Procédures légères

270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des mères sont exposées à un cocktail de bisphénol S, d'éthinylestradiol et de Round-Up pendant la gestation et la lactation, et une partie de leur descendance femelle subit une ovariectomie suivie de la pose d'implants d'œstradiol, pour mesurer l'effet de ces polluants sur le comportement et la reproduction. Le porteur indique que les chirurgies d'ovariectomie peuvent provoquer des douleurs viscérales, musculaires et cutanées. Il affirme que les études de neuroanatomie et de comportement ne sont "pas réalisables in vitro ni par modélisation".

Objectifs

Une partie de ce projet vise à identifier les impacts moléculaires, cellulaires et comportementaux de 3 polluants environnementaux : l'éthynilestradiol, le bisphénol S et le Round-Up. Si les analyses moléculaires et cellulaires sont possibles in vitro, l'évaluation de ces polluants sur la mise en place des réseaux neuroendocrines et le comportement implique nécessairement l'utilisation d'animaux. Il est décrit dans la littérature scientifique que certains polluants environnementaux peuvent avoir un impact sur les comportements sociaux et sexuels, sur la fertilité femelle et sur les réseaux neuro-gliaux associés. Nous souhaitons, dans le cadre de ce projet, évaluer l'impact de ces trois polluants (EE2, BPS, RU) en simple et triple exposition afin de mesurer l'effet cocktail suite à une exposition développementale, période de mise en place des réseaux neuro-gliaux contrôlant les comportements étudiés et la fertilité femelle.

Bénéfices attendus

Meilleure caractérisation des mécanismes d'action des perturbateurs endocriniens et de leur effet cocktail.

Procédures

Afin d'évaluer les effets developpementaux, les 30 mères seront exposées aux polluants environnementaux du milieu de la gestation jusqu'a J21 pendant la période de lactation (30 jours d'exposition). Un suivi des caractéristiques générales de la descendance (poids hebdomadaire), reproductives (ouverture vaginale entre J19 et J30) sera réalisé jusqu'à l'âge adulte. Une moitié des animaux sera utilisée pour tester leur comportement social et reproducteur. Les 60 femelles participant à ces tests (12 femelles pour 5 lots correspondant aux différentes conditions) qui necessite une ovariectomie suivie d'une pose d'implants d'oestradiol pour une durée d'un mois afin de palier aux variations des stéroïdes sexuels Différentes mesures des tractus reproducteurs seront réalisées sur l'ensemble des animaux qui seront euthanasiés par euthanasie gazeuse ou perfusion intra-cardiaque.

Impact sur les animaux

Les polluants environnementaux entrainent des perturbation de la fonction de reproduction et du comportement social. Les chirurgies pour les ovariectomies peuvent entrainer des douleurs viscérales, musculaires et cutanées.

Devenir

Après l'exposition aux polluants, tous les animaux seront utilisés pour un suivi des caractéristiques générales et reproductives. Une moitié des animaux (120) seront utilisés pour les tests de comportements qui necessitent une ovariectomie et une pose d'implants d'oestradiol pour les femelles y participant (60). Ces animaux subiront ensuite une euthanasie gazeuse. L'autre moitié des animaux (120) sera euthanasiée par perfusion intra-cardiaque pour des analyses de marqueurs par immunohistochimie au niveau cerebral. Les 30 femelles adultes reproducteurs seront euthanasiées en fin d'expérience. L'ensemble des animaux euthanasiés sera utilisé pour des mesures sur le tractus reproducteur.

Remplacement

Les études de neuroanatomie et de comportement ne sont pas réalisables in vitro ni par modélisation. Le projet a pour but d'explorer les réseaux neuro-gliaux, notamment en mesurant des paramètres cellulaires et les interactions entre neurones et cellules gliales, études uniquement réalisables sur animaux. Les comportements étudiés dans ce projet, comme tous comportements, ne s'expriment et se mesurent uniquement sur animal vigile. Il n'existe pas de système alternatif à ces études.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant d'observer des effets statistiques éventuels sur la base de notre expérience préalable.

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupes sociaux avec un nid cartonné et du matériel (carton) pour creuser. Un enrichissement acoustique est également disponible. Le poids des animaux sera suivi de façon hebdomadaire. En cas de perte de poids supérieure à 15%, de blessure, de prostration ou de repli social, le responsable du bien-être animal est informé directement afin de traiter l'animal (analgésiques et/ou antiseptiques en cas de plaie, ajout de nourriture appétente, isolement de temps de la récupération). Si le traitement ne fonctionne pas, l'euthanasie par dislocation cervicale ou par CO2 sera décidée par les responsables du projet pour éviter des souffrances inutiles.

Choix des espèces

La souris est un modèle expérimental largement admis pour les études de comportements. De plus, la neuroanatomie chez cette espèce est très bien connue. Enfin, ce projet concerne la toxicologie expérimentale, le modèle souris est privilégié dans les études de toxicologie. L'âge des animaux utilisés sera de 10 semaines. Ceci correspond à un âge dit adulte où les comportements sociaux et sexuels sont établis et le développement des réseaux neuro-gliaux est complet.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses d'une mutation induisant un lupus, elles sont gavées quotidiennement jusqu'à huit semaines et subissent des prélèvements sanguins réguliers, pour tester la rapamycine sur ce modèle auto-immun. Le porteur décrit un phénotype "dommageable" avec protéinurie et survie réduite à environ sept mois, et prévoit la mise à mort des animaux atteignant un score de souffrance défini. Il affirme que la complexité du système immunitaire rend son étude "impossible" par des tests in vitro.

Objectifs

Notre système immunitaire nous protège constamment vis à vis des agressions des agents pathogènes comme les virus ou les bactéries. Cependant dans certaines situations rares, le système immunitaire se dérègle et se retourne contre l’organisme, c’est ce qu’on appelle l’auto-immunité. L’hyperactivité du système immunitaire dans le lupus a vraisemblablement pour origine de multiples facteurs, même si les causes exactes restent inconnues. Toutefois, lorsqu’au sein d’une famille, plusieurs membres sont atteints, nous pouvons suspecter qu’il existe une cause génétique. Grace aux nouvelles techniques de génétiques, il est possible d'identifier des mutations dans des gènes qui codent pour des protéines, éléments essentiels au bon fonctionnement de nos cellules y compris celles du système immunitaire. Ainsi, en explorant plusieurs familles avec un lupus, une mutation prédite pathogénique a été identifiée. Mais comment savoir si c’est bien uniquement cette mutation qui est responsable du développement de la maladie et non d’autres facteurs ? Un modèle murin porteur uniquement de cette mutation a été généré et développe plusieurs symptômes d’auto-immunité. La mutation de ce gène est donc bien responsable du développement de la maladie. De plus, cette mutation altére spécifiquement un type de cellule immunitaire, les lymphocytes B. Actuellement,ce modèle murin est utilisé afin de démontrer le rôle essentiel de la protéine codée par le gène identifié dans les lymphocytes B et pour comprendre comment la mutation de ce gène peut induire le lupus. Cette étude permettra de mieux comprendre un des mécanismes qui maintient le bon fonctionnement de notre système immunitaire. L'élevage de ses animaux est necessaire afin de les conserver et pour continuer à les étudier. De plus, les lymphocytes B de notre modèle ont une activation anormalement élevée de la voie mTOR. Cette voie est primordiale pour contrôler le métabolisme cellulaire. En effet, l’inhibition de cette voie avec la rapamycine, inhibiteur de mTOR, permet de réduire la prolifération des lymphocytes B. Ce projet se propose donc de tester in vivo la rapamycine chez ces souris porteuses de la mutation identifiée développant un phénotype auto-immun et d’observer si le traitement améliore les symptômes de nos animaux.

Bénéfices attendus

Le lupus systémique est une maladie rare dont les causes sont encore mal comprises. Ce projet aidera à comprendre l’implication de variants de la voie du BCR identifiés chez des patients avec un lupus dans le développement de la maladie et leurs rôles dans la pathogénèse du lupus. Les mécanismes altérés pourront être recherchés chez d’autres patients et ciblés par des interventions pharmacologiques.

Procédures

Les animaux seront gavés quotidiennement sur une période maximale de 8 semaines. Un prélevement sanguin sera réalisé toutes les 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux présentent un phénotype auto-immun, défini comme dommageable. Entre 3-5 mois, les souris ne présentent pas de phénotype particulier malgré la détection de signes biologiques auto-immun (présence d’auto-anticorps, signature interféron). A partir de 6 mois, elles ont une protéinurie dans les urines traduisant une inflammation des reins. La survie des souris est réduite à environ 7 mois. Pour la procédure de traitement in vivo à la rapamycine, les animaux vont devoir être gavées tous les jours sur une période conséquente (maximum 8 semaines) pouvant engendrée un stress chez l'animal.

Devenir

Les animaux seront mise à mort à la fin de la procédure afin d'étudier plus précicésement d'autres symptomes liés à l'auto-immunité (rein, rate, ganglion). Nous réaliserons également une analyse précise des lymphocytes B de ces souris afin d'étudier leur niveau de prolifération, activation après le traitement.

Remplacement

Nous avons déjà évalué in vitro qu'un traitement à la rapamycine permettait de baisser le niveau d'activation de la voie mTOR sur les lymphocytes B porteurs de la mutation et permettait de réduire également leurs proliférations. Toutefois, le système immunitaire est biologiquement très complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude dans des tests in vitro. La principale problématique est que l’on ne connaît pas l’ensemble des paramètres de ce système. Il est donc nécessaire d'avoir recours à un modèle animal pour étudier l'efficacité d'un traitement sur le developpement d'une maladie.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été choisi afin qu'ils soient le moins élevé possible mais pour que nous puissons toutefois avoir une force statistique suffisante afin de pouvoir répondre à notre hypothèse. . Considérant une variance hypothétique de 30%, un risque d’erreur de type I (alpha) de 0.05 ainsi qu’une puissance statistique (1- beta) de 0.9, le nombre minimal d'animaux nécessaire à l’observation d’une différence significative si elle existe est de 6 (calculé par epiR package version 0.9-030).

Raffinement

Pour ce projet, nous avons défini plusieurs points limites: - biologiques (présence d'autoanticorps, d'une signature interféron positive et d'une protéinurie sévère (supérieur à 300mg/dL)) - spécifique au modèle: Les souris présentent une survie réduite à partir de 6 mois. En conséquence, , les animaux n'iront pas jusqu'à cet âge durant ce projet. - Surveillance des animaux: Nous évaluerons l’état de bien-être ou de souffrance des animaux après chaque manipulation réalisée. Si les souris présentent ces signes (auto-anticorps, signature interféron et protéinurie élevé), les souris seront mises à mort. En parallèle, un scoring permettra d’évaluer l’état de bien-être de l’animal. Un score cumulé de 3 constitue un point limite et l’animal sera mis à mort si ce point est atteint. APPARENCE DE L'ANIMAL SCORE 0 = Normal SCORE 1 = Toilettage incomplet / Pelage terne / Dos arrondi SCORE 2 = Ecoulement nez/yeux / yeux mi-clos / Amaigrissement 20% par rapport au poids initial / Lésions sévères (automutilation...) COMPORTEMENT DE L'ANIMAL SCORE 0 = Normal SCORE 1 = Isolation du groupe / Vocalisation / Hyperactivité SCORE 2 = Prostration / Immobilité / Tremblements légers SCORE 3 = Tremblements/Dyspnée/Convulsions/Coma Si la souris est visiblement en souffrance (prostration, détresse respiratoire, perte de mobilité), elle sera mise à mort par dislocation cervicale. A la fin du protocole, l'ensemble des animaux sera mis à mort. Chaque protocole se terminera par la mise à mort des souris impliquées.

Choix des espèces

Le système immunitaire est biologiquement très complexe, faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude par des tests in vitro exclusivement. La principale problématique étant que l'on ne connait pas l'ensemble des paramètres du système. De plus, l'ensemble de notre projet porte sur l'utilisation de souris transgéniques, ayant les mêmes mutations que celles rtrouvées chez les patients. Nous avons choisi d'utiliser comme modèle la souris car elle présente plusieurs avantages notamment en immunologie. Le developpement de nombreux outils de génétique (connaissance et exploitation des génomes, génération de mutants...) a permis de faciliter la génération de nouveaux modèles et offre la possibilité de travailler sur un modèle où les connaissances sur le système immunitaire sont déjà bien définies. Nous proposons de traiter les animaux à partir de 4 mois, lorsqu’ils présentent des signes biologiques relatif à l’auto-immunité (auto-anticorps, signature interféron) mais n’ont pas encore de protéinurie positive dans les urines (relatif à une dégradation des reins). Les souris présentant une survie réduite à partir de 6 mois, la procédure s'arretera à cet âge là.

195 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Souris immunodéficientes, elles subissent une lésion musculaire par toxine ou par le froid, une greffe de cellules humaines et une mesure de contractilité sous anesthésie sans réveil, pour étudier la fibrose musculaire. Le porteur indique que l'expérimentation peut provoquer une infection cutanée et une douleur après la lésion du muscle. Il affirme que les cultures in vitro ne donnent qu'une "vision partielle" du comportement des cellules musculaires.

Objectifs

Nous nous intéressons aux dystrophies musculaires, un groupe hétérogène de maladies génétiques touchant le muscle squelettique. Elles sont caractérisées par une faiblesse musculaire, une dégénérescence progressives dans les muscles du corps. Dans certains types de dystrophies musculaires, comme par exemple la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) ou la dystrophie musculaire oculo-pharyngée (OPMD), l’apparition de tissu cicatriciel (fibrose) dans les muscles est également observée. Le processus fibrotique représente une réponse progressive et dérégulée qui, suite à la production excessive de matrice extracellulaire remplaçant le tissu, principalement collagènes et fibronectine, abouti à une dysfonction de l’organe et à dans certains cas peut amener à la mort de l’individu. Malgré à ce jour, dans le muscle squelettique comme dans nombreux autres tissus, la fibrose reste un processus très peu connu, en particulier chez l’homme, une des cellules impliquée dans la fibrose semble être le fibroblaste.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra 1) d’étudier le rôle des fibroblastes humains dans la mise en place de la fibrose dans le muscle squelettique et 2) de pouvoir développer des stratégies thérapeutique anti-fibrotiques ciblant ces cellules chez l’homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à trois actes chirurgicaux: 1) L'injection d'une toxine muscualire ou le dommage avec le froid du muscle poru declancher une régénération musculaire. Le deux intérventions sont de courte durée (environ 1 minute l'injection de toxine; environ 10 minutes le dommage avec le froid); 2) L'injection de cellules en intramusculaire (durée environ 3 minutes); 3) la mesure in situ de la contractilité du muscle squelettique qui est une procédure sans réveil de la durée d'anviron 15 minutes.

Impact sur les animaux

Dans notre projet, nous injectons des cellules en intramusculaire chez la souris (après avoir effectué un dommage musculaire du muscle tibialis anterior). Les effets indésirables de notre expérimentation sur les animaux peuvent être les suivants: une infection de la peau au site d’injection et une douleur post-dommage du muscle.

Devenir

Tous les animaux de la procédure N°1, N°2 et N°3 sont euthanasiés à la fin des procédures. L’analyse des muscles injectés est indispensable pour ce projet. L’euthanasie de l’ensemble des animaux est donc requise.

Remplacement

Nous travaillons sur la fibrose musculaire chez l’homme, un processus dans lequel plusieurs types cellulaires participent. Or les études réalisées in vitro, en culture, ne donnent qu’une vision partielle du comportement des cellules musculaires et des fibroblastes humains lors de la mise en place de la fibrose musculaire.

Réduction

Chaque groupe sera constitué de 15 animaux (fait exception pour les groupes 13, 14 et 15 pour lesquels 5 souris par groupe devraient être suffisants pour obtenir une significativité) pour obtenir des résultats statistiques dans le respect de la règle des 3R. Un totale de 195 animaux seront utilisés et afin de réduire le nombre de souris utilisées les deux TA de chaque souris seront injectés (soit n=30 par groupe pour l’analyse).

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons ou tunnel en carton ou carré de coton compacté. Les animaux seront surveillés quotidiennement pendant toute la durée de l’expérience afin de déceler des signes de douleur. Pour les procédures opératoires, les souris sont anesthésiées. Un traitement analgésique est administré au moment de l’anesthésie afin de renforcer l’analgésie et en période post-opératoire. Les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la perte de poids, des plaies au site d’injection, une croissance excessive des dents seront évalués régulièrement. Les animaux qui montrent un signe quelconque de détérioration de leur santé seront euthanasiés immédiatement

Choix des espèces

L’utilisation de souris immunodéficientes (Rag2-/- Il2rb-/-) nous permets d’évaluer la greffe de cellules humaines dans le muscle. L’immunodéficience est indispensable, puisque il nous permet de nous affranchir de la réponse immunitaire de la souris qui rejetterait les cellules humaines injectées. Nous utiliserons des souris entre 3 et 4 mois d'âge. A ce stade, les souris sont déjà adultes (et elles ont une taille facilitant l’injection dans le TA)

1200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections répétées par trois voies, jusqu'à 32 fois pour certains groupes, et un prélèvement sanguin rétro-orbital sous anesthésie, ainsi que des électromyogrammes, des tests d'agrippement et des mesures de contractilité musculaire, pour tester la protéine GDF5 contre la perte musculaire liée à l'âge. Le porteur indique que les souris âgées de 20 mois peuvent présenter une perte de poids massive ou développer des tumeurs. Les bénéfices annoncés pour l'humain, un futur traitement de la sarcopénie, sont renvoyés à des études précliniques et cliniques ultérieures, tandis que le porteur affirme que le recours à la souris est "indispensable".

Objectifs

Au cours du vieillissement, la masse et la fonction musculaires diminuent progressivement. Lorsque la perte musculaire est excessive, elle peut conduire à une pathologie : la sarcopénie. La sarcopénie est à l'origine d'une détérioration générale de la condition physique qui se traduit par un risque accru de chutes, un allongement de la durée d'hospitalisation, une perte d'autonomie et conduit inévitablement à une augmentation du taux de morbidité et de mortalité. Actuellement, il n'existe pas de traitement pharmacologique. La masse musculaire squelettique dépend de l'état d'innervation des muscles. Lorsque le nerf périphérique est endommagé, le muscle squelettique subit une atrophie. Pour contrecarrer la perte de masse et de fonction, un mécanisme compensatoire se met en place. Il s’agit de la voie GDF5 (Growth differentiation factor 5) qui joue un rôle très important dans le maintien de la masse musculaire. Pour ce projet, nous émettons donc l'hypothèse que la supplémentation en GDF5 pourrait avoir un bénéfice thérapeutique pour lutter contre la perte musculaire liée à l’âge. Pour ce projet, nous utiliserons au total 1200 animaux. 504 souris C57BL/6JRj jeunes (12 semaines) et 696 souris C57BL/6JRj âgées (20 mois) qui seront traitées avec la protéine recombinante rGDF5 ou avec le véhicule. Nous comparerons plusieurs voies d’administration (intra-péritonéale, sous-cutanée et intra-veineuse par injection rétro-orbitale. Les animaux feront aussi l’objet d’évaluations fonctionnelles telles que des mesures de composition corporelle, une exploration fonctionnelle du système nerveux périphérique et des mesures de force.

Bénéfices attendus

Nous émettons l’hypothèse que la protéine rGDF5 puisse représenter un outil thérapeutique pour limiter la perte de masse et de force musculaires chez des souris âgées. A court terme, chez le modèle murin, nous envisageons un maintien de la masse musculaire, une amélioration de la composition corporelle (masse grasse / masse maigre) et des performances (test d’agrippement, course sur tapis…) ainsi qu’une amélioration de la communication nerf-muscle rendant compte d’une amélioration de la force musculaire. S’agissant de bénéfices à long terme, nous envisageons la mise en place d'études précliniques et cliniques pour étudier les effets bénéfiques de l'administration de GDF5 chez des sujets âgés.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d'interventions: -Injection intra péritonéale (20 secondes),(400 animaux) (1 à 3 fois pour lots 1 à 6 / 32 fois pour lot 7), (sans anesthésie) -Injection sous-cutanée (20 secondes),(400 animaux) (1 à 3 fois pour lots 8 à 13 / 32 fois pour lot 14 ), (sans anesthésie) -Injection intra veineuse (20 secondes),(400 animaux) (1 à 3 fois pour lots 1à 6 / 32 fois pour lot 21 ), (avec anesthésie) -Prélèvements de sang en retro-orbital (20 secondes) (1200 animaux) (1 fois en fin de procédure pour chaque animal) (avec anesthésie) Les animaux seront soumis à des mesures fonctionnelles -Mesures de composition corporelle (2 minutes) (192 animaux) (lots 7, 14 et 21) (8 fois) (sans anesthésie) -Tests d'agrippement (5 minutes) (192 animaux) (lots 7, 14 et 21) (3 fois) (sans anesthésie) -Electromyogrammes (20 minutes) (192 animaux) (lots 7, 14 et 21) (3 fois) (avec anesthésie) -Mesures de contractilité musculaire (20 minutes) (192 animaux) (lots 7, 14 et 21) (1 fois) (avec anesthésie)

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des souris âgées qui peuvent présenter une perte de poids massive ou développer des tumeurs. L’injection de protéine rGDF5 se fera 1 à 2 fois par semaine pendant 4 mois. Pour les injections en sous-cutané, cela pourrait engendrer l’apparition de durillons, nous alternerons donc les sites d’injection. Pour les injections en intrapéritonéal et intraveineux, le risque est surtout lié à une mauvaise injection. Nous serons donc très vigilants sur ce point.

Devenir

Des prélèvements et des analyses seront nécessaires post-mortem, les animaux inclus dans les procédures 1 et 2 seront donc euthanasiés en fin de procédure.

Remplacement

Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de la masse musculaire et de la force musculaire au cours du vieillissement. Pour cela, il est nécessaire d’étudier le rôle de notre protéine d’intérêt et les effets du traitement dans un modèle animal tel que la souris pour avoir accès à la masse et à la fonction musculaire. Pour réaliser cette étude, l’utilisation du modèle murin est donc indispensable. La finalité de cette étude est de développer des stratégies thérapeutiques, ce qui ne peut se faire que sur un modèle animal. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.

Réduction

Les protocoles expérimentaux seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que les expériences soient interprétables et pour éviter de les répéter. La taille des effectifs sera établie grâce à un calcul de puissance ce qui permettra d'utiliser un nombre de souris limité. Nous réaliserons des tests statistiques pour permettre une analyse et une interprétation fiables des résultats. De plus tous les muscles et une majorité des organes des souris seront prélevés. Au total, nous prévoyons d'utiliser 1200 animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Elles consistent en un contrôle quotidien des cages, un changement régulier, un nombre réduit d’animaux par cage (5 maximum) et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de laine de bois afin que les souris puissent faire un nid ainsi que de lanières de papier Kraft et des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage. Pour limiter la souffrance et l'angoisse, les procédures qui le nécessiteront seront réalisées sous anesthésie et sous analgésiques. Au cours des différentes procédures, la température des souris est maintenue constante à l’aide d’une plate-forme chauffante ou sous lampe radiante. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Nous mettrons en place des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour la caractérisation de l’homéostasie musculaire. Cette espèce permet de combiner les études moléculaires et fonctionnelles du muscle squelettique. Nous avons choisi d’utiliser la souris C57BL/6JRj. Des souris adultes jeunes (12 semaines) pour que la croissance du muscle soit terminée mais qu’il n’y ait pas de paramètres supplémentaires liés au vieillissement. Des souris vieillissantes (20 mois) pour évaluer l’effet du traitement sur la perte de masse et de fonction musculaires liée à l’âge Nous savons que la perte de masse musculaire liée à l’âge est visible à partir de 19-20 mois, toutefois, avant 24 mois les différences en terme de masse, d'innervation et de force musculaire risquent de pas être significatives entre les souris traitées au véhicule et les traitées au GDF5, car les signes majeurs de dénervation sont présents seulement à un âge très avancé (24 mois). Les souris seront donc traitées pendant 4 mois à partir de l'âge de 20 mois. Les animaux sont séparés selon leur âge. L'identification des animaux se fait avant le début des expérimentations par tatouage au niveau des doigts sous anesthésie (3% d’isoflurane en induction ; 1.5% en maintien) à l’aide d’une seringue insuline 29G et d’encre de chine diluée.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un asthme allergique aggravé par un rhinovirus leur est induit par instillations nasales répétées sous anesthésie, avec administration d'anticorps derrière l'oeil, pour étudier le rôle des cellules natural killer. Le porteur indique que ces protocoles ne sont pas identifiés comme douloureux mais génèrent le stress de préhensions répétées et les effets de l'infection respiratoire. Il affirme que la complexité et la cinétique de cette pathologie ne peuvent être reproduites in vitro ou in silico.

Objectifs

L’asthme est une maladie pulmonaire chronique complexe aboutissant à une obstruction bronchique réversible, qui affecte les enfants et les adultes. Dans le monde, en 2019, on estime que 262 millions de personnes souffraient d’asthme et que cette maladie a entraîné 461 000 décès. Cependant, ces chiffres sont très probablement sous-estimés. L’asthme est sévère pour environ 10% des patients qui souffrent de symptômes persistants malgré une bithérapie de fond incluant des fortes doses de corticoïdes inhalés. Les exacerbations ou aggravations des symptômes d’asthme restent un problème majeur dans le suivi et l’évolution des asthmatiques, qu’ils soient sévères ou non. Elles représentent le motif principal de recours aux soins. Environ 50 à 80% des exacerbations sont associées à des infections virales respiratoires (chez les adultes et les enfants, respectivement). Parmi les virus impliqués, 50-60% sont des rhinovirus, appartenant plus précisément aux groupes A et C. Même si certains mécanismes impliqués dans les exacerbations ont été identifiés, les connaissances restent insuffisantes pour développer des traitements efficaces. Il y a donc un réel besoin de mieux comprendre la physiopathologie des exacerbations viro-induites des asthmatiques allergiques, quel que soit leur âge et leur traitement. Les cellules natural killer (NK) participent à l’immunité innée antivirale précoce, et sont présentes en grande quantité dans les poumons. Cependant, leur rôle dans les exacerbations viro-induites de l’asthme sont largement méconnus. L’objectif de notre travail est de mettre en place un modèle d’exacerbation induite par un rhinovirus (RV) chez la souris, après sensibilisation allergique pulmonaire. Nous utiliserons le RV-C15, qui est associé à des symptômes plus sévères. Dans ce modèle, nous identifierons et caractériserons les cellules NK pulmonaires et leurs fonctions.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet sont de plusieurs niveaux : (1) d’ordre technique ou expérimental, avec la mise en place du modèle d’exacerbation de l’asthme expérimental induite par un rhinovirus de type RV-C15 ; (2) d’ordre fondamental, avec une meilleure compréhension du rôle des cellules NK dans la pathogénèse des exacerbations viro-induites de l’asthme. A plus long terme, ce modèle pourra servir de modèle d’étude pré-clinique pour évaluer de nouvelles thérapeutiques dans le traitement des exacerbations viro-induites de l’asthme.

Procédures

- Instillations intranasales sous anesthésie volatile (isoflurane 2% avec un débit d’air de 1L/min) : * 25µl par souris et par instillation * 6 instillations intranasale par souris, d’extraits d’acarien ou de solution saline * 1 instillation intranasale par souris, de rhinovirus vivant ou de solution contrôle - administration intraveineuse d’anticorps sous anesthésie volatile (isoflurane 2% avec un débit d’air de 1L/min) au niveau du sinus rétro-orbital : 50µl. Une admnistration par souris, uniquement pour la procédure 3. - 1 administration intrapéritonéale par souris pour adminitration léthale de pentobarbital

Impact sur les animaux

Les protocoles d’asthme n’ont pas été identifiés comme protocoles douloureux. Cependant, ils peuvent provoquer des nuisances sur les animaux comme le stress de la préhension pour l'anesthésie volatile (6-7 fois), et celui d'une injection intra-péritonéale pour le surdosage d'anesthésique avant la mise à mort. L'infection avec le rhinovirus RV-C15 génère quant à elle un stress lors de la phéhension pour l'anesthésie volatile (1 fois), et des effets indésirables liés à l'infection respiratoire. Néanmoins, aucune douleur n'a été signalée à ce jour dans la bibliographie concernant l'infection à RV-C15. Les animaux seront donc quotidiennement surveillés afin de répertorier d'éventuels effets indésirables, comme la perte de poids.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort afin de prélever les organes.

Remplacement

Il s’agit de l’étude d’une pathologie faisant appel à de nombreux types cellulaires et à de nombreux paramètres dont la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro, ou modélisées in silico. Nous allions néanmoins ce travail à des études in vitro analysant les fonctions des cellules NK de patients asthmatiques qui pourront enrichir le projet présenté ici, voire orienter nos études futures.

Réduction

Les calculs des effectifs sont basés sur notre expérience en matière de modèles d’asthme et les calculs de puissance effectués permettant des analyses statistiques correctes et la mesure de nombreux paramètres caractéristiques de l’asthme : inflammation (cellules : nombre et localisation, cytokine) et remodelage bronchique, ainsi que sur la publication ayant décrit l’utilisation du RV-C15 pour induire une exacerbation des réponses asthmatiques chez la souris BALB/c (Rajput, et al. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.649520). Ainsi, le nombre a été calculé au plus juste pour chaque protocole. Plus précisément, pour les procédures 1 et 2, nous nous sommes basés sur des résultats précédemment obtenus (composition du lavage bronchoalvéolaire en nombre d’éosinophiles chez des souris mâles et des souris femelles sensibilisées à un autre acarien ou non sensibilisées), et avons réalisé un calcul d’effectif avec le logiciel InVivoStat v4.3.0 en considérant un risque alpha de 5% et une puissance de 80%. Le calcul ainsi réalisé donne un nombre de sujets de 6 par groupe. Pour ce qui est de la procédure 3, nous nous sommes basés sur des résultats préliminaires sur le pourcentage de cellules NK localisées dans le parenchyme pulmonaire parmi les cellules NK pulmonaires. En utilisant le logiciel InVivoStat v4.3.0, avec un risque alpha égal à 5%, une puissance de 80%, et avec pour objectif de mettre en évidence une différence absolue minimale égale à 2 écart-types, nous avons obtenu un effectif de 6 animaux par groupe L’étude préliminaire permettant d’établir notre modèle chez la souris C57BL/6J sera réalisée sur 6 groupes de souris par sexe afin d’envisager toutes les combinaisons et de ne négliger aucun groupe contrôle (y compris les souris sensibilisées aux extraits d’acariens et non infectées et leurs contrôles non sensibilisés), afin de caractériser complétement le modèle. Il faut signaler que ce modèle de sensibilisation allergique est très dépendant de l’animalerie où il est effectué, car les réponses immunes mises en jeu sont modifiées par le microbiote de l’animal, lui-même dépendant de la structure d’accueil. Cependant pour les études suivantes, nous éliminerons les groupes « souris sensibilisées aux extraits d’acariens et non infectées » et leurs contrôles « non sensibilisés » afin de réduire le nombre d’animaux utilisés aux conditions infectées par RV-C15 vivant ou non vivant.

Raffinement

Les expérimentations seront débutées 7 jours après réception des souris pour permettre leur acclimatation. Les animaux seront hébergés en cage de 4, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique teintés. Les facteurs physiques de l'environnement (lumière, bruit, température et renouvellement d'air) sont contrôlés et adaptés au modèle murin. Après anesthésie gazeuse à l’isoflurane (2% avec un débit d’air de 1L/min) et instillation intrasale, les souris seront surveillées jusqu’à leur réveil. Après infection avec le RV-C15, les souris seront suivies quotidiennement par un personnel qualifié. Une fiche d’observation sera remplie afin d’assurer un suivi de l’état de souffrance/douleur des animaux et de prendre les mesures adaptées le plus précocément possible.

Choix des espèces

Les modèles animaux souris reproduisent les différents paramètres de la pathologie asthmatique allergique. En outre de nombreuses souris génétiquement modifiées ou anticorps spécifiques existent permettant d’identifier des molécules ou cellules impliquées. Dans la plupart des protocoles, les souris seront utilisées à l’âge adulte (6-8 semaines) comme dans la majorité de la littérature sur le sujet.

1 282 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les mères sont soumises à une alimentation grasse hypercalorique pendant la gestation et la lactation, puis mères et descendance subissent des gavages, des prélèvements sanguins répétés et des tests de tolérance au glucose sur animal vigile, pour étudier l'effet d'une supplémentation en une vitamine. La plupart sont tuées pour prélèvements, seules 80 souris adultes du groupe témoin pouvant être conservées pour l'élevage selon les besoins de l'unité. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthodes de substitution" pour étudier ces paramètres métaboliques et conclut à un usage "indispensable" de la souris.

Objectifs

Rechercher par quels mécanismes biologiques la supplémentation orale en molécule M chez la mère pendant la grossesse et la lactation améliore la santé métabolique de la descendance.

Bénéfices attendus

Identification du mode d’action de la molécule M lors de la supplémentation orale pendant la gestation et la lactation, en vue de la mise en place d'un protocole de supplémentation systématique chez la femme enceinte et réduire ainsi les facteurs de risque d'obésité chez l'enfant.

Procédures

Ce projet nécessite l’exploration fonctionnelle du contrôle glycémique chez la souris. Les animaux seront ainsi soumis à des tests de performance métabolique, comparables à ceux utilisés chez l’Homme, permettant d’apprécier le rôle physiologique de l’insuline et de détecter des états pré-diabétiques et diabétiques, caractérisés par une intolérance au glucose, une résistance à l’insuline, voir une hyperglycémie à jeun. Ces tests nécessitent des administrations pharmacologiques et des prélèvements sanguins. Les animaux recevront une charge soit de glucose (2g/kg) soit d’insuline (0,75u/kg) par voie intrapéritonéale et un relevé des excursions glycémiques sera réalisé après administration. Pour cela, des prélèvements sanguins (10 microlitres) seront réalisés afin de mesurer la glycémie et l’insulinémie des animaux. En pratique, 7 prélèvements seront réalisés sur une durée de 135 minutes. Comme chez l’Homme, ces tests de performance métabolique sont réalisés impérativement sur sujet vigile car les anesthésiques sont hyperglycémiants et sont incompatibles avec les paramètres physiologiques mesurés. Les procédures de ces tests sont parfaitement maitrisées et le mode opératoire est parfaitement cadré et partagé par la communauté scientifique.

Impact sur les animaux

Le modèle expérimental de mise sous régime HFD maternel pendant la gestation et la lactation provoque un stress métabolique qui se traduit par une adiposité supérieure voir une intolérance au glucose (cette dernière est recherchée dans ce projet). Il n'y a pas de dystocie, et la taille des portées et le sex-ratio à la naissance est conservé dans ce modèle. D'autre part la consommation en molécule M exogène n’a pas d’effet indésirable connu. La supplémentation orale en molécule M, qui est une vitamine, vise au contraire à contrer une carence induite expérimentalement par une alimentation maternelle appauvrie (modèle conventionnel HFD semi-synthétique). La supplémentation orale en molécule M dans ce contexte a donc un effet bénéfique attendu. Les tests de tolérance au glucose pourront provoquer soit une hypoglycémie (injection d'insuline) ou une hyperglycémie (injection de glucose). Enfin les tests de prélevements sanguins au bout de la queue sont succeptibles de générer un inconfort.

Devenir

Tous les animaux soumis au régime hypercalorique et/ou à la molécule M sont soit mis à mort au cours de la procédure (pour prélèvements post-mortem) ou en fin de procédure (par inhalation de CO2) car ils ne peuvent être conservés pour d'autres études de l'unité, du fait de cette programmation nutritionnelle obésogène. En revanche les 80 souris adulte (mâles et femelles) soumis au régime standard et qui participent au projet uniquement pour produire une descendance F1 controle (qui sera quant à elle étudiée), seront soit mises à mort (par inhalation de CO2) soit éventuellement conservées à des fins d'élevage, en fonction des besoin de l'équipe ou de l'unité. Le choix sera donc fait par la responsable de l'animalerie.

Remplacement

Les animaux de laboratoire nous permettent de modéliser l’obésité nutritionnelle et ses complications. Leur utilisation est indispensable pour décrire les processus qui se déroulent pendant l’installation de cette maladie, souvent asymptomatique dans sa phase précoce, et qui ne sont pas encore totalement élucidés à ce jour. Il n’existe pas de méthodes de substitution permettant d’étudier les paramètres physiologiques complexes recherchés dans nos études (prise alimentaire, dépense énergétique, thermogenèse, glycémie, adiposité, etc). Ces paramètres mettent en jeu des arc-réflexes, des rétrocontrôles, et des dialogues entre les organes qui ne peuvent être modélisés complètement. De plus, ces paramètres sont l’expression d’une perception et intégration cérébrale de signaux nutritionnels et métaboliques qui ne peut être étudiée que dans un organisme vivant.

Réduction

Les procédures décrites dans ce projet, ainsi que la stratégie expérimentale, ont été optimisées, standardisées et validées lors d'une précédente étude. L’optimisation des procédures réduisent la variabilité interindividuelle et évitent des études pilotes supplémentaires, ce qui finalement réduit les effectifs nécessaires au projet. Cela permet également de déterminer le nombre d’animaux nécessaires et suffisants pour mener à bien les analyses statistiques et donc là encore d’optimiser le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les procédures concernant l’installation du modèle expérimental et les prises de mesures ont été optimisées et standardisées. Le personnel a été formé et maitrise tous les actes à réaliser. Le travail avec les animaux s’effectue en conditions calmes et maitrisées. Les aliments et l’eau de boisson sont fournis ad libitum. Les animaux sont surveillés quotidiennement et des soins vétérinaires peuvent être donnés au besoin selon l’avis d’un vétérinaire. Les conditions d’hébergements sont enrichies (maison et matériaux de nidation) et apportent des conditions optimales permettant l’expression de comportements innés (vie sociale, gestation, enfouissement, nidation, protection, lactation).

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Sa taille est compatible avec la dissection de tissus et organes d’intérêt permettant des analyses biochimiques, cellulaires, moléculaires, et histologiques. Cet animal permet d’obtenir des analyses pertinentes du comportement alimentaire. La réalisation de différents tests fonctionnels explorant les performances métaboliques est aussi possible chez cet animal, comme la recherche de la tolérance au glucose et la sensibilité à l’insuline, du fait de nombreuses similarités qui existent avec le métabolisme de l’espèce humaine. Les stades de développement étudiés sont les suivants : Stade postnatal P5, P8, P12 (descendance) : ce stade permet d’étudier le rôle neurotrophique de l’insuline (cf procédure 3) Stade postnatal P2 (descendance) : ce stade permet d’étudier le développement sensoriel des animaux (cf procédure 4) Stade postnatal P17 (descendance) : ce stade permet d’étudier la maturation du système neuronal à mélanocortine (cf procédure 5) Stade postnatal P60 (descendance) : ce stade permet d’étudier le contrôle glycémique des animaux (cf procédure 6) Stade adulte (mère) : ce stade permet de caractériser le modèle expérimental et d’évaluer le contrôle glycémique (cf procédure 2)

380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections de dérivés de la kétamine puis passent une série de tests comportementaux, dont le test de la nage forcée, le labyrinthe en croix surélevé, l'open field et le splash test, pour évaluer un possible effet antidépresseur. Le porteur retient la souche Balb/C pour son "phénotype naturellement anxieux", ce qui lui évite d'infliger un stress supplémentaire. Il affirme que les réponses comportementales et la pharmacodynamie de ces molécules ne sont "pas modélisables" sans animaux.

Objectifs

Notre projet vise à édudier les effets antidépresseurs des dérivés de la kétamine (NPS) sur des souris Balb/C de phénotype anxieux. Ces effets seront étudiés d'un point de vue pharmacocinétique et comportemental.

Bénéfices attendus

Le potentiel thérapeutique des dérivés de la kétamine (appelé nouveaux produits de synthèse, NPS) n'a jamais été étudié. Cette étude pharmacologique et comportementale permettra d'identifier un potentiel candidat médicament ayant une activité pharmacologique "antidépresseur".

Procédures

Etude pharmacocinétique : 1 prélèvement sanguin/animal : 2 min (n=200); Comportement: 5 à 10 minutes (n=180) : 1-Test de la nage forcée : Les souris sont placées dans des bocaux de 10 cm de diamètre et de 30 cm de profondeur remplis d’eau tiède (25°C). Ce test de 6 minutes, mesure le temps de nage ainsi que le temps d’immobilité (n=45) 2- Test du labyrinthe en croix surélevé : Ce labyrinthe est composé de 2 bras ouverts et de 2 bras fermés reliés par une plateforme centrale, à 50 cm au-dessus du sol et éclairée par une lampe de faible puissance. Les souris peuvent explorer librement l’ensemble du labyrinthe pendant 5 minutes. Une caméra permet l’enregistrement des déplacements. Un phénotype anxieux se caractérise par une diminution du temps passé dans les bras ouverts par rapport au temps passé dans les bras fermés (n=45). 3- Test de l'openfield : L’animal est placé dans une enceinte étrangère en plexiglas à 2 dimensions (43x43 cm). Les souris peuvent explorer librement l’ensemble de l'enceinte pendant 10 minutes. Des cellules photoélectriques infrarouges permettent l’enregistrement automatique des déplacement de l'animal. Ce test est caractéristique d’un phénotype de type anxieux en évaluant le temps passé et le nombre d’entrées dans le centre de l’enceinte (n=45). 4- Splash test : Les souris sont aspergées avec un spray par environ 500 microlitres d’une solution de sucrose à 10%. La latence et fréquence de toilettage est alors mesurée pendant 5 minutes(n=45).

Impact sur les animaux

Les nuisances pour ces animaux sont très faibles. Pour l'axe comportemental, les administrations I.P seront réalisées par du personnel qualifié à ces techniques et les tests comportentaux n'impliquent pas de douleur ou de durée d'expérimentation déraisonnable. Pour le test de la nage forcée les animaux ne subiront pas ce test jusqu'à épuisement car limité à une durée de 6 minutes.

Devenir

Euthanasie des animaux à l'issue de chaque procédure pour analyses tissulaires et biochimiques des prélèvements.

Remplacement

L'utilisation de souris est indispensable pour ce projet. L'évaluation de processus complexes qui iduisent une réponse comportementale n'est à ce jour pas modélisable. De façon similaire, les analyses de pharmacodynamique des traitements après administration i.p. ne sont pas modélisables non plus.

Réduction

Le calcul de puissance est effectuée pour les expériences de pharmacologie a été réalisé avec le logicile biostatGV. Un écart type de 20 % (issue des données de la littérature et de notre propre expérience) et la possibilité de discriminer un effet de 30% a été envisagé. Une puissance de 0,9 et un alpha de 0,05 ont été choisis. Ceci indique 10 animaux par groupe. Une approche statistique sera envisagée par analyse de la variance (ANOVA) entre les différents groupes d'animaux suivis pas des tests post-hoc adéquat. Les seuils de significativité seront fixés à *p

Raffinement

Le choix de la souche de souris Balb/C constitue un raffinement du protocole dans la mesure où il n'est pas nécessaire d'induire un stress à ces animaux pour évaluer l'activité antidépressive des différents traitements. Par ailleurs, l'évaluation pharmacocinétique effectuée avant la partie comportementale permet de déterminer parvance la dose intéressante de NPS à laquelle l'effet de type anxiodépressif.

Choix des espèces

L'utilisation de de souris est nécessaire pour ce projet en particulier la souche Balb/C de par son phenotype naturellement anxieux. Les animaux entreront dans le protocole expérimental lorsqu'ils seront agés de 8 à 10 semaines.