Procédures légères

80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Ils sont soumis à un régime obésogène puis à un gavage quotidien pendant quatorze semaines, à des prélèvements de sang et à un test de tolérance au glucose, avant euthanasie par exsanguination pour prélèvement d'organes. Le porteur teste l'effet d'une supplémentation en vitamine D et oméga-3 sur les atteintes articulaires liées à l'obésité, avec des applications renvoyées à terme à l'humain, aux chiens et aux chats. Il affirme qu'aucune méthode in silico ou in vitro ne peut remplacer l'observation du développement des lésions.

Objectifs

L’obésité est une affection très répandue aussi bien chez l’Homme que chez les animaux de compagnie. Cette maladie correspond à un déséquilibre entre les apports et les dépenses énergétiques de l’individu et se caractérise par un excès de masse grasse corporelle et une altération de la qualité de vie conduisant à de nombreuses complications. Des altérations ostéo-articulaires résultent de la surcharge pondérale et de l’inflammation associées à cette obésité. La prise en charge des complications ostéo-articulaires, comme l’arthrose, passe souvent par l’utilisation de médicaments visant seulement à soulager les douleurs engendrées. Très peu de composés sont destinés à limiter la propagation des lésions, à l’exception de traitements chirurgicaux lourds et coûteux. Malgré une prévalence élevée de l’obésité, aussi bien chez les animaux de compagnie que chez l’Homme, et des nombreuses complications ostéo-articulaires qui en découlent, l’association d’un traitement à la vitamine D avec une supplémentation en acides gras Oméga-3 n’a jamais fait l’objet de travaux expérimentaux visant la prévention tertiaire des anomalies ostéo-articulaires liées à l’obésité. L’action préventive de la vitamine D et des acides gras Oméga-3 sera évaluée sur un modèle de rat Wistar soumis à un régime riche en gras. La vitamine D3 (cholécalciférol) sera incorporée dans l’alimentation (15 000 UI/kg). Les acides gras DHA et EPA seront administrés par voie orale (gavage). Ces traitements dureront 14 semaines et débuteront après une période de 14 semaines où ils seront soumis au régime seul. Tous les animaux seront hébergés dès leur réception dans l’animalerie Rongeurs du groupe II d’Oniris et subiront une période d’acclimatation de 7 jours avant le début des procédures. L’aliment et l’eau seront fournis ad libidum. Les rats seront âgés de 6-7 semaines au commencement de l’étude.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin de limiter et/ou prévenir les complications ostéo-articulaires associées à l’obésité chez le rat. À terme, l'étude pourrait déboucher sur de potentielles applications chez l'Homme ou chez les animaux de compagnie tels que les chiens et les chats. Ce projet pourrait également donner l'opportunité de mieux comprendre les mécanismes qui régissent la pathogenèse de l'arthrose. De plus, il pourrait mettre en lumière de nouveaux bénéfices de l'utilisation de la vitamine D et/ou des acides gras Oméga-3. Enfin, ces travaux pourraient permettre d'éclaircir le lien entre le microbiote et l'obésité ou les complications ostéo-articulaires et ainsi amener de nouveaux questionnements sur son rôle.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions. Un gavage (environ 30 secondes par rat) sera effectué quotidiennement pendant les 14 dernières semaines du protocole expérimental. Le prélèvement de sang (environ 20 minutes par rat), le catwalk (environ 30 minutes par rat), le prélèvement de fèces (environ 1h par rat) et le test de tolérance au glucose (1h30 par rat) seront effectués en début, milieu et fin de protocole (0, 14, 28 semaines). Les animaux seront également soumis à des prélèvements d'organes (après 28 semaines) après leur anesthésie par injection intra-péritonéale du mélange kétamine (60 mg/kg) / médétomidine (150 μg/kg) puis euthanasie par exsanguination au niveau de l'aorte abdominale. Ces interventions concernent les 64 animaux sur une durée totale de 28 semaines.

Impact sur les animaux

Aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu sur les animaux du groupe avec le régime contrôle. Les animaux soumis au régime HFD vont développer une obésité avec des complications métaboliques et ostéoarticulaires qui seront l'objet de l'étude. Les traitements mis en oeuvre ont comme objectif d'atténuer les complications générées par l'obésité.

Devenir

Tous les animaux des lots étudiés sont concernés par l’euthanasie. Cette dernière est pratiquée par exsanguination au niveau de l’aorte abdominale après anesthésie par injection intra-péritonéale du mélange kétamine (60 mg/kg) / médétomidine (150 μg/kg). L'euthanasie est justifiée par les prélèvements d'organes qui serviront aux analyses histologiques, biochimiques et moélculaires.

Remplacement

Le remplacement des animaux n’est pas possible pour répondre aux questions du présent projet en raison de l’absence de méthodes alternatives (in silico ou in vitro) pour explorer un développement naturel des lésions ostéo-articulaires liées à l’obésité et des potentiels effets bénéfiques du traitement.

Réduction

De manière à respecter la règle de réduction, le nombre d’animaux par groupe a été réduit au minimum permettant d’anticiper les différences interindividuelles. Le nombre de 10 rats par groupe est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats reproductibles et exploitables et réaliser une analyse descriptive. Le nombre d'animaux a été calculé sur BiostaTGV en prenant l'estimation de la variation du taux de leptine avec ou sans traitement (delta de 35 avec écart-type de 24 à 5% d'erreur de première espèce et 0,93 de puissance) et donne 10 animaux par groupe expérimental.

Raffinement

- Un hébergement qui respecte les recommandations en vigueur, une animalerie contrôlée (température, hygrométrie) et un enrichissement des cages (des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). - Manipulation douce régulière des animaux pour habituation à l'expérimentateur. - Un suivi régulier des animaux par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). - Définition des points limites et une grille de scoring de la souffrance et/ou de la douleur chez tous les animaux soumis aux différents traitements prévus dans le projet. - Optimisation des protocoles expérimentaux pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus.

Choix des espèces

L’obésité est une pathologie systémique caractérisée par des altérations multi-organiques et une inflammation de bas-grade qui peuvent déclencher des problèmes ostéo-articulaires comme étudié ici. La souche de rat Wistar est communément utilisée, selon la bibliographie, pour étudier les modifications métaboliques et ostéo-articulaires et répond très bien à l'utilisation d'un régime obésogène. L’utilisation de ce modèle permettra d’étudier la capacité de nos produits testés à prévenir le développement des problèmes ostéo-articulaires et son impact sur l'obésité. Les animaux sont utilisés à l’âge de 6-7 semaines.

4 401 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de souffrance légère. Elles reçoivent des injections de nanomédicaments par voie sanguine, orale ou nasale, avec suivi par imagerie ou prélèvement d'organes, pour étudier la distribution de ces particules dans l'organisme. Le porteur précise qu'aucun traitement antidouleur n'est prévu, afin de "ne pas altérer les résultats" de l'expérimentation. Il présente le recours aux animaux comme "indispensable", affirmant qu'il n'existe pas de système alternatif.

Objectifs

Il s’agit d’un projet visant à évaluer le comportement de nouveaux nanomédicaments enzymatiques dans l’organisme (localisation et élimination). Les enzymes sont des molécules actives qui permettent la conversion de substances en d’autres afin d’éviter l’accumulation de substances toxiques ou de permettre la production de molécules essentielles. Malgré les bénéfices apportés par les médicaments enzymatiques, l’une de leur limitation est le manque de localisation spécifique dans l’organisme. Des stratégies de ciblage sont nécessaires pour optimiser leur efficacité. Nous avons développé une plateforme technologique permettant l’immobilisation et la protection d’enzymes sur des nanoparticules de silice dont la surface peut être modifiée afin d’induire une localisation précise des nanomédicaments dans l’organisme. Ces nanomédicaments ont des applications dans des pathologies diverses et donc des sites d’action variés (ex : intestin, cerveau,…). Les nanoparticules doivent donc présenter des caractéristiques leur permettant d’atteindre les organes cibles afin d’apporter les enzymes au niveau des organes malades. Du site d’action des nanomédicament découle une voie d’administration, d’où cette étude visant à comprendre le chemin parcouru par les nanomédicaments après leur administration dans un organisme. Des tests réalisés en laboratoire sur des cellules, des reconstitutions de paroi d’organes et sur des échantillons de sang ont montré que notre médicament n’est pas nocif. Cependant une caractérisation plus approfondie de notre médicament est nécessaire afin de développer un traitement sûr et efficace. Pour ce faire, l’utilisation de modèles animaux est indispensable. Dans ce cadre, les objectifs de ce projet sont : 1) D’obtenir des données sur le comportement des nanomédicaments en fonction de leurs propriétés physiques et de leur voie d’administration. 2) De définir les spécifications de surface optimale permettant d’apporter le nanomédicament dans d’un organe précis 3) De valider des techniques d’imagerie pour étudier le comportement des nanomédicaments dans l’organisme.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le processus de développement de nouveaux médicaments. Les études précliniques (tests en laboratoire et sur animaux) sont des étapes fondamentales avant de pouvoir administrer un nouveau médicament à l’Homme. Les résultats attendus lors de ces expériences devraient nous permettre 1) de comprendre et visualiser le chemin parcouru par les nanomédicaments dans l’organisme en fonction de leurs spécifications, et 2) de sélectionner les spécifications adéquates pour atteindre les organes cibles (en fonction des domaines d’application). Ces données sont des informations majeures pour le développement spécifique de nouveaux nanomédicaments enzymatiques pour lesquels les traitements actuels ne sont pas satisfaisants. A plus large échelle, cette étude permettra de valider notre procédé de production de nouveaux médicaments. Cette validation permettra d’ouvrir de nombreuses possibilités quant au développement de futures thérapies utilisant cette stratégie.

Procédures

Ce projet sera réalisé sur le modèle de souris CD-1. En fonction des résultats des études préliminaires, les analyses seront préférentiellement réalisées par imagerie. Néanmoins, si l’imagerie ne permet pas d’obtenir des résultats conclusifs, les analyses seront réalisées sur les organes. Le nombre d’animaux concernés par chaque geste seront donc présentés sous forme d’un nombre minimum (dans le cas où l’étude pourrait être réalisée par imagerie), et d’un nombre maximum (dans le cas où l’étude nécessiterait un prélèvement d’organes). Les gestes réalisés seront les suivant : 1) Injection de nanomédicaments dans la circulation sanguine Ce geste sera réalisé sur des animaux préalablement anesthésiés (anesthésie gazeuse), une seule fois durant le temps de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est min : 267, max : 1467. 2) Injection de nanomédicaments par voie orale Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles, une seule fois durant le temps de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est min : 267, max : 1467. 3) Injection de nanomédicaments par voie nasale Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles, une seule fois durant le temps de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est min : 267, max : 1467. 4) Analyse des animaux par imagerie Les analyses des souris par imagerie requièrent une anesthésie légère avant la prise d’images de manière à ce que l’animal reste immobile lors de l’acquisition des scans. Chaque souris sera analysée six fois au cours de l’étude. Dans le cas des analyses par imagerie, le nombre d’animaux nécessaire est de 801. 5) Analyses des organes des animaux L’analyse des organes des animaux nécessite que ceux-ci subissent une sédation profonde. Ce geste sera réalisé une fois par animal durant le temps de l’étude. Pour rappel, ce type d’analyse est optionnel et ne sera réalisé qu’en cas d’impossibilité de réaliser les études par imagerie. Dans ce cas le nombre d’animaux concernés est de 4401.

Impact sur les animaux

Les études de biodistribution précédemment décrites seront réalisées sur des temps cours. Après administration des nanomédicaments, les animaux seront gardés au maximum pendant 96h. De plus, des expériences préliminaires ont montré une parfaite tolérance des animaux suite à l’administration des nanomédicaments. L’ensemble de ces informations suggèrent que les substances administrées (nanomédicaments) n’induiront pas de nuisances ou d’effets indésirables sur les animaux. Les études de biodistribution requièrent une manipulation des animaux pour l’administration des nanomédicaments (voies orale, systémique ou nasale) et les analyses par imagerie. Celles-ci pourraient engendrer un léger stress chez les animaux. Tout sera mis en œuvre pour habituer les animaux à être manipulé et ainsi limiter un éventuel stress.

Devenir

Lorsque les expériences seront terminées, les animaux ne pourront pas être gardés. Dans le respect de la réglementation, la fin de vie des animaux sera effectuée par administration d’une surdose d’anesthésique.

Remplacement

Dans les processus de développement des médicaments, les études de validation d’un nouveau composé jouent un rôle fondamental. Elles font généralement appel à des expérimentations animales. C’est un pré requis obligatoire pour justifier l’investigation et la première administration chez l’Homme. Ces expériences sur les animaux ont une valeur prédictive supérieure à celles réalisées en laboratoire. Le comportement des nanomédicaments dans l’organisme est un processus complexe qui résulte de l’action concertée de plusieurs acteurs cellulaires. De fait, ceux-ci sont difficilement modélisables en laboratoire. Ainsi, même si des expériences préliminaires ont été réalisées au laboratoire les réponses obtenues ne sont qu’indicatives. Il n’existe pas à l’heure actuelle de systèmes alternatifs de remplacement.

Réduction

Nous avons planifié les expériences dans l’optique de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Dans ce but, le nombre de souris à inclure par groupe est limité 8. La significativité statistique de ces différences sera déterminée. Au-delà d’une différence significative entre les différents groupes de souris au sein d’une même expérience, ce qui est important c’est la reproductibilité de l’expérience. Donc on prévoit de reproduire une fois chaque étape. S’il n’y a pas trop d’hétérogénéité au sein des groupes lors de la première expérience on réduira le nombre de souris par groupe de 8 à 6. S’il y a contradiction entre la première et la seconde expérience on prévoit une troisième expérience avec 6 souris par groupe. D’autre part, ce projet débute par des études de faisabilité dans le but de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour le suivi des nanomédicaments dans l’organisme en utilisant l’imagerie comme alternative. Des efforts particuliers seront faits pour valider les techniques d’imagerie et ainsi limiter le nombre de souris utilisées dans ce projet.

Raffinement

Une fois les animaux réceptionnés, un délai de 7 jours sera respecté avant le début du protocole expérimental. Les souris seront hébergées au maximum par 5 dans des cages d’une superficie de 500cm2 à 20-24°C et 30- 50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le milieu sera enrichi à l’aide de litière mélangée à des copeaux (sciure de peuplier, copeaux, briques de peuplier). Les animaux seront surveillés quotidiennement tout au long des expériences. En cas de signes comportementaux, physiologiques, d’une perte de poids de 20% du poids total de l'animal ou d’une détérioration générale de l'état sanitaire de l'animal reflétant une douleur associée à l'expérimentation, celle-ci sera terminée prématurément. Il n’y a pas de traitement antidouleur prévu pour ne pas altérer les résultats de l'expérimentation en cours.

Choix des espèces

Nous avons choisi de réaliser nos études sur le modèle de souris CD-1 pour assurer la continuité avec les expériences précédemment réalisées. Les informations relatives aux doses et volumes injectés peuvent ainsi être réutiliser et évitent des étapes de mises au point supplémentaires, limitant ainsi le nombre d’animaux requis.

50 souris, 50 cobayes et 375 canaris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées de souffrance légère. Ils reçoivent une à deux administrations d'un médicament vétérinaire destiné aux chiens, chats et chevaux, présentés comme des "espèces alternatives" à ces animaux plus gros, puis sont euthanasiés pour prélèvements. Le porteur indique que l'administration "peut occasionner un stress et un inconfort" et fixe la perte de poids de 20 % comme point limite. Il justifie l'usage du canari par une "exigence réglementaire" et le recours aux rongeurs par l'impossibilité de tester l'innocuité in vitro.

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer l’innocuité d’un produit sur des rongeurs (cobayes ou souris) ou canaris ainsi que sur son environnement (animaux en contact, environnement via des études de diffusibilité).

Bénéfices attendus

Ces études sont encadrées selon les exigences de la Directive Européenne 2010/63/UE, de la Pharmacopée Européenne, de guidelines (dont VICH, EMEA) et d’autres exigences spécifiques à chaque pays. Ces études permettent in fine d’assurer le soin des animaux avec des produits présentant un risque minimal. Elles permettent également aux propriétaires de disposer des meilleurs traitements pour leurs animaux tout en réduisant l’impact des maladies infectieuses sur les populations.

Procédures

Les études d’innocuité permettent de voir si le produit présente des effets secondaires sur l’animal par des analyses de laboratoire et des examens cliniques. Les cobayes reçoivent maximum 2 administrations à 2 semaines d'intervalle. Aucun prélèvement n'est effectué. La durée maximale d'une phase animale est de 7 semaines en fonction du produit administré et de l'avancement du projet. Les paramètres cliniques (par exemple, l’état général, examen de la zone d’injection, poids, température rectale) sont suivis. Pour les souris, une seule administration est effectuée. Aucun prélèvement n'est effectué. La durée maximale de la phase animale est de 28 jours. Les paramètres cliniques mesurés sont l'état général, les signes locaux et généraux et éventuellement des pesées. Pour les canaris, 1 seule administration est effectué. Aucun prélèvement n'est effectué. La durée de la phase animale est de 2 semaines. Les paramètres mesurés sont l'état général et les signes locaux.

Impact sur les animaux

L’administration du produit peut occasionner un stress et un inconfort chez l'animal.

Devenir

Les animaux peuvent faire l’objet de prélèvements post mortem et sont donc euthanasiés en fin d’étude. Dans des cas exceptionnels, si l’animal atteint des points limites pendant l’étude, il est euthanasié.

Remplacement

Lorsque cela est possible, une première étape dans le projet de développement d’un produit consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection de ces derniers, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Une série de tests analytiques permet de garantir un certain niveau de sécurité pour les animaux recevant le produit. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux à inclure est très souvent une exigence réglementaire. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste (analyse statistique, historique, définition des objectifs…) de façon à minimiser le nombre d’animaux utilisés en limitant le risque d’études non conclusives.

Raffinement

Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Pour les rongeurs (cobaye, souris) les points limites sont : respiration agonique, perte de poids de 20%, absence de réactions aux stimulis. Pour les oiseaux (canaris), les points limites sont décubitus, perte de poids de 20%, absence de réactions aux stimulis. Dans le cas d'atteinte de point limite, les animaux sont immédiatement euthanasiés pour raison éthique. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les animaux sont hébergés en groupe et des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie des animaux.

Choix des espèces

Ces études sur rongeurs sont des modèles alternatifs pour les études sur chien, chat et cheval. Les chiffres sont donc basés sur l’expérience (études antérieures et bibliographie) et les référentiels du modèle canin, félin et équin. Cette utilisation s’applique dans le cadre des 3R afin d’utiliser les espèces les moins susceptibles de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l’angoisse ou de subir des dommages durables en préservant l’objectif scientifique et la qualité du résultat. D’autant que l’innocuité et la diffusibilité d’un produit ne peuvent pas être testées in vitro. L’utilisation du canari dans les études d’innocuité est une exigence règlementaire. La diffusibilité doit être réalisée dans les organismes cibles ou sensibles (canari) pour que les conclusions soient valides. Les procédures utilisant des rongeurs (cobayes et souris) sont réalisées après le sevrage (dès 21 jours). Les caractéristiques de ces animaux sont bien connues à cet âge ; il s’agit de l’âge qui offre une meilleure sensibilité pour le modèle. Ces animaux sont communément utilisés à cet âge (bibliographie, données fournisseurs agréés). Pour la procédure utilisant des canaris, l’innocuité est testée sur les adultes (>1an) qui est un modèle stable pour réaliser les études. Cela permet de réduire les problèmes zootechniques (comme par exemple une mortalité non liée aux produits administrés) plus présents chez des jeunes canaris.

654 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées de souffrance légère. Ils reçoivent une injection intramusculaire d'un myorelaxant candidat, puis sont soumis au test du "digit abduction score", où l'animal, tenu par le torse, est lâché en chute simulée pour observer l'écartement de ses doigts de pied. Le porteur décrit ce test comme "bref, indolore et peu stressant" et annonce des retombées pour les patients atteints de dystonie ou de spasticité. Il indique avoir tenté de réutiliser les animaux lors d'un projet précédent sans succès, ce qui le conduit à tous les tuer.

Objectifs

Nous démontrerons les bénéfices de nos produits face aux produits de référence utilisé en clinique. Ce projet expérimental d’optimisation concerne le produit d’intérêt FTP-101 identifié suite à nos travaux exploratoires. Cette étude a pour objectif d’optimiser les paramètres d’utilisation du candidat Lead (en particulier la formulation et la cinétique d’injection). Dans cette étude, le produit sera injecté localement aux rats, dans les membres postérieurs pour un suivi du « digit abduction score » (DAS). Cette procédure (injection et test DAS) est brève, indolore, et peu stressante pour les animaux. Notre produit sera comparé au traitement actuel de référence. La voie de développement choisie (d’abord la formulation, la dose, la cinétique d’injection puis la vérification de stabilité de la molécule) pour ce Lead suivra le même principe que celle utilisée pour le Lead FTP-501 à travers différentes demandes d’autorisation de projets (déjà validées par le CEEA)

Bénéfices attendus

Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entrainer des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet global est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé notre premier Lead (FTP-501) quasiment au terme de son développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide (le cas de FTP-101 ici), et d’autres offrent un effet durable par exemple (le cas du premier Lead FTP-501). Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Nous visons ainsi le développement de plusieurs produits, car nous envisageons la possibilité de positionner chacun des produits finaux pour le traitement de différentes maladies neuromusculaires.

Procédures

Les rats seront soumis à l’évaluation du digit abduction score (DAS) après injection intramusculaire des composés. Le DAS correspond à l’évaluation après injection, pour chaque animal, de la capacité à écarter leurs doigts de pied lorsque l’animal est soumis à une simulation de chute (ce reflexe est déclenché pour amortir un choc de réception). Le rat est maintenu par le torse par l’expérimentateur. L’expérimentateur lève alors le bras en l’air (le rat ayant sa face ventrale faisant face au sol), et le redescend relativement rapidement, pour simuler une chute ; il arrête bien sûr son geste avant le contact avec le support (par exemple, la paillasse). L’expérimentateur tourne alors l’animal afin d’observer les doigts de la patte postérieure, attribuant un score. Les degrés de DAS seront enregistrés sur une échelle allant de 0 à 4 (Voir schéma en annexe). La réponse DAS sera mesurée à 5, 15, 30 minutes, 1, 2,4, 8 et 24 heures après injection puis toutes les 24 heures tant qu’un DAS>0 est mesuré.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de cette procédure, aucun signe clinique ni effets secondaires n’est attendu ici suite à l’injection des composés, d’après nos résultats obtenus dans l’étude princeps et la littérature. En effet lors de notre précédent projet, aucun signe clinique de type infection ou inflammation suite à l’injection n’a été observé. Dans le cadre de nos procédures, les nuisances attendus sont : le stress des animaux dû à la contention pour l’injection et le test du DAS ; une douleur à liée à l’injection i.m. Il est important de noter qu’une étude histo-pathologique sur la toxicité locale suite à une injection i.m. de notre composé a été préalablement réalisée et a permis de vérifier que notre composé ne modifie en rien la structure musculaire et qu’aucune lésion n’est présente.

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. En effet, il n’est malheureusement pas possible de les réutiliser dans une nouvelle série d’expériences. Nous avons testé cette possibilité lors du premier projet (APAFiS 18558), malheureusement sans succès. Il est possible que les animaux ayant subi une série d’expériences (suivi d’une période de repos) se soient accoutumés au test DAS, et répondent différemment des animaux naïfs ; le poids plus important des animaux ré-utilisés peut également impacter négativement la réponse au test DAS.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). Le test DAS nous permet au contraire de mesurer l’activité myorelaxante tout en prenant en compte ce paramètre.

Réduction

Pour la réduction, les études précédemment réalisées nous ont donné un certain recul sur la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs (test de kruskal wallis); Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 6 animaux par groupe.

Raffinement

Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés en groupe de 2 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement permettant un suivi clinique de chaque animal. Ainsi, des points limites sont mis en place durant tout ce projet permettant de définir des critères d’arrêt si nécessaire . Nos études précédentes nous ont permis un raffinement du modèle DAS chez le rat : l’injection intramusculaire dans le membre inférieur est réalisée sous contention par un expérimentateur entraîné, et les mesures de DAS sont brèves, indolores et peu stressantes pour les animaux. Au cours de cette étude, nous souhaitons continuer à limiter au maximum le stress des animaux.

Choix des espèces

La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes internes. Or, bien qu’il existe des modèles in vitro qui permettent d’étudier la jonction neuromusculaire, la pertinence de ces modèles pour mimer la fonctionnalité de la jonction est débattue, et ils ne récapitulent pas les problématiques de diffusion qui se jouent in vivo. Le test DAS chez le rongeur, déjà éprouvé lors de notre étude princeps, est au contraire un test reconnu pour sa pertinence pour étudier les myorelaxants. Rats femelles Sprague Dawley femelles âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g) et 10-12 semaines maximum en fin d’expérimentation (300g). Des animaux juvéniles seront choisis pour leur capacité à exhiber un réflexe lors des tests DAS. Les animaux âgés peuvent effectivement répondre de manière moins spontanée aux stimulations. Ils sont également plus légers, donc plus facile à stimuler

2 040 poissons zèbres, utilisés au stade larvaire, vont être tués à l'issue, dans des procédures classées de souffrance légère. Les larves transgéniques sont traitées au métronidazole pour détruire des populations de neurones photorécepteurs, puis leur activité locomotrice est filmée avant mise à mort et génotypage, afin d'étudier l'effet de la lumière sur le rythme circadien. Le porteur note que la mesure d'activité renseigne aussi sur l'anxiété des larves, une larve anxieuse restant davantage sur les bords du puits. Il justifie le choix du poisson zèbre par son caractère de vertébré diurne, jugé "plus pertinent" que les rongeurs pour cette question.

Objectifs

Notre équipe s’intéresse à comprendre quelles sont les structures controlant l’entrainement du rythme circadien par la lumière en utilisant le poisson zèbre Danio Rerio comme organisme modèle. La recherche de notre équipe focalise sur différentes structures d’intérêt en particulier la glande pinéale et l’hypothalamus et sur une famille de gènes codant pour des photopigments de la classe des mélanopsines. Ce projet consiste en la réalisation de mesures d’activité locomotrice sur larves sauvages ou dans lesquelles l’activité neuronale de photorécepteurs spécifiques a été abolie soit en éliminant ces populations neuronales, soit en invalidant leur activité synaptique. Ces larves sont âgées au maximum de 9 jours.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre comment la lumière agit sur le rythme circadien chez un vertébré diurne.

Procédures

Les larves transgéniques sont traitées au métronidazole durant deux jours (jour 2 et 3), changées de milieu (eau) puis leur activité locomotrice est filmée en plaque 96 puits. Elles sont ensuite mises à mort et génotypées.

Impact sur les animaux

Le traitement au métronidazole et la mesure d'activité locomotrice n'induisent pas d'effet indésirable connu alors que ces techniques sont largement utilisées. Pour ce qui concerne les larves génétiquement modifiées (transgènes donnant de l'expression de la nitroreductase : nfsB-mCherry), un effet n'est attendu qu'une fois le metronidazole ajouté au milieu. De plus, après traitement au métronidazole, l'expression des transgènes ne devrait induire ni malformation ni létalité mais pourrait modifier le comportement des larves (activité, humeur...). De manière intéressante, la mesure d'activité locomotrice permet directement d'évaluer le niveau d'anxiété de l'animal. Une larve anxieuse passera en effet plus de temps sur les bords du puit qu'une larve normale (thigmotaxie). Le projet inclus une analyse pilote de ce paramètre après le traitement au métronidazole, ce qui nous permettra de décider d'une éventuelle réduction du nombre d'animaux utilisés s'il s'avérait qu'un des transgènes induisait une anxiété voire un changement de stratégie (voir paragraphe raffinement).

Devenir

Les larves sont génotypées après les expériences. Certains adultes transgéniques peuvent être mis à mort selon la procédure réglementaire effectuée par une personne habilitée à effectuer cette tache.

Remplacement

Notre projet utilise des larves plutôt que des adultes.Le produit du gène nfsB-mCherry nécessite l’addition du métronidazole pour être actif. Ainsi les adultes porteurs ne seront pas traités et ne subiront donc pas d’effets.

Réduction

L'équipe s'intéresse uniquement au comportement des larves. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d’oeufs nécessaires à notre expérimentation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, le fait d’analyser 96 larves simultanément et durant quatre jours permet de réduire le nombre de fondateurs nécessaires pour nos analyses. Les nombres de larves utilisées correspondent aux standards utilisés dans des études similaires. Nous utilisons des transgènes permettant une occurrence plus forte de larves tests que des mutations récessives (occurrence de ½ plutôt que ¼). De plus, si au cours de l’étude nous nous apercevons que nous pouvons obtenir des résultats statistiquement significatifs avec moins d’animaux, nous n’utiliserons que le nombre minimal d’animaux statistiquement nécessaire.

Raffinement

Nous avons prévu d’utiliser le gène nfsB-mCherry pour induire la mort de populations neuronales spécifiques. Si nous observons des effets génants (stress, anxiété) chez les larves modèles au cours des expériences pilotes mesurant la thigmotaxie, nous envisagerons d’utiliser le gène codant pour la toxine botulique qui empêchera l’activité synaptique des neurones cibles. Afin d’éviter que les adultes porteurs soient affectés, nous utiliserons un système de deux transgènes, l’un permettant l’expression de l’activateur transcriptionnel Gal4 et l’autre permettant l’expression de la toxine botulique sous un promoteur UAS. Ce système n'a pas été choisi en première instance car il nécessite plus d'animaux.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un vertébré diurne donc plus pertinent à étudier que les rongeurs pour les questions de rythme circadien. C'est un modèle reconnu pour l'étude du comportement animal. Les larves sont traitées à jour 2 et 3 avec le métronidazole de manière à pouvoir laisser du temps pour l'entrainement circadien. Les mesures d'activité locomotrice sont effectuées à partir du jour 6 pour trois ou quatre cycles selon les expériences. Les larves de zebrafish ont une activité locomotrice rythmique à partir du cinquième jour. L'étude à partir de jour 6 permet d'avoir un jour complet pour que les larves s'habituent à la plaque.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent six injections d'un anticorps ciblant un point de contrôle immunitaire ou d'un placebo, puis sont mises à mort par dislocation cervicale pour le prélèvement de la rate, des ganglions et des fémurs, dans le cadre d'une recherche sur des immunothérapies anticancéreuses. Le porteur indique n'attendre qu'une "angoisse légère et de courte durée". Il affirme que les interactions entre cellules immunitaires ne peuvent "actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables".

Objectifs

Les immunothérapies qui ont révolutionné la prise en charge des patients atteints de maladies auto-immunes et de cancers, reposent notamment sur le ciblage de récepteurs nommés points de contrôle immunitaire. A ce jour, les mécanismes moléculaires participant à l’effet bénéfique de ces thérapies, sont mal compris. L’étude de ces mécanismes d’action apparaît critique pour le développement clinique à large échelle, de cette famille de médicaments. Nos expériences in vitro ont suggéré un rôle possible des protéines de la famille X dans la modulation du système immunitaire induite par le ciblage des points de contrôle. L’objectif de ce projet est de mesurer la contribution des protéines de la famille X dans l’effet modulateur d’un médicament actuellement en cours de développement pré-clinique. Pour ce faire, l’effet de l’administration de ce composé sera évalué dans des souris témoins et des souris porteuses de mutations dans les gènes codant pour X.

Bénéfices attendus

Ces travaux ont tout d’abord une portée fondamentale, puisqu’ils pourraient permettre l’identification des mécanismes impliqués dans la modulation des réponses immunitaires consécutives à l’engagement des médicaments ciblant les points de contrôle. D’autre part, des candidats médicaments ciblant ces points de contrôle étant actuellement testés en clinique dans le cadre d’essais d’immunothérapie du cancer, nos données pourraient fournir un fort rationnel immunologique à leur utilisation et fournir des pistes pour l’amélioration de leur efficacité.

Procédures

6 injections d’un anticorps anti-point de contrôle immunitaire (ou du placebo) dans un volume total de 100µL, par voie intra-péritonéale. (6x30 secondes/souris)

Impact sur les animaux

Nos modèles murins ne présentent pas de phénotype dommageable. Chez la souris, l’injection d’anticorps anti-point de contrôle ne provoque pas d’effets secondaires délétères détectables. Les souris reçoivent au total 6 injections d’anticorps ou de placebo par voie intra-péritonéale. Nous ne prévoyons pas d’effet indésirable de la combinaison de ces deux paramètres. Les animaux subissent donc un ensemble d’étapes de classe de gravité légère, susceptible d’entraîner une angoisse légère et de courte durée. Le comportement, le poids, l’éventuelle déshydratation des souris, et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par dislocation cervicale ; les rates, ganglions lymphatiques et fémurs seront prélevées pour analyse du phénotype immunitaire par cytométrie en flux. Ceci permettra de documenter la fonction des protéines X dans la stimulation des lymphocytes consécutive à l’engagement de points de contrôle immunitaires.

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences dans un contexte physiologique pertinent, c’est-à-dire chez l’animal. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature. Nous avons ainsi calculé une taille d'échantillon de 5 souris par groupe. Pour assurer la reproductibilité des résultats, nous répéterons l'expérience une fois.

Raffinement

Certaines procédures peuvent induire une douleur légère (injections intra-péritonéale). Le protocole d'injection que nous suivrons est bien établi pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles transgéniques nous permettant de mesurer le rôle des protéines de la famille X dans l’effet modulateur induit par des médicaments ciblant des points de contrôle immunitaires. Pour atteindre la maturité du système immunitaire, les souris seront âgées de 7 à 12 semaines.