser le sex-ratio en élevage, la femelle étant jugée plus intéressante pour sa croissance rapide.

Objectifs

L'objectif du projet est de mieux comprendre les bases génétiques du déterminisme du sexe chez le bar. En aquaculture, il est fréquent que le sex-ratio des bars soit très biaisé vers les mâles (70 à 90%) alors que la femelle est l'animal le plus souhaitable à élever de par sa croissance rapide et sa maturation plus tardive. Nous avons démontré précédemment que le sexe du bar avait une composante génétique mais aussi environnementale, la production de femelles nécessitant un élevage froid (

Bénéfices attendus

Il est attendu que le projet permette de révéler les spécificités génétiques du déterminisme du sexe dans les trois populations principales de bar, lors de leur exposition à un traitement thermique féminisant en écloserie. Ceci devrait permettre de mieux comprendre la variabilité qui persiste lorsque ces traitements sont faits, et permettre aux éleveurs et sélectionneurs de bar de mieux maîtriser à terme le sex-ratio dans les populations d'élevage. Par ailleurs, en comparant ces données à celles d'un autre projet, conduit en parallèle sur des profils de température "naturels", nous pourrons aussi approcher le mécanisme de la domestication du bar sur le critère essentiel qu'est le déterminisme du sexe.

Procédures

Les animaux seront soumis à un marquage par puce RFID, à une biopsie de nageoire pour prélèvement d'ADN et à 3 mesures individuelles de croissance à 5, 8 et 12 mois. Ceci concernera les 1500 animaux utilisés dans la procédure

Impact sur les animaux

Les nuisances et les effets indésirables devraient être très limités, toutes les procédures sont d'une sévérité légère et sont maîtrisées par notre équipe sur cette espèce. Les conditions d'élevage en captivité ont été optimisées pour cette espèce.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure 1. Ceci est nécessaire pour pouvoir procéder au sexage des animaux (sujet de l'étude), le bar n'ayant pas de caractères sexuels secondaires externes

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer l’espèce Dicentrarchus labrax pour ces recherches qui impliquent l'étude du déterminisme du sexe d’une espèce de poisson d’importance halieutique et piscicole, dont le système de détermination du sexe (polygénique avec influences environnementales) est assez unique.

Réduction

Pour l’approche génomique et l’analyse génétique de l’héritabilité nécessitent de travailler sur un nombre relativement important d’individus pour des questions de méthodologie statistique appliquée à ces disciplines. Typiquement, un nombre de 500 poissons par population et par condition environnementale est le minimum avec un caractère d'héritabilité de l'ordre de 0.5 (cas du sexe chez le bar) pour avoir une précision suffisante des estimations d’héritabilité et de différences entre populations. Dans notre cas, nous avons 3 populations et une condition, soit un nombre recommandé de 1500.

Raffinement

Pendant le marquage et les biométries lors des mesures de croissance, nous utiliserons une procédure d'anesthésie optimisée pour cette espèce: pré-anesthésie dans les bassins (15 mg/l de benzocaïne) pour calmer les poissons et permettre un pêche non stressante, puis anesthésie plus profonde (45mg/l de benzocaïne) pour toute les manipulations hors de l'eau (qui dureront moins d'une minute pour chaque poisson)

Choix des espèces

Dicentrarchus labrax (bar en Atlantique, loup en Méditerranée) est une espèce de poisson marin côtier, importante pour la pêche et la pisciculture. Comprendre les bases génomiques de son déterminisme du sexe, permettra de mieux contrôler le sexe dans les populations d'élevage, et de comprendre l'effet de la domestication sur le sexe de cette espèce présentant un déterminisme complexe et très particulier. Les animaux seront étudiés du stade juvénile à l'âge de 1 an, où l'observation visuelle des gonades sur poissons mis à mort permet un sexage sans erreur