Procédures légères

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque paire de souris reçoit deux injections d'antigène dans la patte, à douze jours d'intervalle, puis est tuée par dislocation cervicale deux jours plus tard pour prélever les ganglions poplités et en extraire les lymphocytes. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement n'existe pour obtenir des anticorps monoclonaux de souris et que les méthodes de prédiction informatique ne sont pas prouvées pour des antigènes complexes. Il retient la souris plutôt que le rat ou le lapin au motif d'un coût plus faible.

Objectifs

Le but des travaux est d’obtenir des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre des protéines virales de polyomavirus et coronavirus. Ces travaux permettent d’obtenir des réactifs immunologiques indispensables à l’étude de ces virus et potentiellement de développer des immunothérapie. Après une semaine d’acclimatation, les souris (2 souris/ antigène) seront immunisées par voie intrapodale avec 50μl/patte de solution contenant 5 μg d’antigène et 2 μg de QuilA (adjuvant de l'immunité permettant de renforcer l'immunogénicité des protéines injectées). Après 12 jours, une seconde injection avec la meme posologie et voie d'administration sera réalisée. Les souris seront mises à mort 2 jours après la seconde injection et les ganglions poplités seront récupérés afin d’en extraire les lymphocytes. Les souris seront utilisées par paires en fonction des besoins, une paire de souris permettant de réaliser des anticorps monoclonaux pour un antigène. Ainsi, nous prevoyons un total de 40 souris pour 20 antigènes sur la periode de validité de la saisine (5 ans).

Bénéfices attendus

Le projet vise à produire des anticorps monoclonaux dans le but d'avoir des réactifs immunologiques indispensables à l’étude de ces virus. De plus, dans le cas ou ces anticorps sont neutralisants, ils pourront par la suite servir au développement de nouvelles immunothérapies dans des pathologies liées aux Polyomavirus et aux coronavirus.

Procédures

Après une semaine d'acclimatation, les souris seront immunisées par voie intrapodale avec 50μl/patte de solution comportant 5 μg d’antigène et 2 μg de QuilA (Adjuvant de l'immunité permettant de renforcer l'immunogénicité des protéines injectées) Cette intervention dure environ 1 minute. Après 12 jours, une seconde injection avec la meme posologie et voie d'administration et la même durée d'intervention sera réalisée. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale 2 jours après la seconde injection (duré d'intervention inférieur à 1 minute) et les ganglions poplités seront récupérés afin d’en extraire les lymphocytes.

Impact sur les animaux

La seule douleur qui sera ressentie sera celle des inoculations par voie intrapodale (aiguilles 26G). L’adjuvant utilisé n’induit qu’une inflammation légère et le volume injecté n'est que de 50 μl/patte. Au vu de la durée de l'expérimentation et de sa nature, génération d'une réponse immunitaire, les animaux n'ont aucune raison rationnelle de developper un syndrome algique suite à l'injection, il n'existe donc pas de point limite strict liée à l'immunisation . Néanmoins, toute dégradation de l’état de santé des animaux (prostration, pelage hérissé) conduira à leur euthanasie au CO2.

Devenir

Les 40 souris (2/antigène) à J14 seront euthanasiées par dislocation cervicale et prélèvement des ganglions poplités.

Remplacement

Aucune méthode de remplacement n’existe pour l’obtention d’anticorps monoclonaux de souris, l’induction d’une réponse immunitaire in vivo est nécessaire pour l’obtention de ces réactifs. Les methodes informatiques par prédiction n'ont pas encore fait l'objet de preuve de concept pour des antigènes complexes comme des particules virales.

Réduction

Le nombre de souris utilisé (N=2/ antigène) est le nombre minimum de souris requis pour l’obtention d’anticorps monoclonaux, nombre suffisant de lymphocytes.

Raffinement

Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement physique des cages d'hébergement systématique (abris en plastique rouge transparent et papier absorbant) ainsi qu'un enrichissement social (2/cage)

Choix des espèces

La souris est actuellement l’espèce de référence pour la génération d’anticorps monoclonaux. Les autres espèces utilisables, rat et lapin, sont d’un coût plus élevé. 7 semaines (incluant semaine d’acclimatation. Stade physiologique : croissance

20 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dix-neuf étant tués à l'issue et un réutilisé. Chaque lapin reçoit un produit immunogène pour lui faire produire des anticorps, subit des prélèvements sanguins répétés pendant trois à dix semaines, puis une prise de sang terminale sous anesthésie destinée à récolter le sérum. Le porteur revendique le lapin comme l'espèce de référence pour les anticorps polyclonaux et affirme que le recours à l'animal reste "indispensable" pour produire certains réactifs, faute d'alternative in vitro. Il justifie l'usage par le fait que ces réactifs servent ensuite à mettre au point des tests évitant d'autres recours in vivo.

Objectifs

La production de sérum polyclonal chez le lapin permet la production ou le renouvèlement de réactifs de laboratoire. Ceux-ci sont nécessaires pour la réalisation d’analyses dans le cadre d’études réglementaires. A l’heure actuelle il est impossible de les produire in vitro. Or ces réactifs sont indispensables pour développer des techniques analytiques fiables permettant de remplacer des tests in vivo.

Bénéfices attendus

Ces études permettent in fine d’obtenir des tests de laboratoires fiables.

Procédures

Le but de la procédure est d’administrer un produit immunogène au lapin qui va alors produire des anticorps dirigés contre le produit injecté. Les modalités d’administration sont fonction du produit étudié. Les lapins sont ensuite observés quotidiennement et un suivi clinique adapté est mis en place. Les paramètres mesurés lors de cette procédure sont de deux types : - Paramètres cliniques (liste non exhaustive) : examen clinique général - Paramètres biologiques (liste non exhaustive) : sérologie – immunologie Les prélèvements sanguins intermédiaires permettent le suivi de la réponse en anticorps au cours de l’immunisation pour ajuster le plan d’expérience de l’étude au besoin. La prise de sang terminale est réalisée sous anesthésie. La durée de cette procédure est comprise entre 3 et 10 semaines en fonction du produit administré et de la réponse immune induite.

Impact sur les animaux

Les dommages engendrés par la procédure peuvent être le stress et l’inconfort liés à l’administration de l’antigène, aux prélèvements, et réactions locales de courte durée pouvant survenir au point d’injection. Si l’opérateur le juge nécessaire, une anesthésie/analgésie ou d’autres mesures (dont adaptation de la vitesse d’injection du produit) peuvent être envisagées pour limiter les contraintes de l’animal. Les actes techniques sont réalisés par des opérateurs hautement qualifiés qui assurent une approche et une contention adaptées pour que le geste sur l’animal soit le moins douloureux et traumatisant pour ce dernier.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin d’étude pour la production de sérum. Dans des cas exceptionnels, les animaux peuvent être euthanasiés pendant l’étude lorsqu’un point limite est atteint.

Remplacement

Un recueil d’information, lorsqu’il est disponible, est apporté par la bibliographie pour rechercher des alternatives à l’utilisation animale. Néanmoins, le recours à l’animal est à l’heure actuelle indispensable pour la production de certains réactifs. De plus, certains tests analytiques à partir des réactifs produits sur lapins permettent de ne pas avoir recours à des tests in vivo.

Réduction

Les effectifs sont évalués au plus juste (anticipation des projets de Recherche et Développement et définition des besoins de laboratoires) de façon à limiter le nombre d’études.

Raffinement

Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Une anesthésie et analgésie de l’animal peuvent être envisagées lors de certains actes (administration de l’antigène, prélèvements). Une attention particulière est apportée au choix de l’adjuvant. Ce choix est basé sur une revue bibliographique et/ou les informations fournies par le fabricant afin de sélectionner un produit ne générant pas de réaction inflammatoire disproportionnée chez le lapin. Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les animaux sont hébergés en groupe et des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie des animaux.

Choix des espèces

Dans la littérature, il s’agit de l’espèce de référence pour la production d’anticorps polyclonaux, répondant à une large variété d’antigènes et utilisée pour un grand nombre de sérums utilisés en laboratoire. Le lapin permet d’obtenir dans un délai très court une grande variété d’antigènes et d’épitopes. Outre les éléments qualitatifs mentionnés, le choix du lapin permet généralement de récolter des volumes de sérums répondant aux attentes de constitution de lots de réactifs, avec un nombre limité d’animaux. Les lapins utilisés ont entre 3 et 5 mois. A cet âge les lapins sont sevrés et ont atteint un poids qui permet de récolter une plus grande quantité de sérum.

96 rats vont être utilisés, tués au sevrage vers le vingt-et-unième jour, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les ratons sont nourris à la pipette chaque jour de leur quatrième au vingt-et-unième jour de vie, puis reçoivent un gavage intragastrique de marqueurs suivi d'un prélèvement de sang à la queue. Le porteur reconnaît que le gavage peut induire de rares fausses routes et que la prise de sang provoque une douleur qu'il qualifie de légère. Il affirme que seul un modèle animal rend compte de la complexité des fonctions en jeu, les retombées visant les formulations infantiles.

Objectifs

Les gangliosides sont des composants majeurs des membranes plasmiques, notamment des cellules intestinales, dont la composition varie au cours du développement. Ils régulent leurs propriétés et divers évènements de signalisation. En particulier, ils servent de récepteurs aux virus, bactéries et toxines et sont ainsi impliqués dans la mise en place de l’immunité intestinale chez le jeune. Très peu de données concernent leur rôle dans la fonction absorptive. Seul un travail ex vivo semble indiquer que les gangliosides favoriseraient l’absorption intestinale des lipides (Birecki, 2006). Les gangliosides sont naturellement présents dans l’alimentation, en particulier le lait maternel dont les composants bioactifs sont connus pour influencer la maturation intestinale et la mise en place de la fonction absorptive. Parmi les nutriments dont l’absorption intestinale est particulièrement critique en période post-natale figurent les acides gras polyinsaturés oméga-3. La rétine est un tissu particulièrement sensible aux apports alimentaires en période périnatale, notamment en oméga-3 qui sont fondamentaux pour le bon développement des fonctions visuelles. Chez l’enfant, des études cliniques ont montré que la consommation de formulations infantiles pauvres en acide linoléique et dépourvues en acide docosahexanoique (DHA) du fait de l’origine végétale des lipides, conduisait à une baisse d’environ 40% des taux de DHA dans le système nerveux et les globules rouges associée à une baisse significative de l’acuité visuelle et un retard de maturation des photorécepteurs (cellules rétiniennes en charge de la conversion du signal lumineux en signal nerveux) et une baisse significative de l’acuité visuelle ont été montrés, en comparaison des nouveau-nés allaités. Nous formulons l’hypothèse que les gangliosides apportés en période postnatale pourraient jouer un rôle dans la maturation intestinale et moduler l’absorption lipidique, notamment des oméga-3, favorisant ainsi leur incorporation dans la rétine. L’objectif de ce projet est de déterminer l’impact des apports postnataux en gangliosides sur les capacités d’absorption intestinale des oméga-3 et les conséquences sur leur incorporation dans la rétine.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront de vérifier les impacts positifs potentiels des apports postnataux en gangliosides sur les capacités de la muqueuse intestinale à absorber efficacement les oméga-3, ainsi que sur l’incorporation rétinienne des oméga-3, connus pour leurs bénéfices dans ce tissu en période de développement. De plus, mâles et femelles seront étudiés de façon à documenter un éventuel effet du sexe. Ainsi, ce projet devrait permettre de soutenir l’importance des apports en gangliosides dans le développement post-natal et le fait que les gangliosides font partie des composants bioactifs du lait maternel à considérer dans les questions de nutrition infantile. Il pourrait ouvrir la voie à des travaux visant une prise en compte des gangliosides dans les formulations infantiles et des recommandations nutritionnelles destinées aux femmes enceintes et allaitantes, à l’instar de ce qui s’est mis en place auparavant pour les oméga-3.

Procédures

Les animaux seront "biberonnées" un fois par jour entre J4 et J21, à l'aide d'une pipette souple par des solutions nutritionnelles (volumes adaptés à leur âge). Un gavage intra-gastrique de marqueurs de perméabilité intestinale suivi par un prélèvement de sang à la queue (quelques gouttes, environ 60 uL) sont prévus une seule fois dans la vie des ratons (J19/J20).

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales de ce projet sont de classe légère. Des nuisances peuvent être attendues lors du gavage intra-gastrique de la solution permettant la mesure de la perméabilité intetsinale ion vivo ainsi qu'au moment du prélèvement d'une goutte de sang à la queue pour les dosages. Le gavage intra-gastrique peut induire des fausses routes mais c'est extrêmement rare chez les ratons de 20 jours et lorsque réalisé par du personnel compétent. Le prévèlement de sang à la queue peut induire une douleur qui reste légère car la zone est peu innervée.

Devenir

Les aniamaux sont gardés en vie à l'issu de chaque procédure et seront mis à mort à l'âge du sevrage à J21/22.

Remplacement

L’objectif de cette expérimentation est d’évaluer les effets d’une supplémentation nutritionnelle post-natale sur l’accrétion lipidique de la rétine. Seul un modèle animal permet de rendre compte de la complexité des différents fonctions physiologiques qui interviennent (digestion, absorption intestinale, distribution et incorporations tissulaires). L’expérimentation animale ne peut donc pas être remplacée.

Réduction

Le nombre d’animaux a été estimé à 10 par groupe sur la base d’un calcul d’effectif à partir de données bibliographiques permettant d’estimer l’effet attendu (sur l’accrétion en oméga-3 dans la rétine mais également sur les voies mécanistiques explorées telles que la perméabilité intestinale et la mesure d’expression de transporteurs lipidiques), pour une puissance de test statistique de 90% et un risque d’erreur de 5%. Toutes les analyses seront réalisées à partir d’un seul animal. L’utilisation des mâles et des femelles dans les groupes expérimentaux valorise au maximum les animaux obtenus à la mise bas.

Raffinement

L’environnement des mères gestantes et allaitantes sera enrichi (matériau cellulosique pour le nid, tunnel, bâton à ronger). Les procédures prévues relèvent toutes de la classe de sévérité « légère » : biberonnage selon réflexe de tétée des nouveau-nés, administration orale de marqueurs de perméabilité intestinale. Les animaux seront suivis par un personnel compétent dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale. Les protocoles ne devraient pas entraîner de souffrance pour les animaux, cependant ils feront l’objet d’une visite quotidienne, y compris le week-end. Les points limites clairement définis conduiront à la mise à mort des animaux le cas échéant.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée dans notre laboratoire et bien adaptée à nos recherches. La taille des ratons facilite la manipulation et le biberonnage. Cette espèce, en particulier la souche choisie, possède également des qualités maternelles qui participeront de la réussite de l’expérimentation. La taille des organes d’intérêts des ratons au sevrage fournira un matériel suffisant pour réaliser nos analyses. Les mères seront commandées gestantes auprès du fournisseur (J1 de gestation) et 10 d’entre elles seront gardées pendant toute la période de lactation. Les petits seront utilisés de la naissance au sevrage (J21) puisque l’expérimentation vise à déterminer les effets de la supplémentation post-natale pendant la durée de la lactation.

1 020 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des souris génétiquement modifiées reçoivent une ou deux injections péritonéales d'un agent immunisant, puis sont anesthésiées pour un prélèvement de sang intracardiaque terminal avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur décrit un stress bref lié à l'injection et affirme que le modèle de culture cellulaire utilisé auparavant n'imite que partiellement ce qui se déroule dans l'organisme vivant. Il présente cette recherche fondamentale comme une étape "indispensable" à la compréhension des immunodéficiences et des cancers.

Objectifs

Notre laboratoire s’intéresse aux lymphomes, des maladies qui se développent à partir des lymphocytes B : cellules du sang qui ont perdu leur capacité à devenir des cellules appelées plasmocytes et dont le rôle est de protéger l’organisme contre les infections par des agents extérieurs. Leur incidence est en constante augmentation et ces maladies restent incurables en dépit de nouvelles thérapeutiques. Notre projet de recherche vise à identifier les étapes critiques et les molécules clefs qui régissent le destin (la différenciation) du lymphocyte B jusqu’au plasmocyte et qui pourraient contribuer au développement ou au maintien de ces lymphomes. Les travaux du laboratoire ont démontré l’importance de molécules, l’interleukine 2 (IL-2) et l’IL-15, dans ce processus par des études menées hors de l’organisme (in vitro). Cependant cela ne permet pas de déterminer quand et comment ces molécules agissent au sein des organes lymphoïdes secondaire où se déroule la différenciation des lymphocytes B. A l’heure actuelle il n’existe pas d’étude menée chez l’animal démontrant leur rôle dans la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes. Notre objectif est d’étudier le rôle de l'IL-2 et l'IL-15 chez des souris modifiées dans lesquelles les lymphocytes B sont insensibles à ces molécules (souris déficientes pour le gène Il2rb). Pour cela nous immuniserons au maximum 1020 souris selon différents protocoles. Cela consiste à introduire dans l’organisme un agent (petites molécule, bactéries) dépourvues de pathogénicité (incapable de rendre malade) mais capable d’induire une réponse immunitaire en induisant la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes capables de produire des anticorps qui reconnaissent et neutralisent l’agent étranger. Cela nous permettra d’évaluer le rôle de l’IL-2 et IL-15 dans la différenciation des lymphocytes B.

Bénéfices attendus

Ce projet fera avancer les connaissances fondamentales sur la différenciation plasmocytaire normale, étape indispensable à la compréhension des mécanismes à l'origine d'immunodéficiences et de cancers.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1 ou maximum 2 injections peritonéales de l'agent immunisant, distantes de 28 jours. Le geste est réalisé par une personne experimentée, ce geste rapide et précis ne durera pas plus de 2 minutes. En fin d'étude, les animaux recevront un traitement analgésique et seront anesthesiés pour prélèvement de sang intra-cardiaque (5 minutes maximum) puis euthanasiés selon une méthode reglementaire.

Impact sur les animaux

Nous immuniserons les souris selon différents protocoles. Cela consiste à introduire dans l’organisme un agent (petites molécule, bactéries) dépourvues de pathogénicité (incapable de rendre malade) mais capable d’induire une réponse immunitaire en induisant la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes capables de produire des anticorps qui reconnaissent et neutralisent l’agent étranger. Ces procédures n’entraineront pas de stress, en dehors du stress bref et modéré lie a l'injection péritonéale, sans forte douleur pour les souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de prelever les organes et réaliser les analyses sur les différents tissus.

Remplacement

Lors de nos précédents travaux, nous avons utilisé un modèle de culture de cellules. Ce modèle nous a permis de comprendre plus finement la biologie du lymphocyte B au cours de son activation, puis de sa différenciation pour produire des anticorps. Malgré tout, ce modèle n’imite que partiellement ce qui se déroule au sein de l'organisme vivant lors d’une infection et il devient nécessaire pour nous d’étudier ce phénomène dans l'animal. La souris est un modèle de choix pour l'étude des réponses immunitaires. C'est pourquoi nous allons utiliser des animaux transgéniques nous permettant d’invalider de manière contrôlé dans le temps l’expression du récepteur à l’interleukine-2 et 15 et de suivre les réponses immunes suite aux immunisations.

Réduction

Dans l’intérêt de réduire le nombre d’animaux utilisé, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible, en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, ganglions, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Enfin les protocoles d'immunisations seront réalisés successivement afin de définir les meilleures conditions expérimentales pour notre étude et uniquement si les résultats obtenus justifient de réaliser un autre type d'immunisation. Pour chaque étude, des groupes de 8 animaux par genotype (sauvage ou muté) nous permettra d'obtenir des statistiques fiables et publiables. Les statistiques seront réalisés à l'aide de tests non paramétriques, le test de Mann et Whitney sera appliqué pour deux échantillons et celui de Kruskal et Wallis pour un nombre quelconque d'échantillons.

Raffinement

Toutes les lignées de souris déjà existantes n'induisent pas de phenotype douloureux. La littérature décrit les protocoles d’immunisation spécifiques aux agents immunogènes qui seront appliqués dans cette étude. Les animaux seront surveillés après immunisation pour détecter l'apparition d'une éventuelle douleur et l'inconfort provoqué sera soulagé. De plus les animaux sont élevés dans des conditions adaptées: locaux confinés, portoirs ventilés, eau et nourriture ad libitum, maximum 5 animaux/cage et aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage.

Choix des espèces

Le modèle animal murin est très utilisé en immunologie. Des protocoles d’immunisation standardisés et des protocoles d’analyses éprouvés sont disponibles. La possibilité d'invalider des gènes spécifiquement dans un type cellulaire et de manière temporelle est importante pour évaluer finement les évènements et les mécanismes impliqués. Les souris avec un potentiel conditionnel pour le gène IL2rb ont été générées. Elles ont été croisées en retour avec la lignée C57BL/6N sur 8 générations. Enfin le croisement avec la lignée CD19-Cre a permis d’inactiver la signalisation IL-2 et IL-15 spécifiquement dans les lymphocytes B. L’acquisition des cellules effectrices étant optimale à l’âge adulte, l’ensemble des études sera effectué sur des animaux adultes (8-12 semaines).

1 870 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la souffrance est déclarée légère. Une toxine est injectée dans un muscle de la patte après incision de la peau refermée par une agrafe, puis la faiblesse musculaire est évaluée en soulevant l'animal éveillé pour observer l'écartement des doigts, sur plusieurs semaines. L'objet est de tester des toxines botuliques destinées au traitement de la spasticité. Le porteur indique que l'injection peut entraîner une perte de poids suivie comme point limite, et affirme que l'efficacité ne peut à ce stade être évaluée que sur l'animal vigile.

Objectifs

Chez l’homme, la toxine botulique est utilisée dans le traitement des maladies neurologiques caractérisées par une contraction exagérée d’un muscle entraînant des troubles des mouvements et/ou de posture qui peuvent être chroniques et douloureux (spasticité des membres, torticolis, le pied bot équin, contractions de la mâchoire, contraction des paupières entraînant la fermeture répétitive et incontrôlée des paupières…). Le traitement consiste en l'injection de petites quantités de toxine botulique dans les muscles atteints empêchant la stimulation du muscle par le nerf associé. La toxine botulique induit alors une faiblesse des muscles hyperactifs injectés. Ce traitement est efficace mais n’agit qu’après quelques jours et doit être renouvelé après plusieurs mois. Des recherches sont donc faites pour améliorer la puissance, la rapidité et la durée d’action des toxines. L’activité des toxines est testée selon un processus qui débute par une évaluation in vitro (mesure de l’activité de la toxine sur sa cible) puis sur des cultures de différents types cellulaires et ensuite différents types de muscles isolés de rongeurs. Le recours aux animaux n’est fait que si les toxines ainsi testées répondent aux critères recherchés. Elles seront alors testées sur le rat. Ce projet a pour objectif d’étudier l’effet de toxines sur la fonction musculaire spontanée de la patte en utilisant une méthode largement décrite et utilisée.

Bénéfices attendus

La toxine botulique est efficace dans le traitement de la spasticité mais nécessite des injections régulières. L'amélioration des caractéristiques (puissance, rapidité d'action et durée d'action) des toxines à des fins thérapeutiques permettra une meilleure efficacité.

Procédures

Tout d’abord, le composé ou son solvant est injecté dans un muscle de la patte arrière gauche du rat anesthésié. Cette injection est faite après une petite incision de la peau ceci afin de bien identifier le muscle d’intérêt. L’incision est refermée par une agrafe et suivie lors de la surveillance quotidienne de l’état de santé des animaux. La faiblesse musculaire spontanée de la patte injectée est ensuite évaluée par simple observation et quantification de l’écartement reflexe des doigts lorsque l’animal éveillé est soulevé (score) 1 fois par jour pendant 5 jours puis éventuellement prolongé 3 fois par semaine pendant maximum 6 semaines. Un suivi pondéral quotidien est réalisé.

Impact sur les animaux

L'injection des toxines peut entrainer, à certaines doses, une perte de poids des animaux : un suivi pondéral journalier est mis en place pour suivre ce point limite.

Devenir

L'effet des toxines sur l'animal n'étant pas prévisible, il n'est pas envisageable de réutiliser les animaux à la fin de la procédure. Tous seront mis à mort.

Remplacement

Nos activités s’inscrivent dans le respect de la règle des « 3R » pour l’expérimentation animale. Si des méthodes alternatives existent lors des phases précoces de développement d’une toxine (une évaluation in vitro puis sur cultures cellulaires et ensuite sur muscles isolés de rongeurs), l’avancement de la caractérisation de la molécule d’intérêt ne permet pas à l’heure actuelle de remplacer l’étude de son efficacité chez l’animal vigile.

Réduction

Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisés est Réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes.

Raffinement

Notre activité permet néanmoins de Raffiner les conditions d’utilisation des animaux en les hébergeant conformément à la réglementation dans des salles à atmosphère contrôlée (température : 22 ± 2°C) sous un cycle jour/nuit de 12 heures (lumière de 06:30 à 18:30) avec eau et nourriture (Rat/Souris Entretien A04 Safe, Epinay/Orge, France) ad libitum. Un enrichissement du milieu (briquettes à ronger et tunnel) est apporté aux animaux. Les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour à partir de l’injection de toxine et un suivi pondéral journalier sera mis en place.

Choix des espèces

L’utilisation du rat se justifie par la taille et la réponse de l’animal qui permet une évaluation de l’effet de la toxine ainsi qu’une injection précise dans le muscle péroneus. Le modèle décrit dans ce projet est largement utilisé chez le rat pour lequel le matériel est adapté et des résultats de référence disponibles. Des rats adultes de poids 170-190g le jour de l’injection de toxine sont utilisés. A ce stade les animaux permettent: * Une manipulation facile * Leur taille est bien adaptée aux matériels utilisés * L’évolution de leur prise de poids facile à suivre L’utilisation d’une gamme de poids restreinte contribue à réduire la variabilité des résultats et ainsi le nombre d’animaux utilisé. Cette gamme de poids est utilisée dans l’article référence pour ce test.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Souris transgéniques et souriceaux reçoivent des injections répétées, dans le péritoine sur animal vigile et dans les muscles des pattes sous anesthésie, en vue d'une transplantation de cellules souches musculaires, puis sont mis à mort pour analyse des muscles. Le projet étudie où s'exprime la dystrophine, protéine absente dans la myopathie de Duchenne. Le porteur affirme que ses souris transgéniques sont "indispensables", les hypothèses ne pouvant selon lui être testées que par ces transplantations in vivo.

Objectifs

La dystrophine est indispensable pour maintien de l’architecture de la fibre musculaire. Elle est exprimée sous la membane de la fibre, le sarcolemme, où elle joue le rôle de relier le cytosquelette avec la matrice extracellulaire, permettant ainsi la contraction d’avoir lieu sans endommager la fibre. L’absence de protéine dystrophine est à l’origine de la myopathie musculaire de Duchenne. Il a été montré récemment que la dystrophine peut aussi être exprimée par les cellules souches musculaires, dénomées cellules satellites (CS), lorsque celles-ci sont activées. Il est également pensé que l’absence de dystrophine dans les CS contribue au phénotype dystrophique de la myopathie. Nous avons généré des souris transgéniques DmdEGFP (Dmd) qui permettent de suivre l’expression de la dystrophine-EGFP, ainsi que des souris DmdGT qui permettent aussi de suivre les CS (exprimant Pax7) par l'expression du fluorophore tdTomato induite par le tamoxifène. Nous avons des données sur des expériences menées ex vivo qui montrent que le site d’expression de la dystrophine pourrait ne pas être dans la CS mais en réalité dans l’espace sous la membrane de la fibre adjacente à la CS. Nous pensons que l’expression de la dystrophine aurait un rôle sur l’établissement de la niche des CS. Le but de ce projet est de déterminer où la dystrophine-EGFP est accumulée lorsque la cellule est activée : dans la niche de la CS, la CS, ou les deux. Comme il est impossible de déterminer cela avec de la microscopie la résolution ne permettant pas de discriminer entre la membrane de la fibre et de la CS, nous voulons résoudre cette question fondamentale en effectuant des expériences de transplantation de cellules souches exprimant tdTomato avec ou sans dystrophine-EGFP dans le muscle de souris sans ou avec la dystrophine-EGFP, afin de créer un muscle « chimérique » et pouvoir distinguer si la dystrophine-EGFP est exprimée dans la fibre ou la CS.

Bénéfices attendus

A terme, ces résultats amélioreraient la compréhension de l’expression de la dystrophine manquante aux patients atteints de DMD et permettraient d’améliorer ou prédire les effets des thérapies pour cette maladie. En effet, ce projet pourrait permettre d’affirmer (ou infirmer) que les cellules souches musculaires sont un site cible pour la restauration de la dystrophine dans le contexte pathologique.

Procédures

Les injections intrapéritonéales seront effectuées sur tous les souriceaux donateurs de CS, avec 3 injections journalières sur animal vigile. Les injections intrapéritonéales seront effectuées sur tous les souris donateurs de CS adultes, uniquement lorsque la diète d’une semaine au tamoxifène (dans les croquettes) est indisponible (délais de fabrication et de livraison des croquettes sont de 3 mois, hors problèmes liés à la pandémie). Chez les adultes, l’injection se fait également sur animal vigile, pendant 5 jours consécutifs. Pour les injections péritonéales l’intervention est très brève, autour d’une minute par animal. Les injections intramusculaires chez les souris adultes receveuses de CS, sont effectuées une seule fois, sur les deux pattes au même temps, sur animal anesthésié à l’isoflurane et après rasage et désinfection des pattes. Cette intervention dure autour de 30 minutes par animal entre l’anesthésie et le réveil. Les injections intramusculaires chez les souriceaux sont également effectuées une seule fois sur les deux pattes au même temps mais sur animal vigile. Dans ce cas l’injection est brève et peut être réalisée sur une-deux minutes par souriceau.

Impact sur les animaux

La durée de l’expérimentation n’étant pas très longue avec la durée maximale de sacrifice à 5 jours post-transplantation intra-musculaire, il y a peu de risques d’induire une réaction auto-immune due à l’apport d’éléments du non-soi (EGFP et tdTomato). Cependant les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la présence de plaies au site d’injection seront évalués post-injection jusqu’au sacrifice. Les animaux montrant un signe quelconque de détérioration de santé seront sacrifiés immédiatement et pourront être analysé même dans ce cas- là.

Devenir

Tous les animaux sont sacrifiés. Tous les animaux donneurs ayant eut un traitement au tamoxifène sont sacrifiés pour isoler leurs cellules souches. Les animaux transplantés sont sacrifiés pour analyse des muscles ayant reçu la greffe de cellules.

Remplacement

Comme décrit dans les objectifs du projet, nous avons effectué un certain nombre d’expériences ex vivo au préalable de ce projet qui nous ont mené vers nos hypothèses actuelles qui ne peuvent être adressées que par ces expériences de transplantation cellulaire.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris utilisées, les deux sexes seront utilisés en fonction des génotypes disponibles, et les deux muscles TA de chaque souris seront injectés (soit au final n=20 par sous-groupe), réduisant ainsi le nombre des souris utilisé de moitié. Le résultat est purement visuel (présence ou absence de dystrophine-EGFP dans les CS ou dans les fibres visualisées par microscopie à fluorescence) mais le phénomène sera difficilement observable, c’est pourquoi il faut prévoir suffisamment d'animaux, afin de pouvoir isoler un nombre suffisant de fibres musculaires qui permettrait de voir l'effet attendu lors d'une transplantation réussie. En prenant en compte les difficultés expérimentales à cause de différents facteurs limitants : injection d’un nombre de cellules insuffisant, ou l’isolement post-sacrifice des fibres pouvant ne pas fonctionner de manière satisfaisante à chaque manipulation, chaque sous-groupe sera constitué de 10 souris pour obtenir des résultats reproductibles.

Raffinement

Le muscle receveur des cellules transplantées tibialis anterior (TA) a été choisi car il est facilement accessible pour l’injection intramusculaire et facile à prélever. Les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la perte de poids, des plaies au site d’injection, une croissance excessive des dents seront évalués quotidiennement. Les animaux montrant un signe quelconque de détérioration de santé seront sacrifiés immédiatement. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères et l'isolement est évité au maximum. De plus, il y a un enrichissement de la litière dans leur cages avec du matériel pour leur nid.

Choix des espèces

Pour l’étude fondamentale de l’expression de la dystrophine dans la niche des cellules souches musculaires, manquante aux patients, nous avons effectué des études ex vivo sur fibres musculaires isolées avec leurs cellules souches attachées. Cependant afin de d’adresser nos hypothèses nous devons effectuer des expériences in vivo. Le modèle animal, et particulièrement nos souris transgéniques, est indispensable pour atteindre les finalités de ce projet. Les souris receveuses seront soit des souris adultes, soit des souriceaux de 3 à 14 jours. Les raisons d’utiliser ces deux stades sont : d’une part pour comparer si l’expression de la dystrophine dans les deux stades est la même, et d’autre part car chez les souris le muscle est en forte croissance postnatale pendant les premières 2-3 semaines de vie. Cette croissance postnatale est accompagnée d’une forte activité des cellules souches, qui sont majoritairement dans un état quiescent après 3 semaines d’âge, ainsi qu’une immaturité du muscle avec peu de tissu conjonctif, rendant potentiellement la transplantation plus efficace à ce stade. Les souris donneuses de CS seront soit adultes soit juvéniles (

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Elles reçoivent une puce sous-cutanée sous anesthésie puis passent une série de tests comportementaux, le Live Mouse Tracker sur trois jours et trois nuits, un labyrinthe en Y et un test de reconnaissance sociale, avant d'être euthanasiées par dislocation cervicale pour prélèvement des cerveaux. Le projet cherche à cerner le rôle d'un gène dans l'autisme au moyen de trois lignées mutantes. Sur le remplacement, le porteur affirme que le modèle animal reste "indispensable" et "nécessaire" pour observer l'effet du gène à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

L’autisme est un trouble neuro-développemental, dont les premiers signes sont perceptibles avant l’âge de 3 ans. Ces symptômes sont dus à un dysfonctionnement cérébral. Les personnes autistes perçoivent ainsi le monde d’une façon différente. Le TSA (Trouble du spectre de l’autisme) affecte le développement de l’enfant dans la communication, les interactions sociales et le comportement. De plus, une déficience intellectuelle (DI) peut être associée à l’autisme, avec un impact sur les capacités intellectuelles d’une manière plus ou moins importante. La déficience intellectuelle s’observe à travers des difficultés de raisonnement, d’apprentissage, d’attention, de mémorisation ou de résolutions de problèmes. Plus de 1300 gènes ont été décrits ayant une implication dans les déficiences intellectuelles et/ou le TSA, et jusqu'à présent, les études fonctionnelles ont été limitées à quelques anomalies génétiques unique. Des mutations dans notre gène d’intérêt sont identifiées chez des individus mâles présentant des TSA et une récente étude montre que 23 patients avec des mutations de ce gène présentaient un retard de développement global léger à modéré et des degrés variables de déficience intellectuelle. L’objectif de notre projet est l’étude de la contribution spécifique de notre gène dans les troubles autistiques. Pour ce faire, nous utiliserons 3 modèles de souris mutantes de ce gène (3 mutations différentes) qui nous permettront de déterminer la fonction du gène en étudiant le comportemental social des souris et améliorer la compréhension de la maladie et permettre la découverte de nouvelles thérapies. Nous utiliserons le protocole Live Mouse tracker qui permet de mesurer le comportement social individuel d’animaux en groupe par détection vidéo. Nous analyserons aussi les cerveaux par imagerie IRM.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à comprendre comment les mutations de notre gène d’intérêt conduisent à des déficits dans les neurones causant la déficience intellectuelle et l’autisme. La caractérisation comportementale et anatomique des souris mutantes sera essentielle pour comprendre l'implication de ce gène dans l'autisme.

Procédures

Tous les animaux vont être soumis à l’ensemble des protocoles suivants selon l’âge: *14 semaines : implantation sous cutanée de puce pour identification de taille 2x12mm sous anesthésie générale. Durée : moins d’une minute *16 semaines : Live mouse tracker, permet de mesurer le comportement individuel d’animaux en groupe par détection vidéo. Durée : 3 jours et 3 nuits. *17 semaines : test du labyrinthe en Y, les souris explorent librement pendant 5 minutes. *18 semaines : test de reconnaissance sociale qui évalue la préférence d’une souris pour un congénère par rapport à un objet placé dans un compartiment opposé. Le test est effectué pendant 2 jours consécutifs. La durée est de 10min le premier jour et 20min le 2eme jour

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont liées aux procédures expérimentales qui seront appliquées aux souris à savoir l'implantation des puces RFID pour le test du LIve Mouse Tracker

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale pour collecte des cerveaux et analyse moléculaire.

Remplacement

Une partie de l’étude de caractérisation du gène ne nécessite pas l’utilisation d’animaux vivants et est étudié in vitro sur des lignées cellulaires modifiées génétiquement. Cependant, le modèle animal reste indispensable et nécessaire pour identifier l’effet de la modification du gène à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre du déficit intellectuel ; le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information.

Réduction

24 animaux par lignée seront nécessaires à ce projet, soit 72 souris au total (3 lignées à étudier) . L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible, et en cherchant à atteindre une puissance statistique de 80%. Le test statistique utilisé sera student-test (comparaison des mutants Vs contrôles).

Raffinement

Nous réduirons au maximum les techniques douloureuses ou stressantes. Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique, et si cette douleur devait persister, les animaux seront euthanasiés pour éviter toute souffrance. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel. Une anesthésie générale sera appliquée lors de la procédure d'implantation des puces RFID.

Choix des espèces

La souris est l'animal de choix pour les études comportementales. Notre objectif est d'étudier l’importance des mutations de notre gène d'intérêt dans les troubles autistiques et dans le déficit cognitif. De plus, aucun modèle d’expérimentation in vitro ne peut mimer ou refléter toute la complexité des phénomènes comportementaux. Les animaux seront âgés de 14 semaines environ au début des tests comportementaux, afin d'étudier des animaux adultes.